KR101143575B1 - Ｎａｄｐｈ 옥시데이즈 복합체 단백질을 유효성분으로 하는 암을 치료, 및 진단하기 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암을 치료, 및 진단하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 NADPH 옥시데이즈 복합체 계열 단백질 및/또는 다이페닐렌아이오도니움, 및/또는 그 유도체를 유효성분으로 하는 암을 치료, 및 진단하기 위한 조성물에 관한 발명이다.

Description

ＮＡＤＰＨ 옥시데이즈 복합체 단백질을 유효성분으로 하는 암을 치료, 및 진단하기 위한 조성물{A COMPOSITION FOR DIAGNOSING AND TREATING CANCER COMPRISING NADPH OXIDASE COMPLEX PROTEIN}
본 발명은 암을 치료, 및 진단하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 NADPH 옥시데이즈 복합체 계열 단백질 및/또는 다이페닐렌아이오도니움, 및/또는 그 유도체를 유효성분으로 하는 암을 치료, 및 진단하기 위한 조성물에 관한 발명이다.
악성 종양 (암)은 미국에서 심장 질환에 이어 두 번째로 높은 사망 원인이다 (문헌 [Boring et al., CA Cancer J. Clin. 43:7 (1993)]). 암은 정상적인 조직으로부터 유래된 비정상적인 세포 또는 신생물 세포 (증식하여 종양 덩어리를 형성함) 수의 증가, 이들 신생물성 종양 세포의 인접 조직으로의 침입, 및 전이라고 일컬어지는 과정에 의해 혈액 또는 림프계를 통해 결국 국부 림프절 및 원위부로 확산되는 악성 세포의 발생을 특징으로 한다. 암성 상태의 세포는 정상적인 세포라면 성장하지 못하는 조건에서도 성장한다. 암 자체는 상이한 정도의 침입성 및 공격성을 특징으로 하는 매우 다양한 형태로 나타난다.
유방암은 여성들의 생존기간 동안 약 10 %의 집단을 발병시키는 것으로 평가되기 때문에, 가장 대부분의 산업화된 나라에서 가장 일반적인 여성의 악성 종양이다. 조기의 진단 및 개선된 치료에 힘입어 이의 사망률이 이의 발생을 따라 증가하지는 않았지만, 여전히 중간 연령의 여성에서 주요한 사망 원인 주의 하나이다. 유방암의 조기 진단에도 불구하고, 새로인 진단된 유방암을 갖는 여성 중 약 1 내지 5 %가 진단 시 원격 전이를 갖는다. 또한 초기 진단된 국부 질환을 갖는 환자의 약 50 %가 결국에는 전이로 재발한다. 이들 재발 중 85 %가 질병의 초기 발현 후 최초 5년 내에 발생한다.
전이성 유방암을 갖는 대부분의 환자는 처음에는 관련된 1 또는 2개의 기관 시스템만을 갖는다. 질병이 시간을 경과하여 진행함에 따라, 다수의 부위가 일반적으로 관련된다. 실제로, 전이는 부검시 신체의 거의 모든 기관에서 발견될 수 있다.
관측되는 전이 연루물의 가장 일반적인 부위는 피부 및 가슴 벽의 연조직 및 겨드랑이의 국부적 (locoregional) 재발부, 및 쇄골위 영역이다. 원격 전이에 대한 가장 일반적인 부위는 골 (원격 전이의 30 내지 40 %), 이어서 폐 및 간이다. 전이성 유방암은 일반적으로 치료할 수 없는 질환으로 여겨진다. 그러나, 현재 이용가능한 치료적 선택은 흔히 질병이 없는 상태 및 총 생존률을 연장시키고 삶의 질의 증진시킨다. 원격 전이의 발현 후 평균 생존 기간은 약 3년이다.
비록 암 (예: 유방암)으로 이끄는 유전적 변화를 이해하는 상당한 진전이 이루어졌지만, 새로운 (de novo) 사람 암세포에대한 신뢰할만한 종양 검정이 부족하여 세포 수준에서의 이들 변이에 대한 영향을 이해할 능력이 방해되었다. 또한, 고형종양 줄기세포에 대한 확인된 암 마커의 부족으로 암 환자 (예: 유방암 환자)에 대한 진단제 및 치료제의 개발이 방해되었다.
또한 의학 문헌에 상세하게 기술된 엄청나게 다양한 암이 있다. 예를 들면, 폐, 결장, 직장, 전립선, 유방, 뇌 및 장의 암을 포함한다. 일반적 모집단이 늙고, 새로운 암이 발생하고 감수성 모집단(예를 들면, AIDS에 감염되거나 태양광에 과도하게 노출된 사람들)이 증가하므로, 암의 발생 수가 계속 오르고 있다. 따라서, 암에 걸린 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 새로운 방법과 조성물에 대한 엄청난 요구가 존재한다.
널리 알려진 암 치료는 환자 내 종양 세포를 근절하기 위하여 외과수술, 화학요법, 호르몬 요법 및/또는 방사선 요법를 포함할 수 있다(예를 들면, Stockdale, 1998, Medicine , vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12,Section IV 참조). 최근, 암 치료는 또한 생물학적 치료 또는 면역요법을 포함할 수 있다. 이러한 모든 접근법은 환자에 대해 중요한 결점이 있다. 예를 들면, 외과수술은 환자의 건강으로 인해 금기될 수 있거나, 환자에게 받아들이기 어려울 수 있다. 추가적으로, 외과수술은 종양 조직을 완전하게 제거하지 않을 수 있다. 방사선 요법는 종양 조직이 정상 조직보다 방사선에 높은 감도를 나타내는 경우에만 효과적이다. 방사선 요법는 또한 심각한 부작용을 종종 이끌어낼 수 있다. 호르몬 요법는 단일 인자로서는 드물게 주어진다. 비록 호르몬 요법가 효과적일 수 있을지라도, 그것은 다른 치료가 암 세포의 대부분을 제거한 후에 암의 재발을 예방하거나 지연시키는데 종종 사용된다. 생물학적 치료 및 면역요법은 수에 제한되고, 발진이나 부기같은 부작용, 열, 오한 및 피로를 포함하는 독감같은 증상, 소화관 문제 또는 알러지 반응을 일으킬 수 있다.
화학요법에 관하여, 암 치료에 이용될 수 있는 다양한 화학요법제들이 있다. DNA 복제 및 동시 세포분열을 막기 위해, 대다수 암 치료제들은 DNA합성을 억제함으로써, 직접 또는 간접적으로 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 전구체의 생합성을 억제함으로써 작용한다.(Gilman et al., Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics , Tenth Ed. (McGraw Hill, New York).
다양한 화학요법제가 사용될 수 있음에도 불구하고, 화학요법은 많은 결점이 있다. Stockdale, Medicine , vol. 3, Rubenstein andFederman, eds., ch. 12, sect. 10,1998. 거의 모든 화학요법제가 유독하고, 화학요법은 심각한 메스꺼움 (severe nausea), 골수기능 억제, 및 면역억제를 포함하는 중요하고 종종 위험한 부작용을 일으킨다. 또한, 심지어 화학요법제의 병용 투여로, 많은 종양 세포가 내성이거나 또는 화학요법제에 대한 내성을 발달시킨다. 사실상, 치료 프로토콜에 사용되는 특정 화학요법제에 대해 내성인 세포들은 그러한 제제가 특정 치료에서 사용되는 약물과는 다른 메카니즘에 의해 작용한다고 하더라도 종종 다른 약물에 대해서 내성인 것으로 판명된다. 이러한 현상은 다면발현성 약물 또는 멀티드럭(multidrug) 내성으로 불려 진다. 약물 내성 때문에, 많은 암들이 표준 화학요법 치료 프로토콜에
대해 난치로 판명된다.
한편 국내의 암(악성 신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명 가운데 25.5%(남자 사망자의 29.6%, 여자 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망이 사망원인의 1위를 차지하고 있다. 이는 우리나라 인구 10만 명당 약 131명이 암으로 사망한다는 것을 의미한다. 암 치료의 관점에서 보면 암환자의 사망률을 감소시키지 못하는 가장 큰 원인 중의 하나는 악성종양화 과정에서 암세포의 사멸 유도 또는 침윤과 전이를 억제하지 못함으로 인해 발생하는 것이다. 미국의 경우 최근의 통계분석 결과는 전이성 암의 경우 지난 20-30년간 5년간 생존율이 향상되지 않았음을 보여주고 있다. 따라서 미국의 경우도 암의 전이를 억제함으로써 암 치료율을 높이는 방향으로 암 치료 전략을 설정하고 있다. 그러므로 악성종양화 과정의 특징인 항암제에 대한 내성, 암세포의 침윤에 대한 분자적 기전의 이해는 암전이의 예방 및 치료제 개발에 대한 토대를 제공함으로써 궁극적으로 암환자의 생존율 향상에 크게 기여할 것으로 판단된다.
한편 Epithelial-mesenchymal transition (EMT)는 상피세포가 섬유세포 (fibroblast)와 같은 중간엽 유래 세포로 변화되는 일련의 과정을 의미한다(Kalluri, R., and Weinberg, R.A. (2009) . J. Clin. Invest. 119, 1420-1428). 이러한 EMT는 정상적인 배아 발생 단계에서 embryonic cell layer movement 그리고 organogenesis에서 관찰되지만, 1990년대에 들어서서는 EMT가 종양의 악성화와 chronic fibrosis 과정을 매개하는 병태생리적 원인으로 보고되기 시작하였다(Flanders, K.C. (2004). Int. J. Exp. Pathol. 85, 47-64). 종양의 진행과정에서 EMT는 종양의 침윤, 전이성 암세포의 intravasation과 extravasation에 특이적으로 관여하며, chronic fibrosis의 경우 세포 외 기질(extracellular matrix) 축적을 유도하는 섬유세포의 생성에 EMT가 중요한 역할을 담당하고 있다(Thiery, J.P., 등. (2009). Cell 139, 871-890;Iwatsuki, M., 등. (2009)Epithelial-mesenchymal transition in cancer development and its clinical significance. Cancer Sci. (Equb ahead of print)).
EMT 과정에서 나타나는 가장 중요한 특징(hallmark)은 상피세포들 간의 cell-cell junction (tight junction, desmosomes, adherens junction, gap junction)이 변형됨으로 인해 epithelial polarity가 파괴되고 actin cytoskeleton의 재배열이 이루어지는 것이다. 이러한 세포골격의 변화가 세포의 이동을 촉진시키고 spindle 모양의 중간엽 유래세포를 유도한다. 이러한 과정에서 상피세포의 표식 단백질들인 E-cadherin과 Zeosin의 발현은 감소하고 중간엽 유래세포의 표식 단백질인 Snail, ZEB1, 및 N-cadherin의 발현은 증가하게 된다(Evdokimova, V., 등. (2009). Cancer Cell 15, 402-415;Huber, M.A., Kraut, N., and Beug, H. (2005), Curr. Opin. Cell Biol. 17, 548-558). 따라서, 악성종양화 과정에서 나타나는 암세포의 특징 중의 하나인 EMT 현상의 분자적 수준에서의 이해는 EMT 관련 질환의 이해의 폭을 넓힘과 동시에 EMT를 인위적으로 modulation 하기 위한 타겟 발굴에 크게 기여할 수 있다.
활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 호기성 생물체 호흡의 부산물로 주로 생성되는데, superoxide anion (O2??), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl anion (?OH) 등을 포함하고 있다. 그러나 최근의 연구 결과들에 의하면 세포 내 ROS 수준이 생리적으로 매우 중요한 요소로 작용하며 많은 현상들이 ROS에 의존하는 것으로 보고되고 있다. 예를 들면 낮은 농도의 ROS는 세포성장 호르몬에 의한 세포증식 과정에 이차 전령 체로서 중요한 역할을 가지며 항산화 효소 활성을 유도한다(Wang, J. and Yi, J. (2008). Cancer Biol. Ther. 7, 1875-1884;Wu, W.S. (2006). Cancer Metastasis Rev. 25, 695-705). 암 세포의 경우, 활발한 에너지 소비로 인해 ROS의 생성 수준이 정상세포와 비교하여 높을 것으로 추정되며 이는 암 세포의 증식과 항산화 효소 활성의 유도를 통한 암 세포의 생존에 크게 기여할 것으로 예상된다. 그러나, 암 세포의 증식, 생존 및 전이과정에서 이러한 ROS의 생성 원, 역할 및 작용 기전에 대한 이해는 매우 부족한 실정이다.
