CN117777296A - B7h3亲和体及其诊疗核素标记物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机化学、放射性化学、肿瘤诊断学及临床核医学技术领域，提供一种B7H3亲和体及其诊疗核素标记物的制备方法与应用。所述B7H3亲和体的序列为：Ac‑PEG4‑AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK[(Acp)‑(Acp)]。本发明提供的B7H3亲和体具有良好的体内稳定性、代谢及药代动力学性质，其与诊断性或者治疗性放射性核素标记合成的核医学分子探针对B7H3靶点均具有良好的亲和力和功能活性，有望成为具有良好应用前景的靶向B7H3显像用及肿瘤治疗用放射性药物。
Description
技术领域
本发明属于有机化学、放射性化学、肿瘤诊断学及临床核医学技术领域，具体地说，涉及一种B7H3亲和体及其诊疗核素标记物的制备方法与应用。
背景技术
作为跨膜糖蛋白B7家族的一员，CD276也被称为B7-H3，是一种T细胞调节剂，与正常组织和良性病变相比，在不同亚型人类恶性肿瘤细胞中具有高度特异性过表达。同时，B7-H3作为一种细胞表面受体蛋白，与肿瘤耐药性、转移和免疫调节高度相关。此外，B7-H3在肿瘤血管系统的内皮细胞上也过表达，但在正常组织的血管生成血管中不过表达。这些特性使B7-H3成为探索靶向治疗剂的理想候选者，该靶向治疗试剂将同时以高特异性消融肿瘤细胞和肿瘤脉管系统。根据最近的一项研究，B7-H3靶向抗体-药物偶联物显示出治疗多种肿瘤类型的巨大潜力。
抗B7-H3抗体偶联的药物用于恶性肿瘤诊断及治疗的研究在近几年获得进展。但是，基于抗体的配体对于临床转化而言可能存在许多问题，这是由于低效和随机的结合、昂贵的价格以及潜在的免疫反应，尤其是在重复给药的情况下。目前的研究表明，较小的蛋白质片段能够实现高效的、位点特异的结合，特别在肿瘤诊断研究中逐渐取代抗体。最近，亲和体（Affibody）已被证明是设计分子成像的有前景的结合配体。ABY是一种58个氨基酸的蛋白质（约7kDa），与抗体相比，ABY表现出更快的肝肾清除率，更高的生物相容性和更强的体内外稳定性，更适用于大规模生产，并能够实现位点特异性结合。
随着核医学分子影像的快速发展，核医学从非特异性诊断逐步走向依靠小分子药物、多肽、单抗等前体药物进行疾病特异性诊疗，其中正电子发射计算机断层显像（Positron Emission Tomography，PET）应用最为广泛并显出其优势，这些新型探针为肿瘤的早期诊断、临床分期、疗效评估提供依据，并对预后进行评价，同时也可应用于肿瘤的靶向治疗。B7H3亲和体经过双功能偶联剂DOTA、H3RESCA-TFP等修饰之后，可以进行诊断性放射性核素68Ga、18F、99mTc等标记，以及治疗型核素90Y、177Lu、225Ac和213Bi等标记，从而用于肿瘤特异性核素诊疗。这些核素各有优势和独特的应用场景，其中68Ga获取成本相对较低，标记方法简单、高效，半衰期相对较短，能够一定程度上减少辐射。18F具有较长的半衰期（T1/2=109 min），适用于一些体内循环代谢较慢的探针，同时，18F能够由医用回旋加速器获得，产量较高，是目前应用最广泛的PET成像核素。99mTc是目前SPECT成像应用最广的核素，具有单光子成像理想的能峰，半衰期及获取途径均具有优势，且SPECT成像成本控制较PET成像更有优势。目前，β治疗核素177Lu，α治疗核素225Ac均有广阔的应用前景，使用治疗型核素标记B7H3探针后，能够在靶点部位大量富集，具有较强的电离辐射效应，发射射线破坏细胞DNA，达到靶向治疗效果。
因此，通过构建B7H3靶向亲和体诊疗用放射性分子探针用于B7H3靶点检测、成药可行性分析以及特异性核素治疗，为B7H3高表达阳性肿瘤患者的筛选、B7H3表达情况的监测提供无创有效的分子影像学手段；B7H3靶向亲和体核素治疗探针为B7H3阳性恶性肿瘤患者靶向治疗耐药后提供新的治疗手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种B7H3亲和体及其诊疗核素标记物的制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种B7H3亲和体，所述B7H3亲和体的序列为（N端-C端）：Ac-PEG4-AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK[(Acp)-(Acp)]（SEQ ID NO:1）；
其中，PEG4为氨基四聚乙二醇羧乙基(1-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oic acid)，连接在N端；Acp为6-氨基己酸，连接在K的C端。
所述B7H3亲和体的结构如式I所示：
式I
