FR2841141A1 - Nouvelles approches therapeutiques de la sclerose lateral amyotrophique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour le traitement (ou la prise en charge) de la sclérose latérale amyotrophique. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le criblage de composés actifs dans cette pathologie. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en oeuvre des méthodes ci-dessus. L'invention décrit notamment le rôle de PGC1 dans cette pathologie et son utilisation comme cible thérapeutique

Description

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NOUVELLES APPROCHES THERAPEUTIQUES DE LA SCLEROSE
LATERALE AMYOTROPHIQUE
Introduction et Art Antérieur La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour le traitement (ou la prise en charge) de la sclérose latérale amyotrophique (SLA).

L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le screening de composés actifs dans cette pathologie. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en #uvre des méthodes ci-dessus. L'invention découle notamment de l'identification du rôle de PGC-1, et des voies métaboliques impliquant ou régulées par PGC-1, dans cette pathologie et décrit leurs utilisations comme cibles thérapeutiques.

La sclérose amyotrophique latérale (SAL ou ALS pour Amyotrophic Lateral Sclerosis) est une maladie neurodégénérative associée à différents types d'inclusions tels les corps de Lewis et caractérisée par une apoptose des motoneurones spinaux et corticaux dont l'issue fatale est parfois associée à une démence frontale. Des formes sporadiques, sans aucune mutation décrite, coexistent avec des formes familiales (FALS) associées à des mutations dans le gène SOD1 codant pour la superoxide dismutase. La majorité des cas est sporadique, les formes familiales (FALS) étant très rares. Il est vraisemblable qu'une longue période asymptomatique précède l'apparition des symptômes cliniques qui sont variés et dont la classification est complexe. Les futurs développements thérapeutiques substitueront aux traitements de la symptomatologie des stratégies basées sur les causes moléculaires de la pathologie.

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Au niveau cellulaire, ces symptômes sont associés à une mort des motoneurones corticaux et des motoneurones spinaux. Cette mort neuronale a été reliée à différents phénomènes qui constituent la base de plusieurs pathologies neurodégénératives. C'est le cas de l'excitotoxicité liée au glutamate, du stress oxydatif, d'une certaine auto immunité dirigée contre des marqueurs neuronaux (les canaux calciques dans le cas de l'ALS) ainsi que d'anomalies du cytosquelette. Si ces phénomènes sont décrits, la ou les causes de ces maladies, dont l'ALS, sont obscures. En outre, même si les FALS sont liées à des mutations dans le gène SOD1 qui code pour la superoxide dismutase, les mécanismes qui engagent les neurones vers la mort cellulaire dont au moins une composante est l'apoptose, sont inconnus.

L'identification des événements moléculaires impliqués dans les différents phénomènes conduisant ou associés à la mort cellulaire permettra de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'étude de ces événements est bien entendu difficilement réalisable à partir de biopsies humaines. Ces biopsies proviennent en effet d'échantillons post-mortem, dont la qualité est difficilement contrôlable, et ne représentent que des états pathologiques représentatifs des phases tardives de la maladie.

Les modèles animaux donnent accès à des échantillons biologiques qui permettent d'analyser différentes étapes du développement d'une pathologie et de comparer ces étapes à des témoins sains.

Un modèle récent et peu étudié a été obtenu par expression dans des souris transgéniques d'interleukine 3 (IL3). Ce modèle reproduit en 7 à 10 mois certains aspects de la SLA avec notamment une paralysie due à la mort des motoneurones.

Le modèle le plus étudié est représenté par des souris transgéniques qui expriment le gène humain SOD1 portant l'une des mutations qui prévaut dans les FALS (mutation G93A). Ce modèle reproduit en 120 jours l'issue fatale de la maladie avec des symptômes comparables à ceux de la maladie humaine.

L'apparition des symptômes d'ALS liés à la mutation G93A dans SOD1 n'est

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pas la conséquence d'une réduction de l'activité superoxyde dismutase mais d'un gain de fonction qui augmente la capacité de l'enzyme à générer des radicaux libres.