Non-phagocytic 동물세포에서 활성산소종은 NADPH oxidase complex (이하, 'Nox'라 함) 의하여 낮은 농도로 생성된다. 동물세포에서 Nox family는 Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, DUOX1 및 DUOX2단백질들로 구성되어 있다(Clrkin, J.S., Naughton, R., Quiney, C., and Cotter, T.G. (2008) Cancer Letters 266, 30-36). 이러한 Nox시스템에 의해 생성되는 낮은 농도의 활성산소종은 세포내에서 second messenger로서 다양한 cellular signaling target과 cell cycle target에 작용한다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 암 진단용 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 진단용 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단용 단백질이 고정된 기질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단용 유전자가 고정된 기질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 1, NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 및 그 기능적 변이체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에 기재된 "폴리펩티드"라는 용어는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 전체 길이를 지칭한다. 바람직한 구체예로서, 용어 "폴리펩티드"는 분리된 폴리펩티드 및 재조합 방법에 의해, 예컨대 샘플로부터 분리하고 정제하는 것에 의해, 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 및 통상의 방법에 의한 단백질 합성에 의해 제조된 폴리펩티드를 포함하며, 상술한 방법은 모두 당해 분야의 업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 전체 폴리펩티드 또는 그의 일부는 메리필드(Merrifield) 수법과 같은 통상의 합성법에 의해 합성될 수 있다. 다른 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 일부는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기능적 변이체를 확인하기 위하여 암호화된 단백질 서열을 발현하도록 제조된 적합한 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있는, 항혈청 또는 특이적 모노클로날 항체를 얻는데 사용될 수 있다.
본 발명의 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 1, NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드 서열은 서열번호 19, 20 내지 21에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명의 명세서에 기재된 폴리펩티드의 "기능적 변이체"는 서열 19 내지 서열 21의 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대하여 서열 상동성, 특히 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 특히 약 90%, 특히 약 95%, 가장 바람직하게는 약 98%의 서열동일성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 기능적 변이체는 예컨대 사람 이외의 생물에서 기인한, 바람직하게는 비-인간 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 원숭이 및 돼지로부터 기인한 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대하여 상동인 폴리펩티드이다. 기능적 변이체의 다른 예는 상이한 개체, 한 생물의 상이한 기관 또는 상이한 발달 단계에 있는 유전자의 상이한 대립유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다. 기능적 변이체는 바람직하게는 또한 천연 산출 또는 합성 돌연변이, 특히 이들 서열에 의해 암호화되는 펩티드의 활성을 현저히 변화시키는 돌연변이를 포함한다. 또한, 이러한 변이체는 바람직하게는 암호화하는 유전자의 상이한 접합으로 부터 생길 수도 있다.
"기능적 변이체"는 본 발명에 따른 상응하는 폴리펩티드와 동일한 생물학적 작용을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 생물학적 작용은 기능적 에세이법으로 분석될 수 있다.후보 폴리펩티드가 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기능적 변이체인지 여부를 검사하기 위하여, 후보 폴리펩티드는 해당분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 기능적 에세이법으로 분석할 수 있으며, 이러한 에세이법은 본 발명에 따른 상응하는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 분석하는데 적합하다. 이러한 기능적 에세이법은 세포 배양계; 유전자가 결실된 마우스("녹아웃") 또는 후보 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 대한 형질전환 마우스의 생성; 효소적 에세이법 등을 포함한다. 후보 폴리펩티드가 본 발명에 따른 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 나타내거나 또는 직접적으로 방해하면, 후보 폴리펩티드는 후보 폴리펩티드가 상술한 % 서열 동일성의 수준에 대한 요건을 충족하는 한, 상응하는 폴리펩티드의 기능적 변이체이다.
또한, 용어 "기능적 변이체"는 후보 기능적 변이체 폴리펩티드가 % 서열 동일성 수준에 대한 기능적 변이체의 기준을 충족하는 한 돌연변이된 유전자로부터 또는 차등적으로 접합된 유전자로 부터 발현된 폴리펩티드를 비롯하여, 참조용 샘플 또는 참조용 라이브러리에 대한 유방암에 걸린 환자에서 차등적으로 발현되는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 발현 분석은 해당분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다.
폴리펩티드의 "기능적 변이체"는 이들이 본 발명에 따른 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는 한, 약 7 내지 약 1000개 아미노산, 바람직하게는 10개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상, 예컨대 100개 이상, 예컨대 200개 이상, 예컨대 300개 이상, 예컨대 400개 이상, 예컨대 500개 이상, 예컨대 600개 이상의 아미노산 길이를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 이들이 본 발명에 따른 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는 한, 약 1 내지 30, 바람직하게는 약 1 내지 15, 특히 약 1 내지 5개 아미노산 범위의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 결실체도 또한 포함된다. 예컨대, 첫 번째 아미노산인 메티오닌은 폴리펩티드의 기능을 현저히 변경시키지 않고도 존재하지 않을 수 있다. 또한, 변역 후 변형, 예컨대 지질 앵커 또는 포스포릴 기는 변이체에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
"서열 동일성"은 폴리펩티드를 예컨대 BLASTP 2.0.1에 의해 결정할 경우 및 핵산을 예컨대 BLASTN 2.014에 의해 결정하는 경우(이때, 필터를 설치하고 BLOSUM은 62임; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402)에서 2개 서열의 동일 정도(% 동일성)를 지칭한다.
"서열 상동성"은 BLASTP 2.0.1에 의해 결정된 2개 폴리펩티드 서열(이때, 필터를 설치하고 BLOSUM은 62임;Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402)의 유사성(% 양성)을 지칭한다.
또한 본 발명은 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 1, NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 그 기능적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에 기재된 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 1, NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열 22 내지 서열 24에 따른 유전자 및/또는 그의 변이체를 지칭한다.
용어 "코딩하는 유전자"는 본 발명에 따른 분리가능한 생활성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열 또는 그의 전구체에 관한 것이다. 폴리펩티드는 예컨대 리셉터-활성과 같은 생물학적 기능이 실질적으로 유지되는 한(기능적 변이체의 정의 참조) 코딩 서열의 전체 길이 또는 그의 일부의 서열에 의해 암호화될 수 있다.
상기 기재된 유전자의 서열에서 예컨대 유전자 암호의 축퇴로 인하여 적은 변화가 존재할 수 있거나 또는 번역되지 않은 서열이 암호화된 폴리펩티드의 활성에 큰 영향을 주지 않고도 핵산의 5' 및/또는 3' 말단에 부착될 수 있다는 것은 공지되어 있다. 따라서 본 발명은 소위 천연 산출 핵산 및 상기 기재된 핵산의 인공적으로 생성된 "변이체"도 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 유전자는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA, 특히 이중쇄 DNA 이다. 특히 본 발명에 따른 유전자는 RNA 분자, 바람직하게는 단일쇄 또는 이중쇄 RNA 분자일 수 있다. 핵산의 서열은 1 이상의 인트론 및/또는 1개의 폴리A 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자는 당해 분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 의해 제조할 수 있으며 이하에 기재되어 있다.
본 발명의 의미 내에서 "변이체"는 스트린젠트(stringent) 조건하에서 참조용 서열과 혼성화되는 DNA 서열에 상보적이고 본 발명에 따른 폴리펩티드와 유사한 활성을 갖는 모든 DNA 서열을 지칭한다. 본 발명에 따른 유전자는 안티센스 서열 형태로도 사용될 수 있다.
유전자의 "변이체"는 바람직하게는 80%, 특히 90%, 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 갖는 다른 종으로부터 얻은 상동체일 수 있다.
유전자의 "변이체"는 본 발명에 따른 상응하는 폴리펩티드와 유사한 활성을 갖는 한 약 8개 이상의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 16개 이상의 뉴클레오티드 길이, 특히 약 21개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 약 40개 이상의 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 본 발명에 따른 유전자의 일부일 수 있다. 이러한 활성은 상기에 기재한 기능적 에세이법을 이용하여 분석될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 유전자는 본 발명에 따른 유전자와 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 유전자는 본 발명에 따른 유전자의 비-기능적 돌연변이성 변이체, 또는 그의 변이체를 포함한다.
또한 본 발명은 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 1, NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드 및 그 기능적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 단백질이 부착된 암 진단용 기질을 제공한다.
또한 본 발명은 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 1, NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 그 기능적 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 유전자가 부착된 암 진단용 기질을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 기질은 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌),유리, 아파타이트(apatite), 실리콘, 금, 은 또는 금속인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 단백질 또는 유전자는 자체 공지의 방법에 의해 상기 기질에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이나 소정의 관능기를 본 발명의 단백질 또는 유전자에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 기질에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 소정의 관능기는, 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기, 알데히드기를 들 수 있다.
또한 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 다이페닐렌아이오도니움, 그 유도체, 또는 약학적으로 수용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에 기재된 "치료하는", "치료" 또는 "예방"은 치료적 처치와 예방 조치 또는 방지 조치 모두를 나타내는데, 이는 표적화된 병리학적 증상 또는 장애를 예방하거나 경감 (감소)시키는 것이 목적이다. 치료가 필요한 대상에는 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 장애가 예방되어야 하는 대상도 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 치료량의 다이페닐렌아이오도니움이 투여된 후에, 암 세포 수의 감소 또는 암세포의 부재; 종양 크기의 감소; 연부 조직 및 뼈로 암이 전이되는 것을 비롯한, 말초기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 1종 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; 이환율 및 사망률 감소; 및 삶의 질 개선 중 하나 이상이 환자에서 관찰가능하고/하거나 측정가능한 정도로 감소되거나 나타나지 않는 경우가 상기 대상체 또는 포유동물이 암에 대해 성공적으로 "치료된" 경우이다. 다이페닐렌아이오도니움 및 그 유도체는 기존 암세포의 성장을 방해하고/하거나 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도일 때 세포정지 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다. 이러한 징후 또는 증상의 감소는 환자도 느낄 수 있다.
질환의 성공적인 치료 및 호전을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 공지된 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 측정할 수 있다. 암 요법의 경우, 효능은, 예를 들어 질환 진행에 소요되는 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응률 (RR)을 측정함으로써 결정할 수 있다. 전이는 질병단계 결정 시험, 및 칼슘 수준 및 다른 효소에 대한 뼈 스캔 및 시험을 통해 측정함으로써 암이 뼈로 전이되었는지 여부를 결정할 수 있다. CT 스캔을 수행하여 골반 및 림프절 부위에 전이되었는지 여부를 알아볼 수도 있다. 흉부 X-선 및 공지된 방법에 의한 간 효소 수준의 측정을 이용하여 폐 및 간 각각에 전이되었는지 여부를 확인한다. 상기 질환을 모니터링하기 위한 다른 통상적인 방법은 경직장 초음파검사법 (TRUS) 및 경직장 침 생검법 (TRNB)을 포함한다.
"장기" 투여는 초기 치료 효과 (활성)가 연장된 기간 동안 유지되도록 단기 투여 방식과는 반대로 제제(들)을 연속적인 방식으로 투여하는 것을 나타낸다. "간헐적" 투여는 중단하지 않고 연속해서 투여하는 것이 아니라 주기적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 치료법이다.
암을 치료하거나, 암의 증상을 완화시키거나, 또는 암을 진단하기 위한 목적에 있어서, "포유동물"은 인간, 가축 및 축산용 동물, 동물원 동물, 경기용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯한 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
또한 본 발명의 다이페닐렌아이오도니움, 그 유도체, 또는 약학적으로 수용가능한 그의 염은 시스플라틴(cisplatin), 탁솔(Taxol), 탁소테레(Taxotere), 독소루비신(Doxorubicin), 에토포시드(Etoposide), 글리벡(Gleevec), 아리미덱스(Arimidex), 타목시펜(Tamoxifen), 에피루비신(Epirubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 마이토마이신-시(Mitomycin-C), 플루타미드(Flutamide), 조세레린(Gosereline), 젬시타빈(Gemcitabine), 메게스테롤 아세테이트(Megesterol acetate), 메소트렉세이트(Methotrexate), 다카바진(Dacarbazine), 암사크린(Amsacrine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 아이포스파미드(Ifosfamide), 멜파란(Melphalan), 타이오테파(Thiotepa), 카르보플라틴(Carboplatin), 클로람부시(Chlorambuci), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 빈블라스틴(Vinblastine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 나벨빈(Nabelvine), 겜자(Gemzar), 캄토벨(Camtobell), 루프론(Rufron), 유렉신(Eulexin), 조메타(Zometa), 하이캄틴(Hycamtin), 및 발스타(Valstar)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제와 병용투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
1종 이상의 추가의 치료제와의 "병용" 투여는 동시에 (함께) 투여하는 것 및 임의의 순서대로 연속적으로 투여하는 것을 포함한다.
