WO2005021739A1 - Nox1ポリペプチドに対する抗体、Nox1遺伝子を利用したガン診断方法、及びガン増殖抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Nox1ポリペプチドに対する抗体、Nox1遺伝子を利用したガン診断方法、及びガン増殖抑制物質のスクリーニング方法 Download PDF

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Junji Mitsushita
Tohru Kamata
Kunitaka Hirose
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Definitions

  • the present invention relates to a cancer diagnosis method, a method for screening for a cancer growth inhibitor, and a pharmaceutical composition based on a cancer-related gene and a polypeptide encoded by the gene. More specifically, a Noxl gene related to a mutant Ras oncogene, a polypeptide encoded by the gene, a method for diagnosing cancer using the polypeptide-specific antibody, and a screening agent for cancer growth inhibitor, The present invention relates to a method and a pharmaceutical composition used for treating cancer. Background art
  • Non-Patent Document 1 a mutant Ras oncogene has a great effect on canceration of mammalian cells and its progress.
  • the mutant Ras oncogene is thought to transform animal cells into cancer and progress through one of its major downstream pathways, the Raf-MAPKK-MAPK pathway (Non-Patent Document 2) . '
  • Patent Document 1 A method for identifying a tumor suppressor gene using oncogenes of H-ras, K-ras and N-ras (Patent Document 2) and the like have been developed.
  • Non-Patent Document 3 shows that active oxygen species such as 3 ⁇ 40 2 (ROS) are generated.
  • ROS active oxygen species
  • Non-patent Documents 4 and 5 since low-level intracellular HOS plays a role as a signal molecule in growth factor-induced cell proliferation (Non-patent Documents 4 and 5), the production of ROS related to the mutant Ras gene Rise is an animal cell Is thought to be the cause of the overgrowth.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 08-508166
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 10-504448
  • Non-patent document 1 Lowy, D.R.Annu.Rev. Biochem. 62, 851-891 (1993)
  • Non-patent document 2 McCormick, F. TCB. 9, M53-M56 (1999)
  • Non-Patent Document 3 Irani, K. et al. Science 275, 1649-1652 (1997)
  • Non-Patent Document 4 Sundaresan, M. et al. Science.270, 296-299 (1995)
  • Non-Patent Document 5 Bae, Y.S. et al. J. Biol. Chem. 272, 217-221 (1997)
  • the present invention provides a Noxl gene associated with a mutant Ras oncogene, a polypeptide encoded by the gene, a method for diagnosing cancer using the polypeptide-specific antibody, and a method for screening for a cancer growth inhibitor.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in cancer treatment.
  • the present inventors found that the mutant Ras oncogene expressed Noxl (1, 2, and 3), a homologue of the catalytic subunit of NADPH oxidase that generates superoxide, in the MAPKK-MAPK pathway. It was found that the siRNA of the Noxl gene effectively suppressed the phenotype of the mutant Ras gene, such as cell adhesion-dependent proliferation, morphological changes, and tumor formation in athymic mice. .
  • the present inventors have solved the above-mentioned problems based on the findings, and have achieved the present invention.
  • the present invention relates to (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (2) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by substitution, deletion, addition and / or insertion of one or more amino acid residues.
  • the present invention also includes administering the antibody-producing composition to a mammal.
  • the present invention provides an antibody specific to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, comprising contacting an antibody specific to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with a biological sample. Further, the present invention provides a composition for cancer diagnosis and a pharmaceutical composition for cancer treatment, comprising the antibody.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, comprising detecting a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof.
  • the detection is preferably performed by detecting the polynucleotide or a fragment thereof by a polymerase chain reaction or a real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • the present invention provides an siRNA corresponding to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof.
  • the present invention relates to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof, siRNA; or to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of positions 71 to 1615 of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising an siRNA.
  • the present invention relates to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof, siRNA; or to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of positions 71 to 1615 of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a cell transformed by siRNA.
  • the present invention relates to a method for screening a cancer cell growth inhibitory substance targeting the Noxl gene, which comprises: (1) transfection with the Noxl gene, and using the transformed cell as a screening target substance. After contact, the inactivation of Noxl activity is detected (primary screening), and (2) whether or not the substance that inactivates Noxl inhibits cancer cell growth is examined (2). Screening), expression of Noxl gene, and detection of inactivation of Noxl activity. (Definition)
  • polypeptide refers to a primary structure of an amino acid sequence, a polypeptide fragment having the primary structure, a polypeptide having a conformational biological activity, or a protein.
  • Noxl polypeptide refers to a polypeptide encoded by a Noxl gene, and includes both full-length polypeptides and polypeptide fragments.
  • homolog refers to a polypeptide having a homologous amino acid sequence with a polypeptide or protein having a specific amino acid sequence, and having a common biological activity or antigenicity.
  • RNA refers to a short RNA fragment that suppresses the expression of a specific gene, or a double-stranded RNA molecule composed of the RNA fragment and its complementary strand.
  • mutated Ras gene refers to a human Ras gene mutated to a state involved in tumor formation.
  • the mutation of glycine at position 12 in K-Ras to aspartic acid, or mutation of palin to arginine in K-Ras which is common in human lung cancer, and the 12th, other 13th, and 61st positions found in lung cancer It is the human Ras gene with the mutations that occur.
  • partial sequence of the amino acid sequence refers to a sequence contained in the amino acid sequence and containing at least 8 or more consecutive amino acid residues.
  • oligonucleotide generally refers to a nucleotide containing less than 100 bases, preferably 6 to 99 bases.
  • FIG. 1 (a) is a graph showing the results of analysis of gene expression by real-time quantitative polymerase chain reaction in Example 1.
  • FIGS. L (b), (c) and (d) show the results obtained by performing a real-time quantitative polymerase chain reaction in Example 2 in the same manner as in Example 1 and detecting the expression of Noxl.
  • FIG. 2 shows that in Example 4, RNAi (l) and RNAi ⁇ RNAi (5) were continuously transfected.
  • FIG. 4 is an electrophoresis image of the results of the transformation in the cell line subjected to datatation, confirmed by PCR using M13F and 3.0 Rev as primers.
  • FIG. 3 shows photographs comparing the changes in the morphology of cells involving the Noxl gene in Example 4.
  • FIG. 4 shows that in Example 4, adhesion-dependent cell proliferation of the cell line shown in the soft agar culture was measured in order to examine the transformation of the cells by the anchorage-independent growth ability. It is the graph shown.
  • FIG. 5 shows that in Example 4, K-Ras-NRK / neg-1 (neg-l), K-Ras-NRK / RNAi (l) -7 (i (l) -7), K-Ras-NRK / R Ai (3) -19 (i (3) -19) and K-Ras-NRK / RNAi (5) -7 (i (5) -7) It is the graph which shows the measured growth curve.
  • FIG. 6 is a graph showing the results obtained in Example 5 in which the treated cells were solubilized and the absorbance at 510 nm was measured to determine the decrease in NBT.
  • FIG. 4 is a graph showing that the production of the GFP-ratNoxl fusion protein is suppressed (left panel) and that the RNAi construct has high specificity for the target gene (right panel).
  • Figure 8 shows that in Example 6, endogenous Noxl mRNA expression was suppressed in each cell compared to K-Ras-NRK and K-Ras-NRK / neg-1.
  • -It is an electrophoresis image confirmed by PCR.
  • FIG. 9 is an image showing, in Example 7, that the siRNA used did not suppress the expression of GFP or GFP-humanNoxl by performing immunoblotting in the same manner as in Example 6.
  • FIG. 10 is a photograph showing the effect on cells by recovering Noxl once suppressed by siRNA in Example 7 by changing the shape of K-Ras-NRK cells.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect on cells by restoring Noxl once suppressed by siRNA, based on the growth rate of cells.
  • Figure 12 shows the effect on cells by recovering Noxl, which was once suppressed by siRNA, using a soft agar culture method in order to examine the effect on anchorage-independent growth ability.
  • 4 is a graph showing the results obtained by examining the adhesion-dependent proliferation ability of cells.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of observing the morphological change of cells in Example 9 for examining the effect of the expression of the Noxl gene on the transformation of the mutant Ras.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of siRNA on tumor formation caused by mutant Ras in Example 9 by observing tumor formation in nude mice for one month and measuring the tumor volume. .
  • the antibody-producing composition of the present invention comprises: (1) a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (2) substitution or deletion of one or more amino acid residues from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; Having an amino acid sequence mutated by addition and Z or insertion,
  • a polypeptide that induces the production of an antibody specific to a polypeptide comprising the amino acid sequence of (2); or (3) a partial sequence of the polypeptide of (1) or (2), It contains a polypeptide fragment that induces the production of an antibody specific to a polypeptide containing an acid sequence.
  • the antibody production composition of the present invention may contain a polypeptide having at least 80%, preferably 90%, and particularly preferably 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. .
  • the amino acid sequence homology as used herein refers to the identity (%) of an amino acid sequence to be compared with a reference amino acid sequence when aligned.
  • the homology is a standard program for performing homology searches of base sequences and amino acid sequences, such as BLAST (J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)) and FASTA (Methods in Enzymology, 183, 63). -69) It is possible to calculate using default (initial setting) parameters with analysis software such as.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a polypeptide encoded by the Noxl gene.
  • the antibody produced by the composition is specific for a human Noxl polypeptide, but is also specific for a homolog of the polypeptide produced by a non-human animal. It can also be used for canceration and for the advancement of cancer.
  • the composition for producing an antibody comprises an antibody for detecting a human cancer cell, and a human Noxl polypeptide. Can also be used for the production of antibodies for screening of mammals capable of producing homologues of cancer and cancer progression.
  • the partial sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a sequence comprising at least 8 or more consecutive amino acid sequences contained in the amino acid sequence, and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is an epitope that induces the production of an antibody specific to a peptide.
  • an appropriate carrier protein can be used in combination.
  • the polypeptide fragment of the present invention is a fragment of the polypeptides (1) and (2), which induces the production of an antibody specific to the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. is there.
  • the length of the peptide fragment is not particularly limited, but is usually 20 to 200, preferably 20 to 100, and more preferably 20 to 70 amino acid residues.
  • polypeptide the polypeptide, the homologue and the fragment of the polypeptide (hereinafter abbreviated as polypeptide if necessary) are, according to standard notation, the N-terminal (amino terminal) at the left end and the right end at the right end.
  • C-terminal carboxyl group
  • Examples of the side chain R of this ester include: C1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl; C3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl; phenyl, alpha - C6-12 Ryoriichi Honoré groups such as naphthyl, Benjinore, Fueeru such phenethyl - C1-2 alkyl group, or alpha - naphthylmethyl etc. - such as an alkyl group, such as naphthyl -C1-2 alkyl group is there.
  • polypeptides and the like of the present invention include a protective group such as a formyl group and an acetyl group at the amino terminal at the ⁇ terminal, and a glutamine residue at the ⁇ terminal generated by cleavage in vivo.
  • a protective group such as a formyl group and an acetyl group at the amino terminal at the ⁇ terminal, and a glutamine residue at the ⁇ terminal generated by cleavage in vivo.
  • a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule for example, -OH, -SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.
  • It also includes complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bonded.
  • the polypeptide of the present invention may have a physiologically acceptable inorganic or organic acid. It can be used as salting.
  • the inorganic acid addition salts include salts of hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, and sulfuric acid.
  • the organic acid addition salts include acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, and the like. Salts include maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • the antibody production composition of the present invention contains the polypeptide, a homolog thereof, a peptide fragment thereof, or an acid addition salt thereof. Further, if necessary, the composition may contain components such as a vehicle, a diluent, and an adjuvant.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a homolog thereof, or an antibody specific to the peptide fragment, using the composition for producing an antibody.
  • the antibody produced by the method of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for the purpose of the present invention.
  • examples thereof include a human / mouse chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody.
  • Antibodies refers to an antibody containing several% of mouse-derived antibodies in the whole antibody, and the human antibody refers to an antibody consisting of 100% human-derived antibodies.
  • a human antibody is one containing 10 to 20% of a mouse-derived antibody. Further, the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced by the following method.
  • First, the composition for producing an antibody is administered to a non-human mammal.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance antibody production.
  • Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • non-human mammals include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, with mice or rats being generally preferred.
  • an individual producing antibody is selected, and 2 to 5 days after the final immunization, antibody-producing cells contained in the spleen or lymph node are collected, and the same or different animal
  • antibody-producing cells contained in the spleen or lymph node are collected, and the same or different animal
  • the antibody titer in the antiserum is measured by reacting the labeled protein with the antiserum and measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • Do. Cell fusion can be performed by a conventional method such as the method of Koehler and Milstein (Nature, 256, 495, 1975).
  • the fusion promoter for example, polyethylene render recall (PEG), Sendai virus and the like can be used.
  • myeloma cells include non-human mammal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, and P3U1 is particularly preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used for fusion and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20, and PEG, preferably PEG1000 to PEG6000, is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be performed by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Screening of monoclonal antibody-producing hybridomas can be performed by various methods.
  • a solid phase for example, a microplate
  • an antigen is adsorbed directly or together with a carrier
  • To detect monoclonal antibodies bound to the solid phase contact the hybridoma culture supernatant with the solid phase to which anti-immunoglobulin antibodies, etc. are adsorbed, and then contact with a protein solution labeled with radioactive substances, enzymes, etc. There is a method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by contact.
  • Hybridomas producing monoclonal antibodies can be selected by a conventional method.
  • a medium for animal cells supplemented with HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • RPMI 1640 medium containing 10 to 20% fetal bovine serum
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum.