Malgré ces informations, les événements moléculaires qui président aux différentes étapes de l'ALS sont mal connus. La complexité de ces événements moléculaires reflète l'évolution de la pathologie : Dans le modèle transgénique étudié, aucune dérégulation neuronale ou manifestation clinique n'a été rapportée à 30 jours. 60 jours correspondent à un stade qui précède de peu les premiers symptômes, mais qui est déjà caractérisé au niveau cérébral par des changements dans la physiologie cellulaire tels qu'une altération du métabolisme mitochondrial, un stress et une mort neuronale associés à un phénomène d'excitotoxicité. A 90 jours, 50% des motoneurones corticaux et spinaux sont morts et un processus actif d'apoptose neuronale est engagé parallèlement à une activation astrocytaire. Le phénomène d'excitotoxicité n'est plus observé à ce stade. La mort neuronale y est associée à l'activation de caspases qui ne semblent pas impliquées dans les phases précoces de la pathologie.

Résumé de l'Invention La présente invention décrit à présent l'identification d'événements génétiques associés au développement de l'ALS. La présente invention fournit ainsi de nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques de cette pathologie, ainsi que de nouvelles cibles pour l'identification de composés actifs.

Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits d'échantillons de cerveau et de moelle épinière, sans isolement préalable des neurones afin de prendre en compte un maximum d'évènements d'épissages alternatifs liés au développement de la pathologie.

Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS, décrite dans la demande n W099/46403.

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La présente demande de brevet découle notamment de l'identification de modifications des ARN messagers de l'ostéopontine et de PGC1 ( PPAR Gamma Co-activator 1 ), qui distinguent les ARN de sujets sains de ceux qui sont engagés dans le développement des symptômes de l'ALS.

La présente demande met donc en évidence et documente pour la première fois l'implication de PGC1 dans le développement de l'ALS.

Un premier aspect de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé modulant l'activité de PGC1 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'ALS.

Un autre aspect de l'invention réside dans une méthode de traitement de l'ALS comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant l'activité de PGC1.

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mise en évidence d'une prédisposition à l'ALS chez un sujet, comprenant la détermination (typiquement in vitro ou ex vivo) de la présence d'une altération du locus PGC1 chez le sujet.

Il est entendu que le terme sujet ou patient désigne tout mammifère, de préférence un humain.

Un autre aspect de l'invention concerne des procédés de criblage de composés actifs dans l'ALS, comprenant la mesure de l'effet de composés tests sur l'activité de PGC1 et, typiquement, la sélection des composés capables d'augmenter ou de mimer cette activité. Ces tests peuvent être réalisés in vitro, in vivo, ex vivo, en système cellulaire, animal ou acellulaire, etc.

Un autre aspect de l'invention concerne des outils et compositions utilisables dans les méthodes décrites ci-avant. Il s'agit notamment d'acides nucléiques, de polypeptides, anticorps et cellules recombinantes.

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Description détaillée de l'invention La présente demande concerne des compositions et méthodes pour la détection, le diagnostic et le traitement de l'ALS ainsi que pour le criblage de composés actifs sur cette pathologie.

La présente demande est basée plus particulièrement sur l'identification du rôle de PGC1 dans le développement de cette maladie. Les résultats obtenus montrent une altération différentielle de l'ARNm de PGC1, liée à une modification structurale de l'ARN correspondant, notamment à une délétion dans la région 3'UTR. Cette modification, qui distingue la situation saine de la situation SLA, dérive de la région 3' non codante (3'UTR) et a été identifiée par DATAS lorsque les hétéroduplex sont formés par les ARNm d'animaux contrôles et les ADNc des animaux transgéniques pour le gène SOD1. Cela signifie que cette région est préférentiellement délétée dans le répertoire des ARNm des sujets pathologiques. Les séquences 3'UTR étant impliquées dans la stabilité et la traductibilité des ARNm, la délétion observée est compatible avec une déstabilisation ou une baisse de la traductibilité de l'ARNm de PGC1 et donc avec une diminution de l'activité de PGC1.

La présente invention décrit donc un événement moléculaire original qui aboutit à une altération de l'ARNm de PGC1 dans le cerveau des sujets pathologiques et qui est corrélé dans le temps avec le phénomène d'excitotoxicité et/ou de mort neuronale. L'invention montre également, pour la première fois, qu'une altération de l'expression de PGC1 est associée aux stades précoces de l'ALS. PGC1 constitue donc une cible thérapeutique nouvelle et importante dans le développement de thérapeutiques de ces pathologies, utilisables notamment à des phases précoces de leur développement, et s'adressant aux véritables bases moléculaires de la pathologie et non aux symptômes ou composantes inflammatoires associées.