용어 "치료적으로 유효한 양"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애의 "치료"에 효과적인 다이페닐렌아이오도니움 또는 다른 약물의 양을 나타낸다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암세포 수의 감소; 종양 크기의 감소; 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및/또는 암과 관련된 1종 이상의 징후의 어느 정도까지의 완화를 가능하게 할 수 있다. 본원의 "치료"에 대한 정의를 참조한다. 약물이 기존 암세포의 성장을 방해하고/하거나 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도일 때 세포정지 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "담체"는 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함하며, 이들은 사용되는 투여량 및 농도에서 이들에 노출된 세포 또는 포유동물에 무독성이다. 흔히, 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는 인산염, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 및/또는 트윈 (TWEEN; 등록상표), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스 (PLURONICS; 등록상표)와 같은 비이온성 계면활성제가 있다.
본 발명의 명세서에 사용된 용어 " 암 진단"이란, 이에 제한되는 것은 아니나, 양성 조직, 이전-암 조직 또는 암 조직의 존재, 암의 단계, 및 피검체의 예후 등을 포함한, 피검체에서 하나 이상의 암 샘플의 특성 확인을 의미한다. 암은, 이에 한정되는 것은 아니나, 본 명세서에 기술된 암 마커 단백질을 포함한, 하나 이상의 암 마커의 발현을 확인하는 것으로 특징지워질 수 있다.
본 발명의 명세서에 사용된 용어 "비-암 대조군에 대해 감소 또는 증가된 발현을 검출"은 비-암 샘플에서의 수준과 비교하여 유전자 발현 수준 (예: mRNA 또는 단백질의 수준)을 측정하는 것을 언급한다. 유전자 발현은, 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 기술된 것을 포함하여 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암으로 진단된 환자"는 시험되어 암세포를 갖는 것으로 밝혀진 피검체를 언급한다. 암은 이에 한정되는 것은 아니나 생검, X-선, 혈액 시험, 및 본 발명에 따른 진단 방법을 포함한 적당한 방법으로 진단될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생검 조직"은 샘플이 암 조직을 포함하는 가를 결정하기 위해 피검체로부터 떼어낸 조직의 샘플을 언급한다. 하나의 양태에서, 피검체가 암을 갖는 것으로 의심되기 때문에 생검 조직이 수득된다. 이어서, 생검 조직은 암의 존재 또는 부재에 대해 시험된다.
본 발명에 사용된 용어 "벡터"는 하나의 세포로부터 또 다른 세포로 DNA 절편을 전달하는 핵산 분자에 대해 사용된다. 용어 "비히클"이 때때로 "벡터"와 상호교환적으로 사용된다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파아지 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래된다.
본 발명에 사용된 용어 "발현 벡터"는 목적하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적합한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA를 언급한다. 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 일반적으로, 다른 서열과 함께, 프로모터, 오퍼레이터 (임의), 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것으로 공지되어 있다.
용어 "과발현" 및 "과발현하는" 및 문법적 등가물은 대조군 비-유전자이식 동물에서의 지정 조직에서 관측되는 것에 비해 약 1.5배 이상 (또는 초과)의 발현 수준을 나타내기 위해 mRNA의 수준에 대해 사용된다. mRNA 수준은, 이에 한정되는 것은 아니나, 노던 블롯 분석을 포함한 당업자에게 공지된 많은 기술을 이용하여 측정된다. 적합한 대조군은 분석되는 각각의 조직으로부터 로딩된 RNA의 양의 차이에 대한 대조군으로 노던 블롯에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "시험관 내(in vitro)"는 인위적 환경 및 인위적 환경에서 발생하는 과정 또는 반응을 언급한다. 시험관 내 환경은, 이에 한정되는 것은 아니나, 시험 튜브 및 세포 배양으로 구성될 수 있다. 용어 "생체 내(in vivo)"는 천연 환경 (예: 동물 또는 세포) 및 천연 환경에서 발생하는 과정 또는 반응을 언급한다.
본 명세서에 사용된 용어 "샘플"은 광범위한 의미로 사용된다. 하나의 의미로서, 이는 모든 공급원으로부터 수득된 피검물 또는 배양물, 및 생물학적 및 환경적 샘플을 포함함을 의미한다. 생물학적 샘플은 동물 (사람 포함)로부터 수득될 수 있으며, 유액, 고형물, 조직, 및 가스를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액 산물, 예를 들어 혈장, 혈청 등을 포함한다. 환경 샘플은 표면 물질, 토양, 물, 크리스탈 및 산업용 샘플과 같은 환경 물질을 포함한다.
본 발명의 명세서에 사용된 용어 "암" 및 "종양"은 통상적으로 비조절된 세포 성장으로 특징지워지는 포유동물에서의 병적 상태를 언급하거나 기술한다. 암의 예는, 이로 한정되는 것은 아니나, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평상피세포암, 소세포성 폐암, 비-소세포성 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암종, 복막암, 간세포암 (hepatocellular cancer), 위장암, 췌장암, 교아구종, 경부암, 난소암, 간암 (liver cancer), 방광암, 간종양 (hepatoma),유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암종 (hepatic carcinoma) 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본 발명은, 유전자 발현 측정방법을 기준으로 하여, 단백질뿐만 아니라 관련 세포의 유전자 발현 패턴을 측정하는 어떠한 방법과도 연관시켜 사용할 수 있다. 유전자 발현 프로필을 설정하기에 바람직한 방법에는 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있는 유전자에 의해 생성된 RNA의 양을 측정하는 것이 포함된다. 이는 역전사효소 PCR(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 차동 RT-PCR, 노던 블롯 분석 및 기타 관련 시험에 의해 수행된다. 개별적인 PCR 반응을 사용하는 이러한 기술을 사용할 수도 있지만, mRNA로부터 생성된 복사 DNA(cDNA) 또는 복사 RNA(cRNA)를 증폭시킨 후 마이크로어레이를 통해 분석하는 것이 가장 좋다. 다수의 상이한 마이크로어레이 형태 및 이의 제조방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본원에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,445,934호, 제5,532,128호, 제5,556,752호, 제5,242,974호, 제5,384,261호, 제5,405,783호, 제5,412,087호, 제5,424,186호, 제5,429,807호, 제5,436,327호, 제5,472,672호, 제5,527,681호, 제5,529,756호, 제5,545,531호, 제5,554,501호, 제5,561,071호, 제5,571,639호, 제5,593,839호, 제5,599,695호, 제5,624,711호, 제5,658,734호 및 제5,700,637호에 기술되어 있다.
마이크로어레이 기술은, 수 천개의 유전자의 정상 상태 mRNA 수준을 동시에 측정하여 비조절된 세포 증식의 개시, 정지 및 조절과 같은 효과를 동정하는 강력한 수단을 제공할 수 있다. 2가지의 마이크로어레이 기술이 현재 널리 사용되고 있다. 첫 번째는 cDNA 마이크로어레이이고 두 번째는 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이이다. 이러한 칩의 구조에는 차이가 있더라도 모든 하부 데이타 분석 및 출력은 본질적으로 동일하다. 이러한 분석의 결과는 전형적으로 마이크로어레이에서 공지된 위치에 있는 핵산 서열과 하이브리드된 샘플의 cDNA 서열을 검출하는데 사용되는 표지된 프로브로부터 수용된 시그날의 강도 측정치이다. 전형적으로, 시그날의 강도는 cDNA 양에 비례하므로 샘플 세포에서 발현되는 mRNA 양에 비례한다. 이러한 다수의 기술은 입수가능하며 유용하다. 유전자 발현을 측정하기 위한 바람직한 방법은, 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제6,271,002호(Linsley 등), 제6,218,122호(Friend 등), 제6,218,114호(Peck 등) 및 제6,004,755호(Wang 등)에서 찾아볼 수 있다.
발현 수준의 분석은 상기한 강도를 비교하여 수행한다. 시험 샘플 중 유전자의 발현 강도 대 대조 샘플 중 유전자의 발현 강도의 비율 매트릭스를 산출하여 수행하는 것이 가장 좋다. 예를 들어, 질환이 있는 조직의 유전자 발현 강도를,동일 유형의 정상 조직으로부터 생성된 발현 강도와 비교할 수 있다(예: 질환이 있는 결장 조직 샘플과 정상 결장 조직 샘플). 이러한 발현 강도의 비율은 시험 샘플과 대조 샘플의 유전자 발현의 배수 변화(fold change)로 나타난다.
비정상 세포에는 상향 조절 또는 하향 조절과 같이 특이적으로 발현되는 조절된 유전자가 있다. 상향 조절 및 하향 조절은 검출가능한 차이가 동일한 기준에 비해 유전자의 발현량으로 (이를 측정하는데 사용되는 시스템의 잡음 기여도를 능가하여) 발견되는 것을 의미하는 상대적인 용어이다. 이러한 경우에, 기준은 정상 세포의 유전자 발현 측정치이다. 따라서, 비정상 세포의 문제의 유전자는 동일한 측정 방법을 사용한 기준 수준에 비해 상향 또는 하향 조절된다.
바람직하게는 상향 및 하향 조절 수준은, 하이브리드된 마이크로어레이 프로브의 강도 측정치의 배수 변화를 기준으로 하여 구별한다. 예를 들어, 이러한 구별에 1.5배 이상의 차이가 사용되는 경우, 질환이 있는 세포는 정상 세포에 비해 1.5배이상 또는 1.5배 미만의 강도가 나타난다는 것을 알 수 있다.
이를 구별하는데는 또 다른 방법이 유용하다. 예를 들어, 통계적 시험법을 사용하여 다양한 샘플 그룹간에 가장 유의적으로 상이한 유전자를 찾을 수 있다. 예를 들어, 스튜던트 t-시험(Student t-test)는 두 그룹간 중요한 차이를 발견하는데 사용할 수 있는 확고한 통계법이다. p 값이 작을수록 그 유전자가 상이한 그룹간에서 차이가 난다는 보다 강력한 증거가 된다. 그럼에도 불구하고 마이크로어레이는 동시에 하나 이상의 유전자를 측정하기 때문에, 수 만개의 통계적 시험법이 한번에 요구될 수도 있다. 이러한 이유로, 무작위/치환 실험뿐만 아니라 시닥 보정법(Sidak correction)을 사용하여 변화시키고 조정하여 작은 p 값을 수득하는 것이 가능하다.
본 발명에서는 부분적으로는 다이페닐렌아이오도니움, 그 유도체, 또는 약학적으로 수용가능한 그의 염을 포함하는 경구 투약용 조성물의 투약 요법에 기반을 둔다. 또한, 부분적으로 본 발명의 상기 다이페닐렌아이오도니움, 그 유도체, 또는 약학적으로 수용가능한 그의 염의 특정 암에 대한 치료 효능에 기반을 둔다.
본 발명은 포유류의 종양을 치료하는 방법을 포함하는데, 이는 치료학적 유효량의 다이페닐렌아이오도니움, 그 유도체, 또는 약학적으로 수용가능한 그의 염을 그 자체로 상기 포유류에 투약하는 것과 관련이 있으며, 또는 1종 이상의 치료제와 결합하여 이러한 치료가 필요한 포유류에 투약하는 것과 관련이 있다.