  • Kojun Pharmaceutical Co., Ltd. or a serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks
  • the culture is usually performed in the presence of 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of the obtained monoclonal antibody include salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis and other immunoglobulin separation and purification methods, and adsorption and desorption by ion exchanger (DEAE).
  • Method ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or specific purification method in which the antibody is collected using a protein A-active adsorbent and the bond is dissociated to obtain the antibody. .
  • the polyclonal antibody of the present invention immunizes a non-human mammal with a complex of the above-mentioned polypeptide or the like which is an immunizing antigen, or a peptide fragment thereof and a carrier protein, and then contains an antibody such as serum. It can be produced by collecting the components and separating and purifying the antibody.
  • the mixing ratio between the immunizing antigen and the carrier protein is determined so that antibodies are efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking with the carrier.
  • serum serum albumin thyroglobulin, hemocyanin and the like can be used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5, with respect to 1 hapten.
  • glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like can be used for the hapten and carrier coupling.
  • the complex antigen may be administered alone or in combination with a carrier, a diluent, or complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant in order to enhance the antibody-producing ability.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody is collected from blood, ascites, egg yolk and the like of the immunized mammal.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed in the same manner as in the separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the cancer diagnostic kit of the present invention contains the polyclonal or monoclonal antibody thus obtained.
  • the diagnostic kit may be used, if necessary, for immunological reaction tools, stains, enzyme-labeled antibodies for detection, washing solutions, antibody diluents, sample diluents, enzyme substrates, enzyme substrate diluents, etc. Of the reagent.
  • the pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention suppresses the expression of a specific protein encoded by the oxl gene, it can be used for prevention of canceration, delay of progression, and treatment. .
  • the antibody can be administered orally or parenterally, and the parenteral administration includes topical administration to a tissue.
  • ingredients for pharmaceutical preparations such as commonly used carriers, for example, fillers, extenders, binders, disintegrants, disintegration inhibitors, buffers, isotonic agents, and emulsifiers , Dispersants, stabilizers, coating agents, surfactants, absorption enhancers, Humectants, humectants, adsorbents, lubricants, excipients and the like can be used.
  • additives such as a coloring agent, a preservative, a flavor, a flavor, and a sweetener may be used.
  • compositions include excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, pudose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, and caicic acid, water, ethanol, simple syrup, and glucose.
  • excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, pudose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, and caicic acid, water, ethanol, simple syrup, and glucose.
  • LA Absorption promoters such as sodium peryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite, and colloidal keic acid, and lubricants such as purified talc and stearate .
  • LA Absorption promoters such as sodium peryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite, and colloidal keic acid
  • lubricants such as purified talc and stearate .
  • parenteral administration it can be in the form of injection, such as infusion, intravenous injection, subcutaneous injection, or intramuscular injection, suppositories made of oils and fats, water-soluble suppositories, and rectal administration using suppositories.
  • injection such as infusion, intravenous injection, subcutaneous injection, or intramuscular injection, suppositories made of oils and fats, water-soluble suppositories, and rectal administration using suppositories.
  • the preparation can be easily carried out by a usual method using a usual carrier in the pharmaceutical field.
  • compositions containing the antibody of the present invention include, for example, humans and other mammals (eg, rats, mice, monoremots, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dosage varies depending on the condition of the subject, the administration route and the like.For example, in the case of oral administration, generally, for an adult patient weighing 60 kg, about 10 to 4000 mg per day, preferably about 20 to 2000 mg per day , More preferably about 50-500 mg.
  • the single dose of the siRNA varies depending on the subject of administration, the condition of liver cancer, and the like.For example, for an adult patient weighing 60 kg in the form of an injection, about 10 ⁇ It is preferable to administer about 2000 mg, preferably about 20 to 1000 mg, more preferably about 50 to 500 mg intravenously.
  • cancer can be diagnosed by detecting and quantifying the Noxl gene in a living tissue or body fluid by an immunochemical measurement method including contacting the antibody of the present invention with a biological sample.
  • the antibody of the present invention is held on a carrier.
  • carriers used in the measurement method include agarose gel (Sepharose 4B and Sepharose 6B (Pharmacia Fine Chemical Co.)), dextran gel (Sephadex G-75, Sephadex G-100, and Sephadex G-200). (Pharmacia Fine Chemicals)), polyacrylamide gels (Biogel P-30, Biogel P-60, and Biogel P-100 (Biorad Laboratories)), cellulose particles (Avicel (Asahi Kasei)), and other gel particles.
  • Material-adsorbents such as ion-exchanged cenorelloses, such as getylaminoethyl cenorellose and canoleboxy methizole cellulose, glass, silicon chips, and stainless steel resins, imnoassay plates (Nunc), and weakly basic anion exchange Resin (Amberlite IR-4B, Dow X3 (Dow Chemical).
  • ion-exchanged cenorelloses such as getylaminoethyl cenorellose and canoleboxy methizole cellulose, glass, silicon chips, and stainless steel resins, imnoassay plates (Nunc), and weakly basic anion exchange Resin (Amberlite IR-4B, Dow X3 (Dow Chemical).
  • the antibody can be retained on the carrier by a conventional method such as the Bromcian method and the Daltaraldehyde method. Further, as a simpler method, it may be physically adsorbed on the surface of the antibody.
  • the labeling agent in the antibody to which the labeling agent is bound include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like, and it is preferable to use an enzyme.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable, and peroxidase, anorecaliphosphatase, j8-D-galactosidase, and gnorecosoxidase can be used, and peroxidase is particularly preferable.
  • Test samples in the immunochemical assay system of the present invention include urine, serum, plasma, cerebrospinal fluid and other body fluids, or animal cells and their culture supernatants.
  • an antigen-antibody reaction is performed by adding an analyte such as a Noxl polypeptide to be measured to the antibody held on the carrier, and then performing a reaction between the labeling agent and the anti-Noxl antibody. Add the conjugate and react.
  • a labeling agent for example, an enzyme substrate, is added to the obtained reaction product, and the absorbance or the fluorescence intensity of the resulting substance is measured. You can know the enzyme activity of the product.
  • a labeling agent for example, a standard solution of the enzyme
  • the relationship between the absorbance with Noxl polypeptide or the like or the fluorescence intensity is created as a standard curve, and the unknown amount of Noxl polypeptide is determined.
  • the present invention also provides a method for diagnosing cancer, comprising detecting a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof. Detection of the polynucleotide or a fragment thereof can be carried out by a conventional method using a polymerase chain reaction (PCR) or a real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a sense strand fragment corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is used as a foreprimer, and an antisense strand fragment is used as a reverse primer.
  • the length of the forward primer is not particularly limited, but is usually from 14 to 60 bases.
  • the length of the reverse primer is not particularly limited, but is preferably from 14 to 60 bases. Examples of the feed primer and the reverse primer used in the cancer diagnosis method of the present invention include the following.
  • Forward primer 5′-GGAGCAGGAATTGGGGTCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
  • Reverse primer 5′-TTGCTGTCCCATCCGGTGAG-3 (SEQ ID NO: 6)
  • a forward primer used for detection by the real-time quantitative polymerase chain reaction examples include the following. Ford Primer
  • siRNA or siRNA corresponding to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof according to the present invention suppresses the expression of the Noxl gene and reduces the production of the Noxl polypeptide. Therefore, by using the siRNA or the oligonucleotide, canceration of cells induced by the mutant Ras gene or cancer progression can be suppressed.
  • the siRNA or oligonucleotide of the present invention refers to a polynucleotide containing a continuous nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide or oligonucleotide complementary to a fragment thereof.
  • the siRNA of the present invention may also correspond to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of positions 71 to 1615 of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof.
  • the length of the siRNA is less than 100 bp, preferably 8 to 99 bp, particularly preferably 10 to 30 bp.
  • Preferred examples of ssi include the following. Human Noxl siRNA
  • siRNA of the present invention can be directly administered to a subject to be treated, or cells can be removed from the subject to be treated and then infused to return the cells to the subject, or can be used as an expression vector. After integration, the vector can be used by administering it to a subject for expression.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the siRNA.
  • the pharmaceutical composition can be formulated using a conventionally used pharmaceutical material and in a conventional manner, similarly to the above-described pharmaceutical composition containing an antibody.
  • Pharmaceutical compositions containing the siRNA of the present invention include, for example, humans and other mammals (eg, rats, mice, monoremots, egrets, sheep, pigs, horses, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). ) Can be administered.
  • the dose varies depending on the condition of the subject, the administration route, and the like.For example, in the case of oral administration, generally, for an adult patient weighing 60 kg, about 10 to 4000 mg, preferably about 20
  • the single dose of the siRNA varies depending on the administration subject, the target cancer situation, etc.For example, for an adult patient weighing 60 kg in the form of an injection, about 10 ⁇
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof, siRNA; or to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of positions 71 to 1615 of SEQ ID NO: 1, or to a fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a cell transformed by siRNA.
  • the transformed cell may be a cell provided by a third party or a cell removed from a patient to be treated. Further, the transformed cells can be used as cells for cancer treatment.
  • the present invention also relates to a partial sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
  • an RNA molecule consisting of a mutant nucleotide sequence in which at least one base in the sequence has been added, deleted or substituted, and which suppresses the expression of Noxl polypeptide in human cells.
  • the RNA molecule can be designed based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, vol. 411, p. 494, 2001).
  • the RNA molecule of the present invention is a double-stranded RNA molecule comprising the RNA molecule and its complementary RNA.
  • a hydroxyl group is added to the 3'-terminus of the RNA molecule, both ends of the double strand are chemically bonded by a thiophosphoryl group, and ultraviolet light, bis (2-octamethyl) amine, 4-thioperacil is added between each strand.
  • RNA molecule of the present invention suppresses the expression of the Noxl gene associated with transformation by the mutant Ras gene, it is used as a pharmaceutical composition for preventing canceration of cells, suppressing cancer progression, and treating cancer cells. be able to.
  • the present invention also provides a method for screening for a cancer cell growth inhibitor that targets the Noxl gene.
  • a cancer cell growth inhibitor that targets the Noxl gene.
  • the Staring Jung method after contacting a cell having a mutant Ras gene or a normal cell transfected with the Noxl gene with a substance to be screened, expression of the Noxl gene and inactivation of its enzyme activity are performed. Is detected. Next, the transformed cells are cultured with a substance to be screened to examine their ability to inhibit growth.
  • the effect of the screening target compound on Noxl gene expression can be detected by detecting the increase or decrease of mRNA expression by real-time quantitative polymerase chain reaction, detecting the polypeptide encoded by the Noxl gene or its peptide fragment by using an antibody, or detecting the It can be performed by observing the morphological change of the transformed cells.
  • the cells having the mutant Ras gene used in the screening method are not particularly limited, and for example, H-Ras-NIH3T3 cells, K-Ras-NRK cells, or hamster cells can be used.
  • a vector used for introducing the Noxl gene for example, pEGFP-Cl (control), pEGFP-Cl-Noxl, or the like can be used.
  • a vector for expressing siRNA for example, pSilencer can be used. Can be.
  • the pEGF-Cl-Noxl vector can be continuously transfected into NIH3T3 cells or NRK cells using the ribofectamine method to establish a cell line that highly expresses Noxl.
  • a kidney cancer cell having a mutant Ras gene can be used.
  • DMEM Dulbeco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • cells can be cultured in a multiplate (96-well, 48-well), and the substance to be screened can be added, and large-scale and rapid processing can be performed.
  • K-Ras-NRK rat kidney cells
  • K-Ras-NRK cells Korean murine sarcoma virus transformed NRK cells
  • the immulotting was performed using 1 ⁇ 10 5 sample cells in a 2 ⁇ sample buffer (0.1 M Tris Cl, H 6.8, glycerol 20%, SDS 4%, DTT 3.1%, BPBO.001%). After solubilization, the polypeptides were separated by SDS gel electrophoresis and subsequently analyzed by Imunobutting.
  • the protein was transferred electrically to a nitrocellulose membrane in transfer buffer (25 mM Tris CI pH 8.3, 92 mM glycine, methanol 20%), and anti-Ras antibody (primary antibody) and HRP-conjugated anti-heron-IgG It was reacted with the antibody and detected by the chemical publishing (ECL) method.
  • transfer buffer 25 mM Tris CI pH 8.3, 92 mM glycine, methanol 20%
  • anti-Ras antibody primary antibody
  • HRP-conjugated anti-heron-IgG HRP-conjugated anti-heron-IgG It was reacted with the antibody and detected by the chemical publishing (ECL) method.
  • NIH3T3 cells cultured overnight in serum-free condition were stimulated with serum (30%) or epidermal growth factor (EGF) 50 ng / ml, and then subjected to real-time quantitative polymerase chain reaction. Analyzed by As a result, as shown in FIGS. 1 (c) and (d), the expression of Noxl gene increased 6 to 20 times within 12 hours from the start of culture. Thus, the expression of the Noxl gene is associated with factors that promote cell growth, because both platelet-derived growth factor (PDGF) and angiotensin II form superoxide, and This is consistent with reports that it induces Noxl gene expression in vascular smooth muscle cells (1, 4).
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • angiotensin II form superoxide
  • wortmanin (wortmanin: 100 nM), which is a PI3 kinase inhibitor, did not inhibit the increase in Noxl expression in H-Ras-NIH3T3 cells (data not shown).
  • oligonucleotides 1-S and 1-AS were annealed and subcloned into pSilencer hygro, HI-promoter (Ambion) to obtain RNAi (l).