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TRAITEMENT DE L'ALS Un premier objet de l'invention concerne donc l'utilisation d'un composé modulant l'activité de PGC1 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'ALS. Un autre aspect de l'invention réside dans une méthode de traitement de l'ALS comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant l'activité de PGC1.

Au sens de l'invention, PGC1 désigne le co-activateur-1 des récepteurs PPAR gamma. La séquence complète de la protéine est connue de l'homme du métier, et référencée dans les banques de données. Ainsi, la séquence d'une protéine PGC-1 humaine est disponible sous la référence Genbank AF159714, de même que l'ADN correspondant. La séquence d'une protéine PGC-1 de souris est disponible sous la référence Genbank AF049330, de même que l'ADN correspondant. Il est entendu que le terme PGC-1 désigne toute protéine, de préférence de mammifère, notamment humaine, comprenant la séquence indiquée ci-dessus ainsi que tout homologue ou variant, notamment les homologues ou variant naturels résultant de polymorphisme, épissage, ou provenant d'autres espèces.

L'invention concerne l'utilisation de composés modulant l'activité de PGC1 pour le traitement de l'ALS. On entend par composé , de manière large, toute molécule, substance, composition ou traitement, ou une combinaison de ceuxci. Il s'agit de préférence d'une substance ou composition.

Dans un mode de réalisation préféré, le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi-synthétique, capable de moduler l'activité de PGC1. Il peut s'agir typiquement d'un acide nucléique, lipide, polypeptide (e. g., protéine, peptide), d'une molécule chimique de synthèse, etc.

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Le terme activité de PGC1 inclut toute étape ou événement impliqué, participant ou résultant de l'expression de l'activité biologique de la protéine PGC1. Cela comprend notamment la synthèse de la protéine ou du messager (transcription, traduction, épissage, etc.), la maturation de la protéine (glycosylation, transport, dégradation) ou l'activité biologique de la protéine (liaison à un récepteur, régulation transcriptionnelle, etc. ), y compris l'expression ou l'action de PGC1 sur une ou des voies de signalisation intracellulaire.

Le composé utilisé est plus particulièrement un activateur de PGC1, c'est-à-dire un composé capable d'augmenter, de restaurer ou de mimer l'activité PGC1. En effet, la présente demande montre pour la première fois que l'ALS est associée à une altération génétique conduisant à une diminution de l'activité PGC1. Les stratégies thérapeutiques de l'ALS proposées dans la présente demande reposent donc préférentiellement sur une restauration ou une stimulation de l'activité PGC1 chez des sujets.

Dans une première variante, le composé est une molécule capable de moduler, de préférence d'activer la synthèse de PGC1, notamment la transcription du gène, la traduction du messager, ou la maturation du messager. Il s'agit plus préférentiellement d'un activateur de la synthèse de PGC-1, comme par exemple un acide nucléique codant PGC-1 ou un composé activateur du promoteur PGC-1.

Dans une autre variante, le composé est une molécule capable de moduler, de préférence d'activer l'expression ou l'action de PGC1 sur une ou des voies de signalisation intracellulaire. Ainsi, il est connu que PGC1 occupe une place essentielle dans le métabolisme et la signalisation cellulaires. En particulier, PGC1 est un co-activateur du récepteur gamma activé par les peroxysomes ou PPAR gamma. Une altération de PGC1 aboutit donc à une altération de l'activation du récepteur PPAR gamma. Une stratégie thérapeutique ayant pour but d'augmenter la stimulation de PPAR gamma peut donc être proposée dans le cadre de l'ALS. La présente invention fournit donc pour la première fois les

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bases moléculaires au rationnel qui préside à l'utilisation d'agonistes de PPAR gamma pour le traitement de l'ALS. Ces agonistes peuvent être sélectionnés avantageusement parmi la troglitazone, la pioglitazone, la rosiglitazone et la ciglitazone.

Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans l'utilisation d'un agoniste de PPAR gamma pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicité neuronale associée à l'ALS. Ces agonistes peuvent être sélectionnés avantageusement parmi la troglitazone, la pioglitazone, la rosiglitazone et la ciglitazone.

Il peut également être envisagé pour la première fois d'utiliser dans le traitement de l'ALS des molécules qui augmentent l'expression et/ou l'activité transcriptionnelle de PPAR gamma. Ces molécules sont avantageusement sélectionnées parmi la famille des inhibiteurs d'HMGCoA réductase que forment les statines. Parmi celles-ci sont utilisées avantageusement la pravastatine, la cérivastatine, la lovastatine, la fluvastatine, l'atorvastatine et la simvastatine.

En rétablissant une stimulation appropriée du PPAR gamma, l'emploi des composés mentionnés ci-dessus doit restaurer les chemins de signalisation, les voies métaboliques qui sont altérées dans l'ALS.

Un autre objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un inhibiteur d'HMGCoA réductase pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicité neuronale associée à l'ALS. Ces inhibiteurs sont avantageusement choisis dans le groupe des statines, et notamment parmi la pravastatine, la cérivastatine, la lovastatine, la fluvastatine, l'atorvastatine et la simvastatine.

De même, l'expression de l'ostéopontine est régulée négativement par PPAR gamma. L'emploi des composés listés ci-dessus permet par conséquent de diminuer l'expression de l'ostéopontine, et l'invention inclut également

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l'utilisation de composés inhibant ou réduisant l'expression ou l'activité de l'ostéopontine dans le traitement de l'ALS.

L'art antérieur ne permet pas d'anticiper l'invention qui propose de nouvelles approches thérapeutiques pour la SLA. Ainsi, Henka et al (J.Neuroimmunol., 100 (1999) 156-168) propose l'utilisation d'agonistes de PPAR gamma pour le traitement de la maladie d'Alzheimer. Le rationnel avancé pour cela est basé sur l'observation que les agonistes de PPAR gamma peuvent protéger les cellules granulaires du cervelet de l'apoptose induite par les cytokines. D'autre part, Uryu et al (Brain Res. 924 (2002) 229-36) ont montré que la troglitazone peut protéger de l'excitotoxicité les cellules granulaires du cervelet. En revanche, aucune évidence de protection n'est apportée dans d'autres types neuronaux, tels les neurones corticaux et les motoneurones. Ces neurones sont plus particulièrement affectés dans des pathologies neurodégénératives comme la SLA. La présente invention documente pour la première fois une modification de la signalisation cellulaire relayée par le PPAR gamma dans un modèle de SLA.

Plus précisément, la présente invention décrit une diminution de l'activation de PPAR gamma et fournit le premier rationnel à l'utilisation d'agonistes de PPAR gamma pour le traitement de l'ALS.

Le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif ou palliatif de la pathologie, y compris la réduction de la souffrance, la diminution de la progression de la pathologie, l'augmentation de la survie des sujets ou l'amélioration de la viabilité de neurones placés en conditions d'excitotoxicité, etc. D'autre part, les traitements proposés peuvent être réalisés seuls ou en combinaison avec d'autres principes actifs ou traitements, notamment adressant des événements tardifs ou des symptômes de la pathologie, tels que des inhibiteurs de caspases ou autres composés actifs telle riluzole.

L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intracérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Ces doses

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injectées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (e. g., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc. ).

DETECTION La présente invention est également utilisable pour le diagnostic de l'ALS, notamment en phases précoces. Elle est notamment utilisable pour détecter la présence, la prédisposition ou le développement de l'ALS, ou pour la caractérisation de la présence d'une telle pathologie chez un sujet. Elle est particulièrement adaptée à la détection à un stade précoce de l'ALS.

Un autre aspect de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence d'une prédisposition, de la présence, ou du stade de développement de l'ALS chez un sujet, comprenant la détermination (typiquement in vitro ou ex vivo) de la présence d'une altération du locus PGC1 chez le sujet.

Un autre aspect de la présente demande concerne des méthodes et outils pour détecter la présence d'un variant de PGC1 (variant d'épissage ou autre altération génétique) dans des échantillons biologiques, ou pour doser ou déterminer les quantités relatives d'un tel variant.