본 발명의 명세서에서 "유도체"라는 용어는 최광의 의미로서, 어떤 유기화합물을 모체로 하여 생각하였을 때 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등등 모체의 구조와 성질을 대폭 변하지 않는 한도에서 변한 화합물을 말한다. 따라서 본 발명은 특정 암의 예방 및/또는 치료와 관련하여 다이페닐렌아이오도니움 화합물과 유사한 활성을 가지는 다이페닐렌아이오도니움 화합물을 모체로 한 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등으로 당업자로부터 용이하게 인식되어지는 유도체 모두를 포함하는 것으로, 그 구체적인 예로는 Dibenziodium, chloride (= Diphenylenpropodium iodide); Dibenziodium, sulfate; Dibenziodolium, 3-chloro-, butanoate; Dibenziodolium, 3-chloro-, carbonate; Dibenziodolium, 3-chloro-, 2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylate(3-); Dibenziodolium, 3-chloro-, cyclopropanecarboxylate;Dibenziodolium, 3-chloro-, hydroxide; Dibenziodolium, 3-chloro-, 2-hydroxyethanesulfonate; Dibenziodolium, 2-chloro-, malonate (7Cl);Dibenziodolium, 3-chloro-, methanesulfonate;Dibenziodolium, 3-chloro-, propanoate; Dibenziodolium, 3-amino-, chloride;Dibenziodolium, 1-bromo-3,7-dinitro-, chloride; Dibenziodolium, 3,7-dichloro-, chloride; Dibenziodolium, 3,7-diamino-, chloride;5H-Dibenziodole, 5-(3-chlorophenyl)- (9Cl);5H-Dibenziodole, 5-(4-chlorophenyl)- (9Cl);Phenanthro[4,5-bcd]iodolium, chloride (8Cl);Dibenziodolium, 1-iodo-, chloride; Dibenziodolium, 2-chloro-, phosphate; Dibenziodolium, salt with 2,4,5-trichlorophenol (8Cl);Dibenziodolium, 3-chloro-, sulfate;Dibenziodolium, 3,7-dichloro-, sulfate;Dibenziodolium, 2-chloro-, sulfate;Dibenziodolium, 2,4-dichloro-, sulfate; Dibenziodolium, 3,7-dinitro-, chloride;Dibenziodolium, 1-(dimethylamino)-2-naphthalenesulfonate;Dibenziodolium, salt with 4-[[(trifluoromethyl)sulfonyl]oxy]benzenesulfonic acid;Dibenziodolium-2,4,6,8-t4 (9Cl);Dibenziodolium, salt with chromic acid (H2Cr2O7)(9Cl);Dibenziodolium, (OC-6-11)-hexafluoroantimonate(1-);Dibenziodolium, salt with trifluoroacetic acid (9Cl);Dibenziodolium, salt with trifluoromethanesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, salt with 9,10-dihydro-9,10-dioxo-2-anthracenesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, salt with 9,10-dimethoxy-2-anthracenesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, O-ethyl carbonodithioate (9Cl);Dibenziodolium, salt with 1,1'-[[(methylsulfonyl)methylene]bis(sulfonyl)]bis[benzene] (9Cl);Dibenziodolium, diethylcarbamodithioate (9Cl);Dibenziodonium, 1-pyrrolidinecarbodithioate, compd. with chloromethane (9Cl);Dibenziodolium, 1-pyrrolidinecarbodithioate, compd. with trichloromethane (9Cl);Dibenziodolium, 1-pyrrolidinecarbodithioate (9Cl);5H-Dibenziodole, 5-(2-naphthylthio)- (7Cl);1,3-Cyclohexanedione, 5,5-dimethyl-, 5H-dibenziodole deriv. (7Cl);Dibenziodolium, (T-4)-tetraiodomercurate(2-) (9Cl);Dibenziodolium-131I (9Cl);Dibenziodolium, salt with 4-methylbenzenesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, hexafluoroarsenate(1-) (9Cl);Dibenziodolium, bromide;Dibenziodolium-5-125I (9Cl);Dibenziodolium, trichloromercurate(1-) (8Cl);Dibenziodolium, iodate (8Cl);Dibenziodolium, tetrafluoroborate(1-) (8Cl,9Cl);Dibenziodolium, hexafluorophosphate(1-); Dibenziodolium, citrate (8Cl);Dibenziodolium, salt with 2-hydroxyethanesulfonic acid (8Cl);Dibenziodolium, methanesulfonate (7Cl,8Cl,9Cl);Dibenziodolium, 2-hydroxyethyl sulfate (9Cl);Dibenziodolium, methyl sulfate (8Cl);Dibenziodolium, oxonium ;Dibenziodolium, cyclopropanecarboxylate (7Cl,8Cl);Dibenziodolium, butyrate (7Cl,8Cl);Dibenziodolium, propionate (7Cl,8Cl); Dibenziodolium, carbonate (8Cl,9Cl);Dibenziodolium, sulfate (8Cl,9Cl);Dibenziodolium, salt with 2,4,5-trichlorophenol (8Cl);Dibenziodolium, acetate (7Cl,8Cl);Dibenziodolium, phosphate (8Cl);Dibenziodolium, glycolate (7Cl,8Cl);Dibenziodolium, salt with 2-hydroxypropanoic acid (9Cl);Dibenziodolium, nitrate (6Cl,7Cl,8Cl,9Cl);Dibenziodolium, iodide; Dibenziodolium, fluoride
5H-Dibenziodole (8Cl,9Cl);Dibenziodolium, 3-[[2-[(2-aminoethyl)thio]acetyl]amino]-;Dibenziodolium, 3-[[2-[(2-aminoethyl)amino]acetyl]amino]-;Dibenziodolium, 3-[[2-[(2-aminoethyl)thio]acetyl]amino]-, chloride, hydrochloride ;Dibenziodolium, 3-[[2-[(2-aminoethyl)amino]acetyl]amino]-, chloride, hydrochloride;Dibenziodolium, 3-nitro-, chloride (1:1);Dibenziodolium, 3,7-dinitro-, tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)borate(1-);Dibenziodolium, 3-nitro-, tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)borate(1-) ;Dibenziodolium, 3-nitro-, tetraphenylborate(1-);Dibenziodolium, 1-(dimethylamino)-2-naphthalenesulfonate;Dinaphth[1,2-b:1',2'-d]iodolium, salt with trifluoromethanesulfonic acid ;Dinaphth[1,2-b:1',2'-d]iodolium, tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate(1-) (9Cl);Dinaphth[2,1-b:1',2'-d]iodolium (9Cl);Dibenziodolium, 3-chloro-, butanoate ;Dibenziodole, 1-methyl-, ion(1-);Dinaphth[2,3-b:2',3'-d]iodolium, 1,2,3,4,8,9,10,11-octahydro;Dibenziodolium, 1-methoxy-;Dibenziodolium, 1,9-dimethoxy;Dibenziodolium, 3-methoxy;Dibenziodolium, 1,2,3,7,8,9-hexamethoxy;Dibenziodolium, 3,7-bis(methoxycarbonyl);Dibenziodolium, 1-(1,3-dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)-;Dibenziodolium, 3,7-bis(trifluoromethyl);Dibenziodolium, 1-iodo;Dibenziodolium, 1-nitro;Dibenziodolium, 3-methyl;Dibenziodolium, 3,7-dibromo;Dibenziodolium, 3-chloro-, carbonate; Dibenziodolium, 3-chloro-, 2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylate(3-) ;Dibenziodolium, 3-chloro-, cyclopropanecarboxylate ;Dibenziodolium, 3-chloro-, hydroxide ;Dibenziodolium, 3-chloro-, 2-hydroxyethanesulfonate ;Dibenziodolium, 2-chloro-, malonate (7Cl); Dibenziodolium, 3-chloro-, methanesulfonate ;
Dibenziodolium, 3-chloro-, propanoate ;Dibenziodolium, 3,7-diiodo;Dibenziodolium, 1,2,3,4-tetramethyl;Dibenziodolium, 3,7-diamino;1,20:3,6-Dimetheno-6H,8H,20H-[1,10]dioxacycloheneicosino[5,6-c]iodolium;9,10,11,12,13,14,15,16,17,18-decahydro- (9Cl);Dibenziodolium, 2,3-dimethoxy;Dibenziodolium, 2,7-dinitro; 1,20:3,6-Dimetheno-6H,20H-[1,4,7,10,13]pentaoxacycloheneicosino[17,18-c]iodolium, 8,9,11,12,14,15,17,18-octahydro- (9Cl);Dibenziodolium, 1-phenyl;Dibenziodolium, 3,7-bis(trimethylammonio)-;Dibenziodolium, 1,4-dimethyl;Dibenziodolium, 1-bromo-3,7-dinitro;Dibenziodolium, salt with 4-[[(trifluoromethyl)sulfonyl]oxy]benzenesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, 3-amino; 1,20:3,6-Dimetheno-6H,8H,20H-[1,10]dioxacycloheneicosino[5,6-c]iodolium (9Cl);1,20:3,6-Dimetheno-6H,20H-[1,4,7,10,13]pentaoxacycloheneicosino[17,18-c]iodolium (9Cl);1,20:3,6-Dimetheno-6H,8H,20H-[1,10]dioxacycloheneicosino[5,6-c]iodolium,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18-decahydro-, iodide (9Cl);1,20:3,6-Dimetheno-6H,20H-[1,4,7,10,13]pentaoxacycloheneicosino[17,18-c]iodolium, 8,9,11,12,14,15,17,18-octahydro-, iodide (9Cl);Dibenziodolium-2,4,6,8-t4, 3-nitro- (9Cl);Dibenziodolium-2,4,6,8-t4 (9Cl);Dinaphth[1,2-b:1',2'-d]iodolium, (13bS)-, tetrafluoroborate(1-) (9Cl);Dinaphth[1,2-b:1',2'-d]iodolium, (13bS)- (9Cl);5H-Dibenziodol-5-yl, 3-(nitro-15N)- (9Cl);5H-Dibenziodol-5-yl, 3-nitro- (9Cl);Dibenziodolium, 3-nitro-, sulfate ;Dibenziodolium, 3-amino-, chloride ;Dibenziodolium, 3,3'-methylenebis-, salt with 9,10-dimethoxy-2-anthracenesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, 3,3'-methylenebis- (9Cl);Dibenziodolium, salt with chromic acid (H2Cr2O7) (9Cl);Dibenziodolium, 1-methyl-, sulfate ;Dibenziodolium, 1-methyl;Dibenziodolium, 1-methyl-, chloride ;Dibenziodolium, 3-methyl-, chloride ;Dibenziodolium, 1-bromo-3,7-dinitro-, iodide ;Dibenziodolium, 1-bromo-3,7-dinitro-, bromide ;Dibenziodolium, 1-bromo-3,7-dinitro-, chloride ;Dibenziodolium, (OC-6-11)-hexafluoroantimonate(1-) ;Dibenziodolium, salt with trifluoroacetic acid (9Cl);Dibenziodolium, salt with trifluoromethanesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, 3,7-bis(1,1-dimethylethyl)-, 1,1,1-trifluoromethanesulfonate ;Dibenziodolium, 3,7-bis(1,1-dimethylethyl)-;Dibenziodolium, 2-chloro-, tetrafluoroborate(1-) ;5H-Dibenziodole, 5-[(methylsulfonyl)bis(phenylsulfonyl)methyl]- (9Cl);Dibenziodolium, salt with 9,10-dihydro-9,10-dioxo-2-anthracenesulfonic acid (9Cl); Dibenziodolium, salt with 9,10-dimethoxy-2-anthracenesulfonic acid (9Cl);Dibenziodolium, 3,7-bis(dimethylamino)-4,6-bis(hydroxymethyl)-, inner salt;Dibenziodolium, O-ethyl carbonodithioate (9Cl);Dibenziodolium, salt with 1,1'-[[(methylsulfonyl)methylene]bis(sulfonyl)]bis[benzene] (9Cl);
Dibenziodolium, diethylcarbamodithioate (9Cl);Dinaphth[2,3-b:2',3'-d]iodolium, 1,2,3,4,8,9,10,11-octahydro-, iodide ;Dinaphth[2,3-b:2',3'-d]iodolium, iodide ;Dibenziodolium, 1,9-dimethoxy-, salt with iodonium ;Dibenziodolium, 1-methoxy-, iodide ;1-Methyldibenziodolium iodide (6Cl);Dibenziodolium, 3-methoxy-, iodide ;Dibenziodolium, 2-bromo-, iodide ;Dibenziodolium, 2,7-dinitro-, iodide ;Dibenziodolium, 3-nitro-, iodide ;Dibenziodolium, 3-nitro-, nitrate ;Dibenziodonium, 1-pyrrolidinecarbodithioate, compd. with chloromethane (9Cl);Dibenziodolium, 1-pyrrolidinecarbodithioate, compd. with trichloromethane (9Cl);Dibenziodolium, 1-pyrrolidinecarbodithioate (9Cl);5H-Dibenziodole, 5-(2-naphthylthio)- (7Cl);Dibenziodolium, 1,2,3,7,8,9-hexamethoxy-, iodide;1,3-Cyclohexanedione, 5,5-dimethyl-, 5H-dibenziodole deriv. (7Cl);Dibenziodolium, 3,7-bis(diethylamino)-, iodide ;Dibenziodolium, 3,7-bis(ethylmethylamino)-, formate를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 조성물은 정맥 투약, 피하 투약, 근육내 투약 및 경막내 투약 및 비강내 투약, 직장 투약 또는 질 투약 등의 장관외적 투약 및 경구 투약을 비롯한 어떠한 적절 투약 경로라도 본 발명에 맞추어 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 아니한다. 또한, 직접적으로 종양 내로 투약되거나, 또는 경피 패치를 통하여 투약되거나, 삽입 장치 (특히 서방성 (徐放性))를 통하여 투약된다. 상기 약학 조성물은 멸균의 생리학적으로 허용 가능한 (수성 또는 유기성) 용액, 콜로이드, 현탁액, 크림, 연고, 페이스트 (pastes), 캐플릿 (caplets), 정제 및 카세(cachets)의 형태로 사용될 수 있다. 이 경우에도 역시 서방성 또는 지연 방출성 투약형이 포함된다.
