CN114929748A - 抗b7-h3单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents

抗b7-h3单克隆抗体及其使用方法 Download PDF

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S·加蒙
F·皮萨内斯基
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Abstract

本文提供了靶向B7‑H3的试剂，例如抗体、抗体‑药物缀合物或嵌合抗原受体。提供了治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的B7‑H3‑靶向剂。如果癌症表达B7‑H3水平升高，则可选择患者进行治疗。

Description

抗B7-H3单克隆抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年11月18日提交的美国临时申请第62/936,783号的优先权益，其全部内容通过引用并入本文。
参考序列表
本申请含有已经以ASCII格式经EFS-Web提交的序列表，并且特此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年11月4日，命名为UTFCP1481WO_ST25.txt，大小为6.9千字节。
技术领域
本发明总体涉及医学、免疫学和癌症生物学领域。更具体地说，它涉及靶向B7-H3的抗体及其使用方法。
背景技术
通过减弱效应T细胞上的内源性免疫检查点，利用宿主免疫系统在选定的实体瘤患者中产生了显著且持续的肿瘤反应(Sharma等人,2011)。阻断共抑制T细胞信号的抗体，如靶向针对CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗体，已在10-30％的患有多种实体癌(包含转移性黑色素瘤、RCC、NSCLC和卵巢癌)的患者中显示出客观反应率，否则这些实体癌将会是致命的。许多有前途的免疫检查点疗法(ICT)作为单一疗法和联合试验正在研究中。然而，毒副作用很大，而许多患者对ICT有抗性，因此需要新的方法来阻断免疫检查点以达到治疗目的。
发明内容
在一个实施例中，本文提供的是单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括来自MIL33B抗体的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括来自所述MIL33B抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括源自SEQ ID NO:7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括源自SEQ ID NO:8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在一些方面，所述抗体或抗体片段能够与B7-H3结合。
在一些方面，所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:11的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:12的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:13的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:14的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:15的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:16的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:18的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:20的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:21的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:18的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或抗体片段包括与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面，所述抗体或抗体片段包括与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面，所述抗体或抗体片段包括具有根据SEQ ID NO:7的序列的重链可变序列；和具有根据SEQ ID NO:8的序列的轻链可变序列。
在一些方面，所述抗体或抗体片段是人源化的。在一些方面，所述抗体片段是单价scFv(单链片段可变)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab')2片段、F(ab')3片段、Fv片段或单链抗体。在一些方面，所述抗体是嵌合抗体、双特异性抗体或BiTE。在一些方面，所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。
在一个实施例中，本文提供的是单克隆抗体或抗体片段，其与根据本发明任一实施例的单克隆抗体或抗体片段竞争结合相同的表位。
在一个实施例中，本文提供的是单克隆抗体或抗体片段，其与由本发明任一实施例的抗体识别的B7-H3上的表位相结合。
在一些方面，所述抗体或抗体片段与显像剂、细胞毒剂、金属或放射性部分缀合或融合。在一些方面，所述显像剂是荧光团。在一些方面，所述放射性部分是Zr-89、Cu-64、F-18、Y-90、Lu-177、At-211、Ac-225或Pb-212。
在一些方面，所述抗体或抗体片段是免疫缀合物。在一些方面，所述抗体或抗体片段与鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生物缀合。
在一些方面，所述抗体或抗体片段是抗体-药物缀合物。
在一个实施例中，本文提供的是分离的核酸，其编码本发明任一实施例的抗体分子的抗体重链和/或轻链可变区。在一些方面，所述核酸包括与SEQ ID NO:9具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核酸包括与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的核苷酸序列。
在一个实施例中，本文提供了包括本发明任一实施例的核酸的表达载体。
在一个实施例中，本文提供了杂交瘤或工程细胞，其包括编码本发明任一实施例的抗体或抗体片段的核酸。
在一个实施例中，本文提供了制备本发明任一实施例的单克隆抗体或抗体片段的方法，所述方法包括：在允许所述抗体表达的条件下培养本发明实施例的杂交瘤或工程细胞，并任选地从所述培养物中分离所述抗体。
在一个实施例中，本文提供了药物调配物，其包括本发明任一实施例的一种或多种抗体或抗体片段。
在一个实施例中，本文提供了治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括施用有效量的本发明任一实施例的抗体或抗体片段。在一些方面，所述癌症已被确定为相对于健康组织表达升高水平的B7-H3。在一些方面，所述癌症是肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤或神经外胚层癌。在一些方面，所述方法进一步包括施用至少第二抗癌疗法。在某些方面，所述第二抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法、免疫疗法、放射疗法、放射免疫疗法、光疗法、基因疗法、手术、激素疗法、表观遗传调节、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。在一些方面，所述患者先前对免疫检查点抑制剂没有反应。在一些方面，所述患者旧病复发。
在一个实施例中，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括重链可变区(VH)，其包括来自所述MIL33B抗体的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括来自所述MIL33B抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗原结合结构域包括重链可变区(VH)，其包括源自SEQ ID NO:7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括源自SEQ ID NO:8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和SEQID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:11的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:12的VHCDR2氨基酸序列和SEQID NO:13的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:14的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:15的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:16的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:18的VHCDR2氨基酸序列和SEQID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:20的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:21的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:18的VHCDR2氨基酸序列和SEQID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗原结合结构域能够与B7-H3结合。在一些方面，所述抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域。
在一些方面，所述抗原结合结构域包括与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面，所述抗原结合结构域包括与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面，所述抗原结合结构域包括具有根据SEQ ID NO:7的序列的重链可变序列；和具有根据SEQ ID NO:8的序列的轻链可变序列。
在一些方面，所述CAR蛋白质进一步包括铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述铰链结构域是CD8a铰链结构域或IgG4铰链结构域。在一些方面，所述跨膜结构域是CD8a跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在一些方面，所述细胞内信号传导结构域包括CD3z细胞内信号传导结构域。
在一个实施例中，本文提供了编码本发明任一实施例的CAR的核酸分子。在一些方面，编码所述CAR的序列与表达控制序列有效连接。在一些方面，所述核酸进一步定义为表达载体。
在一个实施例中，本文提供了工程细胞，其包括编码本发明任一实施例的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子。在一些方面，所述细胞是T细胞。在一些方面，所述细胞是NK细胞。在一些方面，所述核酸整合到所述细胞的基因组中。在一些方面，所述细胞是人类细胞。
在一个实施例中，本文提供了药物组合物，其包括在药学上可接受的载体中的根据本发明任一实施例的细胞群。
在一个实施例中，本文提供了在有需要的人类患者中治疗癌症的方法，包括：向所述患者施用抗肿瘤有效量的细胞疗法，所述细胞疗法包括根据本发明任一实施例的一种或多种细胞。在一些方面，所述细胞是同种异体细胞。在一些方面，所述细胞是自体细胞。在一些方面，所述细胞与所述受试者HLA配型。在一些方面，所述癌症已被确定为相对于健康组织表达升高水平的B7-H3。在一些方面，所述癌症是肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤或神经外胚层癌。
在一些方面，所述方法进一步包括施用至少第二抗癌疗法。在一些方面，所述第二抗癌疗法是化学疗法、分子靶向疗法、免疫疗法、放射疗法、放射免疫疗法、光疗法、基因疗法、手术、激素疗法、表观遗传调节、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。在一些方面，所述患者先前对免疫检查点抑制剂没有反应。在一些方面，所述患者旧病复发。
在一个实施例中，本文提供了诊断患者患有表达B7-H3的癌症的方法，所述方法包括将获自所述患者的癌组织与本发明任一实施例的抗体或抗体片段接触；以及检测所述抗体或抗体片段与所述组织的结合，其中如果所述抗体或抗体片段与所述组织结合，则所述患者被诊断为患有表达B7-H3的癌症。在一些方面，所述检测包括：进行ELISA、免疫印迹、免疫组织化学法、多光谱荧光细胞计数成像、FACS、质谱流式细胞术(CyTOF)、成像质谱流式细胞术(IMC)、光学成像、PET成像、SPECT成像或MRI。在一些方面，所述方法进一步包括向被诊断为患有表达B7-H3的癌症的患者施用根据本发明任一实施例的有效量的抗体或抗体片段或包括一种或多种细胞的细胞疗法。
在一个实施例中，本文提供了选择用抗B7-H3抗体治疗的癌症患者的方法，所述方法包括(a)确定所述癌症是否表达B7-H3；和(b)如果B7-H3由所述癌症表达，则选择所述患者进行治疗。在一些方面，步骤(a)包括(i)从所述患者获取或已经获取生物样品；和(ii)对生物样品进行或已经进行测定以确定B7-H3是否在癌症中表达。在一些方面，所述方法进一步包括向所选定的患者施用根据本发明任一实施例的有效量的抗体或抗体片段或包括一种或多种细胞的细胞疗法。
在一些方面，通过检测所述样品中的B7-H3蛋白来确定B7-H3是否在癌症中表达。在一些方面，所述蛋白质通过质谱流式细胞术、成像质谱流式细胞术、蛋白质印迹(Westernblot)、FACS、免疫组织化学法、ELISA、RIA、光学成像、PET成像、SPECT成像或MRI检测。在一些方面，通过使所述癌症样品与本发明任一实施例的抗体接触来检测所述蛋白质。
在一个实施例中，本文提供了检测细胞表面、组织中、器官中或生物样品中是否存在B7-H3的方法，所述方法包括(a)使所述细胞、组织、器官或生物样品与本发明任一实施例的抗体接触；和(b)检测与所述细胞、组织、器官或样品相关的所述抗体是否存在。在一些方面，所述接触和检测在体外进行。在一些方面，所述接触在体内进行并且所述检测在体外进行。在某些方面，所述显像剂是荧光团或生色团。在一些方面，所述接触和检测在体内进行。在某些方面，所述显像剂是放射性核素。在某些方面，所述检测是通过PET、SPECT、MRI或超极化MRI进行的。在某些方面，所述检测是通过超极化MRI进行的，其中所述可检测标记是Si-29纳米颗粒。
在一个实施例中，本文提供了进行荧光引导手术的方法，所述方法包括：(a)在一定条件下向患者施用包括本发明实施例的抗体缀合物的组合物并持续足以使所述抗体在给定手术部位积聚的时间；(b)用激发光照射所述手术部位以引起所述荧光部分的发射；以及(c)对在激发光激发时发出荧光的区域进行手术切除。
在一个实施例中，本文提供了本发明任一实施例的抗体分子或药物组合物，用于治疗受试者的癌症。
在一个实施例中，本文提供了本发明任一实施例的抗体分子或药物组合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
如本文所使用的，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示没有任何特定组分被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是这样一种组合物，其中用标准分析方法不能检测到特定组分的量。
如本文所使用的，“一个”或“一种”可以意指一个或多个。如本文所使用的，当与单词“包括(comprising)”结合使用时，单词“一个”或“一种”可以意指一个或多于一个。
权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出其仅指替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指替代方案以及指“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于表示一个值，其包含设备的固有误差变化、确定该值所采用的方法、研究对象之间存在的变化，或在规定值的10％以内的值。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应当理解，尽管详细描述和具体实例指示本发明的优选实施例，但仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员来说是显而易见的。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分并被包含在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的特定实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1.用于MIL33B与人4Ig-B7-H3和小鼠2Ig-B7-H3结合的ELISA。
图2.MIL33B与人4Ig-B7-H3结合的示例。解离常数Kd是利用生物层干涉(Octet)测定法确定的。MIL33B被捕获到光学传感器的表面上。然后将该表面置于分析物溶液中，随时间测量指示结合的相移。然后，将探针移入不含分析物的溶液中并测量脱结合的时间过程。对多种分析物浓度重复此循环，并且根据分析物与抗体结合的浓度和时间依赖性的全局曲线拟合来计算Kd。
图3.人4Ig-B7-H3和小鼠2Ig-B7-H3在各种细胞系中表达的蛋白质印迹。
图4A-C.Alexa594标记的MIL33B和Alexa594标记的同种型对照IgG2a与表达4Ig-B7-H3和/或2Ig-B7-H3的细胞的结合。图4A示出了来自表达天然4Ig-B7-H3的人HeLa和HCT116细胞的高信号。注意来自细胞自发荧光或标记IgG2a的低背景荧光。此外，当Alexa594标记的MIL33B在摩尔过量的未标记MIL33B存在下被添加时，细胞荧光会被减低到背景，证明了特异性。图4B示出了表达中等天然2Ig-B7-H3并经工程改造以表达人4Ig-B7-H3或空载体对照的鼠4T1细胞。图4C示出了表达2Ig-B7-H3的鼠Pan02细胞。
图5.通过蛋白质印迹证实的MIL33B与鞭毛蛋白的缀合，及其与人4Ig-B7-H3结合的亲和力分析。
图6A-D.鞭毛蛋白缀合的MIL33B对NF-κB的诱导。图6A说明了κB-RE5-IκBα-Fluc报告基因。图6B示出了由TNFα诱导的(时间＝0)IκBα-Fluc报告基因损失引起的发光量的初始损失，以及随后来自κB反应元件(RE5)诱导的IκBα-Fluc再合成的发光量增加。单独的MIL33B不会激活NF-κB信号传导。图6C示出了发光量的初始损失，以及随后在用鞭毛蛋白和鞭毛蛋白缀合的MIL33B处理后驱动IκBα-Fluc再合成的κB响应元件(RE5)的发光量增加。图6D示出了刺激后4小时由鞭毛蛋白缀合的MIL33B和不同浓度的单独鞭毛蛋白引发的IκBα-Fluc介导的光子通量的水平。1.8nM鞭毛蛋白和18.2nM MIL33B-鞭毛蛋白缀合物之间存在信号等效性。
图7.与缀合至DFO并用89Zr放射性标记的同种型对照IgG2a相比，使用与DFO缀合并用89Zr放射性标记的MIL33B通过PET成像在体内检测表达人4Ig-B7-H3或载体对照的4T1鼠乳腺和B16F10鼠黑色素瘤。示出作为最大强度投影(MIP)的冠状PET图像(左图)以及在注射放射性标记的MIL33B或同种型对照抗体后24小时和72小时的体积分析(％ID/cc)(中图和右图)。在中图和右图中，对于每对列，左列代表MIL33B，右列代表IgG2a。
图8.经MIL33B单一疗法或未处理的对照(PBS载体)处理的携带表达4Ig-B7-H3的鼠B16F10肿瘤的小鼠的存活曲线(上图)和肿瘤生长曲线(下图)。
具体实施方式
B7-H3是一种在许多肿瘤细胞表面以及肿瘤微血管系统中表达的共抑制配体(Suh等人,2003；Zang等人,2007；Wang等人,2012)。它被认为可以积极抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应子功能或诱导调节性T细胞的产生，所有这些都会下调免疫反应(Pardoll,2012)。尽管CTLA-4和B7-H3都是CD28/B7扩展家族的成员，但是CTLA-4和B7-H3具有非重叠的功能，并且在动物模型中进行的研究表明，这两种途径在免疫调节中发挥着不同的作用(Zang等人,2007；Wang等人,2012)。
B7-H3蛋白在大多数肿瘤细胞类型以及肿瘤相关脉管系统中表达(Seaman等人,2017)。例如，B7-H3在肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤和神经外胚层癌(Loo等人,2012)以及前列腺癌细胞(Zang等人,2007；Koenig,2014)，表明靶向B7-H3可广泛用于治疗和成像。例如，在来自803名局部疾病(localized disease)患者的前列腺切除术标本中，绝大多数(93％)前列腺肿瘤表达B7-H3(Zang等人,2007)。此外，B7-H3(和/或B7-H4，另一种共抑制配体)的高水平表达与临床失败(转移)和7年内死亡的较高风险相关，这表明这些分子作为抑制抗肿瘤免疫反应的抑制性免疫检查点(Zang等人,2007；Zang等人,2003)。此外，肾癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、甲状腺癌和胰腺癌通过IHC显示高达99％的B7-H3阳性染色(Koenig,2014)。最重要的是，正常人体组织中的B7-H3蛋白有限(Koenig,2014；Zang等人,2003)。因为B7-H3在癌细胞和癌症脉管系统的表面上而不是在正常组织中高度表达，B7-H3为抗癌免疫疗法、正电子发射断层扫描(PET)和免疫PET成像以及双功能缀合药物治疗提供了极好的靶点。
已知的抗B7-H3抗体仅对人类或仅对小鼠B7-H3表现出适度的纳摩尔亲和力PMID:22894780、PMID：26487718、PMID：28399408、PMID：22615450]。这些抗体已在具有鼠2Ig-B7-H3的正常小鼠中开发，其与人4Ig-B7-H3和人2Ig-B7-H3具有高度同源性和结构域同一性。因此，胸腺诱导的对自身抗原的耐受性可能会限制在正常小鼠品系(如常见的C57Bl6品系)中发现的表位库。进一步地，B7-H3与B7家族的其他旁系同源物具有显著的同源性，进一步限制了在正常或B7-H3敲除小鼠中发现的高亲和力表位的可及性。
虽然仅人类的亲和力显然已足以用于临床转化和所需的治疗应用，但它使得临床前鼠类模型难以或不可能执行，因为仅人类抗体不能识别鼠类表位。在当今与免疫检查点抑制剂联合治疗的时代，这变得特别成问题，并且需要使用鼠类替代活性抗体。另一方面，仅识别鼠类表位的抗体将能够在适当的鼠类模型中进行临床前分析，但会阻止向人类的转化。理想的单克隆抗体将对人和鼠靶标共有的表位(在这种情况下为B7-H3)显示出高亲和力。
因此，本文提供了对人4Ig-B7-H3(皮摩尔)和小鼠2Ig-B7-H3(纳摩尔)具有高双物种亲和力的单克隆抗体MIL33B。MIL33B是从免疫过的新西兰黑/白(NZBWF1/J)小鼠开发而来，这是一种耐受性遭到破坏的品系。MIL33B抗体对人4Ig-B7-H3的亲和力高于任何已发布或商业化的抗体。对于肿瘤和人体免疫系统的中等丰度靶点，亲和力对于最大化免疫反应过程，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体药物缀合物(ADC)治疗、放射疗法和成像至关重要，并且特别是当竞争配体的局部浓度可能很高时，总是有利于连接生物学的功能抑制。所有已发布的商业化抗体，例如ch8H9 mAbs(Ahmed等人,2015)和Macrogenics(Loo等人,2012)的Kd值均大于5nM(或5,000pM)，这表示对于MIL33B具有25倍以上的亲和力优势。MIL33B抗体至少可用于免疫疗法、联合免疫检查点疗法、抗体缀合物、基于抗体的放射疗法、基于抗体的PET/SPECT显像剂、基于抗体的体外诊断。
I.定义
如本文所使用的，“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或其他语法等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸是任何长度的聚合物，该长度包含例如20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。本文所述的多核苷酸一般包含磷酸二酯键，尽管在某些情况下，包含可能具有至少一个不同键的核酸类似物，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键，以及肽核酸骨架和键。可以制备天然存在的多核苷酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同多核苷酸类似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和类似物的混合物。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、cRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任一序列的分离的DNA、任一序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后被进一步修饰，如通过与标记组分缀合。该术语还包含双链和单链分子。除非另外指定或需要，否则术语多核苷酸既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测构成双链形式的两种互补的单链形式中的每种单链形式。当多核苷酸是RNA时，多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。除非另有说明，特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现。