Un autre objet particulier concerne une méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la détection de la présence (ou de l'absence) d'une forme mutée de PGC1 ou de l'ARN correspondant, dans un échantillon provenant du sujet.

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Le terme locus PGC1 désigne tout acide nucléique codant pour la protéine PGC1, incluant l'ADN génomique (régions codantes et non codantes) et les ARN, notamment les ARN messagers. Le terme locus inclut également la protéine PGC1 elle-même.

Comme indiqué précédemment, la présente demande démontre l'existence d'événements génétiques particuliers, affectant le locus PGC1, qui sont corrélés à l'ALS. La demande démontre notamment l'existence d'altérations dans la région 3' non-codante ( 3'-UTR ) de PGC1, qui sont corrélées à l'ALS. Ces altérations sont notamment le résultat d'épissages alternatifs, qui affectent la région 3'-UTR, et induisent une délétion d'une partie de cette région. Un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention comprend donc la détermination de la présence d'un épissage dans l'ARN de PGC-1, notamment dans la région 3' non codante.

Des outils adaptés à la mesure ou à la détection d'une protéine, d'un ARN, d'une altération ou d'une expression comprennent notamment des sondes ou amorces nucléiques, des anticorps ou autres ligands spécifiques, des kits, supports, puces, etc. Les méthodes de détection peuvent inclure les méthodes d'hybridation, d'amplification (e. g., de PCR), de chromatographie, d'immunologie, etc. Ces méthodes sont particulièrement adaptées à la détection, la caractérisation, le suivi de la progression ou de l'efficacité d'un traitement de pathologies telles que mentionnées ci-avant, ou à la détermination d'une prédisposition.

La méthode peut être mise en #uvre à partir de différents échantillons biologiques, tels que sang, plasma, urine, sérum, salive, biopsies ou cultures cellulaires, etc. Il s'agit de préférence d'un échantillon comprenant des cellules nerveuses ou musculaires. Selon la technique utilisée, l'échantillon peut être traité préalablement, par exemple pour rendre les acides nucléiques accessibles à une réaction d'hybridation et/ou d'amplification, et/ou pour rendre les protéines accessibles à une réaction immunologique ou enzymatique.

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Dans un mode particulier de mise en #uvre, on mesure l'expression, on détecte ou on dose, dans l'échantillon, la présence ou la quantité d'ARNm codant PGC1.

Cette mesure, détection et/ou ce dosage peuvent être effectués par différentes techniques, et de préférence par hybridation ou amplification sélective, séquençage, migration sur gel, etc.

Selon un premier mode préféré de mise en #uvre, la détermination est réalisée par hybridation de l'échantillon avec une sonde nucléique spécifique de l'ARN considéré, notamment une sonde comprenant tout ou partie d'une séquence de l'ARN messager de PGC1 ou d'une séquence complémentaire ou dérivée. Dans un mode particulier, la sonde est simple-brin et/ou est marquée, pour faciliter la détection du produit d'hybridation. Le marquage peut être radioactif, fluorescent, luminescent, etc. La sonde peut être immobilisée sur un support. La sonde comprend avantageusement au moins 15 nucléotides, plus préférentiellement au moins 30. Des sondes particulières peuvent comprendre l'intégralité de la séquence de l'ARNm de PGC-1, ou une portion de celle-ci, par exemple correspondant à la région 3' non-codante. Préférentiellement, la sonde comporte une séquence complémentaire et spécifique d'une région au moins de l'ARNm de PGC-1, par exemple d'une région de 30 nucléotides consécutifs.

A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée (e.g., complémentaire) du gène ou de l'ARN messager de PGC1 pour la mise en #uvre d'une méthode de diagnostic, de détection, de dépistage ou de caractérisation d'une situation de stress neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité, notamment d'une méthode de diagnostic, de détection, de dépistage ou de caractérisation de l'ALS.

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Un autre objet particulier concerne un procédé de mise en évidence d'une prédisposition, de la présence, ou du stade de développement de l'ALS chez un sujet, comprenant la mise en contact (typiquement in vitro ou ex vivo) d'un échantillon du sujet avec une sonde nucléique spécifique de PGC-1, dans des conditions permettant la réalisation d'une hybridation entre des séquences complémentaires, et la détection de la formation d'un hybride.