1. 약학 제형
본 발명은 다이페닐렌아이오도니움, 그 유도체를 약학적 유효량으로 포함하는 약학적 항암 조성물에 관한 것이고,1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 보조제, 부형제, 담체, 완충제, 희석제 및/또는 통상의 약학적 보조제의 제조를 위한 이것의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 제형으로 투약될 수 있다. 본 발명은 수중유(水中油) 유탁액, 마이셀 (micelles), 혼합 마이셀, 합성 막 소포체 및 방출된 적혈구를 포함하는 지질계 제형 및 거대 분자 복합물, 나노캡슐 및 마이크로스피어 또는 비즈의 형태로 된 합성 고분자 또는 천연 고분자 등의 어떠한 약학적으로 허용 가능한 제형도 포함한다. 상기 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 고분자에 더하여, 본 발명의 방법에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 제형은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체들 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 모든 용액, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제와 생리학적으로 이에 상당하는 기타의 어떠한 것이라도 포함된다. 예를 들어, 상기 담체는 혈액내로 주입하기에 적합한 것일 수 있다. 부형제는 약학적으로 허용 가능한 안정화제 및 붕괴제 (disintegrants)를 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 제형은 지질계제형을 포함한다. 알려진 어떠한 지질계 의약 전달 시스템도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일관된 캡슐화된 화합물의 방출 속도를 나타낼 수 있는 한, 다소포 리포솜 (multi-vescular liposomes; MVL), 다층판 리포솜 (다층판체 소포체 또는 MLV (multi-lamellar vesicles)로도 알려짐), 소형 단일 층판 리포솜 (소형 단일 층판 소포체 또는 SUV (small uni-lamellar vesicles)로도 알려짐) 및 대형 단일 층판 리포솜 (대형 단일 층판 소포체 또는 LUV (large uni-lamellar vesicles)로도 알려짐)을 비롯한 단일 층판 리포솜 모두가 사용될수 있다. 실시 형태의 하나로서, 상기 지질계 제형은 다소포 리포솜 시스템일 수 있다. 합성 막 소포체의 조성물은 일반적으로 인지질의 결합물, 스테로이드, 특히 콜레스테롤로 이루어진 배합물이다. 다른 인지질 또는 지질도 역시 사용될 수 있다. 합성 막 소포체 제품으로 유용한 지질의 예로서, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아미노, 스핑고지질, 세레브로시드 (cerebrosides) 및 강글리오시드(gangliosides)가 포함된다. 사용하기 좋은 인지질로서, 난(卵; egg) 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 및 디올레오일포스파티딜글리세롤이 포함된다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 상기 화합물을 포함하는 조성물은 생흡수성 기질(matrix) 내로 결합 또는 포화될 수 있다. 게다가, 상기 기질은 상기의 생체 고분자로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 적합한 생체 고분자로는 역시, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 폴리글리콜산,히알루론산, 황산 콘드로이틴, 황산데르마탄 (dermatan sulphate), 황산헤파린, 헤파린, 피브린, 셀룰로스, 젤라틴, 폴리리신 (polylysine), 에치노넥틴 (echinonectin), 엔탁틴 (entactin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 유보모룰린 (uvomorulin), 바이글리칸 (biglycan), 데코린 (decorin) 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 거대 분자가 포함된다. 이러한 거대 분자의 생체 고분자로의 제형은 관련기술 분야에 잘 알려져 있다. 실시 형태에 있어서, 상기 치료 조성물은 치료의 목적으로 인간 환자에게 투약시면역원성 (免疫原性)을 나타내지 않는 것이 좋다.
본 발명의 치료 조성물은 그 구성 성분의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 예컨대, 염산 또는 인산 등의 무기산 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등등의 유기산을 사용하여 형성되는 산 부가 염을 포함한다. 생리학적으로 견딜 수 있는 담체는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 액체 담체의 예로서, 활성 성분 및 물 이외의 물질을 전혀 포함하지 않는 멸균의 수용액 또는 생리학적 pH값으로 인산나트륨과 같은 완충제, 생리학적 식염수 또는 인산 완충 식염수와 같이 양자 모두를 포함하는 멸균의 수용액이 포함된다. 또한, 수성 담체는 2종 이상의 완충 염은 물론 염화나트륨 및 염화칼륨, 포도당, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 다른 용질의 염도 포함할 수 있다. 액체 조성물은 물 이외에 추가로 액상을 포함할 수 있다. 이러한 추가 액상의 예로서, 글리세린, 목화씨 기름과 같은 식물성 유지, 올레산에틸과 같은 유기 화합물 및 수유 (water-oil) 유탁액이 있다. 치료 조성물은
"약학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, <84> 메탄술폰산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 살리실산 등의 무기산과의 반응으로 얻은 화합물로서, 유리 염기의 생물학적 효율성 및 특성을 보유하고 있는 화합물의 염을 가리킨다. 활성 성분을 포함하는 약학 조성물은 경구용으로 적합한 제형일 수 있는데,예를 들어, 정제, 트로키, 로젠지 (lozenges), 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 유탁액, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르 (elixirs)일 수 있다. 경구용 조성물은 약학 조성물의 제조를 위하여 관련 기술 분야에 알려진 어떠한 방법에 따라서도 제조할 수 있는데, 이러한 조성물은 약학적으로 품격있고 맛좋게 제조하기 위한 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제제를 포함한다. 무독성이며 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합한 활성 성분을 포함하는 정제는 제조하기에 적합하다.
이러한 부형제는, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산나트륨 등의 불활성 희석제,옥수수 전분 또는 알긴산 등의 과립화제 및 붕괴제, 전분, 젤라틴 또는 아카시아 등의 결합제, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석 (talc) 등의 활택제일 수 있다. 정제는 코팅되지 않은 것일 수도 있으며, 위장관내에서 붕괴 및 흡수을 지연시켜 더 오랜 시간에 걸쳐 일관된 활성을 제공하기 위하여 알려진 기법을 사용하여코팅된 것일 수도 있다. 예를 들어, 모노스테아르산글리세릴 또는 디스테아르산글리세릴 등의 시간 지연 물질을 사용할 수 있다. 상기 정제는 미국 특허 번호 제4,256,108호, 제4,166,452호 및 제4,265,874호에 개시된 방출조절을 위한 삼투성 치료 정제를 형성하는 기술을 사용하여 코팅할 수도 있다. 약학 조성물은 역시 또는 선택적으로, 1종 이상의 의약을 포함할 수도 있는데, 이것은 조절제에 결합된 것일 수도 있고, 조성물 내에 유리된 것일 수도 있다. 실질적으로, 아래에 설명된 다양한 목적으로 어떠한 의약이라도 본 명세서에 설명된 조절제와 결합하여 투약될 수 있다. 조절제와 함께 투약될 수 있는 의약의 종류의 예시로서, 진통제, 마취제, 항협심증제,항진균제, 항생제, 항암제 (예컨대, 시스플라틴, 탁솔 또는 미토마이신 C), 소염제 (예컨대, 이부프로펜 및 인도메타신), 구충제, 항우울제, 해독제, 항구토제, 항히스타민제, 고혈압 치료제, 말라리아 치료제, 미세관 항생제(antimicrotubule agents) (예컨대, 콜히친 또는 빈카 알칼로이드), 편두통 치료제, 항균제, 항정신병제, 해열제, 방부제, 항신호전달제 (예컨대, 단백질 키나아제 C 억제제 또는 세포내 칼슘 이동 억제제), 항관절염제, 항트롬빈제, 결핵 치료제, 기침약, 항바이러스제, 식욕 억제제, 심장작용약, 화학의존성약 (chemical dependencydrugs), 설사제, 화학요법제, 심혈관 확장제, 뇌혈관 확장제 또는 말초 혈관 확장제, 피임제, 억제제, 이뇨제,거담제, 성장 인자, 호르몬제, 수면제, 면역 억제제, 마약 길항제, 부교감신경흥분제, 진정제, 자극제, 교감신경흥분제, 독소 (예컨대, 콜레라 독소), 진정제 및 비뇨기 감염 치료제가 포함된다.
경구용 제형은 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린 등의 불활성 고형 희석제와 혼합된 활성 성분이 포함된 경질 젤라틴 캡슐로 존재할 수도 있고, 활성 성분이 물 또는 땅콩 기름, 액체 파파핀 또는 올리브 기름 등의 유성 매질과 혼합되어 있는 연질 젤라틴 캡슐로도 역시 존재할 수 있다.
수성 현탁액은 이것의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 부형제는 현탁화제인데,예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시-프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 고무 (gum tragacanth) 및 아카시아 고무; 분산제 또는 습윤제는 천연 발생 인지질,예컨대, 레시틴, 또는 알킬렌 산화물과 지방산의 응축 산물, 예컨대, 스테아르산폴리옥시에틸렌, 또는 긴 사슬지방족 알콜과 산화에틸렌의 응축 산물, 예컨대, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 지방산 및 무수 헥시톨로부터 유도된 부분 화합물과 폴리옥시에틸렌 등과 같은 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 화합물과 산화에틸렌의 응축 산물, 예컨대, (무수 소르비톨 모노 올레산) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트이다. 수성 현탁액은 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트 등의 1종 이상의 보존제, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향미제 및 자당 (蔗糖) 또는 사카린 등의 1종 이상의 감미제도 역시 포함한다.
유성 현탁액은 활성 성분을 아라키스 (arachis) 기름, 올리브 기름, 참기름 또는 코코넛 기름 등의 식물성 유지에 현탁시키거나, 또는 액체 파라핀 등과 같은 무기 유지에 현탁시켜 형성시킬 수 있다. 유성 현탁액은 예컨대,밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜 등의 비후제 (肥厚劑)를 포함할 수 있다. 전술한 것들과 같은 감미제 및 향미제를 첨가하여 입맛에 맞는 경구용 조제약을 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여 보존할 수 있다.
물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁화제(suspending agent) 및 1종 이상의 보존제와의 혼합물의 형태로 활성 성분을 제공한다. 감미제, 향미제 및 착색제 등 예시된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제도 역시 존재할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물도 역시 수중유 유탁액의 형태일 수 있다. 유상 (油相)은 올리브 기름 또는 아라키스 기름 등의 식물성 유지, 또는 액체 파라핀 등의 무기 유지, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유탁제는 아카시아 고무 또는 트래거캔스 고무 등의 천연 발생 고무, 콩, 레시틴 등의 천연 발생적 인지질, 소르비탄 모노올리에이트 등 지방산 및 무수 헥시톨로부터 유도된 화합물 또는 부분 화합물, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 등 상기 부분 화합물과 산화에틸렌의 응축 산물일 수 있다. 유탁액은 감미제 및 향미제도 역시 포함할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 자당 등의 감미제와 함께 제조될 수 있다. 이러한 제형은 완화제, 보존제 및 향미제와 착색제도 역시 포함할 수 있다. 약학 조성물은 멸균의 주사 가능한(injectable) 수성 또는 올레산성 (oleagenous)의 현탁액 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 전술한 바 있는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 관련 기술 분야에 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.
멸균의 주사 가능한 조제형은 1,3-부탄 디올 용액과 같은 무독성이고 장관외용으로 허용 가능한 희석제 또는 용매의 멸균성 주사 가능한 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 사용할 수 있는 허용 가능한 운반체 및 용매 중에는,물, 링거 (Ringer)액 및 등장 염화나트륨 용액이 있다. 게다가, 멸균의 불휘발성 유지는 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적에 있어서, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 비롯한 어떠한 불휘발성 혼합 유지도 사용될 수 있다. 더욱이, 올레산과 같은 지방산은 주사물의 제조에 사용될 수 있다.