  • oligonucleotides 3-S and 3-AS were annealed and subcloned into Silencer hygro, HI-promoter (Ambion) to obtain RNAi (3).
  • the oligonucleotides 5-S and 5-AS were annealed and subcloned into Silencer hygro, HI-promoter (Ambion) to obtain RNAi (5).
  • pSilencer hygro Negative Control plasmid (Ambion) was used as a control vector.
  • RNAi (l) is an siRNA construction that targets positions 223 to 241 of SEQ ID NO: 3.
  • RNAi (3) is an siRNA construct that targets positions 578 to 596 of SEQ ID NO: 3.
  • RNAi (5) is an siRNA construction that targets positions 1224 to 1242 of SEQ ID NO: 3.
  • each oligonucleotide is as follows.
  • RNAi (l), RNAi (3), RNAi (5), and pSilencer hygro Negative Control plasmid was subjected to K-Ras-NRK Each cell was transfected into 1 ⁇ 10 6 cells.
  • Trans Hue transfected cells in order to perform the selection, ⁇ Shi fetal serum (FBS) 10% and HygromycinB 400 ⁇ g / ml and comprising as using DMEM medium supplemented with, C0 2 5% wet environments smell And cultured at 37 ° C for 2-3 weeks. After culture, surviving colonies were isolated.
  • RNAi (l), RNAi (3), and RNAi (5) were continuously cloned for each 3 cell lines (K-Ras-NRK / RNAi (l) -7, K-Ras-NRK / RNAi (l) -12, K-Ras- NRK / RAi (l) -15; K-Ras-NRK / RNAi (3)-17, K-Ras-NRK / RNAi (3) -l 9, K- Ras-NRK / RNAi (3) -96; K-Ras-NRK / RNAi (5) -2, -Ras-NRK / RNAi (5) -3, K-Ras-NRK / RNAi (5) -7), Two clones (K-Ras-NRK / neg-1 and K-Ras-NRK / neg-2) were selected from cells transfected with the pSilencer hygro Negative Control plasmid continuously.
  • a soft agar medium assay was performed. Agarose layer containing 0.53% of agar containing nutrients necessary for cell growth is placed in a 6 cm diameter culture dish, solidified, and cells suspended in DMEM medium containing 0.3% agar and 10% FBS are placed on top. The cells were overlaid so that the final concentration of cells per culture dish was 1.5 ⁇ 10 4 . Then, C0 2 under 5% of the wet environment, and cultured at 37 ° C, and observed the appearance of cell colonies over 3 weeks. Adhesion-dependent cell growth of the indicated cell lines in softgar culture was measured and the standard error (sem) of the three +/- means is shown in FIG.
  • K-Ras-NRK / neg-1 (neg-1)
  • K-Ras-NRK / RNAi (l) -7
  • K-Ras-NRK / RNAi (3) - 19 (i (3) -19 )
  • each cell of the K-Ras-NRK / i ( 5) -7 (i (5) -7) by 10 4 from the culture dish and transferred to a culture medium, C0 2 5% presence, standard culture solution (DMEM, FBS (10%) ) in for 6 days, and liquid culture. Next, the number of cells in the liquid medium was counted, and the growth curve was shown in FIG.
  • K-Ras-NRK / RAi (l) -7, K-Ras-NR / RNAi (3) 19, and K-Ras-NRK / RNAi (5) -7 cells were Although the growth rate decreased, in contrast, no growth inhibitory effect was confirmed with K-Ras-NRK / neg-1.
  • Example 4 Confirmation of superoxide production by NADPH oxidase encoded by Noxl gene
  • the present inventors used the transformed cells of Example 4 to evaluate the role of Noxl in superoxide production induced by mutant Ras. And the production of superoxide was measured by NBT reduction analysis.
  • the method of Suh et al. was used for NBT (Nitroblue Tetrazolium) analysis (1). That is, Hanks containing 0.25% NBT In 0.2 ml of the solution, prepare a solution containing 40 units of superoxide dismutase (SOD), an enzyme that digests active oxygen, and a solution not containing it, and suspend 2 x 10 5 cells at 37 ° C. Treated for 8 minutes.
  • SOD superoxide dismutase
  • the treated cells were separated by low-speed centrifugation, solubilized by adding 0.5 ml of pyridine, and the absorbance at 510 nm was measured to quantify the decrease in NBT (extinction coefficient of 11,000 / M / cm) 0 Data obtained Is shown as three +/- sem in Figure 6.
  • K-Ras-NRK and K-Ras-NRK / neg-1 increased NBT reduction, which was inhibited by superoxide dismutase treatment as compared with NRK.
  • K-Ras-NRK / RNAi (l) -7, K-Ras-NRK / RNAi (3) -19, and K-Ras-NRK / RNAi (5) -7 are K-Ras oncogenes. Reduced the ROS production stimulating effect to the level of NRK cells (FIG. 6), and was shown to be involved in increasing superoxide production in Noxl 1S mutant Ras-transformed cells.
  • the present inventors performed analysis in the following procedure to confirm that Noxl expression was reduced by RNAi (l), RNAi (3), and RNAi (5). That is, to evaluate the inhibitory effect of RNAi (l), RNAi (3), and RNAi (5) on the expression of GFP-ratNoxl, co-transfect GFP-ratNoxl with RNAi (l)-(5), respectively. An eximation was performed and an imknob mouthing analysis was performed in the same manner as in Example 2. As shown in the left panel of Figure 7, the expected fusion polypeptide of GFP and ratNoxl was produced, and the co-expression of RNAi (l), RNAi (3), and RNAi (5) was dependent on these vectors.
  • RNAi (l) and RNAi (5) both target rat Noxl. Using the same method as in the left panel of Fig. 7, RNAi (l) and RNAi (5) do not suppress human Noxl, that is, the RNAi construct has high specificity for the target gene. This is shown in the right panel.
  • K-Ras-NRK / RNAi (l) -7 K-Ras-NRK / RNAi (l) -12, K-Ras-NRK / RNAi (3) -19, In each cell of K-Ras-NRK / RNAi (3) -96, K-Ras-NRK / RNAi (5) -2 and K-Ras-NRK / RAi (5) -7, K-Ras-NRK: , And K-Ras-NRK / neg-1 were shown to be certainly suppressed by RT-PCR.
  • Fig. 8 shows the results.
  • the siRNA could not be released only by adding the control vector to K-Ras-NRK / RAi (l) -7 (i (l) -7 + GFP), and the cells were flat.
  • the morphology returned to a stomach-like morphology similar to that of previous K-Ras-NRK cells (Fig. 10). .
  • DPI diphenylene iodonium
  • K-Ras-NRK cells were treated with DPI, a flavoprotein inhibitor, or the antioxidant, n-acetyl cysteine, 10 mM (data not shown).
  • the cells transiently took on a flat morphology and became a morphology close to NRK cells.
  • FIG. 13 such morphological changes were also observed in K-Ras-NRK cells treated with PD98059. Therefore, it was shown that an increase in Noxl gene expression is essential for promoting the transformation of mutant Ras by the Ras-MAPKK-MAPK pathway.
  • K-Ras-NRK / neg-1 K-Ras-NRK / RNAi (l) -7, -Ras-NRK / RNAi (l) -12, K-Ras -NRK / RNAi (3) -19, K- Ras-NRK / RNAi (3) -96 and K-Ras-NRK / RNAi (5) -2
  • ⁇ -Ras-NRK / neg-l formed an active tumor within 2 weeks.
  • K-Ras-NRK / RNAi (l) -7, K-Ras-NRK / RNAi (l) -12, -Ras-NR / RNAi (3) -19, K-Ras-NRK / RNAi ( 3) -96 markedly suppressed tumor growth.
  • Histological observation by dissection revealed that the tumor formed with K-Ras-NRK / neg-1 had increased blood vessels. This is consistent with the possibility that the Noxl gene induces angiogenesis through increased production of vascular endothelial growth factor (1).
  • the mutant Ras elevates the mitogenic oxidase Noxl via the MAPKK-MAPK pathway, while the expression of the Noxl gene causes cell transformation, cancer It is essential for formation and its progress.
  • our research has revealed the molecular mechanism that Noxl polypeptide plays an essential role as a redox signal molecule in transformation with mutant Ras.
  • Nox family proteins Noxl-5 homologs of Gp91phox have been identified in non-phagocytic cells and have been reported to perform specific functions in various cellular processes (1 and 5-9) .
  • the Noxl gene is unique in that it encodes a transmembrane oxidase that mediates mitogenic signals from growth factors (1 and 4) and oncogenes.
  • SEQ ID NO: 1 Shows the nucleotide sequence of mRNA or cDNA transcribed from human Noxl gene.
  • SEQ ID NO: 2 This shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the human Noxl gene.
  • SEQ ID NO: 3 Shows the nucleotide sequence of mRNA or cDNA transcribed from rat Noxl gene.
  • SEQ ID NO: 4 This shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the rat Noxl gene.
  • SEQ ID NO: 5 This shows the base sequence of the free primer for the Noxl gene used in the method for diagnosing human cancer.
  • SEQ ID NO: 6 This shows the base sequence of the reverse primer for Noxl gene used in the method for diagnosing human cancer.
  • SEQ ID NO: 7 This shows the sequence of a for-primed primer used for detecting human Noxl gene by real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • SEQ ID NO: 8 This shows the sequence of the reverse primer used for detecting human Noxl gene by real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • SEQ ID NO: 9 This shows the sequence of TaqMan probe used for detecting human Noxl gene by real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • SEQ ID NO: 11 This shows the base sequence of siRNA for human Noxl gene of the present invention.
  • SEQ ID NO: 12 This shows the base sequence of siRNA for rat Noxl gene of the present invention.
  • SEQ ID NO: 13 This shows the base sequence of siRNA for rat Noxl gene of the present invention.
  • Example 1 In Example 1, the presence or absence of Noxl expression was determined in real time. It is the nucleotide sequence of the first primer used for detection by quantitative polymerase chain reaction.
  • SEQ ID NO: 16 This is a nucleotide sequence of a reverse primer used in Example 1 to detect the presence or absence of Noxl by a real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • SEQ ID NO: 17 This is the nucleotide sequence of the TaqManMGB probe used in Example 1 to detect the presence / absence of Noxl by real-time quantitative polymerase chain reaction.
  • SEQ ID NO: 18 This is the nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the siRNA construct used in Example 4 to examine the involvement of the Noxl gene in the transformation with the mutant Ras gene.
  • SEQ ID NO: 19 This is the nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the siRNA construction used in Example 4 to examine the involvement of the Noxl gene in the transformation with the mutant Ras gene.
  • SEQ ID NO: 20 This is the nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the siRNA construction used in Example 4 to examine the involvement of the Noxl gene in the transformation with the mutant Ras gene.
  • SEQ ID NO: 21 This is the nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the siRNA construct used in Example 4 to examine the involvement of the Noxl gene in the transformation with the mutant Ras gene.
  • SEQ ID NO: 22 This is the nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the siRNA construction used in Example 4 to examine the involvement of the Noxl gene in the transformation with the mutant Ras gene.
  • SEQ ID NO: 23 This is the nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the siRNA construction used in Example 4 to examine the involvement of the Noxl gene in the transformation with the mutant Ras gene.
  • SEQ ID NO: 24 This is a nucleotide sequence of one of M13 primers used in Example 4 for confirming transfection of siRNA construction with respect to Noxl gene.
  • SEQ ID NO: 25 This is the nucleotide sequence of the 3.0 Rev primer used in Example 4 to confirm the transfection of the siRNA construction for the Noxl gene.
  • SEQ ID NO: 26 This shows the nucleotide sequence of the nucleotide primer used in Example 6 to confirm the decrease in Noxl expression.
  • SEQ ID NO: 27 This shows the nucleotide sequence of the reverse primer used in Example 6 to confirm the decrease in Noxl expression.