本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。这些术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适应于天然存在的氨基酸聚合物、含有改性残基的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在本示例中，术语“多肽”涵盖抗体或其片段。
如本文所使用的，在重组核酸技术、微生物学、免疫学、抗体工程以及分子和细胞生物学领域中使用的其他术语一般将被适用领域的普通技术人员所理解。
II.抗体和抗体修饰
如表1-3所示，本文提供了具有来自重链和轻链的克隆配对的互补决定区(CDR)的单克隆抗体。此类抗体可使用本文所述的方法生产。
本发明的单克隆抗体具有多种应用，包含生产用于检测B7-H3以及用于治疗与B7-H3水平升高有关的疾病的诊断试剂盒。在这些情况下，可以将此类抗体与诊断或治疗剂连接起来，将它们用作竞争性测定中的捕获剂或竞争剂，或单独使用它们而无需附加其他试剂。如下文进一步讨论的，抗体可以产生突变或被修饰。制备和表征抗体的方法是本领域熟知的(参见，例如，《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988；美国专利4,196,265)。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标为如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用的，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、Fd'、单链抗体(ScFv)、双抗体、线性抗体)、其突变体、天然存在的变体、包括具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及包括具有所需的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。
“分离的抗体”是已经从其自然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可能包含酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在特定情况下，纯化抗体：(1)通过Lowry方法测定的抗体重量超过95％，最特别是重量超过99％；或(2)在还原或非还原条件下，使用考马斯亮蓝或银染色通过SDS-PAGE进行均一化。分离的抗体包含重组细胞内的原位抗体，因为抗体的自然环境中至少有一种成分不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。如本文所使用的，术语“重链”是指较大的免疫球蛋白亚基，其通过其氨基末端区域与免疫球蛋白轻链结合。重链包括可变区(VH)和恒定区(CH)。恒定区进一步包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在IgE、IgM和Igγ的情况下，重链包括CH4结构域但不具有铰链结构域。本领域技术人员将理解，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4、α1-α2)。正是这条链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等能够很好的表征，并且已知可赋予功能特化。
如本文所使用的，术语“轻链”是指与重链的氨基末端区域结合的较小的免疫球蛋白亚基。与重链一样，轻链包括可变区(VL)和恒定区(CL)。轻链根据其恒定域(CL)的氨基酸序列分为kappa或lambda(κ,λ)。这些轻链中的一对可以与各种重链中的任何一对结合以形成免疫球蛋白分子。轻链的含义还涵盖具有连接至κ恒定区(C-κ)的λ可变区(V-λ)或连接至λ恒定区(C-λ)的κ可变区(V-κ)的轻链。
例如，IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的附加多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体能够聚合形成包括2-5个基本4链单元以及J链的多价组合。在IgG的情况下，4链单元通常约为150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接到一条H链，而取决于H链同种型，两条H链通过一个或多个二硫键相互连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有一个可变区(VH)，其后三个用于每个α和γ链的恒定结构域(CH)和四个用于μ和同种型的CH结构域。每条L链在N端均具有可变区(VL)，其另一端具有恒定区(CL)。VL与VH对齐，而CL与重链的第一个恒定结构域(CH1)对齐。据认为，特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见，例如，《基础与临床免疫学(Basic andClinical Immunology)》，第8版，Daniel P.Stites、Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，康涅狄格州诺沃克，1994年，第71页和第6章。
抗体的“可变区”是指抗体轻链可变区或抗体重链可变区中的一者或组合。术语“可变”是指可变区的某些区段的序列在抗体之间存在很大差异这一事实。轻链(VL)和重链(VH)部分的可变区介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布在整个可变区域中。相反，可变区由称为框架区(FR)的相对不变的延伸段组成，所述延伸段由称为互补决定区(CDR)或高变区的极端可变性较短的区域隔开。天然重链和轻链的可变区各包括由三个CDR连接的四个FR，主要采用β片层构型，形成连接β片层结构，且在某些情况下形成β片层结构的一部分的环。CDR补充了抗原的形状，并决定了抗体对抗原的亲和力和特异性。VL和VH中都有六个CDR。每条链中的CDR由FR紧密相连，并与另一条链中的CDR共同形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版，公共卫生服务(PublicHealth Service)，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达，(1991))。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，根据Kabat编号系统，位于VL中的有关残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中有关残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白的序列》，第5版，公共卫生服务(PublicHealth Service)，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，(1991))；和/或来自“高变区环”的那些残基(例如，根据Chothia编号系统，位于VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中有关残基26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)；Chothia and Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)))；和/或来自“高变区环”/CDR的那些残基(例如，根据IMGT编号系统，位于VL中的残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)，和VH中的残基27-38(H1)、56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc,M.P.等人,《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》，27:209-212(1999))，Ruiz,M.等人《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,28:219-221(2000))。任选地，当按照AHo编号时，所述抗体在VL中的以下点28，36(L1)、63，74-75(L2)和123(L3)和VsubH中的28，36(H1)、63，74-75(H2)和123(H3)中一个或多个处具有对称插入；Honneger，A.和Plunkthun，A，《分子生物学杂志》309:657-670(2001))如本文所使用的，CDR可以指由这些编号方法中的任何一种或通过这些方法的组合或通过其他期望的方法定义的CDR。此外，可以使用高度保守的核心、边界和超变区的新定义。
抗体的“恒定区”是指抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区中的单个或组合。轻链(CL)和重链(在IgM和IgE的情况下，CH1、CH2或CH3，或CH4)的恒定区赋予重要的生物学特性，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬作用(ADNP)和抗体依赖性补体沉积(ADCD)。
抗体可以是抗体片段。“抗体片段”仅包括完整抗体的一部分，通常包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。本定义涵盖的抗体片段的示例包含：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，它是在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域以及CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有单一抗体的VL和VH结构域；(vi)由VH结构域组成的dAb片段；(vii)孤立的CDR区域；(viii)F(ab')2片段，其为一种二价片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab'片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；(x)具有两个抗原结合位点的“双体”，包括与同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)；(xi)包括一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
抗体可以是嵌合抗体。“嵌合抗体”是指其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源的那些抗体，而所述链的其余部分与另一个链中的相应序列同源。例如，嵌合抗体可以是包括来自非人供体的抗原结合序列的抗体，所述抗原结合序列移植到异源的非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定域序列)。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区均模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分则与源自另一种哺乳动物的抗体的序列同源。例如，已经开发了用人类来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，而使外源抗体的可变区保持完整的方法。或者，“完全人”单克隆抗体在人免疫球蛋白基因转基因小鼠中产生。还开发了通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更多人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR来源于小鼠单克隆抗体，而框架区和恒定区来源于人氨基酸序列(参见美国专利第5,091,513和6,881,557号，它们通过引用并入本文)。人们认为，将抗体中啮齿类动物特有的氨基酸序列替换为在人抗体相应位置发现的氨基酸序列会降低治疗使用过程中发生不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可能发生基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
A.单克隆抗体
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即除了可能存在的少量天然突变外，构成该群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们可以不受其他抗体的污染而合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，在对抗原特异性B细胞进行单细胞分选后、抗原特异性浆母细胞对感染或免疫接种作出反应后或在大量分选的抗原特异性集合中从单个细胞中捕获连接的重链和轻链后，可用于本公开的单克隆抗体可通过Kohler等人在《自然(Nature)》：256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。也可以使用Clackson等人在《自然》352:624-628(1991)和Marks等人在《分子生物学杂志》222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离单克隆抗体。
用于产生各种类型的单克隆抗体，包含人源化、嵌合和完全人源化的单克隆抗体的方法在本领域是众所周知的并且是高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请：美国专利申请第2004/0126828号和2002/0172677；和美国专利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024号，提供了对此类方法的描述，均通过引用并入本文。
B.单链抗体
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白重链和轻链可变区通过短接头连接在一起的融合体。尽管去除了恒定区并引入了接头肽，但是这种嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常使特异性保持不变。scFv可以直接由源自杂交瘤或B细胞的亚克隆重链和轻链产生。单链可变片段缺少完整抗体分子中发现的恒定Fc区，因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如蛋白A/G)。这些片段通常可以使用蛋白L进行纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基，如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸构成。然而，其他残基也可以发挥作用。例如，接头可以在VHC端后面的两个残基处具有脯氨酸残基，并且在其他位置具有丰富的精氨酸和脯氨酸。
也可以通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常，轻链和重链将在不同的细胞中产生、纯化，然后以适当的方式连接在一起(即，重链的N端通过适当的化学桥连接到轻链的C端)。
交联试剂用于形成连接两个不同分子的官能团的分子桥，例如稳定剂和凝结剂。然而，预期可以产生相同类似物或由不同类似物构成的异聚复合物的二聚体或多聚体。为了逐步连接两种不同的化合物，可以使用异双功能交联剂来消除不需要的均聚物形成。
示例性异双功能交联剂包含两个反应性基团：一个与伯胺基团反应(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)；另一个与硫醇基团反应(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)。通过伯胺反应基团，交联剂可以与一种蛋白质(例如，选定的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应基团，已经与第一种蛋白质结合的交联剂与另一种蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型的含有二硫键的接头可以成功地用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。含有空间位阻二硫键的接头可能会在体内提供更大的稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
例如，SMPT是一种双功能交联剂，其含有一个被相邻苯环和甲基“空间位阻”的二硫键。人们认为，二硫键的空间位阻起到保护该键免受硫醇根阴离子(如可存在于组织和血液中的谷胱甘肽)攻击的作用，从而有助于在将附着的试剂递送至靶位点之前防止缀合物的解偶联。与许多其他已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂具有交联官能团，如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)的能力。另一种可能类型的交联剂包含含有可切割二硫键的异双功能光反应性苯基叠氮化物，如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3′-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，而苯叠氮化物(在光解时)与任意氨基酸残基非选择性反应。
除了受阻的交联剂之外，也可以根据本文使用非受阻的连接剂。其他有用的交联剂被认为不含或产生受保护的二硫化物，包含SATA、SPDP和2-亚氨基硫杂环戊烷。此类交联剂的使用在本领域中是众所周知的。也可以使用柔性接头。
美国专利第4,680,338号描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物的双功能接头，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在各种温和条件下可切割的不稳定键的可切割缀合物。这种接头特别有用，因为目标试剂可以直接与接头结合，通过切割会释放活性试剂。具体用途包含将游离氨基或游离巯基添加至蛋白质，如抗体或药物。
美国专利5,856,456提供了肽接头，用于连接多肽成分以制备融合蛋白，例如单链抗体。接头的长度可达约50个氨基酸，含有至少一次出现的带电荷氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)和脯氨酸，并且特征在于更高的稳定性和聚集的减少。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨基氧基的接头。
C.双特异性和多特异性抗体
抗体可以是双特异性抗体或多特异性抗体。“双特异性抗体”是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以与单一抗原的两个不同表位结合。其他这样的抗体可以将第一抗原结合位点与第二抗原的结合位点结合。或者，抗原特异性臂可以和与白细胞上的触发分子结合的臂组合，从而将细胞防御机制集中和定位到受感染的细胞，所述触发分子如为T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FγRIII(CD16)。双特异性抗体也可用于将细胞毒剂定位于受感染的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和与细胞毒剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)结合的臂。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。Taki等人,(2015)描述了一种双特异性抗B7-H3/抗CD3抗体。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(quadromas)产生了十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成，这相当麻烦，并且产物收率低。
根据不同的方法，具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选地，与包括铰链区、CH2和CH3区的至少一部分的Ig重链恒定结构域融合。优选具有含有轻链键合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。当构建中使用的三个多肽链的不相等比率提供所需双特异性抗体的最佳产量时，这为调整三个多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率表达导致高产量或当比率对所需链组合的产量没有显著影响时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
双特异性抗体可以由一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。这种不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离出所需的双特异性化合物，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种简便的分离方式。这种方法在WO 94/04690中公开。有关产生双特异性抗体的进一步细节参见，例如，Suresh等人,《酶学方法(Methods inEnzymology)》,121:210(1986)。
根据美国专利第5,731,168号中描述的另一种方法，可以对一对抗体分子之间的界面进行工程改造，以最大限度地提高从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在二抗分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿“空腔”。这提供了一种机制，用于提高异二聚体，而不是其他不需要的最终产物(如同源二聚体)的产量。
双特异性抗体包含交联或“异源缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，已提出了此类抗体将免疫系统细胞靶向至不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂在本领域中是众所周知的，并且公开于美国专利第4,676,980号以及许多交联技术中。
文献中也描述了由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以使用化学键制备双特异性抗体。Brennan等人,《科学(Science)》,229:81(1985)描述了一种程序，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生F(ab')2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下被还原，以稳定连位二硫醇(vicinal dithiol)并防止分子间二硫化物的形成。然后将生成的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab'-TNB衍生物重新转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
存在促进从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段的技术，这些片段可以化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》175:217-225(1992)描述了人源化双特异性抗体F(ab')2分子的生产。每个Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，并触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶点的裂解活性。
还描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术(Merchant等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》16,677–681(1998))。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(Kostelny等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,148(5):1547-1553,1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同源二聚体在铰链区被还原形成单体，然后再氧化形成抗体异源二聚体。这种方法也可用于生产抗体同源二聚体。Hollinger等人描述的“双体抗体(diabody)”技术(《美国国立科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》90:6444-6448(1993)提供了另一种制备双特异性抗体片段的机制。这些片段包括通过接头连接到VL的VH，但该接头太短，无法实现在同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。另一种通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的策略也有报道。参见Gruber等人,《免疫学杂志》,152:5368(1994)。