담체 물질과 결합하여 단일 투약형을 얻기 위한 활성 성분의 양은 구체적인 투약 방식 및 치료받을 주체에 따라 변경될 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투약하기 위한 제형은 총 조성물의 약 5%로부터 약 95%까지 변화될 수 있다. 단위 투약 제형은 일반적으로 활성 성분을 약 1 ㎎으로부터 약 500 ㎎까지 사이로 포함한다. 그러나, 임의의 환자를 위한 구체적인 투약 수준은 사용된 특정 화합물의 활성도, 나이, 체중, 평소 건강 상태, 성별, 식단, 투약 기간, 투약 경로, 분비 (excretion) 속도, 의약 조합 및 요법이 수행되는 질환의 중증도 등을 비롯한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 본 발명에 따른 화합물의 투약 유효량은 구체적인 화합물, 독성 및 억제 활성, 치료 조건 및 화합물이 단독으로 투여되었는지 아니면 다른 요법과 병행하여 투여되었는지 여부를 비롯한 인자에 좌우되어 변화될 것이다. 일반적으로는, 투약 유효량은 체중을 기준으로 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 1500 ㎎/㎏이고, 1 내지 1000 ㎎/㎏인 것이 좋으며, 약 1 내지 150 ㎎/㎏인 것이 더욱 좋고, 가장 좋은 것은 약 50 내지 100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 화합물은 예방 또는 치료를 위하여 전술한 질병에 대응하는 유효량으로 이러한 치료를 요하는 인간과 같은 온혈 동물에게 투약될 수 있으며, 이 화합물은 약학 조성물의 형태로 사용되는 것이 좋다.
약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 관련 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 경구투약, 장관외 투약, 정맥 투약, 비강내 투약 및 근육내 투약 등을 비롯한 다양한 치료 요법 및 다양한 제형에 있어서 본 명세서에 설명된 특정 조성물을 사용하는 적절한 투약 및 치료 요법의 개발도 역시 관련 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
1.1. 경구 전달
임의의 응용에 있어서, 본 명세서에 설명된 약학 조성물은 동물에게 경구 투약 방식으로 전달될 수 있다. 이러한 경우에는, 상기 조성물은 비활성의 희석제 또는 동화가능한 (assimilable) 식용 담체와 함께 제조될 수도 있고, 또는 경질 또는 연질 껍질로 된 젤라틴 캡슐에 담을 수도 있으며, 또는 정제로 압축될 수도 있고, 또는 식사 중 음식물에 함께 직접 혼합될 수도 있다.
또한, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취 가능한 정제, 구강 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽,웨이퍼 (wafers) 등의 형태로 사용할 수도 있다. 정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 이하의 것들도 역시 포함할 수 있다: 트래거캔스 고무, 아카시아,옥수수 전분 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 이인산칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕괴제; 스테아르산마그네슘과 같은 활택제 및 자당, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제가 포함될 수 있거나, 또는 페퍼민트, 노루발풀 (wintergreen) 기름 또는 체리맛과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 투약 제형이 캡슐인 경우에는, 상기 유형의 물질에 더하여 액체 담체가 포함될 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅으로서 존재할 수 있거나, 또는 단위 투약 제형의 물리적 형태를 다른 식으로 변경할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 쉘락 (shellac), 설탕 또는 양자 모두로 코팅될 수 있다.엘릭시르 시럽은 활성 화합물 자당을 감미제로서 포함하고, 메틸파라벤 및 프로필파라벤을 보존제로서 포함하며, 염료 및 체리맛 또는 오렌지맛과 같은 감미제를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투약 제형을 제조하는데 사용되는 어떠한 물질도 약학적으로 순수하고 사용된 양에 있어서 실질적으로 무독성이어야 한다. 게다가, 활성 화합물은 지연 방출 조제 및 제형으로 결합되어 사용될 수 있다.
일반적으로, 이러한 제형은 전체 제형의 중량 또는 부피에 대하여 활성 성분을 약 0.1% 이상 포함할 수 있으며,비록 활성 성분의 백분율이 당연히 변할 수 있다고 하더라도, 통상적으로는 약 1 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 이상 사이일 것이다. 일반적으로, 제조 가능한 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 양은 이 화합물의 주어진 임의의 단위 투약량 중에서 얻을 수 있는 적합한 투약량의 방식으로 정해진다. 관련 기술 분야의 당업자는 이러한 약학 제형의 제조에 있어서, 용해도, 생적합성, 생물학적 반감기, 투약 경로, 제품의 유통 기한 등 뿐만 아니라 기타 약리학적 고려 사항들과 같은 인자를 고려할 수 있으며, 다양한 투약량 및 치료 요법을 고려하는 것이 좋다.
경구 투약을 위하여, 본 발명의 조성물은 구강 세정제, 치약, 구강 정제, 경구용 분무액 또는 설하용 구강 투약 제형의 형태로 1종 이상의 부형제와 혼합된 것일 수도 있다. 예를 들어, 구강 세정제는 붕산나트륨 용액(Dobell solution)과 같은 적당한 용매 중에서 필요한 양의 활성 성분과 혼합되어 제조될 수 있다. 또한, 활성성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨 등과 같은 경구용 용액에 혼합되거나, 또는 치약 중에 분산되거나,또는 물, 결합제, 연마제, 향미제, 기포제 및 연석제(humectants)가 포함될 수 있는 조성물에 약학적 유효량으로 첨가될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 혀 밑에 위치하거나, 또는 다른 방식으로 입 속에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액의 형태로 제조될 수 있다.
1.2. 주사형 전달
어떤 경우에 있어서는, 본 발명의 약학 조성물을 장관외적, 정맥, 근육 또는 심지어 복강내 전달 방법을 사용하는 것이 좋을 수 있다. 유리 염기 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 표면 활성제와 적절하게 혼합된 수용액으로 제조될 수 있다. 분산액은 글리세롤 용액, 액체 폴리에틸렌 글리콜 용액 및 이들의 혼합 용액, 및 유지 용액으로도 역시 제조될 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건하에서, 이러한 제조 형태에는 미생물의 번식을 방지하기 위하여 보존제가 포함된다.
주사용으로 적합한 약학 제형은 멸균 수용액 또는 멸균 분산액 및 멸균의 주사 가능한 용액 또는 분산액의 임시약제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 제형은 멸균 상태이어야 하고, 용이하게 주사기로부터 방출 가능한 정도로 유동성이 있어야 한다. 또한, 제조 및 보관 조건하에서 안정하여야 하고, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존될 수 있어야 한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및/또는 식물성 유지 등을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써 유지될 수 있고, 분산액의 경우에는 필요한 입도를 유지함으로써 유지될 수 있고, 표면 활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용으로부터 보호하기 위하여 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤(parabens), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 (thimerosal) 등을 사용할 수 있다. 많은 경우에 있어서,설탕 또는 염화나트륨 등의 등장제 (isotonic agents)를 포함시키는 것이 좋을 수 있다. 조성물 중에 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴 등의 흡수 지연제를 사용함으로써 주사 가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
장관외용 투약을 위한 수용액에 있어서, 예를 들어, 필요한 경우 용액은 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 우선 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장액으로 만들어야 한다. 이러한 특수 수용액은 특히 정맥 투약, 근육내 투약, 피하 투약 및 복강내 투약에 적합하다. 이러한 관점에서, 관련 기술 분야의 당업자는 본 명세서를 참조하여 사용될 수 있는 멸균 수성 매질을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투약량을 등장 NaCl용액 1 ㎖에 용해시키고 대량 피하 주사액 (hypodermoclysis fluid) 1000 ㎖를 첨가하거나, 또는 원하는 주입부위에 주사할 수 있다. 치료 대상 환자의 조건에 따라 다소의 투약량 변화가 필요할 것이다. 어떠한 경우에도,투약 수행자는 환자에 대하여 개별적으로 적절한 투약량을 결정하여야 할 것이다. 또한, 인간에 대한 투약용 약제는 멸균성 (sterility), 발열원성 (pyrogenicity) 및 국가적 또는 지역적 생물학적 표준 관련 사무소가 요구하는 일반적인 표준 안전성 및 순도를 충족시켜야 한다.
멸균의 주사 가능한 용액은 활성 화합물의 필요량을 적합한 용매 중에서 필요시 전술한 몇 가지 기타 성분과 함께 혼합하여 제조한 다음에, 여과하여 멸균시킨다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산매질을 포함하는 멸균 운반체에 혼합시키고 전술한 것과 같은 필요한 기타 성분을 혼합시킴으로써 제조한다. 멸균 분말의 경우에 있어서, 멸균 주사 용액에 대한 바람직한 제조 방법은, 활성 성분 및 기타 원하는 추가 성분으로 된 분말을 이들의 사전 멸균 여과된 용액으로부터 얻기 위한 진공 건조법 및 동결 건조법이다.
본 명세서에 설명된 조성물은 중성 또는 염의 형태로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염(단백질의 유리 아미노기를 사용하여 형성)을 포함하며, 염산 또는 인산 등과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산을 사용하여 형성된다. 유리 카르복실기를 사용하여 형성되는 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철의 수산화물 등과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터도 역시 유도될 수 있다. 제형을 고려하여, 용액은 투약 제형에 적합한 방식으로 투약될 것이며, 치료학적 유효량에 적합한 양으로 투약될 것이다. 제형은 주사액, 의약 방출 캡슐 등을 비롯한 다양한 투약 형태로 용이하게 투약된다.
본 명세서에 있어서, "담체"는 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 운반체, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충 용액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 이러한 매질 및 제제의 약학 활성 물질로서의 용도는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 어떤 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분에 적합하지않은 경우를 제외하고는, 치료 조성물에 사용하는 것을 고려할 수 있다. 보조 활성 성분도 역시 상기 조성물에 혼합될 수 있다.
1.3. 비강 전달
어떤 실시 형태에 있어서는, 비강내 분무, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 운반체를 사용하여 약학 조성물을 전달할 수 있다. 마찬가지로, 비강내 미소입자 수지 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용하는 의약 전달도 역시 약학 기술 분야에 잘 알려져 있다.
2. 표적암
치료 대상 환자로는, 일반적으로 포유류가 포함될 것이며, 가장 바람직하기로는 인간 암환자 등의 인간 환자일것이다. 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 결합하여 사용될 수 있다. 또한, 치료 화합물은 다른 종류의 치료와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 다른 화학 요법, 예를 들어, 시스플라틴, 타목시펜 (tamoxifen),탁솔, 메토트렉세이트 (methothrexate), 항체와 같은 생체물, 성장 인자 또는 림포카인 (limpokines), 방사선 등과 함께 사용될 수 있다. 요법들을 조합하면 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 적응증은 암인 것이 좋으며, 특히 전술한 암들인 것이 좋다.
본 명세서에 의하여 제공되는 조성물 및 방법은 특히 유방, 중추 신경계, 결장, 난소, 신장, 폐, 간, 방광, 전립선, 두경부 등의 고형 종양을 포함하는 원발 및 전이성 종양에 대하여 유용한 것으로 보인다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 조성물 및 방법에 의하여 치료될 수 있는 종양으로는 이하와 같은 상피 기원성 종양을 포함하
나 이에 한정되지는 아니한다.
폐: 기관지 기원성 암종 (편평 세포 암종, 미분화 소세포 암종, 미분화 대세포 암종, 선암종(腺癌腫)), 폐포(세기관지성(細氣管支性)) 암종, 기관지 선종(腺腫), 육종, 림프종, 연골종(軟骨腫)성 과오종(過誤腫), 중피종(中皮腫);
위장: 식도 (편평 세포 암종, 선암종), 위 암종, 결장직장 암종;
비뇨 생식기 관: 신장 (선암종, Wilm 종양) [신장모세포종], 림프종, 백혈병) , 방광 및 요도 (편평 세포 암종,이행 (transitional) 세포 암종, 선암종), 전립선 (선암종, 육종), 고환 (정상피종);
간: 간암 (간세포 암종);
뼈: 골원성 육종 (골육종);
신경계: 신경모세포종, 망막모세포종, 교모세포종 (膠母細胞腫; glioblastoma), 핍지교종 (乏枝膠腫;oligodendroglioma);
부인과: 자궁경부 (자궁경부 암종, 전종양 (pre-tumour) 자궁경부 형성이상);
혈액학: 혈액 (골수성 백혈병 [급성 및 만성] , 급성 림프모세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma) [악성 림프종];
피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포종, Karposi 육종; 및
선 및 관: 선암종, 유두상 암종 및 유두상 선암종.