本发明的B7H3（CD276）亲和体的结构是基于模拟抗B7H3单克隆抗体片段结构设计的，在该结构的N端直接进行双功能偶联剂的修饰，或增加一个PEG4结构后进行双功能偶联剂修饰，或在C端增加两个Acp结构，从而提高亲和体在人体内的生物相容性、稳定性、增加体内循环时间、优化代谢速度及途径。
本发明的B7H3（CD276）亲和体及修饰的B7H3（CD276）亲和体可通过本领域各种多肽合成/修饰方法制得，例如，先合成氨基酸序列，再与双功能偶联剂（DOTA、H3RESCA-TFP）反应后制得，双功能偶联剂对B7H3（CD276）亲和体进行修饰的方法可采用本领域常规的各种方法，这些方法为本领域技术人员所熟知，本发明对此没有特别限定。例如，在0.1 MpH8.5-9.0的NaHCO3缓冲液体系中，将B7H3（CD276）与DOTA按照（5~10）:1的摩尔比混合，常温反应30 min-2 h。合成步骤如图1所示。
第二方面，本发明提供一种修饰的B7H3亲和体，其为双功能偶联剂修饰的所述B7H3亲和体，所述双功能偶联剂包括但不限于DOTA、H3RESCA-TFP、NOTA、HBED-CC、DTPA、3pC-NETA-NCS。
其中，H3RESCA-TFP修饰的B7H3亲和体的结构如式II所示：
式II
优选地，所述双功能偶联剂修饰在所述B7H3（CD276）亲和体的N端。
第三方面，本发明提供一种放射性诊疗核素标记物，其为放射性核素标记的所述B7H3亲和体或所述修饰的B7H3亲和体。
根据本发明一种实施方式，所述放射性核素可以为诊断用放射性核素，所述诊断用放射性核素优选为68Ga、18F、99mTc。
当所述放射性核素为68Ga时，放射性核素标记的B7H3（CD276）亲和体的制备方法包括以下步骤：
1）通过使用柱式锗镓发生器制备68Ga核素；
2）使用0.04-0.06 M HCl溶液1-4 mL淋洗锗镓发生器，并混合0.8-1.2 M NaAc至68Ga淋洗液中；
3）将所述修饰的B7H3亲和体20-100 µg加入步骤2）所得68Ga溶液1-4 mL中，混匀后加热37-40℃或85-100℃反应10-20min；
4）对步骤3）所得产物进行纯化，无水乙醇洗脱产物，所得即为68Ga标记的B7H3（CD276）亲和体。
具体地，以进行双功能螯合剂DOTA修饰为例，68Ga对修饰后的B7H3亲和体的标记可采用以下方法：
双功能偶联剂DOTA修饰后B7H3亲和体序列后，得到序列(DOTA)- PEG4-AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK[(Acp)-(Acp)]（DOTA-B7H3亲和体）；对制备得到的DOTA-B7H3亲和体进行68Ga（T1/2=68 min；β+:89%；E=511 keV）核素的标记，68Ga用68Ge-68Ga发生器进行制备。取3 mL 0.05 M HCl溶液淋洗68Ga至195 μL 1M NaAc中；将0.1 mL（60 μg）的DOTA-B7H3亲和体前体加入上述体系，混匀，95oC反应10 min，用3mL生理盐水洗脱放射性杂质，再用0.8 mL 80%乙醇洗脱出目标化合物68Ga-B7H3亲和体，用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。得到的68Ga-B7H3亲和体放射性化学纯度大于95%。标记率小于90%时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，其中Sep-pak柱需用5mL无水乙醇和5 mL高纯水活化以备用。取适量经无菌过滤的产品制剂进行质量控制检验，所有项目均合格后进行后续研究。
当所述放射性核素为18F时，放射性核素标记的B7H3亲和体的制备方法包括以下步骤：
1）采用医用回旋加速器制备18F溶液；
2）将回旋加速器生产的含有18F的H2 18O通过QMA离子交换柱进行吸附；使用0.45-0.55 mL生理盐水冲洗上述QMA柱，洗脱18F至生理盐水中，得到含18F的溶液；
3）取步骤2）所得含18F的溶液50-150 µL与10-15 µL KHP（邻苯二甲酸氢钾，0.5M）和5-10 µL AlCl3溶液（2 mM）混合，震荡摇匀后室温放置4-10 min，再加入所述修饰的B7H3亲和体20-100 µg，在37-40℃或100-120℃反应10-20 min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，生理盐水洗涤后乙醇洗脱，得到产物18F标记的B7H3（CD276）亲和体。
具体地，以进行双功能螯合剂H3RESCA修饰为例，18F对修饰的B7H3亲和体标记可采用以下方法：