双特异性或多特异性抗体可以形成为DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物(参见，例如美国专利第7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400号)。通常，该技术利用特异性和高亲和力的结合相互作用，这种结合相互作用发生在cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化和对接结构域(DDD)序列和衍生自多种AKAP蛋白中的任何一种的锚定结构域(AD)序列之间(Baillie等人,《欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)》，2005；579:3264；Wong和Scott,《自然分子细胞生物学述评(Nat.Rev.Mol.CellBiol.)》2004；5:959)。DDD和AD肽可以附接到任何蛋白质、肽或其他分子上。由于DDD序列自发二聚化并与AD序列结合，因此该技术允许在可能附接到DDD或AD序列的任何选定分子之间形成复合物。
考虑了具有多于两个化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等人,《免疫学杂志》147:60,1991；Xu等人,《科学》,358(6359):85-90，2017)。抗体还可以涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列包含源自IgA的序列，其允许与J链一起形成多聚体。另一个多聚域是Gal4二聚域。
多价抗体可以比二价抗体更快地被表达与抗体结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本公开的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)，其可以容易地通过重组表达编码抗体多肽链的核酸产生。多价抗体可以包括二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包括Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况下，抗体将包括一个Fc区和三个或更多位于Fc区氨基末端的抗原结合位点。多价抗体可包括三个至约八个，例如四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包括至少一条多肽链(并且优选地两条多肽链)，其中多肽链包括两个或更多可变区。例如，多肽链可以包括VD1-(X1).sub.n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc为Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n为0或1。例如，多肽链可以包括：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体可以进一步包括至少两个(优选四个)轻链可变区多肽。例如，本文中的多价抗体可以包括约两个至约八个轻链可变区多肽。此处考虑的轻链可变区多肽包括轻链可变区，并且任选地进一步包括CL结构域。
电荷修饰在多特异性抗体的情况下特别有用，其中Fab分子中的氨基酸置换减少了轻链与不匹配的重链的错配(Bence-Jones型副产物)，这种错配可发生在基于Fab的双特异性/多特异性抗原结合分子的生产中，在它们的结合臂之一(或多个，以防分子包括多于两个抗原结合Fab分子)中具有VH/VL交换(另参见PCT公开号WO 2015/150447，特别是其中的示例，通过引用整体并入本文)。
D.BiTES
双特异性T细胞衔接器
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是一种人工双特异性单克隆抗体，其可指导宿主的免疫系统，更具体地说是T细胞的细胞毒活性，从而靶向患病细胞。BiTE是融合蛋白，由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)或来自四个不同基因的氨基酸序列组成，位于约55千道尔顿的单肽链上。其中一个scFv通过CD3受体与T细胞结合，另一个通过特定分子与受感染的细胞结合。
与其他双特异性抗体一样，不同与普通的单克隆抗体，BiTE形成了T细胞和靶细胞之间的联系。这导致T细胞通过产生穿孔素和颗粒酶等蛋白质对靶细胞发挥细胞毒活性，而与MHCI或共刺激分子的存在无关。这些蛋白质进入靶细胞并启动细胞凋亡。这种作用模拟了在T细胞攻击受感染细胞期间观察到的生理过程。
E.抗体缀合物
本公开的抗体可以与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。缀合物可以是例如与另一种蛋白质、碳水化合物、脂质或混合部分分子缀合的抗体。此类抗体缀合物包含但不限于包含将抗体连接至一种或多种聚合物的修饰。例如，抗体可以与一种或多种水溶性聚合物连接。与水溶性聚合物的连接降低了抗体在水性环境(如生理环境)中沉淀的可能性。本领域技术人员可以基于一些考虑来选择合适的水溶性聚合物，这些考虑包含但不限于，聚合物/抗体缀合物是否将用于治疗患者以及(如果是)抗体的药理学特征(例如，半衰期、剂量、活性、抗原性和/或其他因素)。
为了提高抗体分子作为诊断或治疗剂的功效，通常连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。这种分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有所需活性例如细胞毒活性的分子。已附接至抗体的效应分子的非限制性示例包含毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子被定义为可以使用测定法检测到的任何部分。已与抗体缀合的报道分子的非限制性示例包含酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、光亲和分子、有色颗粒或配体、酶(例如，催化比色或荧光或生物发光反应的酶)、底物、固体基质，如生物素。抗体可以包括这些标记中的任何一个、两个或更多个。
抗体缀合物可用于将细胞毒剂递送至靶细胞。这种类型的细胞毒剂可以提高抗体介导的细胞毒性，并且包含直接或间接刺激细胞死亡的细胞因子、放射性同位素、化学治疗药物(包含前药)、细菌毒素(例如，假单胞菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(例如，蓖麻毒素、白树毒素等)、化学缀合物(例如，美登素类毒素、加利车霉素等)、放射性缀合物、酶缀合物(例如，核糖核酸酶缀合物、颗粒酶抗体导向的酶/前药疗法)等。
抗体缀合物也用作诊断剂。抗体诊断通常分为两类，一类用于体外诊断，如各种免疫测定；另一类用于体内诊断方案，通常称为“抗体定向成像”。许多合适的显像剂是本领域已知的，它们与抗体的附接方法也是已知的(参见例如美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。使用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测物质、MR超极化分子、靶向超声气泡和X射线成像剂。
预期用作缀合物的顺磁性离子包含铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，特别优选钆。在其他情况下有用的离子，如X射线成像，包含但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)。可供选择的有用同位素是那些用于超极化MRI的同位素，如碳13和二氧化硅29。
考虑作为缀合物或共价结合用于成像和放射疗法的放射性同位素包括：砹-211、锕-225、碳-14、铋-212、铬-51、氯-36、钴-57、钴-58、铜-64、铜-67、铕-152、氟-18、镓-68、镓-67、金-198、氢-3、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、铁-52、铁-59、铅-212、镥-177、磷-32、铼-186、铼-188、铷-82、铑-99、硒-75、硫-35、钐-153、锶-92、锶-89、铊-201、[1钍-227、锝-94m、锝-99m、钇-86、钇-90、锆-86，和/或锆-89[PMID：29545378；PMID：8679266]。F-18、Zr-89和Cu-64通常是PET成像优选的。Lu-177、At-211和Yt-90通常是放射疗法的优选的。本公开的放射性标记的单克隆抗体和抗体片段可以根据本领域熟知的方法产生。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及如次氯酸钠之类的化学氧化剂或如乳过氧化物酶之类的酶促氧化剂接触而被碘化。根据本公开的单克隆抗体可以通过配体交换过程用锝-99m标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝，将还原的锝螯合到Sephadex柱上并将抗体施加到这一柱上。或者，可以使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、如SNCl2之类的还原剂、如邻苯二甲酸钾钠溶液的缓冲溶液和抗体。包含通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合到抗体上的螯合剂的中间官能团是二乙烯-三胺-五乙酸(DTPA)、乙二胺-四乙酸(EDTA)、单体或树枝状1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、去铁胺(DFO)或1-羟基-2(1H)-吡啶酮衍生物(例如3,4,3-LI(1,2-HOPO)或HOPO)。
示例性给药方案可以在美国专利第5,595,721和6,015,542号中找到，它们各自通过引用整体并入本文。例如，放射性标记的抗体可以以设计为递送大量放射性的单剂量给药。在此类方法中，考虑将大于200cGy的辐射剂量递送到患者的整个身体。在这种“高剂量”方法中，需要骨髓移植或其他一些重建患者造血功能的方法。
可以施用治疗剂量的放射性标记抗体，但是，患者接受的辐射剂量被限于对骨髓的毒性不显著的水平并且不需要通过骨髓移植或其他方式重建造血功能。在这种方法中有效的剂量范围是向患者全身递送25至200cGy，优选25至150cGy的剂量范围。
或者，可将大量未标记抗体施用于患者以施用治疗剂量的标记抗体。可以通过该治疗剂量向患者全身递送5至500cGy、优选25至150cGy的辐射剂量。
可以将痕量标记量的抗体施用于患者，然后对抗体在患者中的分布进行成像。成像后，施用放射性标记抗体的治疗方案，设计成将25至500cGy、优选25至150cGy的辐射剂量递送至患者全身。
上述剂量是单次施用的限度。这种施用可以重复，因此患者在成像和治疗过程中可能会接受更高的总累积剂量。
例如，向全身提供大约500cGy的放射性量估计为大约825mCi的I-131。待施用的放射性量部分取决于所选择的同位素。对于使用I-131的治疗方案，可采用5至1500mCi，优选量为5至800mCi，最优选5至250mCi。对于Y-90疗法，1至200mCi的放射性量被认为是合适的，优选的量是1至150mCi，最优选的是1至100mCi。根据施用的放射性量估计组织剂量的优选方法是使用示踪剂剂量进行成像或其他药代动力学方案，以便获得预测剂量测定的估计值。
全身接受200至600cGy(或更高)的“高剂量”方案通常需要骨髓替代方案的支持，因为骨髓是由于毒性而限制辐射剂量的组织。对于全身而言，优选的剂量在15至150cGy的范围内，最优选的范围是40至120cGy。使用此类“低剂量”方案，对骨髓的毒性要低得多，我们发现无需骨髓替代疗法即可实现完全缓解。
诊断和治疗施用之一或两者可以在未标记抗体的“预剂量”之前。已发现预给药对成像和治疗的影响因患者而异。通常，最好使用增加未标记抗体的预剂量进行一系列诊断成像给药。然后，在施用放射免疫治疗剂量之前使用提供了肿瘤剂量与全身剂量之间最佳比率的预剂量。
预期用作缀合物的荧光标记包含：Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(CascadeBlue)、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。
本公开中考虑的其他类型的抗体是主要旨在用于体外的那些抗体，其中抗体与二级结合配体和/或与在和生色底物接触后将产生有色产物的酶(酶标签)连接。合适的酶的示例包含脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体是生物素和抗生物素蛋白以及链霉抗生物素化合物。
本领域已知几种用于将抗体附着或缀合至其缀合物部分的方法。一些附接方法涉及使用金属螯合络合物，例如使用如二乙烯-三胺-五乙酸酐(DTPA)之类的有机螯合剂；乙二胺四乙酸；单体或树枝状1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)；DFO；HOPO；N-氯对甲苯磺酰胺；和/或附接至抗体的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体也可以在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备具有荧光素标记物的缀合物。在美国专利4,938,948中，乳腺肿瘤的成像是使用单克隆抗体实现的，并且可检测的成像部分使用接头如对羟基苯甲酸甲酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯与抗体结合。
分子与抗体的位点特异性附接的另一种已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记的反应。本质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸发生反应，从而破坏这一位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为它导致抗体缀合物失去抗原结合。
含有叠氮基的分子也可用于通过低强度紫外光产生的反应性氮烯中间体与蛋白质形成共价键。特别是，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已被用作定点光探针，以鉴定粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白。2-和8-叠氮基核苷酸也已用于绘制纯化蛋白质的核苷酸结合结构域图，并可用作抗体结合剂。
还考虑使用不改变抗体结合位点的反应条件，通过在免疫球蛋白的Fc区选择性地引入巯基来衍生免疫球蛋白。公开了根据这一方法产生的抗体缀合物，显示出寿命、特异性和敏感性的改进(美国专利5,196,066，通过引用并入本文)。公开了效应子或报道分子的位点特异性附接，其中报道分子或效应分子与Fc区中的碳水化合物残基缀合，也已在文献中公开。据报道，这种方法可以产生诊断和治疗有前景的抗体，目前正在临床评估中。
F.抗体药物缀合物
抗体药物缀合物或ADC是一类新型高效生物药物，旨在作为治疗疾病患者的靶向疗法。ADC是由抗体(整个mAb或抗体片段，如scFv)构成的复杂分子，所述抗体通过具有不稳定键的稳定化学接头连接到具有生物活性的细胞毒性/抗病毒有效载荷或药物。抗体药物缀合物是生物缀合物和免疫缀合物的示例。
通过将单克隆抗体的独特靶向能力与细胞毒性药物的抗癌能力相结合，抗体-药物缀合物可以敏感地区分健康组织和患病组织。这意味着，与传统的系统性方法相比，抗体-药物缀合物靶向并攻击患病细胞，从而减少对健康细胞的严重影响。
在基于ADC的抗肿瘤疗法的开发中，抗癌药物(例如，细胞毒素(cell toxin/cytotoxin))与特异性靶向特定细胞标记物(例如，理想情况下仅存在于患病细胞中或表面的蛋白质上)的抗体偶联。抗体靶向体内的这些蛋白质，并将抗体自身附着在患病细胞的表面。抗体与靶蛋白(抗原)之间的生化反应在靶细胞中触发信号，然后靶细胞将抗体与连接的细胞毒素一起吸收或内化。ADC被内化后，细胞毒性药物被释放并杀死细胞或损害细胞复制。在其他情况下，接头在靶细胞或早期内体的表面上是可切割的，因此不需要完全内化。由于这种靶向性，理想情况下，该药物具有较低的副作用并提供比其他药剂更宽的治疗窗口。
抗体和细胞毒剂之间的稳定连接是ADC的一个重要方面。接头基于包含二硫化物、腙或肽(可切割)或硫醚(不可切割)的化学基序，并控制细胞毒剂向靶细胞的分布和递送。可切割和不可切割类型的接头已在临床前和临床试验中被证明是安全的。本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)包含一种酶敏感的可切割接头，可将强效和剧毒的抗微管剂单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E)或MMAE(一种合成抗肿瘤剂)递送至人特异性CD30阳性恶性细胞。由于高毒性，MMAE通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂，因此不能作为单药化疗药物使用。然而，与抗CD30单克隆抗体(cAC10，一种肿瘤坏死因子或TNF受体的细胞膜蛋白)结合的MMAE组合被证明在细胞外液中是稳定的，可被组织蛋白酶切割并且对治疗是安全的。曲妥珠单抗(Trastuzumab emtansine)是另一种获批的ADC，它是通过稳定、不可切割接头附接的微管形成抑制剂mertansine(DM-1)(一种美登素的衍生物)和抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0003730287820000241
/Genentech/Roche)的组合。
更好和更稳定的接头的可用性改变了化学键的功能。接头的类型(可切割的或不可切割的)向细胞毒性(例如，抗癌)药物提供了特定的性质。例如，不可切割的接头将药物保持在细胞内。因此，整个抗体、接头和细胞毒剂进入靶细胞，在靶细胞中抗体被降解到氨基酸水平。由此产生的复合物——氨基酸、接头和细胞毒剂——现在成为活性药物。相比之下，可切割的接头由宿主细胞中或宿主细胞上的酶催化，从而释放细胞毒剂。接头切割的常用机制是蛋白酶敏感性、pH敏感性和谷胱甘肽敏感性。
另一种类型的可切割接头在细胞毒性药物和切割位点之间添加了一个额外的分子。这种接头技术使研究人员能够更灵活地创建ADC，而不必担心改变切割动力学性质。研究人员还在开发一种基于Edman降解的肽切割新方法。ADC的未来发展方向还包含开发位点特异性缀合(TDC)以进一步提高稳定性和治疗指数，以及α发射免疫缀合物和抗体缀合纳米颗粒。
G.胞内抗体
在一个特定的实施例中，抗体是适合在细胞内起作用的重组抗体——这种抗体被称为“胞内抗体”。这些抗体可能通过多种机制，如通过改变细胞内蛋白质运输、干扰酶功能和阻断蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用来干扰靶点功能。在许多方面，它们的结构模仿或平行于单链和单域抗体的结构，如上所述。实际上，单转录本/单链是允许在靶细胞中进行细胞内表达的重要特征，并且还使蛋白质跨细胞膜转运更可行。但是，还需要附加功能。胞内抗体可能需要的另一个特征是用于细胞内靶向的信号。已经设计出能够将胞内抗体(或其他蛋白质)靶向亚细胞区域(如细胞质、细胞核、线粒体和ER)的载体，并且可以商购(Invitrogen公司)。
影响胞内抗体治疗实施的两个主要问题是递送(包含细胞/组织靶向)和稳定性。关于递送，已经采用了多种方法，如组织定向递送、使用细胞类型特异性启动子、基于病毒的递送、使用细胞渗透性/膜易位肽和使用外泌体递送。一种递送方式包括使用基于脂质的纳米颗粒或外泌体，如美国专利申请公开2018/0177727中所教导的，该专利通过引用整体并入本文。关于稳定性，该方法通常是进行强力筛选，包含涉及噬菌体展示并可包含共有序列的序列成熟化或开发的方法；或进行更直接的修饰，如插入稳定序列(例如，Fc区、伴侣蛋白质序列、亮氨酸拉链)和二硫化物替换/修饰。
H.抗体的生产和纯化
产生单克隆抗体的方法通常与制备多克隆抗体的方法相同。这两种方法的第一步都是对合适的宿主进行免疫。如本领域所公知的，用于免疫的给定组合物的免疫原性可能不同。因此，通常需要增强宿主免疫系统，这可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。将多肽与载体蛋白缀合的手段在本领域中是众所周知的，并且包含戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和双-二氮杂联苯胺。如本领域所公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性和优选佐剂用于动物时包含完全弗氏佐剂(一种含有杀死的结核分枝杆菌的免疫反应的非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂，并且在用于人类时包含明矾、CpG、MFP59和免疫刺激分子的组合(“佐剂系统”，如AS01或AS03)。其他实验形式的接种以诱导抗原特异性B细胞是可能的，这些实验形式包含纳米颗粒疫苗，或在物理递送系统(如脂质纳米颗粒或金基因枪珠)中作为DNA或RNA基因递送并通过针头、基因枪或经皮电穿孔装置递送的基因编码抗原。抗原基因也可以由具有复制能力的或有缺陷的病毒载体如腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、疱疹病毒或甲病毒复制子编码，或者由病毒样颗粒编码。
产生抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，尽管在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学或电学)的存在情况下，该比例可以从大约20:1至大约1:1不等。在一些情况下，用Epstein Barr病毒(EBV)转化人B细胞作为初始步骤会增加B细胞的大小，从而增强与相对较大的骨髓瘤细胞的融合。通过在转化培养基中使用CpG和Chk2抑制剂药物可以提高EBV的转化效率。或者，人B细胞可以通过在含有额外可溶性因子(如IL-21和人B细胞激活因子(BAFF)，一种TNF超家族的II型成员)的培养基中与表达CD40配体(CD154)的转染细胞系共培养来激活。使用仙台病毒或聚乙二醇(PEG)的融合方法也是已知的。使用电诱导融合方法也是合适的。融合程序通常在低频(大约1×10-6至1×10-8)下产生可行的混合体，但通过优化程序，可以实现接近两百分之一的融合效率。然而，相对低的融合效率不会造成问题，因为通过在选择性培养基中培养，融合杂交体与亲代、注入的细胞(尤其是注入的骨髓瘤细胞，它们通常会无限期地继续分裂)分化。选择性培养基一般是一种含有阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性和优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和氮丝氨酸。氨蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤的情况下，培养基中添加了次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用氮丝氨酸时，培养基中添加了次黄嘌呤。如果B细胞来源是EBV转化的人B细胞系，则添加哇巴因(Ouabain)，以消除尚未与骨髓瘤融合的EBV转化的细胞系。
优选的选择培养基是HAT或带有哇巴因的HAT。只有能够操作核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶中存在缺陷，例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，并且它们无法存活。B细胞可以操控这一途径，但它们在培养中的寿命有限，通常会在大约两周内死亡。因此，唯一能在选择性培养基中存活的细胞是那些由骨髓瘤和B细胞形成的杂交细胞。当用于融合的B细胞来源是EBV转化的B细胞系时，如这里，哇巴因也可用于杂交体的药物选择，因为EBV转化的B细胞对药物杀伤敏感，而使用的骨髓瘤伴侣被选为具有哇巴因抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常，杂交瘤的选择是通过在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，然后测试单个克隆上清液(大约两到三周后)的所需反应性来进行的。该测定应具有灵敏、简单且快速特性，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、点免疫结合测定等。然后将选定的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞仪分选单细胞并克隆到单个产生抗体的细胞系中，然后这些克隆可以无限增殖以提供单克隆抗体。细胞系可以两种基本方式用于生产单克隆抗体。可以将杂交瘤样本(通常注入腹膜腔)注射到动物(例如小鼠)中。任选地，动物在注射前用碳氢化合物，特别是如鲸蜡(四甲基十五烷)等油类进行预处理。当以这种方式使用人杂交瘤时，最好向免疫功能低下的小鼠，如SCID小鼠注射，以防止肿瘤排斥。注射的动物产生肿瘤，分泌由融合细胞杂交产生的特异性单克隆抗体。然后可以抽取动物的体液，如血清或腹水，以提供高浓度的单克隆抗体。单个细胞系也可以在体外培养，其中单克隆抗体自然分泌到培养基中，从中可以很容易地获得高浓度的单克隆抗体。或者，人杂交瘤细胞系可用于体外，以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可以适于在无血清培养基中生长，以优化回收高纯度人单克隆免疫球蛋白的能力。
可以培养杂交瘤，然后裂解细胞并提取总RNA。随机六聚体可与RT一起使用以生成RNA的cDNA拷贝，然后使用预期扩增所有人类可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。PCR产物可以克隆到pGEM-T Easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动DNA测序进行测序。结合和中和的测定可以使用从杂交瘤上清液中收集并通过FPLC使用蛋白G柱纯化的抗体进行。
通过将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，可以产生重组全长IgG抗体，并转染到293(例如Freestyle)细胞或CHO细胞中，并且可以从293或CHO细胞上清液中收集抗体并纯化。其他合适的宿主细胞系统包含细菌，如大肠杆菌、昆虫细胞(S2、Sf9、Sf29、High Five)、植物细胞(例如，烟草，经过或不经过人类样聚糖工程化)、藻类，或用于各种非人类转基因环境，如小鼠、大鼠、山羊或奶牛中。
还考虑了编码抗体的核酸的表达，既用于随后的抗体纯化，又用于宿主的免疫。抗体编码序列可以是RNA，如天然RNA或修饰的RNA。修饰的RNA考虑了某些化学修饰，这些修饰赋予mRNA增加的稳定性和低免疫原性，从而促进治疗上重要的蛋白质的表达。例如，N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)在翻译能力方面优于其他几种核苷修饰及其组合。除了关闭免疫/eIF2α磷酸化依赖性翻译抑制之外，掺入的N1mΨ核苷酸通过增加核糖体暂停和mRNA上的密度来显著改变翻译过程的动力学特性。修饰mRNA的核糖体负载的增加使它们更容易地通过支持同一mRNA上的核糖体再循环或从头核糖体募集来实现。此类修饰可用于在接种R/NA后增强体内抗体表达。RNA，无论是天然的还是修饰的，都可以作为裸RNA递送或在递送载体中递送，如脂质纳米颗粒。