따라서, 본 명세서에서 "암세포"는 상기에 명시된 질환 조건 중 임의의 1종의 질환에 걸린 세포를 포함하는 용어이다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 초기 및 말기 단계의 인간 유방암 세포주를 대상으로 Nox의 발현수준을 분석하였고 발암적 EMT 및 침윤 과정에서 이들의 역할을 조사하였다. 또한 항암치료제인 cisplatin에 저항성을 갖는 이들 암세포주의 형질 획득이 특정 Nox 단백질의 활성에 기인하는지를 규명하였다. 더 나아가, Nox의 저해제인 다이페닐렌아이오도니움 (dipheneyleneiodonium)을 사용하여 암세포의 EMT 유도 및 침윤에 대한 억제효과 및 cisplatin과의 복합 조성물 구성 시 암세포 사멸에 미치는 상승효과도 동정하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
정상 유선세포 및 전이성 유방암세포에서 활성산소종 및 Nox 유전자의 발현수준 비교
활성산소종의 세포내 수준이 정상세포 및 암세포에서 차이가 있는지를 분석하였다. 도 1A에서 보듯이, 정상 유선세포 MCF10A와 비교하여 대표적인 두 전이성 유방암 세포 MDAMB-231(7.14배)과 Hs578T(13.86배)에서 활성산소종의 수준이 현저히 높게 측정되었다. 또한 Nox1, Nox4 및 Nox5의 mRNA 발현도 두 전이성 암세포에서 크게 증가되어 있음을 확인하였다 (도 1B).
전이성 유방암 세포의 활성산소종 생성원으로서 Nox 단백질의 역할 규명
전이성 유방암세포의 활성산소종 생성원을 조사하였다. 세포내의 활성산소종의 주요 생성원으로는 Mitochonria의 전자전달계로부터의 생성, Xanthine oxidase에 의한 금속이온 반응을 통한 생성과 NADPH oxidase에 의한 생성이 대표적이다.
본 발명에서는 Nox family 중 특별히 Nox1, 4 및 Nox5의 역할에 초점을 두고 분석하였다. 각각의 Nox 단백질의 역할을 규명하기 위하여 세포 내 Nox 유전자로부터 생성되는 mRNA를 분해하는 small hairpin RNA (shRNA) plasmid DNA를 제조하여 세포 내 염색체에 영구적으로 도입시킨 안정성 유전자 변형 세포주를 제조하였다. NADPH oxidase의 활성을 측정하기 위하여 superoxide의 생성을 측정하는 분석법을 적용하였다. 도 2A에서 보듯이, vector plasmid만 도입된 control 세포주와 비교하여 shRNA Nox1, shRNA Nox4, 및 shRNA Nox5 각각이 도입된 세포주에서 superoxide의 생성이 현저히 감소하였다. 이러한 감소 변화는 위의 세 가지 shRNA Nox가 모두 도입된 triple 유전자 변형 세포주에서 제일 크게 나타났다. 이러한 결과와 부합하여 NADPH oxidase 활성의 저해제인 diphenylene iodonium (DPI)를 처리한 경우, 농도 변화에 비례하여 superoxide의 생성 수준이 감소하였다 (도 2B).
전이성 암 세포주에서 Nox 단백질에 의한 E- cadherin 및 Snail1 의 발현변화
악성 종양화 초기단계에서 나타나는 암세포의 특징 중의 하나인 EMT는 종양의 침윤 및 전이과정에 필수적으로 작용한다. 따라서 이러한 EMT를 인위적으로 조절할 수 있는 타겟 조절인자의 발굴은 종양의 진행을 차단하는데 매우 중요하다. 일반적으로 전이성 암세포에서 EMT 과정에 핵심적 역할을 담당하는 상피세포 표지 단백질인 E-cadherin의 발현은 감소되어 있고 중간엽 유래세포의 표지 단백질인 Snail1의 발현은 증가되어 있다.
도 3A에서 보듯이, Nox 저해제인 DPI를 처리한 전이성 암세포의 형태가 섬유세포에서 상피세포로 현저히 회복됨을 알 수 있다. 이러한 EMT의 역 현상인 MET 과정은 동일한 DPI 처리 조건에서 E-cadherin(녹색형광)의 발현이 회복되고 Snail1 (적색형광)의 발현이 감소되는 결과를 통하여 단백질 수준에서 증명되었다 (도 3B). 더 나아가, 두 단백질의 상반된 발현변화는 mRNA 수준에서도 동일하게 일어남을 알 수 있었다 (도 3C).
DPI의 효과를 다시 한번 증명하기 위하여 Nox1, Nox4, Nox5 또는 Nox1/4/5의 발현을 억제시키는 shRNA 시스템을 세포내 염색체에 도입시킨 전이성 암세포주에서 분석하였다. mRNA 수준에서 도 3C와 동일한 결과를 얻었다 (도 3D). 이러한 발현변화의 효과는 Nox1, Nox4 및 Nox5가 모두 억제되어 있는 세포주에서 현저히 높게 나타났다.
전이성 암세포의 이동 및 침윤도에 있어서 DPI 및 shNox1 , shNox4 , shNox5 의 저해효과
EMT에 의해 유도되는 암세포의 이동 및 침윤 능력에 미치는 DPI 및 shRNA Nox1, Nox4, Nox5 또는 Nox1/4/5의 작용효과를 조사하였다.
DPI를 다양한 농도로 처리한 전이성 암세포주의 경우에 있어서 세포의 이동이 현저하게 감소됨을 확인하였다 (도 4A). 또한 Traswell migration assay를 통한 암세포의 침윤 정도를 측정한 실험에 있어서도 DPI의 저해도가 control 대비 70% 수준으로 나타나는 것을 확인하였다 (도 4B). 암세포의 침윤에 대한 DPI의 저해효과는 shRNA Nox1(저해도: 55%), shRNA Nox4(저해도: 52%), shRNA Nox5(저해도: 45%) 또는 shRNA Nox1/4/5(저해도: 78%) 전이성 암세포에서도 비교할만한 수준으로 증명되었다 (도 4C).
DPI 와 cisplatin 복합조성에 의한 전이성 암세포 사멸의 상승효과
말기 암 환자의 주된 사망 원인은 항암제와 같은 화학요법 치료제에 대한 암세포의 내성에 기인한다. 암세포의 경우, 세포 내 활성산소종 수준의 증가를 통해 항산화 시스템의 활성을 유도함으로써 자체적으로 생존성을 높이는 것으로 추측된다. 이러한 가능성은 전이성 암세포에서 Nox 단백질 발현 증가에 의한 세포내 활성산소종의 증가와 이로 인한 EMT 및 침윤의 증가 결과를 통해 높게 예상된다. 도 5A에서 보듯이, DPI 또는 cisplatin 단독으로 처리한 경우, 암세포의 사멸이 증가하지 않았다. 반면 5 μM DPI를 100 μM cisplatin과 함께 처리한 경우, 암세포의 세포사멸이 크게 증가하였다. 이러한 효과는 세포사멸의 표지 단백질로 사용되는 PARP의 cleavage 증가에서도 재확인되었다 (도 5B). 더 나아가, 사멸되는 세포의 막 지질성분에 결합하여 세포사멸의 정도를 나타내는 annexin V의 염색도 (G2 phase; late apoptosis, G4 phase: early apoptosis)도 두 물질을 복합 조성한 경우에 크게 증가하였다 (도 5C).
NOX1 , NOX4 와 NOX5 가 knock - down 된 MDA - MB231 세포의 cisplatin 내성도 감소
MDA-MB231 세포는 Cisplatin에 의해 유도되는 세포사멸에 내성을 지닌다. NOX1, NOX4, 및 NOX5의 발현을 억제시킨 MDA-MB231-shRNA NOX1/4/5 세포의 경우, MDA-MB231-pLKO.1 세포와 비교하여 cisplatin에 의한 세포 사멸 민감도가 현저히 증가하였다 (도6A 및 6B).
상기의 과제 해결수단 및 첨부된 도면 등에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 암세포의 악성 종양화와 항암제에 대한 내성 획득의 유발 인자로서 Nox 단백질의 역할을 최초로 규명하였다. 또한 암전이 및 암세포의 생존 과정에서 Nox1, Nox4, 및 Nox5의 역할에 대해서도 최초로 규명하였다. 특별히 Nox의 저해제인 diphenylene iodide (DPI)을 항암제인 cisplatin과 복합조성물을 통하여 암세포를 사멸시킬 수 있는 효과를 가진다는 것을 본 발명을 통하여 알 수 있고, 더욱 효과적인 DPI 유도체를 발굴한다면 암치료제 개발에도 크게 기여할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 정상 유선세포 MCF10A와 전이성 유방암 세포인 MDA-MB231과 Hs578T에서 활성산소종의 생성수준 (A)과 NOX1, NOX4, NOX5 및 GAPDH mRNA 발현수준(B)을 분석한 실험결과이다.
도 2는 control vector (pLKO.1), shRNA NOX1, shRNA NOX4, shRNA NOX5 또는 shRNA NOX1/NOX4/NOX5가 발현되는 전이성 암세포인 MDA-MB231에서 superoxide의 시간별 생성양과 (A) NOX 저해제인 DPI를 농도별로 처리한 MDA-MB231 세포주에서 superoxide의 생성양을 보여주는 실험결과이다.
도 3은 (A) 전이성 암세포인 MDA-MB231과 Hs578T의 형태가 NOX 저해제인 DPI(2.5 mM)를 처리한 경우(12 시간) 중간엽 유래세포에서 상피세포로 전환되는 결과를 보여 준다. 세포의 형태는 위상차 현미경을 사용하여 촬영하였다 (배율, X 200). (B) Hs578T 세포에 NOX 저해제인 DPI(2.5 mM)를 처리하여(12 시간) E-cadherin 및 Snail1의 발현변화를 공촛점 레이저 현미경을 사용하여 면역염색법으로 세포 상에서 직접 분석하였다. (C) MDA-MB231 및 Hs578T 세포를 대상으로 NOX 저해제인 DPI를 농도별로 처리하여 (12 시간) E-cadherin, Snail1, 및 GAPDH의 발현변화를 mRNA 수준에서 RT-PCR 방법으로 분석하였다. (D) Control vector (pLKO.1), shRNA NOX1, shRNA NOX4, shRNA NOX5 또는 shRNA NOX1/NOX4/NOX5가 발현되는 전이성 암세포인 MDA-MB231에서 E-cadherin, Snail1, NOX1, NOX4, NOX5 및 GAPDH의 발현변화를 mRNA 수준에서 RT-PCR 방법으로 분석하였다.
도 4는 (A) MDA-MB231 및 Hs578T 세포를 대상으로 NOX 저해제인 DPI를 농도별로 처리하여 (12 시간) 세포의 이동능력을 비교하였다. 6-well 배양접시에 세포를 100 % 분포되게 한 후, 일정 넓이로 scratching 하였다. PBS로 세척 후배양액을 교환 하였고 세포를 12 시간 배양하면서 DPI 처리에 의한 이동능력을 조사하였다. (B) 동일조건에서 Hs578T 세포의 membrane filter를 통과하는 세포의 침윤도를 분석하였다. (C) Control vector (pLKO.1), shRNA NOX1, shRNA NOX4, shRNA NOX5 또는 shRNA NOX1/NOX4/NOX5가 발현되는 전이성 암세포인 MDA-MB231 세포의 침윤도를 분석하였다. 각각의 막대형 그래프는 침윤 세포의 숫자를 나타낸다.
도 5는 (A) MDA-MB231 및 Hs578T 세포를 대상으로 NOX 저해제인 DPI (2.5 mM), cisplatin (100 mM), 또는 DPI plus cisplatin을 처리 시 세포사멸의 정도를 세포형태학적으로 조사하였다. 괴사되는 탈부착 및 원형형태의 세포를 위상차 현미경으로 촬영하였다 (x 200 배율). (B) MDA-MB231 및 Hs578T 세포를 대상으로 NOX 저해제인 DPI (2.5 mM), cisplatin (100 mM), 또는 DPI plus cisplatin을 처리한 후 (24 시간) 세포추출액을 수득하여 세포사멸의 정도를 나타내는 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 절단 정도를 Western blotting 방법으로 분석하였다. b-actin은 사용한 단백질의 전체 양이 동일함을 보여준다. (C) NOX 저해제인 DPI를 농도별로 cisplatin (100 mM)과 복합조성물을 형성하여 MDA-MB231 세포에 처리한 조건에서 세포사멸 정도를 나타내는 prodium iodide (PI, 세로 축) 및 Annexin V (가로축)의 염색정도를 Flowcytomety analysis 방법으로 조사하였다.
도 6은 sh RNA Nox 1/4/5 유전자가 도입된 MDA-MB 231 세포주에서 시스플라틴에 의한 세포사멸의 상승 효과를 나타내는 그림이다.(A)는 세포의 형태적 변화를 (B)는 FACS분석에 의한 세포사멸도를 나타낸다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에서 사용된 Diphenyl iodonium (DPI), cisplatin은 Sigma에서 구입하였다. H2DCFDA 형광 염색약은 Molecular Probe 회사에서 구입하였다. PARP와 beta-actin 항체들은 Santa Cruz Biotechnology 회사에서 구입하였다.