双功能偶联剂H3RESCA修饰后的B7H3亲和体序列为(H3RESCA)-PEG4-AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK[(Acp)-(Acp)]；对制备得到的H3RESCA-B7H3亲和体进行18F（T1/2=109.8 min；β+:96.7%；E=511 keV）核素的标记，18F利用回旋加速器制备。加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，18F-被吸附到QMA柱中，用0.5 mL生理盐水冲洗上述QMA柱；取0.1 mL含18F-的生理盐水置于含有11 µL 10倍KHP、6 µL2 mM AlCl3溶液的反应管中，混匀后室温放置5 min；加入10 µL 10 mg/mL标记前体H3RESCA-B7H3亲和体，37℃反应15 min；反应液冷却至室温后，将产物用C18分离柱纯化，用5 mL生理盐水洗涤后，0.6 mL 80%乙醇将产物淋洗出并通过0.22 μm无菌滤膜；N2吹干溶剂后用生理盐水稀释后得产品制剂；用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。所述18F-B7H3亲和体经分离纯化后放射化学纯度大于95%。标记率小于90%时，用Sep-pakC18柱分离纯化，其中Sep-pak柱需用5mL无水乙醇和5mL高纯水活化以备用。取适量经无菌过滤的产品制剂进行质量控制检验，所有项目均合格后进行后续研究。
当所述放射性核素为99mTc时，放射性核素标记的B7H3亲和体的制备方法包括以下步骤：
1）通过钼锝发生器制备99mTcO4溶液；
2）取20-100 µg所述修饰的B7H3亲和体加入0.5-1 mL 0.2M Na2HPO4溶液，混匀；
3）取1mg/mL氯化亚锡0.01-0.02 mL加入到步骤2）所得溶液，然后加入99mTcO4溶液，混匀后加热90-100℃反应10-20min；
4）对步骤3）所得产物进行纯化，80%乙醇洗脱产物，即得99mTc标记的B7H3亲和体。
根据本发明，所述放射性核素也可以为治疗用放射性核素，以期达到B7H3高表达肿瘤靶向分子影像治疗的目的。所述治疗用放射性核素优选为90Y、177Lu、225Ac和213Bi中的至少一种。
经双功能偶联剂DOTA、双功能偶联剂DTPA、双峰双功能配体3pC-NETA-NCS、双峰双功能配体H3RESCA-TFP修饰之后的B7H3亲和体可进行治疗用放射性核素90Y，177Lu，225Ac或者213Bi标记，得到90Y-B7H3亲和体、177Lu-B7H3亲和体、225Ac-B7H3亲和体、213Bi-B7H3亲和体治疗用分子探针。
治疗用放射性核素的标记可以采用本领域常规的各种方法。根据本发明的一种优选实施方式，90Y，177Lu，225Ac或者213Bi标记B7H3亲和体可采用如下方法：
当所述放射性核素为177Lu时，制备方法包括以下步骤：
1）购置177Lu核素瓶，内含约50-150 mCi核素；
2）取6 mL 0.05 M HCl，向其中加入0.39 mL 1.0M醋酸钠，以pH试纸测定其pH值为4.0左右，作为标记缓冲液(Labeling buffer)；
3）配制0.1 M NaHCO3，作为中和缓冲液，用于调节标记总产品样品pH至7.4；
4）向反应瓶中加入0.5 mL标记缓冲液，并加入所述修饰的B7H3亲和体20-100 µg；
5）向177Lu核素瓶中加入0.5 mL标记缓冲液，得到177Lu缓冲溶液，然后取0.6mL177Lu缓冲溶液，加入到步骤4）的反应瓶中，混匀后加热85-100℃反应10-20min；
6）对步骤5）所得产物进行纯化，无水乙醇洗脱产物，即得177Lu标记的B7H3亲和体。
进一步地，以177Lu为例，双功能螯合剂DOTA、DTPA、3pC-NETA-NCS、H3RESCA-TFP修饰后的B7H3亲和体，得到相应的标记前体。按照3 mL 0.05M HCl对应195 µL 1M NaAc来配制标记缓冲液，待用；100 µL（60µg）标记前体（DOTA-B7H3亲和体，DTPA-B7H3亲和体，3pC-NETA-B7H3亲和体，H3RESCA-B7H3亲和体）中，加入100-150 µL标记缓冲液，然后加入177Lu；将pH调至5.5，95oC反应10-15 min，标记率小于90%时，用Sep-pak C18柱分离纯化，得到177Lu-B7H3亲和体。用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。制得的177Lu-B7H3亲和体经分离纯化后放射化学纯度大于95%。
第四方面，本发明提供诊断用放射性核素标记的B7H3亲和体在制备B7H3靶向性的肿瘤PET或SPECT显像试剂中的应用。
第五方面，本发明提供治疗用放射性核素标记的B7H3亲和体在制备B7H3靶向性的肿瘤核素治疗药物中的应用。
第六方面，本发明提供一种经修饰的靶向B7H3的亲和体结构，并进行诊断性和治疗性放射性核素的标记与评价。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）B7H3亲和体结构具有较好的体内稳定性，药代动力学性质，体内代谢，亲和力和特异性。