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Abstract

（課題）　突然変異Rasガン遺伝子と関連するNox1遺伝子を利用したガン診断方法、ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、及びガン治療に用いる医薬組成物を提供する。（解決手段）　Nox1遺伝子がコードするポリペプチド、そのホモログ、及びこれらのペプチド断片を含む、抗体製造用組成物、Nox1遺伝子がコードするポリペプチドに対する抗体、これらの抗体、又はNox1を発現したmRNAを検出する方法である。

Description

明細:
Noxlポリぺプチドに対する抗体、 Noxl遺伝子を利用したガン診断方法、 及ぴガン増殖抑制物質のスクリ一二ング方法
技術分野
本発明は、 ガン関連遺伝子、 及ぴ該遺伝子にコードされたポリペプチドに基 づく、 ガン診断方法、 ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、 及び医薬組成 物に関するものである。 さらに詳細に述べると、 突然変異 Rasガン遺伝子と関 連する Noxl 遺伝子、 該遺伝子にコードされたポリペプチド、 及び該ポリぺプ チド特異的抗体を用いるガン診断方法、 ガン増殖抑制物質のスクリ一ユング方 法、 及ぴガン治療に用いる医薬組成物に関するものである。 背景技術
従来から、 突然変異 Rasガン遺伝子は、 哺乳動物細胞のガン化、 及ぴその進 行に大きな影響を与えることが知られている （非特許文献 1 )。 例えば、 突然変 異 Rasガン遺伝子は、 その主要な下流経路の 1つである Raf-MAPKK-MAPK経 路を介して、 動物細胞をガン化し、 進行させると考えられている （非特許文献 2 )。 '
そして、 このような知見に基づき、 N-ras腫瘍サプレッサーが欠損しているガ ン細胞を対象として、 p94RBをコードする遺伝子を含む発現ベクター遺伝子を 投与する腫瘍抑制遺伝子治療法 （特許文献 1 ) や、 H-ras、 K-ras及び N-rasの発 ガン遺伝子を利用して腫瘍抑制遺伝子を同定する方法 （特許文献 2 ) などが開 発されてきた。
近年の研究により、 突然変異 Ras遺伝子により形質転換された細胞で、 スー パーォキシド、 ¾02などの活性酸素種 （ROS) が生成されることが報告された (非特許文献 3 )。 そして、 細胞内の低レベル HOSは、 増殖因子で誘導される 細胞増殖において、 シグナル分子としての役割を演じていることから （非特許 文献 4及び 5 )、 突然変異 Ras遺伝子に関連した ROS生成の上昇は、 動物細胞 の異常増殖の原因になると考えられるようになった。
しかし、突然変異 Ras遺伝子によるガン化、ガンの進行促進などに関与する、 活性酸素産生酵素はこれまで知られていなかった。
(特許文献 1 ) 特表平 08-508166号公報
(特許文献 2 ) 特表平 10-504448号公報
(非特許文献 1 ) Lowy, D. R. Annu. Rev. Biochem. 62, 851-891 (1993) (非特許文献 2 ) McCormick, F. TCB. 9, M53-M56 (1999)
(非特許文献 3 ) Irani, K. et al. Science 275, 1649-1652 (1997)
(非特許文献 4 ) Sundaresan, M. et al. Science. 270, 296-299 (1995)
(非特許文献 5 ) Bae, Y. S. et al. J. Biol. Chem. 272, 217-221 (1997) 発明の開示
本発明は、 突然変異 Ras ガン遺伝子と関連する Noxl遺伝子、 該遺伝子にコ 一ドされたポリぺプチド、 及ぴ該ポリべプチド特異的抗体を用いるガン診断方 法、 ガン増殖抑制物質のスクリーニング方法、 及びガン治療に用いる医薬組成 物を提供することを目的とする。
本発明者らは、 研究の結果、 突然変異 Rasガン遺伝子が、 MAPKK-MAPK経 路において、 スーパーォキシドを生成する NADPH酸化酵素の触媒サブュニッ トのホモログ Noxl (1、 2及び 3) の発現を著しく上昇させ、 かつ該 Noxl遺伝 子の siRNAが、 細胞接着依存性の増殖、 その形態変化、 無胸腺マウスにおける 腫瘍の形成など、 突然変異 Ras遺伝子の表現型を効果的に抑えるという知見を 得た。本発明者らは、当該知見に基づき前記課題を解決し、本発明を達成した。
したがって、本発明は、（1 )配列番号 2のアミノ酸配列を含むポリべプチド； ( 2 ) 配列番号 2のアミノ酸配列から、 アミノ酸残基 1以上の置換、 欠失、 付 加及び/又は挿入によって変異したアミノ酸配列を有し、 前記配列番号 2のァ ミノ酸配列を含むポリぺプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポリべプチ ド；又は （ 3 ) ( 1 ) 又は （ 2 ) のポリぺプチドの部分配列を有し、 前記配列番 号 2のアミノ酸配列を含むポリべプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポ リペプチド断片を含む、 抗体製造用組成物を提供する。
また、 本発明は、 前記抗体製造用組成物を、 哺乳類に投与することを含む、 配列番号 2のァミノ酸配列を含むポリぺプチドに特異的な抗体の製造方法を提 供する。
さらに、 本発明は、 配列番号 2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的 な抗体を提供する。
さらに、 本発明は、 配列番号 2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的 な抗体を、 生物試料と接触させることを含む、 ガンの診断方法を提供する。 さらに、 本発明は、 前記抗体を含む、 ガン診断用組成物、 及びガン治療用医 薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片を検出することを特徴とする、 ガン診断方法を提供する。 該検出 は、 ポリメラーゼ連鎖反応、 又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応に より該ポリヌクレオチド、 又はその断片を検出することにより行うのが好まし い。
さらに、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNAを提供する。
さらに、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA ;又は配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオ チド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNAを含む、 ガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA ;又は配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオ チド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNAによって 形質転換された細胞を含む、 ガン治療用医薬組成物を提供する。
さらに、 本発明は、 Noxl遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリ 一二ング方法であって、 （1 ) Noxl 遺伝子でトランスフエクシヨンし、 該形質 転換細胞をスクリ一二ング対象物質と接触させた後、 Noxl活性の不活化を検出 ( 1次スクリ一ユング) し、 かつ ( 2 ) その Noxl を不活化する物質が、 がん 細胞増殖を抑制するか否かを調べることにより （2次スクリーニング）、 Noxl 遺伝子の発現、 及び Noxl 活性の不活化を検出することを含む、 該スクリー二 ング方法を提供する。 (定義）
本明細書における「ポリペプチド」 という用語は、アミノ酸配列の一次構造、 該一次構造のポリぺプチド断片、 立体構造を伴う生物活性を有するポリぺプチ ド、 又はタンパク質を意味する。
本明細書における 「Noxl ポリペプチド」 とは、 Noxl遺伝子にコードされて いるポリペプチドをいい、 全長ポリペプチド、 及びポリペプチド断片の双方を 含む。
本明細書における 「ホモログ」 という用語は、 特定のアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 又はタンパク質と、 アミノ酸配列が相同性を有し、 かつ共通の 生物活性又は抗原性を有するポリぺプチドをいう。
本明細書における 「siRNA」 という用語は、 特定の遺伝子の発現を抑制する 短 RNA断片、 又は該 RNA断片とその相補鎖からなる二本鎖 RNA分子を意味 する。
本明細書における 「突然変異 Ras遺伝子」 とは、 腫瘍の形成に関与する状態 に突然変異したヒ ト Ras遺伝子をいう。 例えば、 ヒ ト滕臓ガンで多い K-Rasの 12番目のグリシンからァスパラギン酸への突然変異、 又はパリンゃアルギニン への突然変異、 さらに肺ガンで見られる 12番目、 その他 13番目、 61番目に起 きる変異を有するヒ ト Ras遺伝子である。
本明細書における、 ポリペプチドの 「アミノ酸配列の部分配列」 とは、 該ァ ミノ酸配列に含まれる、 少なくとも 8個以上の連続するアミノ酸残基を含む配 列をいう。
本明細書における 「オリゴヌクレオチド」 とは、 通常、 塩基を 100個未満、 好ましくは 6〜99個を含むヌクレオチドをいう。 図面の簡単な説明
図 1 (a)は、 実施例 1におけるリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によ り遺伝子発現の解析を行った結果を示すグラフである。
図 l (b)、 （c)及び (d)は、 実施例 2において、 実施例 1と同じ方法でリアルタイ ム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、 Noxlの発現を検出した結果を示す。 図 2は、 実施例 4において、 RNAi(l)、 RNAi \ RNAi(5)を持続的にトランス フエタトされた細胞株における、 形質転換の結果を、 M13F及び 3.0Revをプラ イマ一として PCRで確認した電気泳動像である。
図 3は、 実施例 4における、 Noxl遺伝子が関与する細胞の形態の変化を比較 した写真を示す。
図 4は、 実施例 4において、 細胞の形質転換を、 足場非依存性の増殖能によ り調べるため、 ソフトァガー培養において示された細胞株の接着依存的細胞増 殖を測定し、 その結果を示したグラフである。
図 5は、実施例 4において、 K-Ras-NRK/neg-1 (neg-l) , K-Ras-NRK/RNAi(l)-7 (i(l)-7)、 K-Ras-NRK/R Ai(3)-19 (i(3)-19)、及ぴ K-Ras-NRK/RNAi(5)-7 (i(5)-7) の各細胞の数を液体倍地中で計測した、 その増殖曲線を示すグラフである。
.図 6は、 実施例 5において、 処理された細胞を可溶化し、 510nmにおける吸 光度を測定して NBTの減少を定量した結果を示すグラフである。
図 7は、 実施例 6において、 GFP と ratNoxl の融合ポリペプチドが産生され たこと、 そして RNAi(l)、 RNAi (3)、 RNAi(5)の共発現は、 これらのベクターの 量依存的に GFP-ratNoxl 融合蛋白質の生産を抑えること （左パネル）、 また該 RNAi コンストラク トは,標的遺伝子に対する特異性が高いこと (右パネル) を 示すグラフである。
図 8は、 実施例 6において、 内在性の Noxlの mRNA発現が、 各細胞におい て、 K-Ras-NRK、及び K-Ras-NRK/neg-1に比べて抑制されていることを、 RT-PCR により確認した電気泳動像である。
図 9は、実施例 7において、使用した siRNAが GFP、または GFP - humanNoxl の発現を抑制しないことを、 実施例 6と同様の手法によりィムノブロッテイン グすることにより示した像である。
図 1 0は、 実施例 7において、 siRNAにより一度抑制された Noxl を回復す ることによる細胞への影響を K-Ras-NRK細胞の形状変化により示す写真であ る。
図 1 1は、 siRNAにより一度抑制された Noxl を回復することによる細胞へ の影響を、 細胞の増殖速度により示すグラフである。
図 1 2は、 siRNAにより一度抑制された Noxl を回復することによる細胞へ の影響を、 足場非依存性増殖能により調べるため、 ソフトァガー培養法を用い て細胞の接着依存的增殖能を検討した結果を示すグラフである。
図 1 3は、 実施例 9における、 突然変異 Rasの形質転換に対する Noxl 遺伝 子の発現の影響の検討で、細胞の形態変化を観察した結果を示すグラフである。 図 1 4は、 実施例 9における、 突然変異 Rasによる腫瘍形成に対する siRNA の影響を、 ヌードマウスの腫瘍形成を 1 ヶ月間に渡り観察し、 かつ腫瘍の体積 を測定することにより示したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の抗体製造用組成物は、 （ 1 ) 配列番号 2のァミノ酸配列を含むポリぺ プチド； （ 2 ) 配列番号 2のァミノ酸配列から、 ァミノ酸残基 1以上の置換、 欠 失、 付加及び Z又は揷入によって変異したアミノ酸配列を有し、 前記配列番号
2のアミノ酸配列を含むポリぺプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポリ ペプチド；又は （3 ) ( 1 ) 又は （2 ) のポリペプチドの部分配列を有し、 前記 配列番号 2のァミノ酸配列を含むポリぺプチドに特異的な抗体の産生を誘導す る、 ポリペプチド断片を含むものである。
なお、 本発明の抗体製造用組成物は、 配列番号 2のアミノ酸配列と少なく と も 80%、 好ましくは 90%、 特に好ましくは 95%の相同性を有するポリべプチ ドを含んでいてもよい。 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性とは、 一線上 に並べた場合における、 基準となるアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列と の同一性 （％) をいう。 該相同性は、 塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を 行うための標準のプログラムである、 BLAST (J. Mol. Biol., 215, 403 (1990) ) や FASTA (Methods in Enzymology, 183, 63-69) 等の解析ソフトで、 デフオルト (初期設定） のパラメータを用いて計算することができる。
配列番号 2のアミノ酸配列を含むポリべプチドは、 Noxl遺伝子にコードされ たポリペプチドであり、 該ポリペプチドの産生を検出することにより、 検査対 象の組織のガン化、 及びガンの進行をスクリーニングできる。 なお、 該組成物 で製造された抗体は、 ヒ ト Noxl ポリペプチドに特異的であるが、 さらに非ヒ ト動物が産生する該ポリペプチドのホモログにも特異性を有する場合、 非ヒ ト 動物のガン化、 及びガン進行のスクリーユングにも使用できる。 したがって、 該抗体製造用組成物は、 ヒ トガン細胞検出用抗体、 及ぴヒ ト Noxl ポリべプチ ドのホモログを産生し得る哺乳類のガン化、 及ぴガン進行のスクリーニング用 抗体の製造にも使用することができる。
また、 配列番号 2のァミノ酸配列の 分配列とは、 該ァミノ酸配列に含まれ る、 少なく とも 8個以上の連続するアミノ酸配列をであって、 配列番号 2のァ ミノ酸配列を含むポリべプチドに特異的な抗体の産生を誘導するェピトープと なるものをいう。 なお、 該部分配列をェピトープとして用いる場合、 適当なキ ャリァータンパク質を組み合わせて用いることができる。
また、 本発明のポリペプチド断片は、 前記ポリペプチド （1 ) 及び （2 ) の 断片であって、 前記配列番号 2のアミノ酸配列を含むポリべプチドに特異的な 抗体の産生を誘導するものである。
また該ペプチド断片の長さは、 特に限定されるものではないが、 通常 20個〜 200個、 好ましくは 20個〜 100個、 さらに好ましくは 20〜70個のアミノ酸残基 長である。