실시예 1: 세포주 배양
인간 유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB231과 Hs578T는 미국 세포주 균주 은행(American Type Culture Collection (ATCC))에서 구입하였다. 각 세포주는 10% Fetal bovine serum (FBS)를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 gas가 제공되는 세포 배양기에서 배양하였다.
실시예 2: shRNA Nox 유전자 재조합 플라스미드 제조
하기 서열번호 1 내지 6의 oligonucleotide를 합성하여 90 ℃에서 denaturation한 후, 상온에서 서서히 annealing하였다. Annealed oligonucleotides를 Age I 과 EcoRI으로 cutting 한 후, pLKO.1-TRC의 Age I/EcoR I cloning site에 접합하였다. 전기영동을 통하여 재조합 플라스미드의 완성을 확인하였다.
human Nox1 sh oligo Fw(서열번호 1)
CCGGATTCTCTCCAGCCTATCTCATCTCGAGATGAGATAGGCTGGAGAGAATTTTTTG
human Nox1 sh oligo Re(서열번호 2)
AATTCAAAAAATTCTCTCCAGCCTATCTCATCTCGAGATGAGATAGGCTGGAGAGAAT
human Nox4 sh oligo Fw(서열번호 3)
CCGGAGCAAGATACCGAGATGAGGACTCGAGTCCTCATCTCGGTATCTTGCTTTTTTG
human Nox4 sh oligo Re(서열번호 4)
AATTCAAAAAAGCAAGATACCGAGATGAGGACTCGAGTCCTCATCTCGGTATCTTGCT
human Nox5 sh oligo Fw(서열번호 5)
CCGGTGTTCTATTGGACTCACCTGTCTCGAGACAGGTGAGTCCAATAGAACATTTTTG
human Nox5 sh oligo Re(서열번호 6)
AATTCAAAAATGTTCTATTGGACTCACCTGTCTCGAGACAGGTGAGTCCAATAGAACA
실시예 3: 유전자변형 세포주 제작
pLKO1, pLKO1-shNox1, pLKO1-shNox4, 및 pLKO1-shNox5 plasmid DNA (1㎍)를 psPAX2 packaging plasmid (0.75 ㎍)와 pMD2 envelop plasmid (0.25 ㎍)와 함께 각각 바이러스 숙주세포인 293T 세포에 도입하였다. 12 시간 후에, 배지를 교환하고 24시간 추가 배양한 후, 바이러스를 함유하는 세포배양액을 수거하여 원심분리 (1,000 rpm, for 5 min) 하였다. Filtering에 의한 분리된 상층액의 바이러스를 target 세포인 MDA-MB231에 감염시켰다. 이 때, Polybrene (8 ㎍/ml)을 함께 처리하였다. 6 시간마다 배양 접시를 꺼내어 500 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 바이러스를 침전시킨 후, 세포배양기에서 재배양하는 과정을 5번 반복하였다. 새로운 배지로 교체한 후, 항생제인 puromycin을 2 ㎍/ml로 처리하였다. 2-3일 마다 항생제를 함유한 배지로 교체하면서 3주 동안 배양하여 항생제에 저항성을 획득한 세포들을 population으로 수거하였다. Nox1, Nox4 및 Nox5의 발현은 RT-PCR을 통하여 최종 확인하였다.
실험예 1: 세포내 활성산소종 농도 측정
MDA-MB231세포를 6-well plate에 100,000개 seeding하였다. 24 시간 후에, 프로포디움아이오디를 표기된 농도로 처리 한 후 12 시간 추가적으로 배양하고 세포를 수거하기 30분전에 5 μM DCFDA를 처리하였다. PBS로 세척 후, Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 탈 부착시킨 후 600 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 침전물을 PBS에 녹인 후, flow cytometry를 사용하여 세포 10,000개당 분포한 활성산소종의 양을 정량적으로 측정하였다.
실험예 2: NADPH oxidase 활성 측정
NADPH oxidase 활성은 superoxide 생성 수준을 측정하여 동정하였다. MDA-MB231 세포를 6-well plate에 100,000개 seeding하였다. 24 시간 후에, 프로포디움아이오디를 표기된 농도로 처리 한 후 12 시간 추가적으로 배양하였다. PBS로 세척 후, Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 탈 부착시킨 후 600 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 침전물을 450 ㎕ PBS에 녹인 후, 2.5 mM lucigenin (Sigma) 50ul 와 100 mM NADPH(Calbiochem) 1ul를 처리하여 반응시켰다. Superoxide 생성은 luminometer (BD Monolight™ 3010C Luminometer)를 사용하여 10초 간격으로 측정하였다.
실험예 3: RNA 정제 및 역전사 효소-유전자 증폭 반응 ( reverse transcriptase -polymerase chain reaction )
RNA는 phenol-guanidinium isothiocyanate 방법[Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159]사용하여 정제하였다. 역전사 효소-유전자 증폭 반응은 Acess RT-PCR system (Promega, Madison, WI)의 지침에 의해 수행하였다. 사용된 primer의 염기서열은 아래와 같다.
Human Nox1-specific primers forward(서열번호 7) 5 GTA CAA ATT CCA GTG TGC AGA CCA C 3' reverse(서열번호 8) 5'GAG ACT GGA ATA TCG GTG ACA GCA3'
human Nox4-specific primers forward(서열번호 9) 5 GTT CTT AAC CTC AAC TGC AGC C 3' reverse(서열번호 10) 5'GCA TAT GTA GAG GCT GTG ATC 3'
human Nox5-specific primers forward(서열번호 11) 5 ATG AGT GGC ACC CCT TCA CCA TCA G 3' reverse(서열번호 12) 5 GTC AGC AGG CTC ACA AAC CAC TCG AA 3'
human E-cadherin-specific primers forward(서열번호 13) 5 CCT TCC TCC CAA TAC ATC TCC C 3' reverse(서열번호 14) 5'TCT CCG CCT CCT TCT TCA TC 3'
human Snail1-specific primers forward(서열번호 15) 5 GGG CAG GTA TGG AGA GGA AGA 3' reverse(서열번호 16) 5'TTC TTC TGC GCT ACT GCT GCG 3'
human beta actin-specific primers forward(서열번호 17) 5 ACG TTG CTA TCC AGG CTG TG 3' reverse(서열번호 18) 5'GCG ACG TAG CAC AGC TTC TC 3'
역전사 효소-유전자 증폭 반응은 1단계 (95 ℃에서 5 분간), 2단계 (94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분 순서로 35회 반복) 그리고 3 단계 (72 ℃ 10분, 4 ℃ 냉각)의 조건하에서 수행한다. 증폭된 생성물은 0.8 % agarose 전기영동법을 통해 분리되었고 ethidium bromide 염색법으로 UV lamp하에서 형광 탐지한다.
실험예 4:세포 내 단백질 형광염색
Hs578T 및 MAD-MB231 세포주를 18 mm glass coverslip에 50,000개 seeding 하였다. 24 시간 후에 물질을 처리하고 3.5 % ice cold paraformaldehyde에 5분 동안 반응을 통하여 고정 시켰다. Ice cold methanol에 2분간 반응시켜 permeabilization 시킨 후, 5 mM glycine 용액에 5분간 담가 두었다. 세포 내 E-cadherin과 Snail1 단백질은 각각에 선택적인 anti-E-cadherin rabbit polyclonal 항체와 anti-Snail1 mouse polyclonal 항체를 사용하여 표지하였다. 세포를 PBS로 두 번 (5 분씩) 세척 후, fluorescence isothiocyanate (FITC) conjugated goat anti-mouse IgG또는 rhodamine (TRITC) conjugated goat anti-rabbit IgG 이차항체를 상온 암실에서 1 시간 반응시켰다. 염색된 세포는 PBS로 세 번 세척 후, 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI)를 함유하는 용액으로 mounting 시키고 Olympus Fluoview-FV300 confocal microscope를 사용하여 분석하였다.
실험예 5: 막 이동 침투 ( Transwell migration ) assay
Matrigel (BD Cat# 356234)을 4℃에서 녹인 후 단지 DMEM 배지에 1:9로 희석한 후 upper chamber에 30 ㎕ 정도 넣어주고 상온에 2시간 정도 dry 시켰다. Transfection된 cell을 trypsin 처리 후 탈부착하여 그 중 104 개의 MDA-MB231 세포를 matrigel로 코팅한 upper chamber (BD Cat# 353097) 에 serum free-medium 200 ml 와 함께 넣어주었다. Lower chamber엔 500 ㎕ growth medium 에 100 ng/ml EGF 를 처리하여 24 시간 incubation한 후 membrane을 고정시켰다. 현미경으로 임의의 5 영역의 cell 수를 세고 평균을 내었다. Membrane 고정은 upper chamber 에 있는 medium 을 suction 한 후 안쪽 면에 있는 cell 을 면봉으로 닦아내고 4% formalin 에 넣고 5분 동안 incubation후 PBS로 세척하였다. Methanol에 2분 동안 incubation (permeabilization) 후, PBS로 세척하였다. Hematotoxylin (Sigma Cat# MHS16)에서 5분 동안 염색한 후, PBS로 세척하였다. 0.5 % eosin (Sigma Cat# E4382) 에서 5분 동안 염색하고 PBS로 세척하였다. 칼로 membrane을 잘라내서 Canada balsam(Sigma Cat# C1795)을 사용해 슬라이드 글라스에 고정시켰다.
실험예 6: Cell scratching assay
MDA-MB231 또는 Hs578T 세포를 6-well plate에 1000,000개 seeding하였다. 세포 분포가 100 % 형성되면 일정한 폭을 형성하도록 세로로 scratching하였다. PBS로 두 번 세척 후, 새로운 배지로 교환하고 1 시간 후에 지정된 조건의 물질을 처리하였다. 24 시간 동안 세포의 이동을 관찰하였다. 세포의 사진은 카메라를 장착한 Inverted microscope를 사용하여 촬영하였다.
실험예 7: Annexin V 염색
MDA-MB231 세포를 6-well plate에 1000,000개 seeding하였다. 24시간 후, 지정된 조건의 시약으로 세포를 처리하고 24 시간 추가 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하여, Trypsin-EDTA를 처리한 후 탈부착시키고 200 xg 에서 5 min 동안 원심 분리하였다. 침전물을 100 ㎕의 Annexin-VFLUOS labeling solution (1 ml의 incubation buffer (bottle 3)에 녹아있는 Annexin-V-Fluos labeling reagent (vial 1)와 propidium iodide solution (vial 2)의 1:1 혼합물)에 resuspend하여 15-25℃에서 20분 동안 반응시켰다. 488 nm excitation, 515 nm band pass filter (fluorescein 검출용) 및 filter 〈600 nm 조건 (PI 검출용)에서 Flow cytometer를 사용하여 분석하였다.
실험예 8: Western blotting
MDA-MB231 또는 Hs578T 세포를 6-well plate에 1000,000개 seeding하였다. 24시간 후, 지정된 조건의 시약으로 세포를 처리하고 24 시간 추가 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 200 xg 에서 5 min 동안 원심 분리하였다. 침전물을 100 ㎕의 1% Triton X-100 lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM 베타-glycerophosphate, 1 ㎍/ml leupeptin, 및 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)를 가하여 4℃에서 5분 동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 10 min 동안 원심 분리한 후, 상층액을 수거하였다. Bradford 방법에 의하여 전체 단백질의 양을 측정한 후, SDS-PAGE 전기영동을 통하여 분자량에 따라 동량의 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane에 옮긴 후 해당 단백질에 대한 항체와 반응시켜 단백질의 양 및 변화를 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드는 각각 서열번호 20 및 21에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 조성물.
  3. NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 또는 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 23 및 24에 기재된 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 조성물.
  5. NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드가 부착된 유방암 진단용 기질.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드는 각각 서열번호 20 및 21에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 기질.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 기질은 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌),유리, 아파타이트(apatite), 실리콘, 금, 은 또는 금속인 유방암 진단용 기질.
  8. NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 또는 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 선택된 유전자가 부착된 유방암 진단용 기질.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 4 및 NADPH 옥시데이즈 복합체(Nox) 5 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 23 및 24에 기재된 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 기질.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 기질은 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌),유리, 아파타이트(apatite), 실리콘, 금, 은 또는 금속인 유방암 진단용 기질.
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