Comme indiqué ci-avant, la présente demande démontre l'existence d'une forme épissée de PGC-1 dans certains tissus engagés dans des processus de neurotoxicité. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention comprend une détection ou un dosage (par exemple relatif) de la forme épissée et/ou de la forme non épissée dans un échantillon. L'apparition, la présence ou l'augmentation de l'espèce épissée est corrélée au développement de la situation d'excitotoxicité, notamment de l'ALS. Dans une variante particulière, la méthode de l'invention prévoit donc une analyse de la présence de la forme épissée et/ou de la forme non épissée de l'ARN codant PGC1. Cette détection peut être réalisée par exemple en utilisant une sonde nucléique spécifique de la séquence résultant de la jonction entre les régions délétées (i.e., épissées) de l'ARN. L'évolution de rapport entre la forme épissée et la forme non épissée peut être suivie, comme un indicateur de la progression de la pathologie (ou de l'efficacité d'un traitement).

A titre d'exemple spécifique, la région délétée porte par exemple sur les nucléotides 2678 à 2734 référencés selon la séquence GenBank AF049330. La séquence délétée est représentée en gras ci-dessous, ainsi que les séquences flanquantes dans l'ARN non épissé (la séquence représentée correspond aux nucléotides 2641 à 2701 de la séquence GenBank AF049330). aacaacaaca ataacaacaa caaccatacc agaacaagaa caacggttta catgaacaca gctgctgaag aggcaagaga cagaatgata atccagtaag cacacgttta ttcacgggtg Une sonde particulière pour la détection ou le dosage de la forme non épissée peut donc comprendre une séquence complémentaire et spécifique de la région indiquée ci-dessus en caractères gras, ou d'une partie de celle-ci.

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Une sonde particulière pour la détection ou le dosage de la forme épissée peut comprendre une séquence complémentaire et spécifique de la région de jonction formée après élimination de la séquence indiquée ci-dessus en caractères gras. Il peut s'agir par exemple d'une sonde complémentaire et spécifique de la séquence agaacaaagtaag.

De manière similaire, la région 3'-UTR commence au nucléotide 2427 de la séquence référencée dans Genbank sous le n AF159714. A partir de cette séquence, il est possible de synthétiser des sondes complémentaires de l'ARN de PGC-1, notamment de la région 3'-UTR, et en particulier spécifiques des formes épissées et non épissées.

Selon un autre mode préféré de mise en #uvre du procédé de l'invention, la mesure, détection ou le dosage d'une altération du locus PGC-1 peut également être effectuée par amplification sélective des acides nucléiques de l'échantillon avec une amorce nucléique (ou un couple d'amorces) spécifique de l'ARN considéré. Le terme amorce désigne un acide nucléique simple-brin, de longueur généralement comprise entre 10 et 60 nucléotides, dont la séquence est complémentaire et spécifique d'une portion d'une séquence cible (celle de PGC-1), permettant ainsi d'initier une réaction d'amplification. Les amorces comprennent donc typiquement une séquence complémentaire d'une portion de l'ARN de PGC-1, et peuvent être synthétisées par exemple sur la base de la séquence de PGC-1 telle que fournie ci-avant. Dans un mode particulier, l'amorce (ou l'une des amorces du couple) est spécifique de la séquence résultant de la jonction entre les régions délétées (i.e., épissées) de l'ARN, telle que définie ci-avant. Ainsi, un produit d'amplification n'est obtenu que lorsque l'échantillon testé comporte la forme épissée.

L'amplification peut être effectuée selon différentes techniques, par exemple par PCR, LCR, NASBA, etc. Les techniques préférées sont la PCR, notamment spécifique d'allèle. Le produit d'amplification peut être détecté ou dosé par toute

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technique connue. Les amorces (ou couples d'amorces) définis ci-avant constituent un autre objet de la présente demande.

Dans un autre mode particulier de mise en #uvre, on détecte ou on dose, dans l'échantillon, la présence ou la quantité de PGC1. Cette détection peut être réalisée en utilisant un anticorps spécifique, ou tout autre ligand spécifique.