本明細書において、ポリペプチド、該ホモログ及び該ポリペプチドの断片（以 下、 必要な場合はポリペプチドと略す。） は、 標準的標記法に従い、 左端が N末 端 （ァミノ末端）、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 該ポリペプチド 等は、 C 末端がカルボキシル基 (-COOH)、 カルボキシレート (-COO-)、 アミ ド （-CONH2) 又はエステル （-COOR) とすることもできる。 このエステルの側 鎖 Rの例を挙げると、 例えば、 メチル、 ェチル、 n-プロピル、 イソプロピル、 n-ブチルなどの C1-6アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3-8 シク口アルキル基、フエニル、 α -ナフチルなどの C6-12了リ一ノレ基、ベンジノレ、 フエネチルなどのフエエル- C1-2アルキル基、 又は α -ナフチルメチルなどの - ナフチル -C1-2アルキル基などのアルキル基などがある。
また、 本発明のポリペプチド等は、 Ν 末端のアミノ酸残基のァミノ基が、 ホ ルミル基、 ァセチル基などの保護基、 生体内で切断されて生成する Ν末端のグ ルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置 換基 （例えば- OH、 -SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジ ノ基など） が適当な保護基で保護されたもの、 又は糖鎖が結合したいわゆる糖 タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
また、 本発明のポリペプチド等は、 生理学的に許容し得る無機又は有機酸付 加塩として用いることができる。 該無機酸付加塩の例を挙げると、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 及び硫酸の塩があり、 また有機酸付加塩の例を挙げると、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 及びベンゼンスルホン酸 などの塩がある。
すなわち、本発明の抗体製造用組成物は、前記ポリペプチド、そのホモログ、 これらのペプチド断片、 又はこれらの酸付加塩を含むものである。 また、 必要 に応じて、 該組成物はべヒクル、 希釈剤、 アジュバンドなどの成分を含んでい てもよい。
本発明では、 前記抗体製造用組成物を用いて、 配列番号 2のアミノ酸配列を 含むポリペプチド、 そのホモログ、 又は該ペプチド断片に特異的な抗体を製造 する方法を提供する。
本発明の方法で製造する抗体は、 本発明の目的に応じて使用できるものであ れば特に制限されないが、 例を挙げると、 ヒ ト /マウスキメラ抗体、 ヒ ト化抗 体、又はヒ ト抗体などがある。 ここで、 ヒ ト化抗体（Humanized Antibody) とは、 全抗体中に数％のマウス由来抗体を含むものをいい、 ヒ ト抗体とは 100%ヒ ト 由来の抗体からなるものをいい、 キメラ · ヒ ト抗体とは、 マウス由来抗体を 10 〜20%含むものをいう。 また、 該抗体は、 ポリクローナル抗体、 又はモノクロ ーナル抗体のいずれであってもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、 次の方法で製造することができる。 まず、 前記抗体製造用組成物を非ヒ ト哺乳動物に投与する。抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ レ、。 投与は通常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行う。 該非ヒ ト哺乳動物 の例を挙げると、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラッ卜、 ヒッジ、 ャギ、 及ぴニヮトリがあり、 一般に好ましいのはマウス、 又はラットである。 前記組成物で免疫した非ヒ ト哺乳動物から抗体産生が認められた個体を選択 し、最終免疫の 2〜5日後に脾臓、又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞採取し、 同種、 又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗 体産生ハイプリ ドーマを作製する。 抗血清中の抗体価の測定は、 標識化タンパ ク質と抗血清とを反応させ、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによ り行う。 また細胞融合は、 ケーラーとミルスタインの方法 （Nature, 256, 495, 1975) などの常法で行うことができる。 融合促進剤として、 例えば、 ポリェチ レンダリコール （PEG) やセンダイウィルスなどを用いることができる。
また、 骨髄腫細胞の例を挙げると、 NS-1、 P3U1、 SP2/0、 及び AP- 1などの 非ヒ ト哺乳動物の骨髄腫細胞があり、 特に P3U1 が好ましい。 融合に用いる抗 体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20程度で あり、 PEG、 好ましくは PEG1000〜PEG6000を 10〜80%度の濃度で添加し、 20 〜40°C、 好ましくは 30〜37°Cで 1〜10分間インキュベートすることにより細胞 融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングは、 種々の方法で 行うことができる。例えば、抗原を直接、又は担体とともに吸着させた固相 （例 えば、 マイクロプレート） と、 ハイプリ ドーマ培養上清を接触させ、 次に放射 性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体を含む溶液を接触させ、 固 相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体など を吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を接触させ、 次いで放射性物質や 酵素などで標識したタンパク質の溶液と接触させ、 固相に結合したモノクロ一 ナル抗体を検出する方法などがある。
モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマの選別は常法で行うことがで きる。 例えば、 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン) を添加し た動物細胞用培地に、 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地、 1〜10%の 牛胎児血清を含む GIT培地 （和光純薬工業 （株)）、 又はハイプリ ドーマ培養用 無血清培地 （SFM-101、 日水製薬 （株）） などを用いることができる。 培養温度 は 20〜40°C、 培養時間は、 通常 5 日〜 3週間で、 培養は、 通常 5%炭酸ガス存 在下で行う。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の 測定と同様にして測定できる。
また、 得られたモノクローナル抗体の分離精製は、 塩析法、 アルコール沈殿 法、 等電点沈殿法、 及び電気泳動法などの免疫グロプリンの分離精製法、 ィォ ン交換体 （DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相、 又 はプロティン A活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を 得る特異的精製法などの常法で行うことができる。 また、本発明のポリクローナル抗体は、免疫抗原である前記ポリぺプチド等、 又は該そのペプチド断片とキャリアータンパク質との複合体で、 非ヒ ト哺乳動 物を免疫し、 その後、 血清などの抗体含有成分を採取して、 抗体の分離精製を 行うことにより製造することができる。
該免疫抗原とキャリアータンパク質との混合比は、 キャリアーに架橋させて 免疫したハプテンに対して抗体が効率よく産生されるように決定する。例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプ テン 1に対し、 約 0.1〜20、 好ましくは約 1〜5の割合で用いることができる。 また、 ハプテンとキヤリァ一の力ップリングには、 グルタルアルデヒ ドやカル ポジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有 する活性エステル試薬等を用いることができる。
該複合体抗原は、 単独で、 又は担体、 希釈剤、 さらに抗体産生能を高めるた め、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントとともに投 与してもよい。 投与は、 通常約 2〜6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜10回行う。 該ポ リクローナル抗体は、 免疫された哺乳動物の血液、 腹水、 卵黄などから採取す る。 抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測 定と同様にして測定できる。 また、 ポリクローナル抗体の分離精製は、 前記モ ノクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。
本発明のガン診断用キットは、 このようにして得られたポリクローナル、 又 はモノクローナル抗体を含む。 また、 該診断用キットは、 必要に応じて、 免疫 反応用ゥ ル、 染色剤、 検出用の酵素標識抗体、 洗浄液、 抗体希釈液、 検体希 釈液、 酵素基質、 酵素基質液希釈液、 その他の試薬を含むものである。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、 oxl遺伝子にコードされている特異的タ ンパク質の発現を抑制するものであるから、 ガン化の予防、 進行遅延、 及び治 療に使用することができる。
該抗体は、 経口的に、 又は非経口的に投与することができ、 さらに該非経口 的投与は、 組織への局所的な投与を含む。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、 汎用されている担体などの製剤用 成分、 例えば、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 崩壊剤、 崩壊抑制剤、 緩衝剤、 等張 化剤、 乳化剤、 分散剤、安定化剤、 コーティング剤、 界面活性剤、 吸収促進剤、 保湿剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢剤及び賦形剤などを用いることができる。 また、 必要に応じて着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤などの添加剤を用いても よい。
製薬用成分の具体的な例を挙げると、 乳糖、 白糖、 塩化ナトリウム、 プドウ 糖、 尿素、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオリン、 結晶セルロース、 ケィ酸な どの賦形剤、 水、 エタノール、 単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチ ン溶液、 カノレボキシメチノレセノレロース、 セラック、 メチルセルロース、 リン酸 カリ ウム、 ポリ ビュルピロリ ドンなどの結合剤、 乾燥デンプン、 アルギン酸ナ トリゥム、カンテン末、 ラミナラン末、炭酸水素ナトリゥム、炭酸カルシウム、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、 ラウリル硫酸ナトリ ウム、 ス テアリン酸モノグリセリ ド、 デンプン、 乳糖などの崩壌剤、 白糖、 ステアリン 酸、 カカオバター、 水素添加油などの崩壊抑制剤、 第 4級アンモニゥム塩、 ラ ゥリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、 デンプン、 乳糖、 カオリン、 ベントナイト、 コロイ ド状ケィ酸等の吸着剤、 精 製タルク、 ステアリン酸塩等の滑沢剤などである。 さらに必要に応じて、 上記 の各剤形について公知のドラッグデリバリーシステムの技術を採用し徐放化、 局所適用化 （トロー'チ、 バッカル剤、 舌下錠等）、 薬物放出制御、 腸溶性化、 胃 溶性化などを施すことができる。
また、 非経口投与する場合、 点滴、 静脈注射、 皮下注射、 筋肉注射などの注 射による投与、 油脂製坐剤、 水溶性坐剤、 座剤による直腸投与などの形態とす ることができる。 該調剤は、 製薬分野における通常の担体を用い、 常法により 容易に行うことができる。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、 例えば、 ヒ ト、 その他の哺乳動物 （例え ば、 ラット、 マウス、 モノレモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、サルなど） に対して投与することができる。 その投与量は、対象の状態、 投与ルートなどにより適宜変わるが、 例えば、 経口投与する場合、 一般的に、 体重 60kgの成人患者においては、 一日にっき約 10〜4000mg、 好ましくは約 20 〜2000mg、より好ましくは約 50〜500mg投与する。非経口的に投与する場合は、 該 siRNA の 1回投与量は投与対象、 肝臓ガンの状況などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で体重 60kg の成人患者においては、 一日につき約 10〜 2000mg程度、好ましくは約 20〜1000mg程度、 より好ましくは約 50〜500mg程 度を静脈から投与するのが好ましい。
また、 本発明の抗体を、 生物試料と接触させることを含む、 免疫化学的測定 法によって、 生体組織や体液中の Noxl 遺伝子の検出 ·定量を行い、 ガンを診 断することができる。
この免疫化学的測定法を行う場合、 本発明の抗体を担体に保持する。 該測定 方法で用いる担体の例を挙げると、 ァガロースゲル （セファロース 4B、 及びセ ファロース 6B (フアルマシア · ファインケミカル社））、 デキストランゲル （セ フアデックス G-75、 セフアデックス G-100、 及びセフアデックス G-200 (ファ ルマシァ 'ファインケミカル社））、ポリアク リルァミ ドゲル（バイオゲル P-30、 バイオゲル P-60、及びバイオゲル P-100 (バイオラッド'ラボラトリーズ社））、 セルロース粒子 （アビセル （旭化成）） などのゲル粒子、 ジェチルアミノエチル セノレロース、 カノレボキシメチゾレセルロースなどのィオン交換セノレロース、 ガラ ス、 シリコン片、 ステンレス系樹脂などの物質的吸着剤、 ィムノアッセィ用プ レート （ヌンク社）、 弱塩基性陰イオン交換樹脂 （アンバーライ ト IR-4B、 ダウ エックス 3 (ダウケミカル社）) などがある。
担体に抗体を保持させるには、 ブロムシアン法、 及びダルタルアルデヒド法 などの常法による行うことができる。 また、 より簡便な方法として物理的に抗 体表面に吸着させてもよい。標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、 放射性同位元素、 酵素、 螢光物質、 発光物質などが挙げられるが、 酵素を用い るのが好ましい。
該酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルォキシダーゼ、 ァノレカリホスファターゼ、 j8 -D-ガラクトシダーゼ、 グノレコースォキシダーゼを 用いることができ、 特にペルォキシダーゼが好ましい。
本発明の免疫化学的測定系における被検試料としては、 尿、 血清、 血漿、 髄 液等の体液、 又は、 動物細胞やその培養上清がある。 本発明の免疫化学的測定 方法を行う場合、 担体に保持された抗体に、 測定すべき Noxl ポリペプチドな ど分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後、 標識剤と抗 Noxl 抗体との結 合物を加えて反応させる。 得られた反応生成物に標識剤、 例えば酵素の基質を 加え、 生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定することにより該反応生成 物の酵素活性を知ることができる。 これを既知量の標識剤、 例えば酵素の標準 溶液に対してあらかじめ行い、 Noxlポリペプチドなどとの吸光度、 又は蛍光強 度との関係を標準曲線として作成しておき、 未知量の Noxl ポリペプチドを含 む分析対象物 （被検試料） について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲 線と比較し、 分析対象物中の Noxlポリペプチド等の量を測定する。