或者，编码抗体的DNA可用于相同目的。该DNA包含在一个表达盒中，该表达盒包括一个在为其设计的宿主细胞中具有活性的启动子。表达盒有利地包含在可复制载体中，如常规质粒或微型载体。载体包含病毒载体，如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒和慢病毒。还考虑了编码抗体基因的复制子，如基于VEE病毒或Sindbis病毒的甲病毒复制子。此类载体的递送可以通过针经肌肉内、皮下或皮内途径进行，或者在需要体内表达时通过经皮电穿孔来进行。
或者，可以使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。标记有目标抗原的单个B细胞可以使用顺磁珠选择或流式细胞仪分选进行物理分选，然后可以从单个细胞中分离RNA，并通过RT-PCR扩增抗体基因。或者，可以将抗原特异性大量分选的细胞群分离成微泡，并使用重链和轻链扩增子的物理连接或来自囊泡的重链和轻链基因的共同条形码从单个细胞中回收匹配的重链和轻链可变基因。通过用带有RT-PCR引物和条形码的细胞穿透纳米粒子来处理细胞，还可以从抗原特异性B细胞群中获得匹配的重链和轻链基因，以实现每个细胞用一个条形码标记转录本。抗体可变基因也可以通过杂交瘤细胞系的RNA提取来分离，通过RT-PCR获得抗体基因并克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，组合免疫球蛋白噬菌粒库由分离自细胞系的RNA制备，并通过使用病毒抗原淘选来选择表达适当抗体的噬菌粒。与传统杂交瘤技术相比，这种方法的优势在于：在一轮中可以产生大约104倍的抗体并进行筛选；并且H链和L链组合产生了新的特异性，这进一步增加了找到合适抗体的机会。
教导可用于本公开的抗体生产的其他美国专利(每一个都通过引用并入本文)包含：美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法生产嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制剂；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱方法，如FPLC或亲和色谱来纯化通过任何方式产生的单克隆抗体。本公开的单克隆抗体的片段可以通过包含用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的方法和/或通过化学还原切割二硫键的方法从纯化的单克隆抗体获得。或者，本公开所涵盖的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪来合成。
本公开的抗体可以被纯化。如本文所用，术语“纯化的”意指可从其他组分中分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得状态被纯化至任何程度。因此，纯化的蛋白质也指这样一种蛋白质，它不受其可能天然存在的环境的影响。当使用术语“基本上纯化”时，这一名称将指代一种组合物，在该组合物中，蛋白质或肽形成组合物的主要组分，如构成组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多蛋白质。
蛋白质纯化技术为本领域技术人员所熟知。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级为多肽和非多肽级分。将多肽与其他蛋白质分离后，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化目标多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。其他蛋白质纯化方法包含：用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性沉淀，然后离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和层析；以及此类和其他技术的组合。
在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可以使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其他细胞成分中纯化多肽。如本领域公知的，人们认为可以改变进行各种纯化步骤的顺序；或者可以省略某些步骤，并且仍然产生制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常，使用结合抗体Fc部分的试剂(即蛋白A)对完整抗体进行分级分离。或者，抗原可用于同时纯化和选择合适的抗体。此类方法通常利用结合到支撑物的选择剂，如柱、过滤器或珠子。抗体与支撑物结合，去除(例如，洗掉)污染物，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
鉴于本公开，用于量化蛋白质或肽的纯化程度的各种方法将是本领域技术人员已知的。这些方法包含，例如，确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。评估馏分纯度的另一种方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，从而计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于选择在纯化后使用的特定测定技术，以及表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。
众所周知，多肽的迁移会随着SDS/PAGE的不同条件而变化，有时甚至是显著变化。因此应当理解，在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可能不同。
I.抗体修饰
可以出于多种原因修饰抗体序列，如提高表达、提高交叉反应性或减少脱靶结合。修饰的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包含通过标准分子生物学技术的表达，或多肽的化学合成。
例如，人们可能希望进行修改，如将保守变化引入抗体分子。在进行此类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性在本领域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle,1982)。人们普遍认为，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这反过来又定义了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
基于亲水性可以有效地进行相似氨基酸的置换。美国专利4,554,101以引用的方式并入本文，指出蛋白质的最大局部平均亲水性，由其相邻氨基酸的亲水性决定，并且与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所述，氨基酸残基具有以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和蛋氨酸(-1.3)；疏水性非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
一种氨基酸可以被另一种具有相似亲水性的氨基酸置换，并产生一种生物或免疫学修饰的蛋白质。在此类变化中，优选亲水性值为±2以内的氨基酸的置换，特别优选亲水性值为±1以内的氨基酸，更特别优选亲水性值为±0.5以内的氨基酸的置换。
氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性置换对于本领域技术人员来说是众所周知的并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本公开还考虑了同种型修饰。通过修饰Fc区使其具有不同的同种型，可以实现不同的功能。例如，改变IgG1可以增加抗体依赖性细胞毒性，改用A类可以改善组织分布，并且改用M类可以提高效价。
人们可以通过改变C1q结合和/或FcγR结合并由此改变CDC活性和/或ADCC活性来设计具有改变的效应子功能的抗体的Fc区。“效应子功能”负责激活或减少生物活性(例如，在受试者中)。效应子功能的示例包含但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等的下调。此类效应子功能可能需要将Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用各种测定法(例如，Fc结合测定法、ADCC测定法、CDC测定法等)进行评估。
例如，可以产生具有改进C1q结合和改进FeγRIII结合的抗体的变体Fe区(例如，具有改进ADCC活性和改进CDC活性)。或者，如果希望降低或消除效应子功能，可以工程改造变体Fc区，使其具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性。在其他实施例中，可以仅增加这些活性中的仅一种，并且任选地还降低了其他活性(例如，以产生具有提高的ADCC活性但降低的CDC活性的Fc区变体，反之亦然)。
分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可含有基本上均质的聚糖，而不含唾液酸、半乳糖或岩藻糖。上述基本上均质的聚糖可以共价附接至重链恒定区。
单克隆抗体可能具有新的Fc糖基化模式。Fc区的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附接到天冬酰胺残基的侧链。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸附接，最常见的与丝氨酸或苏氨酸附接，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。将碳水化合物部分酶促附接到天冬酰胺侧链肽序列的识别序列是天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些肽序列中任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。
可以例如通过删除在多肽中发现的一个或多个糖基化位点，和/或添加在多肽中不存在的一个或多个糖基化位点来改变糖基化模式。将糖基化位点添加到抗体的Fc区可方便地通过改变氨基酸序列以使其含有一种或多种上述三肽序列来完成(对于N-连接的糖基化位点而言)。示例性糖基化变体具有重链残基Asn 297的氨基酸置换。也可以通过向原始多肽的序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(对于O-连接的糖基化位点而言)。此外，将Asn 297更改为Ala可以去除其中一个糖基化位点。
分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以存在于由GNGN或G1/G2糖型代表的基本上同质的组合物中，与不含基本上同质的GNGN糖型和含G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF或GNGNFX糖型的相同抗体相比，其显示对FcγRI和FcγRIII的结合亲和力增加。Fc糖基化在治疗性mAb的抗病毒和抗癌特性中起重要作用。核心岩藻糖的消除显著提高了由自然杀伤(NK)细胞介导的mAb的ADCC活性，但似乎对多形核细胞(PMN)的ADCC活性具有相反的作用。
分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可在表达β(1,4)-N-乙酰氨基葡糖基转移酶III(GnT III)的细胞中表达，使得GnT III将GlcNAc添加到抗体中。通过这种方式产生抗体的方法在WO/9954342和WO/03011878中提出。可以使用基因组编辑技术(如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR))来改变细胞系以增强或减少或消除某些翻译后修饰，如糖基化。例如，CRISPR技术可用于消除293或用于表达单克隆抗体的CHO细胞中编码糖基化酶的基因。
可以对从B细胞中获得的抗体可变基因序列进行工程改造，以提高其可制造性和安全性。以通过搜索与包含以下内容的位点相关的序列基序来识别潜在的蛋白质序列倾向：
1)未配对的半胱氨酸残基；
2)N-连接的糖基化；
3)Asn脱酰胺；
4)Asp异构化；
5)SYE截断；
6)Met氧化；
7)Trp氧化；
8)N端谷氨酸；
9)整合素结合；
10)CD11c/CD18结合；或
11)片段化
此类基序可以通过改变包括编码抗体的cDNA的合成基因来消除。
可以对抗体进行工程改造以提高溶解度。例如，与其他亲水残基如天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸相比，一些亲水残基如天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸对蛋白质溶解度的贡献显然更有利。
B细胞库对来自献血者的人类B细胞进行深度测序已经在大范围内进行。关于人类抗体库的重要部分的序列信息有助于对健康人类中常见的抗体序列特征进行统计评估。通过对人重组抗体可变基因参考数据库中抗体序列特征的了解，可以估计抗体序列的“似人特性(Human Likeness)”(HL)的位置特异性程度。HL已被证明可用于开发临床使用的抗体，如治疗性抗体或作为疫苗的抗体。目标是增加抗体的似人特性，以减少潜在的副作用和抗抗体免疫反应，这些反应将导致抗体药物的功效显著降低或可能诱发严重的健康影响。可以对三个健康人类献血者的总共约4亿个序列的组合抗体库的抗体特征进行评估，并创建新型的“相对似人特性”(rHL)评分，该评分专注于抗体的高变区。rHL评分允许轻松地区分人类(正评分)和非人类序列(负评分)。可以对抗体进行工程改造，以消除人类库中不常见的残基。
J.抗体的表征
根据本公开的抗体可以首先通过它们的结合特异性来定义。通过使用本领域技术人员熟知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可以确定此类抗体是否落入本权利要求的范围内。例如，与给定抗体结合的表位可以由位于抗原分子内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)氨基酸的单一连续序列组成(例如，结构域中的线性表位)。或者，该表位可由位于抗原分子内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如，构象表位)。
本领域普通技术人员已知的各种技术可用于确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包含例如常规交叉阻断测定，如在《抗体(Antibodies)》,Harlow和Lane(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港(ColdSpring Harbor)，纽约)中描述的那些技术。交叉阻断可以在如ELISA、生物层干涉法或表面等离子共振等各种结合测定中测量。其他方法包含丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)《分子生物学方法学(Methods Mol.Biol.)》248:443-63)、肽切割分析、使用单粒子重建的高分辨率电子显微镜技术、cryoEM或断层扫描、晶体学研究和NMR分析。此外，可以采用如表位切除、表位提取和抗原化学修饰等方法(Tomer(2000)《蛋白质科学(ProtSci.)》9:487-496)。可以用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对目标蛋白质进行氘标记，然后将抗体与经氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，并且受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比并非是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率经历氢-氘反交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘，并且因此表现出与并未包含在界面中的氨基酸相比相对较高的质量。在解离抗体后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，由此揭示与抗体相互作用的特定氨基酸相对应的经氘标记的残基。参见，例如，Ehring(1999)《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》267:252-259；Engen和Smith(2001)《分析生物化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A。
术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞对其作出反应的位点。B细胞表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三次折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含至少3个，更通常是至少5个或8-10个独特空间构象的氨基酸。
修饰辅助分析(MAP)，也称为基于抗原结构的抗体分析(ASAP)，是一种根据每种抗体与化学或酶修饰抗原表面的结合特征的相似性，对针对同一抗原的大量单克隆抗体进行分类的方法(参见US 2004/0101920，通过引用其整体并入本文)。每个类别可反映与另一个类别所代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。这种技术允许快速过滤基因相同的抗体，从而可以将表征集中在基因不同的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可有助于鉴定产生具有所需特征的单克隆抗体的稀有杂交瘤克隆。MAP可用于将本公开的抗体分类成结合不同表位的抗体组。
本公开包含可以结合同一表位或表位的一部分的抗体。通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与和参考抗体相同的表位结合或者与所述参考抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与和参考抗体相同的表位结合，使参考抗体在饱和条件下与靶标结合。接下来，评估测试抗体与靶分子结合的能力。如果在用参考抗抗体进行饱和结合后，测试抗体能够与靶分子结合，则可以得出结论，测试抗体与和参考抗抗体的表位不同的表位结合。另一方面，如果在用参考抗体进行饱和结合后，测试抗体不能与靶分子结合，则测试抗体可以与和参考抗体结合的表位相同的表位结合。
在另一个方面，抗体可以由它们的可变序列定义，其包含额外的“框架”区域。这些可变序列在表4中提供，代表完整的可变区。此外，任选地使用下文更详细讨论的方法，抗体序列可能与这些可变序列不同。例如，核酸序列可能与上述可变序列的不同之处在于(a)可变区可以与轻链和重链的恒定结构域分离；(b)核酸可与上述不同，但不影响由其编码的残基；(c)核酸可以与上述那些相差给定百分比的同源性，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(d)核酸可因在高严格条件(例如低盐和/或高温条件)下杂交的能力而不同于上述那些，如在约50℃至约70℃的温度下由约0.02M至约0.15M NaCl提供的；(e)氨基酸可以与上述那些相差给定百分比的同源性，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；或(f)通过允许保守置换，氨基酸可与上述不同。
当比较多核苷酸和多肽序列时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列在最大对应比对时相同，则这两个序列是“相同的(identical)”，如下所述。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口上对序列进行比较以识别和比较序列相似性的局部区域来进行。如本文所使用的，“比较窗口”是指至少约20个，通常为30至约75、40至约50个连续位置的片段，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。
可使用生物信息学软件Lasergene套件(威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司)中的Megalign程序，利用默认参数对用于比较的序列进行最佳比对。或者，用于比较的序列的最佳比对可以通过下列方式进行：通过局部同源性算法，Smith和Waterman(1981)《应用数学进展(Add.APL.Math)》2:482；通过同源性比对算法，Needleman和Wunsch(1970)《分子生物学杂志》48:443；通过相似性搜索方法，Pearson和Lipman(1988)(《美国国立科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》85:2444，这些算法通过计算机实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊的Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.)；或通过检查。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个特定示例是BLAST和BLAST 2.0，它们分别描述于Altschul等人(1977)《核酸研究》25:3389-3402和Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410中。BLAST和BLAST 2.0可以例如与本文所述的参数一起用于确定本公开的多核苷酸和多肽的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可以从美国国家生物技术信息中心公开获取。抗体序列的重排性质和每个基因的可变长度需要多轮BLAST搜索来寻找单个抗体序列。此外，不同基因的手动组装很困难且容易出错。序列分析工具IgBLAST(万维网：ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)可识别与种系V、D和J基因的匹配、重排连接处的细节、Ig V结构域框架区和互补决定区的描述。IgBLAST可以分析核苷酸或蛋白质序列，可以批量处理序列，并允许同时搜索种系基因数据库和其他序列数据库，以最大限度地减少丢失可能最匹配的种系V基因的机会。
在一种方法中，“序列同一性百分比”通过在比较窗口上在至少20个位置对两个最佳比对序列进行比较来确定，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括20％或更少，通常为5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即，间隙)。百分比通过以下来计算：确定相同核酸碱基或氨基酸残基出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量；用匹配位置的数量除以参考序列中的位置的总数(即，窗口大小)；以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
定义抗体的又另一种方式是作为本文提供的任何抗体及其抗原结合片段的“衍生物”。衍生抗体或抗体片段可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰进行修饰，包含但不限于特异性化学切割、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成等。在一个实施例中，抗体衍生物将具有与亲本抗体相似或相同的功能。在另一个实施例中，抗体衍生物将表现出相对于亲本抗体有所变化的活性。例如，衍生抗体(或其片段)可以比亲本抗体更紧密地与其表位结合或对蛋白水解具有更强的抗性。
术语“衍生物”是指与抗原免疫特异性结合但相对于“亲本”(或野生型)分子包括一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸置换、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。此类氨基酸置换或添加可引入天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”涵盖例如具有改变的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区以便例如形成抗体等的变体，和具有表现出增强或受损的效应子或结合特性的变体Fc区的变体。术语“衍生物”还涵盖非氨基酸修饰，例如，可以被糖基化(例如，改变了甘露糖、2-N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-乙二醇神经氨酸等含量)、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白质的氨基酸。在一些实施例中，改变的碳水化合物修饰调节以下一项或多项：抗体的溶解、抗体的亚细胞转运和分泌的促进、抗体组装的促进、构象完整性和抗体介导的效应子功能。在一个具体实施例中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子功能。导致抗体介导的效应子功能改变的碳水化合物修饰是本领域众所周知的。