Dans le cas d'un anticorps, la détection peut être réalisée par des techniques classiques d'immunologie, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Dans ce contexte, on peut utiliser tout anticorps spécifique de PGC-1, ou tout fragment ou dérivé d'un tel anticorps, notamment des fragments Fab, Fab'2, des régions CDR, des anticorps synthétiques, poly-fonctionnels, simple-chaîne, etc. Un test classique comprend la mise en contact de l'échantillon avec un anticorps (ou fragment ou dérivé) et la détection de la présence d'un complexe immun.

Un autre objet de l'invention concerne tout variant d'épissage de PGC1 ainsi que tout acide nucléique codant un tel polypeptide, les vecteurs le contenant, cellules recombinantes, et utilisations. Il s'agit plus préférentiellement d'un variant de l'ARN de PGC-1, comprenant une altération dans la région 3'-non codante, notamment une délétion. Les vecteurs peuvent être des plasmides, phages, cosmides, virus, chromosomes artificiels, etc. Des vecteurs préférés sont par exemple des vecteurs plasmidiques, comme ceux dérivés de plasmides commerciaux (pUC, pcDNA, pBR, etc.). De tels vecteurs comportent avantageusement un gène de sélection et/ou une origine de réplication et/ou un promoteur transcriptionnel. D'autres vecteurs particuliers sont par exemples des virus ou des phages, notamment des virus recombinants défectifs pour la réplication, tels que des virus dérivés de rétrovirus, adénovirus, AAV, herpèsvirus, baculovirus, etc. Les vecteurs peuvent être utilisés dans tout hôte compétent, comme par exemple des cellules procaryotes ou eucaryotes. Il peut s'agit de bactéries (par exemple E. coli), levures (par exemple Saccharomyces ou Kluyveromyces), cellules végétales, cellules d'insectes, cellules de mammifères, notamment humaines, etc. Il peut s'agir de lignées, cellules

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primaires, cultures mixtes, etc. A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne toute cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant un PGC-1.

Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs acides nucléiques (y compris un vecteur, une sonde, une amorce, un oligonucléotide, un antisens), polypeptides (y compris un anticorps) ou cellules tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les polypeptides ou acides nucléiques sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'interaction avec un ligand spécifique, tel qu'un anticorps ou une sonde. Les polypeptides ou acides nucléiques peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.

CRIBLAGE La présente invention fournit également une nouvelle cible pour l'identification, la validation, la sélection ou l'optimisation de composés actifs. L'invention permet en effet de sélectionner des composés ayant des propriétés thérapeutiques ou biologiques avantageuses, sur la base de leur capacité à moduler l'activité de PGC1, notamment à augmenter ou mimer cette activité.

Ces tests peuvent être réalisés en système cellulaire, animal, ou acellulaire (e. g., sur des protéines, polypeptides ou acides nucléiques isolés, ou sur des système d'expression in vitro), et être basés sur la mesure d'une interaction (e. g., tests de liaison, déplacement, compétition, etc. ) ou d'une fonction (activité, transcription, etc.).

Un objet particulier de l'invention concerne un procédé de criblage de composés actifs dans l'ALS, comprenant (i) la mesure de l'effet de composés tests sur

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l'activité de PGC1 et (ii) la sélection des composés capables d'augmenter ou de mimer cette activité. Ces tests peuvent être réalisés in vitro, in vivo, ex vivo, en système cellulaire, animal ou acellulaire, etc., par mise en contact du composé test et de PGC-1 (ou d'un système d'expression de PGC-1), et mesure de l'activité.

Un autre objet particulier de l'invention concerne une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs, notamment sur les pathologies associées à l'excitotoxicité ou au stress neuronal, en particulier l'ALS, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant une PGC1 ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci, et la détermination de la capacité du composé à augmenter l'expression ou l'activité de cette protéine.

Les méthodes peuvent être mises en #uvre avec différentes populations cellulaires, telles que des cellules primaires ou des lignées de cellules d'origine mammifère (humaine, murine, etc. ). On utilise avantageusement des cellules qui n'expriment pas PGC1 de manière naturelle, et qui sont transfectées avec un acide nucléique codant cette protéine. De cette manière, la sélectivité de la méthode est augmentée. On peut également utiliser des cellules eucaryotes inférieures (levure, etc. ) ou des cellules procaryotes. On peut également utiliser des animaux non-humains transgéniques.