また、 本発明は、 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片を検出することを特徴とする、 ガン診断方法を提供する。 該ポリ ヌクレオチド、 又はその断片の検出は、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR)、 又はリ アルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により常法で行うことができる。
該ポリメラーゼ連鎖反応、 又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応に おいて、 配列番号 1のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォヮ一ドプ ライマーとして、 アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いる。 該 フォワードプライマーの長さは、 特に制限する必要はないが、 通常 14〜60ベー スであり、 かつリバースプライマーの長さも特に制限する必要はないが、 通常 14〜60ベースとするのが好ましい。 また、 本発明のガン診断方法で用いるフォ ヮードプライマ一、及ぴリバースプライマーの例を挙げると下記のものがある。 フォワードプライマー 5'- GGAGCAGGAATTGGGGTCAC -3' (配列番号： 5 ) リバースプライマー 5'- TTGCTGTCCCATCCGGTGAG -3， （配列番号： 6 ) また、 前記リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う場合 に用いる、 フォワードプライマー、 リバースプライマー、 及び TaqManプロ一 ブの例を挙げると下記のものがある。 フォヮ一ドプライマ一
5 ' - CCACTGTAGGCGCCCTAAGTT -3' (配列番号： 7 ) リパースプライマー
5 ' - AAGA ATGACCGGTGC A AGGA -3 ' (配列番号： 8 ) TaqMan プローブ
5 ' - AAGGGCATCCCCCTGAGTCTTGGAA -3' (配列番号： 9 ) 本発明における、 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA、又は siRNAは、 Noxl遺伝子の発現を抑制し、 Noxl ポリペプチドの産生を低下させる。 したがって、 該 siRNA又はオリゴヌ クレオチドを用いることにより、 突然変異 Ras遺伝子に誘導される細胞のガン 化、 又はガンの進行を抑制することができるであろう。
なお、 本発明の siRNA、 又はオリゴヌクレオチドとは、 配列番号 1の連続す るヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に相補的なヌクレ ォチド、 又はオリゴヌクレオチドをいう。
本発明の siRNAは、 また、 配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオチド配列 を含むポリヌクレオチド、又はその断片に対応するものであってもよい。また、 該 siRNAの長さは、 l OObp未満、好ましくは 8〜99bp、特に好ましくは 10〜30bp である。 また、 好ましい ssiの例を挙げると下記のものがある。 ヒ ト Noxlに対する siRNA
TTGGAAA-3'
(配列番号： 1 0 ) TGGAAA-3'
(配列番号： 1 1 ) ラット Noxlに対する siRNA TTTGGAAA-3'
(配列番号： 1 2 )
TGGAAA-3'
(配列番号： 1 3 ) 5'- TTGGAAA-3*
(配列番号： 1 4 ) また、 本発明の siRNAは、 治療対象に直接投与するか、 治療対象から細胞を 取り出した後、 インフエクシヨンさせて該細胞を治療対象に戻すか、 又は発現 ベクターに組み込んだ後、 該ベクターを治療対象に投与して発現させることに より使用することができる。
したがって、 本発明では、 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレ ォチド、 又はその断片に対応する、 siRNA；又は配列番号 1の 71位〜 1615位の ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA を含む、 ガン治療用医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、 先に記載した抗体を含む医薬組成物と同じく、 従来使用さ れている医薬用の材料を使用し、 かつ常法で製剤することができる。 また、 本 発明の siRNAを含む医薬組成物は、例えば、 ヒ ト、その他の哺乳動物（例えば、 ラット、 マウス、 モノレモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィ ヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 その投与量は、 対象の状態、 投与ルートなどにより適宜変わるが、 例えば、 経口投与する場合、 一般的に、 体重 60kgの成人患者においては、 一日につき約 10〜4000mg、 好ましくは約 20
〜2000mg、より好ましくは約 50〜500mg投与する。非経口的に投与する場合は、 該 siRNA の 1回投与量は投与対象、 対象ガンの状況などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で体重 60kg の成人患者においては、 一日につき約 10〜
2000mg程度、好ましくは約 20〜1000mg程度、 より好ましくは約 50〜500mg程 度を静脈から投与するのが好ましい。
また、 本発明は、 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA ;又は配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオ チド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNAによって 形質転換された細胞を含む、 ガン治療用医薬組成物を提供する。
ここで該形質転換される細胞は、 第三者から提供を受けた細胞であっても、 治療対象の患者から取り出された細胞であってもよい。 また、 該形質転換した 細胞をガン治療用細胞として使用することができる。
また、 本発明は、 配列番号 1のヌクレオチド配列の部分配列、 又は該部分配 列の少なくとも 1塩基が付加、 欠失、 又は置換された変異ヌクレオチド配列か らなり、 かつ、 ヒ ト細胞の Noxlポリペプチドの発現を抑制する RNA分子を提 供する。 該 RNA分子 （siRNA) は、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷、 494頁、 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列をもとに設計することが できる。
なお、 本発明の RNA分子を In vivo又は In vitroで使用する場合、 該 RNA分 子とその相補的 RNAからなる 2本鎖 RNA分子とする。この場合、該ニ本鎖 RNA 分子が細胞内で分解しないよう、 又は一本鎖に解離しないよう処理するのが好 ましい。 例えば、 該 RNA分子の 3'-末端に水酸基付加する、 二本鎖の両末端を チォホスホリル基によって化学結合させる、 又各鎖の間に紫外線、 ビス （2-ク 口ロメチル） ァミン、 4-チォゥラシル、 ソラレンなどの二官能基により化学結 合を誘導するなどの方法で処理することである。本発明の該 RNA分子は、突然 変異 Ras遺伝子による形質転換に伴う Noxl遺伝子の発現を抑制するものであ るから、 細胞のガン化防止、 ガンの進行抑制、 治療用の医薬組成物として使用 することができる。
また、本発明は、 Noxl遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリー ニング方法を提供する。 該スタリ一ユング方法において、 突然変異 Ras遺伝子 を有する細胞や、 Noxl遺伝子でトランスフエクションした正常細胞を、 スクリ 一二ング対象物質と接触させた後、 Noxl遺伝子の発現とその酵素活性の不活化 を検出する。 次に、 該形質転換細胞を、 スクリーニング対象物質とともに培養 して増殖抑制能を調べる。
また、 スクリーニング対象化合物による Noxl 遺伝子発現への影響は、 リア ルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応による mRNA発現増減の検出、抗体によ る Noxl 遺伝子にコードされたポリペプチド、 又はそのペプチド断片の検出、 又はその形質転換細胞の形態変化を観察することで行うことができる。
該スクリ一ユング方法で使用する、 突然変異 Ras遺伝子を有する細胞は特に 制限されないが、 例えば、 H-Ras-NIH3T3 細胞、 K-Ras-NRK細胞、 又は膝臓癌 細胞などを使用することができる。 また、 Noxl遺伝子の導入に用いるベクター として、 例えば、 pEGFP-Cl (コントロール）、 pEGFP-Cl-Noxlなどを用いるこ とができ、 さらに、 siRNAを発現させるベクターとして、 例えば pSilencerを用 いることができる。
なお、 NIH3T3細胞、 又は NRK細胞に pEGF-Cl-Noxlベクターをリボフェク タミン法を用いて持続的にトランスフヱクトして、 Noxlを高発現する細胞株を 樹立することができる。 あるいは、 突然変異 Ras遺伝子を有する塍臓癌細胞を 利用することもできる。 該膝臓癌細胞は、 ヒ ト膝臓癌患者より、 分離 *榭立し たものを用いるのが好ましい。 これらの細胞を、 C02 5 %の存在下、 標準培養 液 （Dulbeco's modified Eagle medium (DMEM)、 牛胎仔血清 （FBS) 10%含有） 中で培養する。 スクリーニングは、 マルチプレート （96穴、 48穴） に細胞を培 養して、スクリーニング対象物質を加え、大量、迅速に処理することができる。
(実施例 1 )
突然変異 Ras遺伝子による Noxl遺伝子の発現上昇の確認
本発明者らは、 NIH3T3細胞における Noxl遺伝子の過剰発現が、 スーパーォ キシドの生成と細胞増殖を上昇させることから （1及び 2)、 Noxlが特定のがん 遺伝子の形質発現と関連すると考えた。 そこで、 K-Ras Vall2ガン遺伝子で形質 転換した細胞を用いて、 Rasガン遺伝子による Noxl遺伝子発現の上昇を確認し た。
まず、 ラット腎臓細胞 （NRK) 及ぴ K-Ras-NRK細胞 （Kirstein murine sarcoma virus transformed NRK cells) を準備した。 なお、 K-Ras-NRKは、 ATCCから購入 した。
まず、 ラット腎臓細胞 （NRK) 及ぴ K-Ras-NRK細胞における Noxlの発現の 有無を、 リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出した。 該リアル タイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応では、 配列番号 1 5のフォヮ一ドプライマ 一、及び配列番号 1 6のリパースプライマー、及び配列番号 1 7の TaqManMGB プローブを使用した。 フォヮ一ドプライマ一：
5'- GGTCACTCCCTTTGCTTCCA -3 ' (配歹 ij番号： 1 5 ) リバースプライマー：
5'- GGCAAAGGCACCTGTCTCTCT -3' (配列番号： 1 6 ) TaqManMGB プローブ：
5'- TCCAGTAGAAATAGATCTTT -3' (配列番号： 1 7 ) なお、 該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、 ABI Prism 7700 (ァプ ライ ド 'バイオシステムズ） を用い、 反応条件はデオフオルト設定で行づた。 解析値の標準化には rRNA 18Sを用いた。
該リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子発現の解析を行つ た結果、 図 1 ( a ) のグラフに示されているように、 K-Ras ガン遺伝子で形質 転換した K-Ras-NRK細胞において、 Noxl遺伝子の発現は上昇していた。 (実施例 2 )
突然変異 Ras遺伝子による一過的トランスフエクシヨンによる Noxl遺伝子 の発現上昇の確認
突然変異 Ras遺伝子の一過性のトランスフエクションによる影響を解析する ため、 pcDNA3.1ベクター （空ベクター）、 及び pcDNA3.1担持 Ras Vall2ベクタ 一 (pcDNA3.1 carrying Ras Vail 2 vectors) を使用して、 NRK細胞に一過的にト ランスフエクシヨンし、 48 時間後、 Noxl の発現を検出するため、 実施例 1と 同じ方法でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。 その結果、 図 1 ( b )に示すように、 コントロールベクターを用いた場合の発現と比較して、 H-Ras Vail 2を一過的にトランスフエクシヨンした NRK細胞においても、 Noxl 遺伝子の発現は、 増加していた。 なお、 トランスフエクシヨンした Ras V12の 発現は、 ゥサギ抗 Ras抗体を用いるィムノブロッテイング （IB) で確認した。 なお、 該ィムノブロッテイングは、 試料細胞 1 X 105個を、 2Xサンプルパッ ファー （0.1M トリス Cl、 H 6.8、 グリセロール 20%、 SDS4%、 DTT3.1%、 BPBO.001%) で可溶化し、 該ポリペプチドを SDS ゲル電気泳動により分離し、 続いてィムノブ口ッティングにより解析した。
タンパク質をトランスファーバッファー （25mM トリス CI pH8.3、 92mMグ リシン、 メタノール 20%) 中で電気的にニトロセルロース膜に移し、 抗 -Ras抗 体 （1次抗体） と、 HRP-結合抗ゥサギ -IgG抗体に反応させ、 化学発行 （ECL) 法で検出した。
このように実施例 1及び 2の結果から、 Noxl 遺伝子発現の上昇は突然変異 Rasガン遺伝子の働きによることが示された。
なお、 無血清状態で一晩培養した NIH3T3細胞を、 血清 （30% ) 又は上皮増 殖因子 （epidermal growth factor: EGF) 50 ng/mlで促進処理を行ったのち、 リァ ルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により解析した。 その結果、 図 1 ( c )、及 ぴ（d )に示すように培養開始から 12時間以内に Noxl遺伝子の発現が 6〜20倍 に上昇した。 つまり、 Noxl遺伝子の発現は、 細胞増殖を促進する因子と関連し ており、 これは、 血小板由来増殖因子 （platelet-derived growth factor: PDGF) と アンジォテンシン II の両方がスーパーォキシド形成、 及び血管平滑筋細胞の Noxl遺伝子の発現を誘導するという報告と一致している （1、 4)。
(実施例 3 )
突然変異 Ras遺伝子による Noxl遺伝子発現を起こすシグナル経路の解析 突然変異 Ras遺伝子による Noxl遺伝子の発現上昇を起こす、 Rasシグナル経 路の下流を解析するため、 一連の実験を行った。 実施例 1および 2において、 細胞に MAPKKの阻害剤である PD98059 (PD： 20 μ Μ、 100 μ Μ) を 12時間処 理し、 K-Ras-NRK細胞における Νοχ-1の発現、 血清、 EGFによる Noxlの発現 誘導をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により解析した。
その結果、 K-Ras-NRK細胞における Nox-1の発現は PD98059により濃度依存 性に抑制された （図 l (a))。 また、 血清、 EGFによる Noxlの発現誘導もそれぞ れ PD98059 20 μ Μで抑制された （図 1 (c)及び (d))。
一方、 コントロールの実験において、 PI3キナーゼの阻害剤であるウォルトマ ニン (wortmanin: 100nM)は、 H-Ras-NIH3T3細胞における Noxl の発現上昇を阻害 しなかった （データ示さず）。 これらの結果から、 突然変異 Ras遺伝子とその増 殖因子のシグナルが、 PBKを介する経路ではなく、 Ras-MAPKK-MAPKを介し て Noxlの発現を誘導していることが示された。