可以确定抗体的生物物理特性。通过利用平均表观解链温度，可以利用升高的温度来展开抗体以确定相对稳定性。差示扫描量热法(DSC)用于测量分子的热容量Cp(加热它所需的热量，每度)作为温度的函数。可以使用DSC来研究抗体的热稳定性。mAb的DSC数据特别有趣，因为它有时会解析mAb结构中单个结构域的展开，从而在热谱图中产生多达三个峰(来自Fab、CH2和CH3结构域的展开)。通常，Fab结构域展开时会产生最强的峰。Fc部分的DSC曲线和相对稳定性显示出人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类的特征差异(Garber和Demarest,《生物化学与生物物理进展(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》355,751-757,2007)。还可以使用圆二色性(CD)确定平均表观解链温度，使用CD光谱仪进行。将在200至260nm范围内以0.5nm的增量测量抗体的远紫外CD光谱。最终光谱可以确定为20次累积的平均值。可以在背景减除后计算残留椭圆率值。可以在25-95℃和1℃/分钟的加热速率下，在235nm监测抗体的热展开(0.1mg/mL)。可以使用动态光散射(DLS)来评估聚集倾向。DLS用于表征包含蛋白质在内的各种颗粒的大小。如果系统在尺寸上不是分散的，则可以确定颗粒的平均有效直径。这一测量取决于颗粒核心的大小、表面结构的大小和颗粒浓度。由于DLS本质上测量颗粒引起的散射光强度波动，因此可以确定颗粒的扩散系数。商业DLA仪器中的DLS软件显示不同直径的粒子群。使用DLS可以方便地进行稳定性研究。通过确定颗粒的流体动力学半径是否增加，样品的DLS测量值可以显示颗粒是否随时间或温度变化而聚集。如果粒子聚集，则可以看到更大半径的粒子群。可以通过原位控制温度来分析取决于温度的稳定性。毛细管电泳(CE)技术包含用于确定抗体稳定性特征的成熟方法。可以使用iCE方法来解决由于脱酰胺、C端赖氨酸、唾液酸化、氧化、糖基化和任何其他可能导致蛋白质pI变化的蛋白质变化而引起的抗体蛋白质电荷变体。每种表达的抗体蛋白都可以使用Protein SimpleMaurice仪器在毛细管柱(cIEF)中通过高通量、游离溶液等电聚焦(IEF)进行评估。可以每30秒进行一次全柱紫外吸收检测，以实时监测聚焦在等电点(pIs)的分子。这种方法将传统凝胶IEF的高分辨率与基于柱的分离中的定量和自动化优势相结合，同时无需流动步骤。该技术可对表达的抗体的特性、纯度和异质性进行可重复的定量分析。结果确定了抗体的电荷异质性和分子大小，具有吸光度和天然荧光检测模式，检测灵敏度低至0.7μg/mL。
可以确定抗体序列的固有溶解度分数。可以使用CamSol Intrinsic(Sormanni等人,《分子生物学杂志》427,478-490,2015)计算固有溶解度分数。可以通过在线程序评估每个抗体片段(如scFv)的HCDR3中残基95-102(Kabat编号)的氨基酸序列，以计算溶解度分数。还可使用实验室技术确定溶解度。存在多种技术，包含将冻干蛋白加入溶液直至溶液饱和并达到溶解度极限，或通过超滤在具有合适截留分子质量的微浓缩器中进行浓缩。最直接的方法是诱导无定形沉淀，其使用硫酸铵沉淀蛋白质的方法测量蛋白质溶解度(Trevino等人,《分子生物学杂志》，366:449-460,2007)。硫酸铵沉淀可快速准确地提供关于相对溶解度值的信息。硫酸铵沉淀产生了具有明确水相和固相的沉淀溶液，并且需要相对少量的蛋白质。使用硫酸铵诱导无定形沉淀进行的溶解度测量也可以在不同的pH值下轻松完成。蛋白质溶解度高度依赖于pH，而pH被认为是影响溶解度的最重要的外在因素。
一般认为，在个体发育过程中应通过阴性选择来消除自身反应性克隆；然而，很明显，许多具有自身反应特性的人类天然存在的抗体持续存在于成人成熟的库中，并且自身反应性可能增强许多针对病原体的抗体的抗病毒功能。已经注意到，早期B细胞发育期间抗体中的HCDR3环通常富含正电荷并表现出自身反应模式(Wardemann等人,《科学》301,1374-1377,2003)。可以通过在显微镜检查(使用贴壁HeLa或HEp-2上皮细胞)和流式细胞仪细胞表面染色(使用悬浮Jurkat T细胞和293S人胚肾细胞)中评估与人源细胞的结合水平来测试给定抗体的自身反应性。也可以通过对与组织阵列中的组织的结合进行评估来调查自身反应性。
III.嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CAR)分子是重组融合蛋白，其特点是能够与抗原结合并通过存在于其细胞质尾部的免疫受体激活基序(ITAM)转导激活信号，从而激活基因修饰的免疫效应细胞进行杀伤、增殖和细胞因子的产生。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scFv)产生)的受体构建体提供了“通用”的额外优势，因为它们以不依赖HLA的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。
本文所述的CAR的实施例包含编码抗原特异性CAR多肽的核酸，所述CAR多肽包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包括抗原结合结构域的细胞外结构域。CAR可以识别由一种或多种抗原之间的共享空间构成的表位。任选地，CAR可以包括位于跨膜结构域和抗原结合结构域之间的铰链结构域。CAR可以进一步包括指导CAR表达至细胞表面的信号肽。例如，CAR可以包括来自GM-CSF的信号肽。CAR也可以与膜结合细胞因子共表达以提高持久性。例如，CAR可以与膜结合IL-15共表达。
根据CAR结构域的排列和结构域中使用的特定序列，表达CAR的免疫效应细胞可能对靶细胞具有不同水平的活性。可以将不同的CAR序列引入免疫效应细胞以产生工程细胞，选择用于升高的SRC的工程细胞，并测试所选细胞的活性以鉴定预测具有最大治疗功效的CAR构建体。
嵌合抗原受体可以通过本领域已知的任何方式产生，但优选使用重组DNA技术产生。可以通过标准的分子克隆技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scFv库、定点诱变等)制备编码嵌合抗原受体几个区域的核酸序列，并组装成完整的编码序列。所得编码区可插入表达载体并用于转化合适的表达宿主同种异体或自体免疫效应细胞，如T细胞或NK细胞。
可以将嵌合构建体作为裸DNA或在合适的载体中引入免疫效应细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利第6,410,319号。裸DNA通常是指编码嵌合受体的DNA，该嵌合受体以适当的表达方向包含在质粒表达载体中。或者，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫效应细胞。根据本发明的方法使用的合适载体在免疫效应细胞中是非复制的。已知大量基于病毒的载体，如例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体，其中维持在细胞中的病毒拷贝数低至足以维持细胞的活力的程度。
A.抗原结合结构域
抗原结合结构域可以包括单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。抗原结合区或结构域可包括源自特定小鼠、人或人源化单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链片段。该片段也可以是抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。该片段可以是由针对人密码子使用来优化以在人细胞中表达的序列编码的抗原特异性scFv。在某些方面，CAR的VH和VL结构域由接头序列如Whitlow接头分开。
原型CAR编码的scFv包括源自一种单克隆抗体(mAb)的VH和VL结构域，其与跨膜结构域和一个或多个细胞质信号传导结构域(例如共刺激结构域和信号传导结构域)偶联。因此，CAR可以包括与B7-H3结合的抗体的LCDR1-3序列和HCDR1-3序列。然而，在进一步的方面，鉴定了与目标抗原结合的更多抗体中的两种，并且构建了包括以下内容的CAR：(1)与抗原结合的第一抗体的HCDR1-3序列；(2)与抗原结合的第二抗体的LCDR1-3序列。这种包括来自两种不同抗原结合抗体的HCDR和LCDR序列的CAR可能具有优先结合抗原的特定构象的优势(例如，优先与癌细胞而非正常组织相关的构象)。
或者，可以使用源自不同mAb的VH和VL链对CAR进行工程改造，以产生一组CAR+免疫效应细胞。CAR的抗原结合结构域可以包含第一抗体的LCDR1-3序列和第二抗体的HCDR1-3序列的任何组合。
B.铰链结构域
CAR多肽可以包括位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些情况下，铰链结构域可以包括在CAR多肽中，以在抗原结合结构域和细胞表面之间提供足够距离，或减轻可能对CAR修饰的免疫效应细胞的抗原结合或效应子功能产生不利影响的空间位阻。铰链结构域可以包括与Fc受体如FcγR2a或FcγR1a结合的序列。例如，铰链序列可以包括来自与Fc受体结合的人免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE)的Fc结构域。
CAR铰链结构域可源自人免疫球蛋白(Ig)恒定区或其包含Ig铰链的部分，或源自人CD8α跨膜结构域和CD8a铰链区。CAR铰链结构域可以包括抗体同种型IgG4的铰链-CH2-CH3区。铰链结构域(和/或CAR)可以不包括野生型人IgG4 CH2和CH3序列。可以在抗体重链CH2结构域中引入点突变，以减少CAR修饰的免疫效应细胞的糖基化和非特异性Fcγ受体结合。
CAR铰链结构域可以包括Ig Fc结构域，该结构域相对于野生型Ig Fc结构域包括至少一个降低Fc-受体结合的突变。例如，CAR铰链结构域可以包括IgG4-Fc结构域，该结构域相对于野生型IgG4-Fc结构域包括至少一种降低Fc-受体结合的突变。CAR铰链结构域可以包括相对于野生型IgG4-Fc序列在对应于L235和/或N297的位置处具有突变(如氨基酸缺失或置换)的IgG4-Fc结构域。例如，CAR铰链结构域可以包括相对于野生型IgG4-Fc序列具有L235E和/或N297Q突变的IgG4-Fc结构域。CAR铰链结构域可以包括在L235位置处对于氨基酸具有氨基酸置换的IgG4-Fc结构域，所述氨基酸是亲水性的，如R、H、K、D、E、S、T、N或Q，或具有与“E”(如D)相似的性质。CAR铰链结构域可以包括在N297位置处对于氨基酸具有氨基酸置换的IgG4-Fc结构域，所述氨基酸具有与“Q”(如S或T)相似的性质。
铰链结构域可以包括与IgG4铰链结构域、CD8a铰链结构域、CD28铰链结构域或工程铰链结构域具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
C.跨膜结构域
抗原特异性细胞外结构域和细胞内信号传导结构域可以通过跨膜结构域连接。可用作跨膜结构域一部分的多肽序列包含但不限于：人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域、半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域或来自其他人跨膜信号转导蛋白(如CD16、CD8和促红细胞生成素受体)的其他跨膜结构域。例如，跨膜结构域可以包括与美国专利公开第2014/0274909号(例如CD8和/或CD28跨膜结构域)或美国专利第8,906,682号(例如CD8α跨膜结构域)中提供的序列之一具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，两者均通过引用并入本文。跨膜区可以衍生自(即至少包括跨膜区的)T细胞受体、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的α、β或ζ链。在某些特定方面，跨膜结构域可以与CD8a跨膜结构域或CD28跨膜结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
D.细胞内信号传导结构域
CAR的细胞内信号传导结构域负责激活经工程改造以表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指分化细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(helper activity)，包含细胞因子的分泌。初始、记忆或记忆型T细胞中的效应子功能包含抗原依赖性增殖。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。细胞内信号传导结构域可以来源于天然受体的细胞内信号传导结构域。此类天然受体的示例包括T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如η、δ、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc RI，以及信号分子的组合，如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB/CD137、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12、CD40、OX40/CD134及其组合，以及其他类似分子和片段。可以使用激活蛋白家族的其他成员的细胞内信号传导部分。
虽然可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个细胞内多肽。就细胞内信号传导结构域的截短部分可能有用的程度而言，这种截短部分可用于代替完整链，只要它仍能转导效应子功能信号。因此，术语“细胞内信号传导结构域”意在包含细胞内信号传导结构域的截短部分，足以在CAR与靶标结合时转导效应子功能信号。可以使用一个或多个细胞质结构域，因为所谓的第三代CAR具有至少两个或三个融合在一起的信号传导结构域以产生相加或协同效应，例如CD28和4-1BB可以组合在CAR构建体中。在某些特定方面，细胞内信号传导结构域包括与CD3ζ细胞内结构域、CD28细胞内结构域、CD137细胞内结构域或包括与4-1BB胞内结构域融合的CD28细胞内结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
E.免疫效应细胞
免疫效应细胞可以是T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、自然杀伤(NK)细胞、恒定NK细胞(invariant NK cell)或NKT细胞。本文还提供了产生和工程改造免疫效应细胞的方法以及使用和施用所述细胞用于过继细胞疗法的方法，在这种情况下，所述细胞可以是自体的或同种异体的。因此，免疫效应细胞可用作免疫疗法，如用于靶向癌细胞。
免疫效应细胞可以从受试者，特别是人类受试者中分离。免疫效应细胞可以从目标受试者中获得，如怀疑患有特定疾病或病症的受试者、怀疑易染特定疾病或病症的受试者、正在接受针对特定疾病或病症的治疗的受试者、作为健康志愿者或健康捐赠者的受试者，或来自血库。免疫效应细胞可以从存在它们的受试者中的任何组织或器官收集、富集和/或纯化，组织或器官包含但不限于：血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、在手术过程中移除和/或暴露的组织，以及通过活检程序获得的组织。分离的免疫效应细胞可以直接使用，也可以保存一段时间，如通过冷冻。
从中富集、分离和/或纯化免疫效应细胞的组织/器官可以从活体和非活体受试者中分离，其中所述非活体受试者是器官供体。从脐带血中分离的免疫效应细胞可能具有增强的免疫调节能力，如通过CD4或CD8阳性T细胞抑制来测量。免疫效应细胞可以从汇集的血液，特别是汇集的脐带血中分离，以增强免疫调节能力。汇集的血液可以来自2个或更多个来源，如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。
免疫细胞群可以从需要治疗或患有与免疫效应细胞活性降低相关的疾病的受试者获得。因此，细胞对于需要治疗的受试者来说是自体的。或者，免疫效应细胞群可获自供体，优选同种异体供体。同种异体供体细胞可能与人类白细胞抗原(HLA)相容，也可能不相容。为了使受试者相容，可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。
1.T细胞
免疫效应细胞可以是T细胞。T细胞可以来源于血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴器官。T细胞可以是人T细胞。T细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些细胞。细胞可以包含一种或多种T细胞亚群或其他细胞类型，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、激活状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位、持久能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或隔室中的存在、标记物或细胞因子分泌谱和/或分化程度限定的那些细胞类型。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。对于现成技术，细胞可以衍生自如干细胞之类的全能和/或多能细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。
在T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)的亚型和亚群中有初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞,如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。
一种或多种T细胞群可富集或耗尽对特定标记物如表面标记物呈阳性或对特定标记物呈阴性的细胞。在一些情况下，此类标记物是在某些T细胞群(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达的标记物，但在某些其他T细胞群(例如，记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的标记物。
T细胞可以通过对非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞如CD14)上表达的标记物进行阴性选择而从PBMC样品中分离出来。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4 +辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可以通过阳性或阴性选择在一个或多个初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或相对较高程度地表达的标记物而进一步分类成亚群。
CD8+T细胞可进一步富集或去除初始、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。可进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。
T细胞可以是自体T细胞。在这一方法中，从患者身上获取肿瘤样本并获得单细胞悬液。单细胞悬液可以任何合适的方式获得，例如，机械方式(例如，使用gentleMACSTMDissociator，加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotec)或酶促方式(例如，通过胶原酶或DNase)。肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白细胞介素2(IL-2)中培养。将细胞培养例如约5至约21天，优选约10至约14天直至融合(例如，约2×106个淋巴细胞)。
培养的T细胞可以合并且快速扩增。快速扩增使抗原特异性T细胞的数量在约10至约14天期间内增加至少约50倍(例如，50、60、70、80、90或100，或更多倍)。更优选地，快速扩增使抗原特异性T细胞的数量在约10至约14天期间内增加至少约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900，或更多倍)。
可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种来完成扩增。例如，在饲养淋巴细胞和白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素15(IL-15)，优选IL-2存在下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激物可包含约30ng/ml OKT3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从新泽西州拉里坦市的
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获得)。或者，在T细胞生长因子，如300IU/ml IL-2或IL-15，优选IL-2存在下，可以通过用癌症的一种或多种抗原(包含其抗原部分，如表位或细胞)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞，所述抗原可以任选地从载体表达，如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽。通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原进行再刺激，体外诱导的T细胞迅速扩增。或者，例如，可以用辐照的自体淋巴细胞或辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2重新刺激T细胞。
可以对自体T细胞进行修饰以表达促进自体T细胞生长和激活的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包含例如白细胞介(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域已知的。参见例如，Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL)》,第3版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，2001；和Ausubel等人,《现代分子生物学实验技术(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)》，格林出版合伙公司(Greene PublishingAssociates,Inc.)和约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)，纽约,1994。在特定方面，修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，如IL-12的序列，在本领域中很容易获得，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进了高水平表达。
2.NK细胞
免疫效应细胞可以是自然杀伤(NK)细胞。自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞的一个亚群，对多种肿瘤细胞、病毒感染的细胞以及骨髓和胸腺中的一些正常细胞具有自发的细胞毒性。NK细胞是对转化和病毒感染细胞的早期先天免疫反应的关键效应物。NK细胞约占人外周血淋巴细胞的10％。当淋巴细胞在白细胞介素2(IL-2)存在下培养时，会产生强烈的细胞毒性反应。NK细胞是被称为大颗粒淋巴细胞的效应细胞，因为它们的尺寸较大并且在其细胞质中存在特征性的嗜天青颗粒。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟。NK细胞可以通过特定的表面标记物，如人类的CD16、CD56和CD8来检测。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T标记CD3或表面免疫球蛋白B细胞受体。
NK细胞的刺激是通过来自细胞表面激活和抑制受体的信号串扰来实现的。NK细胞的激活状态通过从一系列种系编码的激活和抑制受体接收的细胞内信号的平衡调节。当NK细胞遇到异常细胞(例如，肿瘤或病毒感染的细胞)并且激活信号占主导地位时，NK细胞可以通过定向分泌含有穿孔素和颗粒酶的溶细胞颗粒或与含有死亡结构域的受体结合来快速诱导靶细胞凋亡。激活的NK细胞还可以分泌I型细胞因子，如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，它们可以激活先天性和适应性免疫细胞以及其他细胞因子。NK细胞在早期先天免疫反应中产生这些可溶性因子显著影响其他造血细胞的募集和功能。此外，通过物理接触和细胞因子的产生，NK细胞与树突状细胞和中性粒细胞在调节性串扰网络中发挥核心作用，以促进或抑制免疫反应。
NK细胞可以通过人类外周血单核细胞(PBMC)、未刺激的白细胞去除术产品(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、骨髓或脐带血通过本领域众所周知的方法获得。在某些方面，NK细胞是离体分离和扩增的。例如，CB单核细胞可以通过聚蔗糖密度梯度离心分离并在含有IL-2和人工抗原呈递细胞(aAPC)的生物反应器中培养。7天后，细胞培养物可能会耗尽任何表达CD3的细胞并再培养7天。可以再次耗尽细胞的CD3并表征以确定CD56+/CD3-细胞或NK细胞的百分比。在其他方法中，脐带CB可用于通过分离CD34+细胞并通过在含有SCF、IL-7、IL-15和IL-2的培养基中培养分化成CD56+/CD3-细胞来衍生NK细胞。
F.免疫效应细胞的工程改造
免疫效应细胞(例如，自体或同种异体T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定NK细胞或NKT细胞)可以进行基因工程改造，以表达抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。例如，可以对宿主细胞(例如，自体或同种异体T细胞)进行修饰以表达对B7-H3具有抗原特异性的CAR。在特定实施例中，NK细胞被工程改造以表达CAR。多种CAR，如不同的抗原，可以添加到单个细胞类型中，如T细胞或NK细胞。
细胞可以包括一种或多种通过基因工程引入的编码一种或多种抗原受体的核酸，以及这些核酸的基因工程产物。核酸可以是异源的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一种生物体或细胞获得的样品中，即通常不存在于被工程改造的细胞和/或衍生这种细胞的生物体中。核酸可能不是天然存在的，如自然界中未发现的核酸(例如嵌合的)。
IV.药物调配物
本公开提供了包括选择性靶向B7-H3的抗体的药物组合物。此类组合物包括预防或治疗有效量的抗体或其片段和药学上可接受的载体。本文还提供了包括表达CAR的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)和药学上可接受的载体的药物组合物和调配物。