L'effet modulateur (e. g., activateur) peut être mesuré de différentes façons, comme notamment par dosage des ARN, dosage de la protéine, mesure d'une activité, etc. Les dosages peuvent être effectués par toute technique immunoenzymatique classique (RIA, ELISA, EIA, etc. ) ou par des techniques d'hybridation avec des sondes marquées, sur puce, amplification avec des amorces spécifiques, etc.

Les méthodes de sélection peuvent également être réalisées en système acellulaire, par mesure de la capacité de composés tests à lier PGC1 ou un

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variant ou fragment de celle-ci. A cet égard, un autre objet particulier de l'invention concerne une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs, notamment sur les pathologies associées à l'excitotoxicité ou au stress neuronal, en particulier l'ALS, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une PGC1 ou un variant ou fragment de celle-ci, et la détermination de la capacité du composé test à lier ladite protéine, fragment ou variant. La PGC1, fragment ou variant peut être utilisée sous forme isolée et purifiée, soluble ou attachée à un support (e.g., bille, colonne, etc. ), ou incorporé à une membrane ou une vésicule. La liaison du composé test et de PGC1 peut être déterminée par toute technique connue, notamment par déplacement d'un ligand de référence marqué, par migration sur gel, électrophorèse, etc.

Le terme variant inclut des polypeptides comprenant une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présentant substantiellement la même spécificité antigénique ou activité, et notamment conservant la capacité à activer PPAR gamma. Des exemples typiques de dérivés incluent des variations de séquence dues au polymorphisme de PGC1, à l'épissage, etc. Des dérivés particulièrement préférés comprennent au plus 5 résidus d'acides aminés distincts de ceux présents dans la séquence sauvage. Le terme fragment désigne tout polypeptide comprenant de 5 à 100 résidus consécutifs de la séquence en acides aminés de PGC1, de préférence de 10 à 100. Les fragments comportent avantageusement un site actif de la protéine.

Les composés tests peuvent être de nature et d'origine variées, telles que des composés naturels ou synthétiques, des lipides, des acides nucléiques, des polypeptides, des molécules chimiques, etc. Il peut s'agir de composés isolés ou sous forme de mélange, de banques combinatoires, etc. Dans les méthodes de l'invention, il est possible de tester en parallèle plusieurs composés tests, par exemple dans des dispositifs adaptés tels que plaque multipuits, boite, etc.

Claims (16)

1. Utilisation d'un composé modulant l'activité de PGC1 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'ALS.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé est un activateur de PGC1.

3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le composé est un activateur de la synthèse de PGC1.

4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé est un activateur de la stimulation de PPAR gamma, de préférence un agoniste de PPAR gamma.

5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi la troglitazone, la pioglitazone, la rosiglitazone et la ciglitazone.

6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur d'HMGCoA réductase.

7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi la pravastatine, la cérivastatine, la lovastatine, la fluvastatine, l'atorvastatine et la simvastatine.

8. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur de l'ostéopontine.

9. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est combiné à un autre principe actif, de préférence un inhibiteur de caspase ou le riluzole.

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10. Procédé de mise en évidence d'une prédisposition, de la présence, ou du stade de développement de l'ALS chez un sujet, comprenant la détermination in vitro ou ex vivo de la présence d'une altération du locus PGC1 chez le sujet.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la présence d'un épissage dans l'ARN de PGC-1, notamment dans la région 3' non codante.

12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que la détermination est réalisée par hybridation ou amplification sélective.

13. Procédé de criblage de composés actifs dans l'ALS, comprenant la mesure de l'effet de composés tests sur l'activité de PGC1, et la sélection des composés capables d'augmenter ou de mimer cette activité.

14. Procédé selon la revendication 13, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant une PGC1 ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci, et la détermination de la capacité du composé à augmenter l'expression ou l'activité de cette protéine.

15. Procédé selon la revendication 13, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une PGC1 ou un variant ou fragment de celle-ci, et la détermination de la capacité du composé test à lier ladite protéine, fragment ou variant.

16. Cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant un PGC-1.