(実施例 4 )
突然変異 Ras遺伝子による形質転換に対する、 Noxl遺伝子の関与
オリ ゴヌク レオチ ド 1 -S、 1 -AS をァニーリ ングさせ、 pSilencer hygro, HI -promoter (Ambion社） にサブクローユングし、 RNAi(l)とした。 同様にオリ ゴヌクレオチド 3-S、 3 -AS をアニーリングさせ、 Silencer hygro, HI -promoter (Ambion社) にサブクローニングし、 RNAi(3)とした。 さらにオリゴヌクレ才 チド 5-S、 5-ASをァニーリングさせ、 Silencer hygro, HI -promoter (Ambion社) にサブクローニングし、 RNAi(5)とした。 また、 コントロールベクターとして、 pSilencer hygro Negative Control plasmid (Ambion个土) 使用した。
RNAi(l)は、 配列番号 3の 223位から 241位を標的とする siRNAコンス トラ クシヨンである。 RNAi(3)は、配列番号 3の 578位から 596位を標的とする siRNA コンス トラタションである。 RNAi(5)は、 配列番号 3の 1224位から 1242位を標 的とする siRNAコンストラクションである。
なお、 各オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである。
1-S
5,
TAATTTTTTGGAAA-3，
(配列番号： 1 8)
1-AS：
5'-AG
ACTTCTCATAACGG-3'
(配列番号： 1 9) 3-S
CTTTTTTGGAAA-3'
(配列番号： 20)
3-AS：
GCCAAGAATCGG-3'
(配列番号： 2 1)
-S： CCTTTTTTGGAAA-3' (配列番号： 2 2 )
5-AS： TTCAAATGTCCGG-3'
(配列番号： 2 3 ) 該 RNAi(l)、 RNAi(3)、 RNAi(5)、および pSilencer hygro Negative Control plasmid 各 を、リボフエタタミン (Lipofectamine: Gibco-BRL社）を用いて、 K-Ras-NRK 細胞 1 X 106個にそれぞれトランスフエクシヨンした。 トランスフエクションし た細胞は、 選択を行うため、 ゥシ胎児血清 （FBS) 10%と HygromycinB を 400 μ g/mlとなるように加えた DMEM培地を用い、 C02 5%の湿潤環境下におい て 37°Cで 2〜3週間培養した。 培養後、 生き残ったコロニーを単離した。
RNAi(l)、 RNAi(3)、 RNAi(5)を持続的にトランスフエクトされた細胞株それぞ れ 3 クローンずつ （K-Ras-NRK/RNAi(l)-7, K-Ras-NRK/RNAi(l)-12, K-Ras- NRK/R Ai(l)-15； K-Ras-NRK/RNAi(3)- 17, K-Ras-NRK/RNAi(3)-l 9, K-Ras-NRK /RNAi(3)-96 ； K-Ras-NRK/RNAi(5)-2, -Ras-NRK/RNAi(5)-3, K-Ras-NRK /RNAi(5)-7)、 pSilencer hygro Negative Control plasmidを持続的にトランスフエク トされた細胞を 2クローン （K-Ras-NRK/neg-l、 K-Ras-NRK/neg-2) 選択した。 これらのコンス トラクションのトランスフエクションは、 M13F及び 3.0Revを プライマーとして PCRで確認しだ（図 2 )。 PCRの温度条件は、 94°C 2分、（94°C 1分、 60°C 1分、 72°C 1分) を 30サイクル、 72°C 10分、 とし、 サーマルサイク ラー装置は Takara Thermal Cycler SP (宝酒造株式会社） を用いた。 (プライマー配列）
M13F： 5'- GTTTTCCCAGTCACGAC-3' (酉己歹 IJ番号： 2 4 )
3.0Rev： 5'-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3' (配列番号： 2 5 ) 次に、 Noxl遺伝子が関与する細胞の形態の変化を比較した。 その結果、 図 3 に示すように、 RNAi(l)-(3)をトランスフエクトされた K-Ras-NRK細胞が伸張し たのに対し、 pSilencer hygro Negativeコント口ールプラスミ ドをトランスフエク トされた K-Ras-NRK細胞は、 導入前の細胞で観察されたように、形態は丸いま ま つた。
次に、 細胞の形質転換を、 足場非依存性の増殖能を見ることにより調べるた め、軟寒天培地ァッセィを行った。細胞増殖に必要な栄養素を含んだ寒天 0.53% を含むァガーロースレイヤーを直径 6cmの培養皿に入れて固め、 その上に寒天 0.3%と FBS10%を含んだ DMEM倍地に懸濁した細胞を、培養皿一枚当たりの細 胞最終濃度が 1.5 X 104個になるように重層した。次いで、 C02 5%の湿潤環境下、 37°Cで培養し、 細胞コロニーの出現を 3週間にわたり観察した。 ソフ トァガー 培養において示された細胞株の接着依存的細胞増殖を測定し、 その 3回の +/— 平均の標準誤差 （s.e.m.) を図 4に示した。 その結果、 K-Ras-NRK細胞および pSilencer hygro Negativeコント口一ノレプラスミ ド (neg-1 と neg-2) のトランスフ ェクションでは、 多くのコロニー形成が見られたが、 RNAi(l)-(5)のトランスフ ェクシヨンではコロニー形成が著明に抑制された。
さ らに、 K-Ras-NRK/neg-1 ( neg-1 )、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7 ( i(l)-7 )、 K-Ras-NRK/RNAi(3)- 19 (i(3)-19)、 及び K-Ras-NRK/i(5)-7 (i(5)-7) の各細胞を、 培養皿から 104個ずつ、 培養液に移し、 C02 5%存在下、 標準培養液 （DMEM、 FBS(10%)) 中で 6日間、 液体培養した。 次いで、 液体倍地中の細胞数を計測し て、 その増殖曲線を図 5に示した。 その結果、 K-Ras-NRK/R Ai(l)-7、 K-Ras-NR /RNAi(3 )19, 及び K-Ras-NRK/RNAi(5)-7 の各細胞は、 液体培養でも 増殖率が減少したが、 対照的に、 K-Ras-NRK/neg-1 では増殖阻害効果は確認で きなかった。
(実施例 5 )
Noxl遺伝子がコードする NADPH酸化酵素によるスーパーォキシド産生の確 本発明者らは、突然変異 Rasが誘導するスーパーォキシド産生における Noxl の役割を評価するため、 実施例 4の形質転換細胞を用いて、 スーパーォキシド の産生を NBT還元解析で測定した。本実施例では、 NBT (Nitroblue Tetrazolium) 解析に Suhらの方法を用いた（ 1 )。すなわち、 NBT 0.25%を含むハンクス（Hanks) 溶液 0.2ml に、 活性酸素を消化する酵素、 スーパーォキシドディスミユターゼ (SOD)を 40単位加えた溶液と加えない溶液を用意し、 2 X 105個の細胞を懸濁し 3 7 °Cで 8分間処理した。処理された細胞を低速度遠心で分離し、ピリジン 0.5ml を加えて可溶化し、 510nm における吸光度を測定して NBT の減少を定量した (extinction coefficient of 11,000/M/cm) 0 得られたデータは、 図 6に 3回の +/-s.e.m.で示した。
該解析の結果、 K-Ras-NRKおよび K-Ras- NRK/neg-1は、 NBTの還元を増加さ せ、 これはスーパーォキシドジスムターゼ処理により、 NRKと比較し阻害され た。 対照的に、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-19、 K-Ras-NRK /RNAi(5)-7は、 K-Rasがん遺伝子の ROS生産刺激効果を NRK細胞レベルまで 低下させ （図 6 )、 Noxl 1S 突然変異 Ras形質転換細胞における、 スーパーォ キシド生産の上昇に関与することが示された。
(実施例 6 )
RNAi( 1 )、 RNAi(3)、 RNAi(5)による、 Nox 1発現の減少の確認
本発明者らは、 RNAi(l)、 RNAi(3)、 RNAi(5)により Noxl発現が減少すること を確認するため、 次の手順で解析を行った。 すなわち、 GFP-ratNoxl の発現に おける RNAi(l)、 RNAi(3)、 RNAi(5)の阻害効果を評価するために、 GFP-ratNoxl を、 RNAi(l)-(5)それぞれとともに、 共トランスフエクシヨンし、 実施例 2と同 様にィムノブ口ッティング解析を行った。 図 7左のパネルに示されるように、 予想される GFP と ratNoxl の融合ポリペプチドが産生されたこと、 そして RNAi(l)、 RNAi(3)、 RNAi(5)の共発現は、 これらのベクターの量依存的に GFP-ratNoxl 融合蛋白質の生産を抑えることを明らかにした。 なお、 図 7左の パネルにおける GFP-Noxlの発現は、 抗 GFP抗体を用いたィムノプロッティン グにより定量的に決定したものであり、 図 7左のパネルの数字はトランスフエ クシヨンした DNAの量 （ g) を示している。 また、 RNAi(l)、 RNAi(5)は、 ど れもラットの Noxl をターゲットとしている。 図 7左のパネルと同様の手法を 用いて、 RNAi(l)、 RNAi(5)がヒ トの Noxl を抑制しない、 すなわち、 該 RNAi コンス トラクションは、 標的遺伝子に対する特異性が高いことを図 7右のパネ ノレに示す。 また、 内在性の Noxl の mRNA 発現が、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 K-Ras -NRK/RNAi(l)-12、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-19、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-96, K-Ras-NRK /RNAi(5)-2、 K-Ras-NRK/R Ai(5)-7の各細胞において、 K-Ras-NRK：、 及ぴ K-Ras -NRK/neg-1 に比べて確かに抑制されていることを、 RT-PCRによりで示した。 その結果を図 8に示す。
実施例 6で用いた PCR用プライマーの配列 フォワードプライマー： 5'-ATGGGAAACTGGCTGGTTA-3，
(配列番号： 2 6 ) リバースプライマー： 5'-TCAGAACGTTTCTTTGTTGAA-3'
(配列番号： 2 7 ) 本実施例における結果は、 細胞骨格と接着蛋白質の構成変化による形態変化 と同様に、 Noxl遺伝子の発現率の上昇と突然変異 Rasによる形質転換が関連し ていることを示している。
(実施例 7 )
siRNAにより一度抑制された Noxlを回復することによる細胞への影響 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 K-Ras-NR /RNAi(5)-7に、実施例 4と同一手法によつ て pEGFP-Cl (GFP)、 pEGFP-humanNoxl (GFP-Noxl) をそれぞれトランスフエ タトし、 実施例 6と同様の手法によりィムノブ口ッティングした (図 9 )。 実施 例 6、 図 7右のパネルで示したように、 RNAi(l)および RNAi(5)はどちらもヒ ト Noxl の発現 を抑制 し な い。 そ の た め 、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 K-Ras-NRK/RNAi(5)-7細胞に pEGFP-humanNoxlをトランスフエクトしても、こ れが siRNAによつて抑制されることはない。
図 1 0に示したように、 K-Ras-NRK/R Ai(l)-7 にコントロールベクターを入 れただけ （i(l)-7 + GFP ) では siRNA を解除できず細胞は扁平だが、 pEGFP-humanNoxl をトランスフエタトすることにより (i(l)-7 + GFP-Noxl -3 )、 形態は、 以前の K-Ras-NRK細胞に近い窮状の形態に戻った （図 1 0 )。
実施例 4と同手法による増殖曲線でも、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7 にコントロー ルべクタ一を入れたもの （GFP-59) や K-Ras-NRK/RNAi(5)-7にコント口ールべ ク タ 一 を入れた も の （ GFP-78 ) に比べ、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7 に pEGFP-humanNoxl を入れたもの （GFP-Noxl-3) や K-Ras-NRK/RNAi(5)-7 に pEGFP-humanNoxl を入れたもの （GFP-Noxl-11) では、 増殖が早くなつた （図 1 1 )。また、実施例 4と同様の軟寒天培地ァッセィでも、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7 にコントロールベクターを入れたもの （i(l)-7 + GFP-59、 i(l)-7 + GFP-60) にく らべ、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7に pEGFP-humanNoxlを入れたもの（GFP-Noxl-2、 GFP-Noxl-3)では、 もとの K-Ras-NRK細胞と同程度までコロニー形成が回復し た （図 1 2 )。
(実施例 8 )
突然変異 Rasの形質転換に対する Noxl遺伝子の発現の影響
Noxlの阻害剤であるジフエ二レンョードニゥム （Diphenylene iodonium: DPI) を用いて、 Noxl遺伝子の発現による、 突然変異 Rasによる形質転換細胞の形態 に及ぼす影響を調べた。 すなわち、 K-Ras-NRK細胞、 及び NRK細胞を、 DPI20 μ Μ又は PD98059 30 μ Μを含む培地中で、 C02 5%を含む湿潤環境下において 37°Cで一晩培養し、 形態変化を観察した。 図 1 3に細胞形態を記録した写真を 示す。
図 1 3に示すように、 K-Ras-NRK細胞を、フラボタンパク質阻害剤である DPI、 又は抗酸化剤 n-ァセチルシスティン （n-acetyl cysteine) 10mM (データ示さず） で、 ー晚処理した場合、 該細胞が一過的に平たい形態を帯び、 NRK細胞に近い 形態になった。さらに、図 1 3に示すように、 PD98059で処理された K-Ras-NRK 細胞においても、 このような形態の変化が観察された。 したがって、 Noxl遺伝 子発現の上昇が、 Ras-MAPKK-MAPK経路による突然変異 Rasの形質転換促進 に必須であることが示された。
(実施例 9 )
突然変異 Rasによる腫瘍形成に対する、 siRNAの影響
K-Ras-NRK/neg-1、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 -Ras-NRK/RNAi(l)-12、 K-Ras -NRK/RNAi(3)-19、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-96およぴ K-Ras-NRK/RNAi(5)-2を無胸 腺マウスに移植し、 腫瘍形成を観察した。 すなわち該細胞 106個を PBS 0.2ml に懸濁した後、 ヌードマウス （無胸腺： Nu/Nu) の皮下に移植した。 その後、 該 全ヌードマウスの腫瘍形成を 1 ヶ月間に渡り観察し、 かつ腫瘍の体積を測定し た。 その結果を図 1 4に示した。 図 1 4において、 黒塗りのバーは腫瘍の体積 であり、 誤差のバーは、 s.e.m.を示し、 また分数は使用した全マウスに対する、 腫瘍を許容したマウスの割合 （腫瘍 Z合計） を示している。