短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物(如人)时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，本领域技术人员将了解包括抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包含本领域普通技术人员已知的任何和所有水性溶剂(例如，水、酒精/水溶液、盐溶液、肠胃外载体，如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，例如材料及其组合。根据众所周知的参数调整药物组合物中各种组分的pH和准确浓度。
活性成分可以配制用于肠胃外施用，例如配制用于通过静脉内、肌肉内、瘤内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，此类组合物可以制备成液体溶液或悬液；也可以制备适用于在注射前加入液体时制备溶液或悬液的固体形式；并且，制剂也可以乳化。
本实施例的治疗组合物有利地以可注射组合物的形式作为液体溶液或悬液施用；也可以制备适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。这些制剂也可以乳化。
适合注射使用的药物形式包含：无菌水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的调配物；和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流体以使其易于注射。它还应该在制造和储存条件下是稳定的，并且必须在免受如细菌和真菌等微生物的污染作用的条件下进行保存。
蛋白质组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其由如例如盐酸或磷酸等无机盐，或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机盐形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
药物组合物可以包含溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物，和植物油。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来延长可注射组合物的吸收。
如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物等形式。口服调配物可以含有标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药剂的示例在《雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)》中有描述。此类组合物将含有预防或治疗有效量的抗体或其片段，优选纯化的形式，连同合适量的载体一起提供适当对患者施用的形式。
抗体的被动转移通常涉及使用静脉内或肌肉内注射。抗体的形式可以是单克隆抗体。这种免疫通常只持续很短的时间，并且还存在超敏反应和血清病的潜在风险，尤其是来自非人类来源的丙种球蛋白。抗体将配制在适合注射的载体中，即无菌和可注射的。
通常，本公开的组合物的成分单独提供或以单位剂型混合在一起，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物，装在密封容器如安瓿或小袋中，其上标明有活性剂的量。当组合物通过注射施用时，它可以用装有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供装有无菌注射用水或盐水的安瓿，从而可以在施用前将成分混合在一起。
在某些实施例中，药物组合物可包括例如至少约0.1％的活性成分。在其他实施例中，活性成分可占单元重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及可从其中得出的任何范围。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的治疗组合物，经计算以产生上文讨论的与其施用相关的所需反应，即适当的途径和治疗方案。根据治疗次数和单位剂量，施用量取决于所需的效果。施用于患者或受试者的本实施例的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素确定，如受试者的体重、年龄、健康和性别、所治疗的疾病类型、疾病渗透的程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、施用途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，每次施用的剂量还可以包括约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(这一范围包含介于中间的剂量)或更多，以及可从其中得出的任何范围。在可从本文所列数字导出的范围的非限制性示例中，可以施用的量为约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等范围内。无论如何，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。
V.治疗方法
本实施例的某些方面可用于预防或治疗与B7-H3水平升高相关的疾病或疾状，如癌症，如肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、前列腺癌和神经外胚层癌。B7-H3的功能可由任何合适的药物降低。优选地，此类物质将是抗B7-H3抗体、抗B7-H3抗体-药物缀合物、B7-H3特异性CAR T细胞或B7-H3特异性CAR NK细胞。
“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指为了获得疾病或健康相关病况的治疗益处的目的，对受试者施用或应用治疗剂或对受试者执行程序或疗法。例如，治疗可以包含：通过单独或组合使用化学疗法、免疫疗法或放射疗法、实施手术或其任意组合施用药物有效量的靶向B7-H3的抗体。
如本文所使用的，术语“受试者”是指对其进行本方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，尽管如本领域技术人员将理解的，受试者可以是动物。因此，其他动物，包含哺乳动物，如啮齿动物(包含小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、农场动物(包含牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)包含在受试者的定义中。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指任何促进或增强受试者在这种病况的医学治疗方面的健康的事物。这包含但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可以涉及例如减小肿瘤的大小、减小肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的受试者的生存期。
如本文所使用的，术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施例中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。
癌症可能特别具有以下组织学类型，但不限于：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病腺癌；实体癌；恶性类癌；鳃-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜形成的硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性男性细胞瘤；塞尔托利氏细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤(amelanoic melanoma)；浅表扩散黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金式；副肉芽肿；恶性淋巴瘤；小淋巴细胞；大细胞、弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。尽管如此，还应认识到本发明还可用于治疗非癌性疾病(例如，真菌感染、细菌感染、病毒感染、神经退行性疾病和/或遗传疾病)。
在某些实施例中，本实施例的组合物和方法涉及针对B7-H3的抗体或抗体片段，其与第二或附加疗法如化学疗法或免疫疗法组合。这种疗法可用于治疗与B7-H3升高有关的任何疾病。例如，疾病可以是癌症。
包含联合疗法的方法和组合能够增强治疗或保护效果，和/或增加另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗效果。治疗和预防方法和组合物可以以有效达到所需效果(如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。这一过程可能涉及使细胞与抗体或抗体片段以及第二疗法接触。可以使组织、肿瘤或细胞与包括一种或多种试剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或多种组合物或药理学调配物接触，或使组织、肿瘤和/或细胞与具有两种或更多种不同组合物或调配物接触，其中一种组合物提供了：1)抗体或抗体片段；2)抗癌剂；或3)抗体或抗体片段和抗癌剂。此外，预期这种联合疗法可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法、免疫疗法或放射免疫疗法结合使用。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置的过程。例如，为了实现细胞杀伤，将两种药剂以有效杀伤细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。
抗体可以在抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用的时间间隔可以从同时到数分钟到数天到数周。在抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的实施例中，通常会确保在每次交付之间不会有很长的时间到期，使得这两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合效果。在这种情况下，预期可以在彼此相距约12至24小时或72小时内，更具体地，在彼此相距约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中在各个施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些实施例中，一个疗程将持续1-90天或更长时间(此范围包含介于中间的天数)。预期可以在第1天至第90天的任何一天(此范围包含介于中间的天数)或其任何组合给予一种药剂，并且在第1天至第90天的任何一天给予另一种药剂(此类范围包含介于中间的天数)或其任何组合。在一天(24小时)内，可给予患者一次或多次施用。此外，在一个疗程之后，预期有一段时间不施用抗癌治疗。这一时间段可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间(此范围包含介于中间的天数)，这取决于患者的状况，例如他们的预后、强度、健康等。预计治疗周期将根据需要重复。
可以采用各种组合。对于下面的示例，抗体疗法是“A”，抗癌疗法是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施例的任何化合物或疗法施用于患者将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施例中有监测可归因于联合治疗的毒性的步骤。
A.化学疗法
根据本实施例，可以使用多种化疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的活动模式，例如，它们是否以及在什么阶段影响细胞周期进行分类。或者，可以基于其直接交联DNA、嵌入DNA、通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征试剂。或者，药剂可抑制细胞中的特定酶活性，例如，抑制激酶、磷酸酶、脂肪酶、甲基转移酶、乙基转移酶、双加氧酶；或者，药剂可以阻断激素活性、抑制信号转导、改变基因表达、诱导细胞凋亡或抑制血管生成，或者药剂可以包括癌症疫苗或基因疗法。
化疗剂的示例包含烷化剂，如噻替哌(thiotepa)及环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺及甲基密胺，包含六甲密胺、三乙撑密胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺及三羟甲基密胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包含合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包含其合成类似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γlI及卡奇霉素Ωl1；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；双膦酸盐类，如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包含吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素，如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫胺嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯酮(testolactone)；抗肾上腺素，如米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美坦辛(maytansinoid)，如美坦辛(maytansine)和柄型菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼群克林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣疱菌A(verrucarin A)、杆孢菌A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(doxetaxel)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位复合物，如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、普利霉素(plicomycin)、吉西他滨(gemcitabien)、纳维滨(navelbine)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、转铂,以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
或者，可以根据本实施例使用多种分子靶向治疗剂中的任何一种。示例包含但不限于酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、PARP1/2抑制剂、血管生成抑制剂、激素阻断剂、基因表达调节剂、表观遗传修饰剂和信号转导抑制剂。
B.放射疗法
导致DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包含通常所说的γ射线、X射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其他形式的DNA损伤因子，如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和紫外线辐照。很可能所有这些因素都会对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维护产生大范围的损害。X射线的剂量范围为从每天50至200伦琴的长期(3至4周)日剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
C.免疫疗法
技术人员将理解免疫疗法可以与实施例的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003730287820000521
就是这样一个示例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某个标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应物，也可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化疗药物、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包含细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标记物，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标记物并且这些中的任何一个都可能适合于在本实施例的上下文中进行靶向。常见的肿瘤标记物包含CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包含：细胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子，如FLT3配体。
目前正在研究或使用的免疫疗法的示例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。或者，阻断肿瘤细胞上的“不要吃我(don't eat me)”信号(CD24)代表另一种策略[PMID:31367043]。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施例中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)，要么调低信号。免疫检查点阻断可能靶向的免疫检查点蛋白包含：腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、CXCL9、CXCR5、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)、HLA-DRB1、ICOS(也称为CD278)、HLA-DQA1、HLA-E、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3，也称为CD223)、Mer酪氨酸激酶(MerTK)、NKG7、OX40(也称为CD134)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1，也称为CD274)、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)，以及T胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA，也称为C10orf54)。特别是，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，如小分子、配体或受体的重组形式，或抗体，如人抗体(例如，国际专利公开WO2015/016718；Pardoll，《癌症自然评论(Nat Rev Cancer)》,12(4):252-264,2012；两者均通过应用并入本文)。可以使用已知的免疫检查点蛋白抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员所知，替代和/或等效名称可用于本公开中提及的某些抗体。这样的替代和/或等效名称在本公开的上下文中是可互换的。例如，众所周知，帕博利珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等效名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伙伴结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合伙伴是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施例中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合伙伴结合的分子。在具体方面，PD-L1结合伙伴是PD-1和/或B7-1。在另一个实施例中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合伙伴结合的分子。在具体方面，PD-L2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体在美国专利第8,735,553、8,354,509和8,008,449号中进行了描述，所有这些都通过引用并入本文。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，如美国专利申请公开第2014/0294898、2014/022021和2011/0008369号中所述，所有这些都通过引用并入本文。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施例中，抗PD-1抗体选自由尼沃鲁单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011组成的群组。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包括融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。尼沃鲁单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003730287820000541
是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck 3475、帕博利珠单抗、
Figure BDA0003730287820000542
和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是一种描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PD-L2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，当与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA-4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中，可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4(一种B7分子的抑制性受体)的表达增加。
在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于美国专利第8,119,129号；PCT公开第WO 01/14424、WO 98/42752、WO 00/37504号(CP675,206，也称为替西木单抗(tremelimumab)；以前称为ticilimumab)；美国专利第6,207,156号；Hurwitz等人(1998)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA),95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncology)》,22(145):摘要No.2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)《癌症研究(Cancer Res)》,58:5301-5304公开的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中。上述出版物中的每一个的教导通过引用并入本文。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体在国际专利申请第WO2001/014424、WO2000/037504号和美国专利第8,017,114号中有所描述；其全部通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体是易普利姆玛(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003730287820000551
)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 01/14424)。在其他实施例中，抗体包括易普利姆玛的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施例中，抗体包括易普利姆玛的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及易普利姆玛的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施例中，抗体与上述抗体竞争结合和/或结合CTLA-4上的相同表位。在另一个实施例中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与易普利姆玛具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。用于调节CTLA-4的其他分子包含：如美国专利第5844905、5885796号和国际专利申请第WO1995001994和WO1998042752号中描述的CTLA-4配体和受体，其全部通过引用并入本文；以及例如美国专利第8329867号中描述的免疫粘附素，其通过引用并入本文。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是淋巴细胞激活基因3(LAG-3)，也称为CD223。人LAG-3的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP-002277。LAG-3存在于激活的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞的表面。LAG-3在与抗原呈递细胞表面的MHC II类结合时充当“关闭”开关。LAG-3的抑制会激活效应T细胞并抑制调节性T细胞。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-LAG-3抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗LAG-3抗体。示例性抗LAG-3抗体是瑞拉利单抗(relatlimab)(也称为BMS-986016)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 2015/116539)。其他示例性抗LAG-3抗体包含TSR-033(参见，例如，WO 2018/201096)、MK-4280和REGN3767。MGD013是一种抗LAG-3/PD-1双特异性抗体，描述于WO 2017/019846中。FS118是一种抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体，描述于WO 2017/220569中。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是T细胞激活的V域Ig抑制因子(VISTA)，也称为C10orf54。人VISTA的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_071436。VISTA存在于白细胞上并抑制T细胞效应子功能。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗VISTA3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-VISTA抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗VISTA抗体。示例性抗VISTA抗体是JNJ-61610588(也称为奥瓦利单抗(onvatilimab))(参见，例如，WO 2015/097536、WO2016/207717、WO 2017/137830、WO 2017/175058)。VISTA也可以用选择性地靶向PD-L1和VISTA的小分子CA-170来抑制(参见，例如，WO 2015/033299、WO 2015/033301)。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种具有免疫功能的代谢蛋白是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。人IDO的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_002155。在一些实施例中，免疫抑制剂是小分子IDO抑制剂。示例性的小分子包含BMS-986205、艾卡哚司他(epacadostat)(INCB24360)和那伏莫德(navoximod)(GDC-0919)。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是CD38。人CD38的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_001766。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗CD38抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-CD38抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗CD38抗体。示例性抗CD38抗体是达雷木单抗(daratumumab)(参见，例如，美国专利第7,829,673号)。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是ICOS，也称为CD278。人ICOS的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_036224。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗ICOS抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-ICOS抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗ICOS抗体。示例性抗ICOS抗体包含JTX-2011(参见，例如，WO 2016/154177、WO 2018/187191)和GSK3359609(参见，例如，WO2016/059602)。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。人TIGIT的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_776160。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗TIGIT抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-TIGIT抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗TIGIT抗体。示例性抗TIGIT抗体是MK-7684(参见，例如，WO 2017/030823，WO2016/028656)。
可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是OX40，也称为CD134。人OX40的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_003318。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗OX40抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-OX40抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗OX40抗体。示例性抗OX40抗体是PF-04518600(参见，例如，WO 2017/130076)。ATOR-1015是靶向CTLA4和OX40的双特异性抗体(参见，例如，WO 2017/182672、WO 2018/091740、WO 2018/202649、WO 2018/002339)。
在本文提供的方法中可以靶向的另一种免疫检查点蛋白是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)，也称为TNFRSF18和AITR。人GITR的完整蛋白质序列具有Genbank登录号NP_004186。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗GITR抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人-GITR抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗GITR抗体。示例性抗GITR抗体是TRX518(参见，例如，WO 2006/105021)。
在一些实施例中，免疫疗法可以是过继性免疫疗法，其涉及离体产生的自体抗原特异性T细胞的转移。用于过继免疫疗法的T细胞可以通过扩增抗原特异性T细胞或通过基因工程重定向T细胞来产生(Park，Rosenberg等人,2011)。肿瘤特异性T细胞的分离和转移已被证明可成功治疗黑色素瘤。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CARs)的遗传转移成功地产生了T细胞的新特异性(Jena,Dotti等人,2010)。CAR是合成受体，由与单个融合分子中的一个或多个信号传导结构域相关的靶向部分组成。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包括通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来自CD3zeta或Fc受体γ链的细胞质区域。CAR已经成功地让T细胞被重新定向到来自各种恶性肿瘤(包含淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原(Jena,Dotti等人,2010)。
在一个实施例中，本申请提供了一种用于治疗癌症的联合疗法，其中该联合疗法包括过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。在一方面，过继性T细胞疗法包括自体和/或同种异体T细胞。在另一个方面，自体和/或同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。
D.手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包含预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包含切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏，并且可以与其他疗法，如本实施例的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法结合使用。肿瘤切除是指对至少部分肿瘤进行物理切除。除肿瘤切除外，手术治疗还包含激光手术、冷冻手术、电手术和显微镜控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，体内可能会形成空腔。治疗可以通过对该区域进行灌注、直接注射或局部应用以及额外的抗癌疗法来完成。此类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以有不同的剂量。
E.其他药剂
预期其他药剂可以与本实施例的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些另外的药剂包含影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化药剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施例中，细胞抑制剂或分化剂可以与本实施例的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑使用细胞粘附抑制剂来提高本实施例的功效。细胞粘附抑制剂的示例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步预期增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂，如抗体c225，可以与本发明实施例的某些方面组合使用以提高治疗功效。
VI.检测方法
在一些方面，本公开涉及用于检测B7-H3表达的免疫检测方法。多种测定形式被考虑用于检测蛋白质产品，包含免疫组织化学法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、斑点印迹、FACS分析、质谱流式细胞术(CyTOF)、成像质量流式细胞术(IMC)和蛋白质印迹法等等。各种有用的免疫检测方法的步骤已在科学文献中进行了描述。一般而言，免疫结合方法包含：获得样品，在有效允许形成免疫复合物的条件下，使样品与待检测蛋白质的特异性抗体接触。通常，免疫复合物形成的检测在本领域是众所周知的并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标记物的检测，如那些放射性、金属、荧光、生物和酶标记任何一种。检测方法可能涉及离体成像，如CyTOF或IMC。或者，检测方法可涉及体内成像，如PET或SPECT成像。当然，如本领域已知的，人们可以通过使用二级结合配体如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列发现额外的优势。
检测中使用的抗体本身可以与可检测标记连接，然后可以简单地检测这一标记，从而可以确定组合物中初级免疫复合物的量。或者，可以通过对抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测结合在初级免疫复合物中的第一抗体。在这些情况下，第二结合配体可以与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，因此可以称为“二级”抗体。初级免疫复合物与标记的二级结合配体或抗体在有效条件下接触足够长的时间以形成二级免疫复合物。然后一般洗涤二级免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记二级抗体或配体，然后检测二级免疫复合物中剩余的标记。
在一些方面，本公开提供了使用本公开的化合物和组合物进行成像的方法。在一些实施例中，成像是正电子发射断层扫描。正电子发射断层扫描(PET)成像基于检测来自发射正电子的放射性同位素的两个时间一致的高能光子。PET成像的独特之处在于其非常高的灵敏度和对体内放射性示踪剂浓度的准确估计。PET成像已被广泛用作肿瘤学、心血管和神经学应用的重要临床模式。PET成像也已成为临床前研究的重要工具，特别是用于研究疾病的小鼠模型和其他小动物模型。
如本文所使用的，术语“样品”是指适用于本发明提供的检测方法的任何样品。样品可以是包括适用于检测或分离的材料的任何样品。样本来源包括血液、胸膜液、腹膜液、尿液、唾液、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液和支气管冲洗液。在一方面，样品是血液样品，包括例如全血或其任何部分或组分。适用于本发明的血液样品可以从任何已知来源提取，包括血细胞或其成分，如静脉、动脉、外周、组织、脐带等。例如，可以使用众所周知的常规临床方法(例如，抽取和处理全血的程序)来获得和处理样品。在一方面，示例性样品可以是取自患有癌症的受试者的外周血。在一些方面，生物样品包括多个细胞。在某些方面，生物样品包括新鲜或冷冻组织。在特定方面，生物样品包括福尔马林固定的石蜡包埋组织。在一些方面，生物样品是组织活检、细针抽吸物、血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、粪便、唾液、循环肿瘤细胞、外来体或抽吸物和身体分泌物，如汗液。在一些方面，生物样品含有无细胞DNA。
VII.调配物和给药途径
在另一个方面，为了向需要诊断评估和/或治疗的患者，施用放射性药物调配物(还称为放射性药物制剂、放射性药物组合物、放射性药物或放射性药物产品)包括诊断或治疗有效量的本文公开的放射性标记的化合物，其与一种或多种适于指定给药途径的赋形剂和/或药物载体一起配制。
在一些实施例中，本文公开的放射性标记的化合物以适于诊断评估或治疗人和/或兽医受试者的方式配制。在一些实施例中，调配物包括将一种或多种本文公开的放射性标记化合物与一种或多种以下赋形剂混合或组合：乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇。在一些实施例中，化合物可以溶解或浆化在水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲液中。在一些实施例中，药物调配物可以进行药物操作，如灭菌，和/或可以含有药物载体和/或赋形剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、包封剂，如脂质、树枝状高分子和聚合物、蛋白质，如白蛋白、核酸和缓冲液。
放射性药物调配物可以通过多种方法施用，如通过注射(例如，皮下、静脉内、瘤内和腹膜内)。根据施用途径，本文公开的放射性标记化合物可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中施用于患者。药学上可接受的稀释剂包含盐水和水性缓冲溶液。脂质体包含水包油包水CGF乳液以及常规脂质体。本文公开的放射性标记的化合物还可以胃肠外、腹膜内、瘤内、脊柱内或脑内给药。分散体可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在一般储存和使用条件下，这些制剂可能含有防腐剂以防止微生物生长。
适用于可注射用途的放射性药物组合物包含无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物，和植物油。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇如甘露醇和山梨糖醇。可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝或明胶来延长可注射组合物的吸收。
在一些实施例中，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式可能是有利的，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗患者的单位剂量的物理离散单位；每个单元含有预定数量的放射性药物，经计算可产生与所需药物载体相关的所需成像效果。在一些实施例中，本公开的剂量单位形式的规格由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)放射性药物的独特特性和要实现的特定成像效果；和(b)为患者成像而配制这种放射性药物的技术的固有限制。在一些实施例中，活性化合物以足以产生患者免疫活性的PET图像的有效剂量施用。例如，可以在动物模型系统中评估化合物的功效，该动物模型系统可以预测在人或其他动物中成像免疫活性的功效。
VIII.试剂盒
在实施例的各个方面，设想试剂盒含有治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂。在一些实施例中，提供了用于制备和/或施用实施例的疗法的试剂盒。试剂盒可以包括一个或多个密封小瓶，该小瓶装有本实施例的任何药物组合物。试剂盒可以包括例如至少一种B7-H3抗体或B7-H3特异性CAR构建体，以及用于制备、配制和/或施用实施例的组分或执行本发明方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施例中，试剂盒还可以包括合适的容器，该容器是不会与试剂盒的组分发生反应的容器，例如eppendorf管、酶联板、注射器、瓶子或试管。容器可以由可消毒的材料制成，如塑料或玻璃。
试剂盒进一步可以包含说明书，该说明书概述了本文所述方法的程序步骤，并且将遵循与本文所述或本领域普通技术人员已知的基本相同的程序。指令信息可以存储在含有机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行这些指令时，将导致递送药学有效量的治疗剂的真实或虚拟过程的显示。
IX.实例
包含以下实例以便说明本公开的说明性、非限制性实施例。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应了解，可在不脱离本公开的精神和范围的情况下在所披露的特定实施例中进行多种变化，同时仍获得相同或类似结果。
实例1–产生靶向B7-H3的治疗性抗体
新西兰黑白F1杂交小鼠(NZBWF1/J，杰克森实验室(Jackson Labs)，库存号100008)用于产生针对B7-H3的抗体。NZBW小鼠被广泛用作类似于人类系统性红斑狼疮的自身免疫性疾病的模型，从而导致免疫球蛋白、抗核抗体、抗胸腺细胞抗体和严重进行性肾小球肾炎水平升高。这些自身免疫特性源于自我耐受的缺陷。在本文中，通过给动物接种适当的来源来利用NZBWF1/J菌株对自身抗原的破坏的耐受性，该来源包括表达鼠和人B7-H3的细胞，其中针对B7-H3表位或生物类似物的候选鼠自身抗体不会被宿主免疫处理消除。因此，从血清中回收对人(外来)和鼠(自身)表位均有反应的高亲和力单克隆抗体的可能性增加。
除了天然鼠2Ig-B7-H3，通过用编码人4Ig-B7-H3的定制慢病毒(GeneCopoeia公司)转导，小鼠L细胞(ATCC)被工程改造为在其细胞表面表达人4Ig-B7-H3。将全细胞(10×106个细胞/接种)接种到NZBWF1/J小鼠中六次，产生了1,440个杂交瘤克隆。筛选产生了14个候选杂交瘤细胞系，通过标准ELISA免疫筛选发现其与4Ig-B7-H3 L细胞结合。在这些候选物中，针对HeLa细胞(表达高水平的人4Ig-B7-H3)的上清液的二次测试产生了一种高亲和力候选物。在扩增和抗体纯化后，通过生物层干涉法的进一步分析发现并表征了MIL33B，它是对人4Ig-B7-H3具有pM亲和力并对鼠2Ig-B7-H3具有nM亲和力的候选物。
将MIL33B杂交瘤颗粒冷冻并送到测序核心设施(田纳西州纳什维尔的范德比尔特测序中心(Vanderbilt Sequencing Center))，用于对重链和轻链的高变区进行测序。MIL33B的同种型已被确定为IgG2a。MIL33B抗体的互补决定区(CDR)和可变区在表1-3中提供。
表1.IMGT/DomainGapAlign预测的MIL33B抗体可变序列的CDR(Ehrenmann等人,2010；Ehrenmann&Lefranc,2011)。
Figure BDA0003730287820000621
表2.Paratome预测的MIL33B抗体可变序列的CDR(Kunik等人,2012a；Kunik等人,2012b)。
Figure BDA0003730287820000622
Figure BDA0003730287820000631
表3.Chothia预测的MIL33B抗体可变序列的CDR。
Figure BDA0003730287820000632
表4.MIL33B可变区的蛋白质序列。
Figure BDA0003730287820000633
表5.MIL33B可变区的核苷酸序列。
Figure BDA0003730287820000634
实例2–MIL33B以pM亲和力与人4Ig-B7-H3结合
通过ELISA评MIL33B对4Ig-B7-H3和小鼠2Ig-B7-H3的体外结合亲和力。购买人4Ig-B7-H3和鼠2Ig-B7-H3的细胞外结构域并铺板到96孔板上。然后将板与不同浓度的纯化MIL33B一起孵育。然后洗涤板并通过吸光度测量来评估抗体结合。本实验针对MIL33B的三个独立生产和纯化完成。计算并绘制每批次每条曲线的EC50(对数图)(图1)。MIL33B对人4Ig-B7-H3具有皮摩尔亲和力，对小鼠2Ig-B7-H3具有纳摩尔亲和力。
实例3–MIL33B与人4Ig-B7-H3选择性结合
所示B7家族蛋白的细胞外结构域购自R&D Systems。供应商对所有蛋白质的纯度和功能性进行验证。Kd值是在“亲和”模式下使用捕获生物层干涉仪(Octet，MolecularDevices)测定的，其中MIL33B抗体被捕获在探针的尖端并置于含有不同浓度目标细胞外结构域的溶液中。Kd、Kd误差和R2值报告在表6中。MIL33B与人4Ig-B7-H3结合的示例性拟合图在图2中示出。这些数据表明MIL33B与4Ig-B7-H3的结合比与其他B7家族成员的结合要好上至少1000倍。
表6：将MIL33B与各种B7家族成员结合。
目标蛋白质 Kd(M) Kd误差(M) R<sup>2</sup>
人4Ig-B7-H3 7.23E-11 5.96E-12 0.9962
人2Ig-B7-H3 5.8E-10 5.17E-11 0.9532
鼠2Ig-B7-H3 4.11E-08 2.98E-09 0.93
人B7-H1 >1.0E-6 1.15E-07 0
鼠B7-H1 >1.0E-6 1.15E-07 0
人PD-1 >1.0E-6 1.15E-07 0
鼠PD-1 >1.0E-6 1.24e-08 0
人PD-L2 >1.0E-6 3.77E-08 0
鼠PD-L2 >1.0E-6 4.52E-09 0
人B7-H2 >1.0E-6 1.0E-12 0
鼠B7-H2 >1.0E-6 4.19E-09 0
人B7-H4 >1.0E-6 5.78E-16 0
鼠B7-H4 >1.0E-6 2.21E-11 0
实例4–荧光标记的MIL33B与B7-H3表达细胞与同种型对照选择性结合
用Alexa594荧光团标记的MIL33B用于活细胞免疫荧光显微镜检查，以证明与肿瘤细胞上表达的人和鼠B7-H3的选择性、可阻断结合。鼠乳腺肿瘤，4T1细胞(ATCC)，被人4Ig-B7-H3或使用慢病毒构建体的空载体稳定转导。选择的细胞显示出与已知表达B7-H3的人实体瘤，如宫颈癌(HeLa)或结肠直肠癌(HCT 116)中内源性发现的细胞相匹配的4Ig-B7-H3表达水平(图3)。这些工程细胞提供了相关模型。
MIL33B或同种型对照IgG2a使用市售试剂盒(《生命科技(Life Technologies)》)以1mg/mL用Alexa594荧光团标记，并通过尺寸排阻柱纯化。所得产品命名为MIL33B-A594或IgG2a-A594。通过UV/Vis光谱法对标记产量进行量化。
表达人4Ig-B7-H3的细胞单独、与标记的MIL33B(1μg/mL)或鼠同种型对照IgG2a(1μg/mL)在37℃下孵育1小时。在加入1μg/mL的MIL33B-A594之前，先用50μg/mL的未标记MIL33B孵育细胞，进行封闭实验。洗涤细胞并通过荧光显微镜检查(TiE，Nikon)成像。抗体结合(红色)与核染色(蓝色)共同作用(图4A和B)。
Pan02细胞是一种已知表达鼠2Ig-B7-H3的鼠源性胰腺肿瘤，使用100μg/mL的MIL33B-A594对MIL33B-A594进行了类似的成像，反映了从人4Ig-B7-H3到鼠2Ig-B7-H3的约100倍的Kd变化(图4C)。
实例5–鞭毛蛋白缀合的MIL33B通过TLR5诱导NF-κB途径
MIL33B与TLR5激动剂鞭毛蛋白缀合，在活细胞测定中保持nM结合亲和力，并能够通过TLR5诱导炎症途径，如NF-κB。
纯化的鞭毛蛋白(InvivoGen)通过市售的接头试剂盒与MIL33B结合(见图)。通过UV-Vis光谱法验证缀合，双蛋白质印迹证实>90％的抗体缀合至更高分子量的物质并且该物质还含有鞭毛蛋白(图5)。预计抗体与配体缀和后会丧失亲和力。由于抗体的初始pM亲和力，通过ELISA测定，在与鞭毛蛋白缀合后，缀合物对人4Ig-B7-H3的EC50仍保持为36nM(图5，右图)。