図 1 4に示すように、 Κ-Ras-NRK/neg-l は、 2週間以内に活発な腫瘍を形成 した。 対照的に、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-12、 -Ras-NR /RNAi(3)-19、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-96は、 腫瘍の増殖が著しく抑えられていた。 解剖により組織学的観察すると、 K-Ras-NRK/neg-1 で形成された腫瘍は、 血管 が増加していた。 これは、 Noxl遺伝子が、 血管内皮増殖因子の産生増加による 血管新生を誘導する可能性と一致している（1)。 また、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-7、 K-Ras-NRK/RNAi(l)-12、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-19、 K-Ras-NRK/RNAi(3)-96 で形 成された、 小さな腫瘍では、 大部分の細胞でネクローシスの兆候が示されてい た (データ示さず）。
これまでの実験結果から、 突然変異 Ras (ガン遺伝子） は、 分裂促進性酸化 酵素 Noxlを MAPKK-MAPK経路を介して上昇させ、 一方、 Noxl遺伝子の発現 は、 該 Rasによる細胞の形質転換、 ガン形成、 及びその進行に必須である。 す なわち、本発明者らの研究により、突然変異 Rasによる形質転換において、 Noxl ポリべプチドがレドックスシグナル分子として必須の役割を果たしているとレ、 う分子機構が明らかになつた。
Gp91phoxのホモログである Noxファミリータンパク質 Noxl〜5は、 非食食 細胞から同定され、 それぞれ様々な細胞プロセスにおいて特異的な機能を果た していると報告されている （1及ぴ 5-9)。 それらの中で、 Noxl遺伝子は増殖因 子 （1及び 4) やガン遺伝子による、 分裂促進性シグナルを仲介する、 膜貫通型 酸化酵素をコードしている点で特異である。
ROSが腫瘍の増殖促進に関係すること、及び悪性ガン細胞において ROS産生 が ROS生産酵素を誘導する可能性を考慮すると（7)、 Noxl遺伝子及びそのポリ ペプチドは、 ガン進行を抑制し、 その治療を可能にする標的分子にできると考 えられる。 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
(配列番号： 1 ) ヒ ト Noxl遺伝子から転写された mRNA又は cDNAのヌク レオチド配列を示す。
(配列番号： 2) ヒト Noxl 遺伝子にコードされたポリペプチドのアミノ酸 配列を示す。
(配列番号： 3 ) ラット Noxl遺伝子から転写された mRNA又は cDNAのヌ クレオチド配列を示す。
(配列番号： 4 ) ラット Noxl 遺伝子にコードされたポリぺプチドのァミノ 酸配列を示す。
(配列番号： 5) ヒ トガン診断方法で用いる Noxl 遺伝子に対するフォヮ一 ドプライマ一の塩基配列を示す。
(配列番号： 6) ヒ トガン診断方法で用いる Noxl 遺伝子に対するリバース プライマーの塩基配列を示す。
(配列番号： 7) ヒ トの Noxl 遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連 鎖反応により検出を行う場合に用いるフォヮ一ドプライマ一の配列を示す。
(配列番号： 8) ヒ トの Noxl 遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連 鎖反応により検出を行う場合に用いるリバースプライマーの配列を示す。
(配列番号： 9) ヒ トの Noxl 遺伝子をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連 鎖反応により検出を行う場合に用いる TaqManプローブの配列を示す。
(配列番号： 1 0) 本発明のヒト Noxl遺伝子に対する siRNAの塩基配列を 示す。
(配列番号： 1 1) 本発明のヒ ト Noxl遺伝子に対する siRNAの塩基配列を 示す。
(配列番号： 1 2) 本発明のラット Noxl遺伝子に対する siRNAの塩基配列 を示す。
(配列番号： 1 3) 本発明のラット Noxl遺伝子に対する siRNAの塩基配列 を示す。
(配列番号： 14) 本発明のラット Noxl遺伝子に対する siRNAの塩基配列 を示す。 '
(配列番号： 1 5) 実施例 1において、 Noxlの発現の有無を、 リアルタイム 定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたフォヮ一ドプライマ 一のヌクレオチド配列である。
(配列番号： 1 6 ) 実施例 1において、 Noxlの発現の有無を、 リアルタイム 定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いたリバースプライマー のヌクレオチド配列である。
(配列番号： 1 7 ) 実施例 1において、 Noxlの発現の有無を、 リアルタイム 定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出するために用いた TaqManMGBプロ一 プのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 1 8 ) 実施例 4において、 突然変異 Ras遺伝子による形質転換 に対する、 Noxl 遺伝子の関与を調べるために用いた siRNA コンス トラタショ ンを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 1 9 ) 実施例 4において、 突然変異 Ras遺伝子による形質転換 に対する、 Noxl 遺伝子の関与を調べるために用いた siRNA コンストラクショ ンを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 2 0 ) 実施例 4において、 突然変異 Ras遺伝子による形質転換 に対する、 Noxl 遺伝子の関与を調べるために用いた siRNA コンストラクショ ンを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 2 1 ) 実施例 4において、 突然変異 Ras遺伝子による形質転換 に対する、 Noxl 遺伝子の関与を調べるために用いた siRNA コンス トラタショ ンを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 2 2 ) 実施例 4において、 突然変異 Ras遺伝子による形質転換 に対する、 Noxl 遺伝子の関与を調べるために用いた siRNA コンストラクショ ンを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 2 3 ) 実施例 4において、 突然変異 Ras遺伝子による形質転換 に対する、 Noxl 遺伝子の関与を調べるために用いた siRNA コンストラクショ ンを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 2 4 ) 実施例 4における、 Noxl 遺伝子に対する siRNA のコン ストラタシヨンのトランスフエクションを確認するために用いた M13プライマ 一のヌクレオチド配列である。 (配列番号： 2 5 ) 実施例 4における、 Noxl 遺伝子に対する siRNA のコン ストラタシヨンのトランスフエクションを確認するために用いた 3.0Revプライ マーのヌクレオチド配列である。
(配列番号： 2 6 ) 実施例 6において、 Noxl発現の減少を確認するために用 いたフォヮ一ドプライマ一のヌクレオチド配列を示す。
(配列番号： 2 7 ) 実施例 6において、 Noxl発現の減少を確認するために用 いたリバースプライマーのヌクレオチド配列を示す。
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Claims

請求の範囲
I . ( 1 ) 配列番号 2のァミノ酸配列を含むポリぺプチド； （ 2 ) 配列番号 2 のアミノ酸配列から、 アミノ酸残基 1以上の置換、 欠失、 付加及び Z又は揷入 によって変異したアミノ酸配列を有し、 前記配列番号 2のアミノ酸配列を含む ポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポリペプチド；又は（3 ) ( 1 ) 又は （2 ) のポリペプチドの部分配列を有し、 前記配列番号 2のアミノ酸配列 を含むポリぺプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポリべプチド断片を含 む、 抗体製造用組成物。
2 . 該抗体が、 ヒ トガン細胞検出用抗体である請求項 1記載の該組成物。
3 . 配列番号 2のァミノ酸配列を含むポリぺプチドを含む、 請求項 1記載の 該組成物。
4 . 配列番号 2のァミノ酸配列の部分配列を有し、 前記配列番号 2のァミノ 酸配列を含むボリぺプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポリぺプチドを 含む、 請求項 1記載の該組成物。
5 . 配列番号 2のアミノ酸配列の部分配列を有し、 前記配列番号 2のァミノ 酸配列を含むポリぺプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、 ポリぺプチド断 片を含む、 請求項 1記載の該組成物。
6 . 請求項 1記載の組成物を、 哺乳類に投与することを含む、 配列番号 2の ァミノ酸配列を含むポリべプチドに特異的な抗体の製造方法。
7 . 配列番号 2のァミノ酸配列を含むポリぺプチドに特異的な抗体。
8 . 該抗体が、 ヒ ト Zマウスキメラ抗体、 ヒ ト型抗体、又はヒ ト抗体である、 請求項 7記載の該抗体。
9 . 該抗体が、 ポリクローナル抗体、 又はモノクローナル抗体である、 請求 項 7記載の該抗体。
1 0 . 請求項 7記載の抗体を、 生物試料と接触させることを含む、 ガンの診 断方法。
I I . 請求項 7記載の抗体を含む、 ガン診断用キット。
1 2 . 請求項 7記載の抗体を含む、 ガン治療用医薬組成物。
1 3 . 該抗体が、 ヒ ト/マウスキメラ抗体、 ヒ ト型抗体、 又はヒ ト抗体であ る、 請求項 1 2記載の該ガン治療用医薬組成物。
1 4 . 該抗体が、 ポリクローナル抗体、 又はモノクローナル抗体である、 請 求項 1 2記載の該ガン治療用医薬組成物。
1 5 . さらに適当なキャリアーを含む、 請求項 1 2記載の医薬組成物。
1 6 . 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断 片を検出することを特徴とする、 ガン診断方法。
1 7 . ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR)、 又はリアルタイム定量的ポリメラーゼ 連鎖反応により該ポリヌクレオチド、 又はその断片を検出する、 請求項 1 6記 載のガン診断方法。 .
1 8 . 配列番号 1のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプ ライマーとして、 配列番号 1のアンチセンス鎖断片をリバースプライマーとし て用い PCRにより検出を行う、 請求項 1 7記載のガン診断方法。
1 9 . 前記フォワードプライマーの長さが 14〜60ベースであり、 かつ前記リ バースプライマーの長さが 14〜60ベースである、請求項 1 8記載のガン診断方 法。
2 0 . 下記フォワードプライマー、 及びリバースプライマーを用いる、 請求 項 1 8記載のガン診断方法：
フォヮ一ドプライマ一 5'- GGAGCAGGAATTGGGGTCAC -3' (配列番号： 5 ) リバースプライマー 5'- TTGCTGTCCCATCCGGTGAG -3' (配列番号： 6 )。
2 1 . 配列番号 1のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプ ライマーとして、 配列番号 1のアンチセンス鎖断片をリバースプライマーとし て用いリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応により検出を行う、 請求項 1
7記載のガン診断方法。
2 2 . 下記フォワードプライマー、 リバ一スプライマー、 及び TaqMan プロ ーブを用いる、 請求項 2 1記載のガン診断方法：
フォワードプライマー 5 ' - CCACTGTAGGCGCCCTAAGTT -3'
(配列番号： 7 ) リバースプライマー 5 ' - AAGAATGACCGGTGCAAGGA -3'
(配列番号： 8 ) TaqMan プローブ 5 ' - AAGGGCATCCCCCTGAGTCTTGGAA -3' (配列番号： 9)。
23. 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断 片に対応する、 siRNA。
24. 配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ チド、 又はその断片に対応する、 請求項 23記載の該 siRNA。
25. ヌクレオチド配列の長さが 8〜30bpである、請求項 23記載の該 siRNA。
26. 下記配列番号 10〜14のヌクレオチド配列からなる群から選ばれた、 ヌ クレオチド配列からなる、 請求項 23記載の siRNA： TTGGAAA-3'
(配列番号： 10)
TGGAAA-3'
(配列番号： 1 1)
TTTGGAAA-3'
(配列番号： 12)
TGGAAA-3'
(配列番号： 1 3) 及び
TTGGAAA-3'
(配列番号： 14)。
27. 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断 片に対応する、 siRNA；及ぴ配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオチド配列を 含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA を含む、 ガン治療用 医薬組成物。
28. 配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断 片に対応する、 siRNA；及び配列番号 1の 71位〜 1615位のヌクレオチド配列を 含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNAによって形質転換さ れた細胞を含む、 ガン治療用医薬組成物。
2 9 . 該形質転換される細胞が、 治療対象の患者から取り出された細胞であ る、 請求項 2 8記載の該ガン治療用医薬組成物。
3 0 . ヒ ト細胞を準備し、 かつ配列番号 1のヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNA；又は配列番号 1の 71位〜 1615 位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 又はその断片に対応する、 siRNAによつて形質転換することを含む、 ガン治療用細胞の製造方法。
3 1 . 該ヒ ト細胞が、 治療対象の患者から取り出された細胞である、 請求項 3 0の該製造方法。
3 2 . Noxl遺伝子を標的とするガン細胞増殖抑制物質のスクリ一二ング方法 であって、 突然変異 Ras遺伝子を有する細胞を、 Noxl遺伝子でトランスフヱク シヨンし、 該形質転換細胞をスクリーユング対象物質と接触させた後、 Noxl遺 伝子の発現及び Noxl 活性の不活化を検出することを含む、 該スクリーニング 方法。
3 3 . 該形質転換細胞を、 スクリーニング対象物質とともに培養することを 含む、 請求項 3 2記載の該スクリーニング方法。
3 4 . Noxl遺伝子の発現を、 リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によ る mRNAの検出、 又は抗体による Noxl遺伝子にコードされたポリべプチド、 又はそのペプチド断片の検出により行う、 請求項 3 2記載の該スクリーユング 方法。
3 5 . Noxl遺伝子の発現を、 その形質転換細胞の形態変化を観察することに より行う、 請求項 3 2記載の該スクリーニング方法。
3 6 . 該突然変異 Ras 遺伝子を有する細胞が、 H-Ras-NIH3T3 細胞、 又は K-Ras-NR 細胞である、 請求項 3 2記載の該スクリーニング方法。
3 7 . pEGFP-Cl ( K-Ras-NRK/GFP )、 又は pEGFP-Cl-Noxl ( K-Ras- NRK/GFP-Noxl) を用いて Noxl遺伝子のトランスフヱクシヨンを行う、請求項 3 2記載の該スクリーユング方法。
3 8 . Noxl遺伝子でトランスフエクシヨンされた、 突然変異 Ras遺伝子を有 する細胞。
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