表达内源性人4Ig-B7-H3和TLR5(鞭毛蛋白的天然同源受体)的HCT116细胞被κB-RE5-IκBα-Fluc报告基因稳定转导。如通过光产量的损失读出的，这一细胞系能够通过IκBα-荧光素酶(IκBα-Fluc)融合蛋白的初始降解来研究IKK的激活；以及如通过来自κB响应元件(RE5)的光产量的二次增加读出的，能够通过IκBα-Fluc的再合成来研究NF-κB转录靶标的后续激活(图6A-B)。MIL33B-flgn缀合物能够通过TLR5在18.2nM下引发NF-κB的激活，其响应能力类似于1.8nM的纯化鞭毛蛋白(图6C-D)。因此，MIL33B缀合物可用于将免疫刺激剂特异性递送至肿瘤微环境。
实例6–MIL33B mAb可以与DFO缀合并用89Zr放射性标记，以通过PET成像在同基因动物肿瘤模型中选择性地检测人4Ig-B7-H3的肿瘤表达
用Zr-89对MIL33B进行放射性标记，用于表达B7-H3的肿瘤的PET成像，在两种不同的免疫活性同基因小鼠肿瘤模型中显示出稳健的信噪比。
使用标准缀和方法将MIL33B(蓝色)或IgG2a同种型对照(红色)抗体与DFO缀和。MIL33B-DFO或IgG2a-DFO通过在醋酸盐缓冲液(pH 7)中孵育1小时，用89Zr进行放射性标记，并通过尺寸排阻色谱法纯化。通过无线电-TLC确认标记。
使用具有表达4Ig-B7-H3或阴性载体(参见图3中的蛋白质印迹)的皮下4T1肿瘤的免疫活性小鼠。4T1肿瘤也具有低但可检测水平的鼠2Ig(参见图3中的蛋白质印迹)。给小鼠注射(i.v.)约30μCi放射性标记的MIL33B抗体或IgG2a对照抗体，并在注射后24和72小时在专用的小动物PET/SPECT/CT扫描仪(Albira，Bruker公司)上成像。类似地，用人4Ig-B7-H3或空载体转导B16F10细胞。这些细胞的内源性鼠2Ig-B7H3少于4T1肿瘤。在与表达人4Ig-B7-H3的肿瘤结合方面，MIL33B在定性和定量方面均优于同种型对照，并且根据其低背景鼠2Ig-B7-H3表达水平预测，给出了与阴性载体结合的正确排序顺序(图7)。
实例7–MIL33B mAb单药剂治疗治愈侵袭性抗ICT人源化B16F10肿瘤
MIL33B抗体(i.p.)的施用在高度抗ICT同基因鼠乳腺癌模型中显示出作为单一药剂免疫治疗剂的治疗潜力。
鼠B16F10黑色素瘤代表一种非炎症性“冷”肿瘤类型，已知在同时使用抗PD-1和抗CTLA-4治疗时对联合免疫检查点疗法(ICT)具有抗性。人源化B16F10肿瘤(如上所示)经工程改造以表达内源性人B7-H3水平，将其皮下植入免疫活性C57Bl6小鼠中，每次植入使用10,000个细胞。小鼠在肿瘤接种后第3、6和9天分别用单独的PBS(n＝5；i.p.)或200μg、100μg和100μg/小鼠的MIL33B(n＝10；i.p.)进行治疗。然后跟踪小鼠直到接种后第150天。当最大肿瘤轴>1.5cm、肿瘤溃疡>3mm或由独立兽医工作人员确定小鼠濒临死亡时，对小鼠实施安乐死。总体存活曲线和个体肿瘤生长曲线在图8中提供。
***
鉴于本公开，在不进行过度实验的情况下，可以制造和执行本文公开和要求保护的全部方法。尽管已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员来说，显然可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对方法和方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体而言，很明显，某些化学和生理相关的药剂可以替代本文所述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的全部这些类似的替代和修改被认为是在权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献，在它们提供示例性程序或其他细节的范围内，对这里阐述的内容进行补充，特别通过引用并入本文。
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序列表
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<140> 尚不清楚
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<150> US 62/936,783
<151> 2019-11-18
<160> 21
<170> PatentIn版本 3.5
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<220>
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<223> 合成多肽
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Tyr Ile Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtca tgcactgggt gaggcagagc 120
cctgggcagg gccttgaggg gattggatat attaattctt acagtgatgg aactaagtac 180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcggcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatgggga 300
ggattaggaa atggcgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
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<212> DNA
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caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgtcagctc aagtgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtgcca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
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<210> 11
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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5

Claims (91)

1.一种单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括来自MIL33B抗体的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括来自所述MIL33B抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其包括源自SEQ ID NO:7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括源自SEQ ID NO:8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:11的VHCDR1氨基酸序列、包括SEQ ID NO:12的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:13的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:14的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:15的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:16的VLCDR3氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列、包括SEQ ID NO:18的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:20的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:21的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
6.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列、包括SEQ ID NO:18的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的轻链可变序列。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括具有根据SEQ ID NO:7的序列的重链可变序列和具有根据SEQ ID NO:8的序列的轻链可变序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体能够结合B7-H3。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源化抗体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体片段是单价scFv(单链片段可变)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab')2片段、F(ab')3片段、Fv片段或单链抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是嵌合抗体、双特异性抗体或BiTE。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。
15.一种单克隆抗体或抗体片段，其与根据权利要求1至14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段竞争结合相同的表位。
16.一种单克隆抗体或抗体片段，其与根据权利要求1至14中任一项所述的抗体识别的B7-H3上的表位结合。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体与显像剂、细胞毒剂、金属或放射性部分缀合或融合。
18.根据权利要求17所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述显像剂是荧光团。
19.根据权利要求17所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述放射性部分是Zr-89、Cu-64、F-18、Y-90、Lu-177、At-211、Ac-225或Pb-212。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是免疫缀合物。
21.根据权利要求20所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体与鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生物缀合。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体是抗体-药物缀合物。
23.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的抗体分子的抗体重链和/或轻链可变区。
24.根据权利要求23所述的分离的核酸，其包括与SEQ ID NO:9具有至少85％同一性的核苷酸序列。
25.根据权利要求23所述的分离的核酸，其包括与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的核苷酸序列。
26.一种包括根据权利要求23至25中任一项所述的核酸的表达载体。
27.一种杂交瘤或工程细胞，其包括编码根据权利要求1至16中任一项所述的抗体或抗体片段的核酸。
28.一种杂交瘤或工程细胞，其包括根据权利要求23至25中任一项所述的核酸。
29.一种制备根据权利要求1至18中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段的方法，所述方法包括：在允许所述抗体表达的条件下培养根据权利要求27或28所述的杂交瘤或工程细胞，并任选地从所述培养物中分离所述抗体。
30.一种药物制剂，其包括根据权利要求1至22中任一项所述的一种或多种抗体或抗体片段。
31.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：施用有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗体片段。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症已被确定为相对于健康组织表达升高水平的B7-H3。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症是肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤或神经外胚层癌。
34.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括施用至少第二抗癌疗法。
35.根据权利要求34所述的方法，其中第二抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法、免疫疗法、放射疗法、放射免疫疗法、光疗法、基因疗法、手术、激素疗法、表观遗传调节、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述患者先前对免疫检查点抑制剂没有反应。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述患者旧病复发。
38.一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括重链可变区(VH)，其包括来自所述MIL33B抗体的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括来自所述MIL33B抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
39.根据权利要求38所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括重链可变区(VH)，其包括源自SEQ ID NO:7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括源自SEQ ID NO:8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
40.根据权利要求38或39所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列，包括SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
41.根据权利要求38或39所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:11的VHCDR1氨基酸序列，包括SEQ IDNO:12的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:13的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:14的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:15的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:16的VLCDR3氨基酸序列。
42.根据权利要求38或39所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列，包括SEQ IDNO:18的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:20的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:21的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
43.根据权利要求38或39所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括如下重链和轻链CDR序列：重链可变区(VH)，其具有包括SEQ ID NO:17的VHCDR1氨基酸序列，包括SEQ IDNO:18的VHCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:19的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其具有包括SEQ ID NO:4的VLCDRl氨基酸序列、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2氨基酸序列和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3氨基酸序列。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括与SEQ IDNO:7具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。
45.根据权利要求38至43中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括与SEQ IDNO:7具有至少95％同一性的重链可变序列；和与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的轻链可变序列。
46.根据权利要求38至43中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括具有根据SEQ ID NO:7的序列的重链可变序列；和具有根据SEQ ID NO:8的序列的轻链可变序列。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域能够结合B7-H3。
48.根据权利要求38至47中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域。
49.根据权利要求38至48中任一项所述的CAR，其进一步包括铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
50.根据权利要求49所述的CAR，其中所述铰链结构域是CD8a铰链结构域或IgG4铰链结构域。
51.根据权利要求49所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD8a跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
52.根据权利要求49所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3z细胞内信号传导结构域。
53.一种核酸分子，其编码根据权利要求38至52中任一项所述的CAR。
54.根据权利要求53所述的核酸分子，其中编码所述CAR的所述序列与表达控制序列有效连接。
55.根据权利要求53所述的核酸分子，其进一步定义为表达载体。
56.一种工程细胞，其包括编码根据权利要求38至52中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子。
57.根据权利要求56所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
58.根据权利要求56所述的细胞，其中所述细胞是NK细胞。
59.根据权利要求56所述的细胞，其中所述核酸整合到所述细胞的基因组中。
60.根据权利要求56所述的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
61.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体中的根据权利要求56至61中任一项所述的细胞群。
62.一种在有需要的人类患者中治疗癌症的方法，其包括向所述患者施用抗肿瘤有效量的细胞疗法，所述细胞疗法包括根据权利要求56至61中任一项所述的一种或多种细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞是同种异体细胞。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞是自体细胞。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞与所述受试者HLA配型。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述癌症已被确定为相对于健康组织表达升高水平的B7-H3。
67.根据权利要求62所述的方法，其中所述癌症是肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤或神经外胚层癌。
68.根据权利要求62所述的方法，其进一步包括施用至少第二抗癌疗法。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是化学疗法、分子靶向疗法、免疫疗法、放射疗法、放射免疫疗法、光疗法、基因疗法、手术、激素疗法、表观遗传调节、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。
70.根据权利要求62所述的方法，其中所述患者先前对免疫检查点抑制剂没有反应。
71.根据权利要求62所述的方法，其中所述患者旧病复发。
72.一种诊断患者患有表达B7-H3的癌症的方法，其包括将获自所述患者的癌组织与根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗体片段接触；以及检测所述抗体或抗体片段与所述组织的结合，其中如果所述抗体或抗体片段与所述组织结合，则所述患者被诊断为患有表达B7-H3的癌症。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述检测包括进行ELISA、免疫印迹、免疫组织化学法、多光谱荧光细胞计数成像、FACS、质谱流式细胞术(CyTOF)、成像质谱流式细胞术(IMC)、光学成像、PET成像、SPECT成像或MRI。
74.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括向被诊断为患有表达B7-H3的癌症的患者施用有效量的根据权利要求1至25中任一项所述的抗体或抗体片段或包括根据权利要求60至65中任一项所述的一种或多种细胞的细胞疗法。
75.一种选择用抗B7-H3抗体治疗的癌症患者的方法，所述方法包括(a)确定所述癌症是否表达B7-H3；和(b)如果B7-H3由所述癌症表达，则选择所述患者进行治疗。
76.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(a)包括(i)从所述患者获取或已经获取生物样品；和(ii)对生物样品进行或已经进行测定以确定B7-H3是否在癌症中表达。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其进一步包括向所述选定的患者施用有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗体片段或包括根据权利要求60至65中任一项所述的一种或多种细胞的细胞疗法。
78.根据权利要求75或76所述的方法，其中通过检测所述样品中的B7-H3蛋白来确定B7-H3是否在癌症中表达。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述蛋白质通过质谱流式细胞术、成像质谱流式细胞术、蛋白质印迹、FACS、免疫组织化学法、ELISA、RIA、光学成像、PET成像、SPECT成像或MRI检测。
80.根据权利要求78所述的方法，其中通过使所述癌症样品与根据权利要求1至22中任一项所述的抗体接触来检测所述蛋白质。
81.一种检测细胞表面、组织中、器官中或生物样品中是否存在B7-H3的方法，所述方法包括(a)使所述细胞、组织、器官或生物样品与根据权利要求1至22中任一项所述的抗体接触；和(b)检测与所述细胞、组织、器官或样品相关的所述抗体是否存在。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述接触和检测是在体外进行的。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述接触是在体内进行并且所述检测是在体外进行。
84.根据权利要求82或83所述的方法，其中所述显像剂是荧光团或生色团。
85.根据权利要求81所述的方法，其中所述接触和检测是在体内进行的。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述显像剂是放射性核素或造影剂。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述检测是通过PET、SPECT、光学、MRI或超极化MRI进行的。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述检测是通过超极化MRI进行的，其中所述可检测标记是Si-29纳米颗粒。
89.一种进行荧光引导手术的方法，所述方法包括(a)在一定条件下向患者施用包括根据权利要求18所述的抗体的组合物并持续足以使所述抗体在给定手术部位积聚的时间；(b)用激发光照射所述手术部位以引起所述荧光部分的发射；以及(c)对在激发光激发时发出荧光的区域进行手术切除。
90.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体分子或根据权利要求30所述的药物组合物，用于治疗受试者的癌症。
91.一种根据权利要求1至22中任一项所述的抗体分子或根据权利要求30所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
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