（二）诊断用放射性分子探针可用于68Ga/18F/99mTc-B7H3亲和体的PET或SPECT显像；68Ga/18F/99mTc-B7H3亲和体可用于B7H3阳性肝细胞癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤患者的筛选，治疗预判和疗效监测。
（三）68Ga/18F/99mTc-B7H3亲和体PET显像可以判断患者对于B7H3靶向治疗的疗效响应，判断患者是否适合用治疗性核素90Y/177Lu/225Ac/213Bi替代68Ga/18F/99mTc进行核素靶向治疗。
（四）90Y/177Lu/225Ac/213Bi-B7H3亲和体等核素靶向治疗，可以为耐药的B7H3肿瘤患者提供新的治疗手段。
（五）本发明的68Ga/18F/99mTc-B7H3亲和体的制备方法标记率高，68Ga标记率可达80%以上，18F标记率可达70%以上，99mTc标记率可达85%以上。
附图说明
图1a和图1b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验的68Ga标记的原亲和体片段的结构式。
图2a和图2b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验的68Ga标记的原亲和体片段的质谱表征图和HPLC表征图。
图3a和图3b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验的68Ga标记的原亲和体片段的体外稳定性分析。
图4a和图4b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验的68Ga标记的原亲和体片段的亲和力检测。
图5a和图5b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验的68Ga标记的原亲和体片段在肿瘤细胞A549、A549（CD276转染）、H1975、H1975（CD276转染）中的细胞摄取分析。
图6a和图6b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验68Ga标记的原亲和体片段的体内药代动力学分析。
图7a和图7b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验68Ga标记的原亲和体片段在正常昆明小鼠的体内分布。
图8a和图8b分别为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体及对照实验68Ga标记的原亲和体片段在H1975（CD276）小鼠的动态micro-PET/CT图像。
图9为本发明较佳实施例中68Ga-RESCA-B7H3亲和体在多种肿瘤模型（SW780、LS174T、U87、H3122、H1975）中的micro-PET/CT图像。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
本实施例提供B7H3（CD276）亲和体序列合成与表征。
该B7H3（CD276）亲和体的序列为：
Ac-PEG4-AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK[(Acp)-(Acp)]，结构如式I所示。该B7H3（CD276）亲和体合成后，经验证氨基酸序列正确。
式I
对所述B7H3（CD276）亲和体序列的分子结构进行HPLC和质谱表征；HPLC分析条件：Kromasil 100-5C18凝胶过滤/体积排阻色谱柱，流速1 mL/min；流动相A为含0.1%三氟乙酸TFA的乙腈；流动相B为含0.1%三氟乙酸TFA的水。流动相梯度设置：0.0min 30%的A和70%的B；20min 60%的A和40%的B；20.1min 100%的A和0%的B。
实施例2
本实施例提供修饰的B7H3（CD276）亲和体以及对照实验的DOTA修饰原亲和体片段的制备与表征。其中，原亲和体片段的序列为：AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK。
对B7H3亲和体序列进行DOTA或H3RESCA-TFP修饰，在0.1 M pH8.8的NaHCO3缓冲液体系中，将B7H3亲和体与DOTA（10 mg/mL）或H3RESCA-TFP（5-10 mg/mL）按照1:10的摩尔比混合，常温反应1 h，得到修饰后的DOTA-B7H3亲和体或RESCA-B7H3亲和体，结构如图1a所示。对照实验的DOTA修饰原亲和体片段的制备同DOTA-B7H3亲和体制备方法，结构如图1b所示。对修饰后的RESCA-B7H3亲和体、DOTA修饰原亲和体片段的分子结构分别进行HPLC和质谱表征；HPLC分析条件如实施例1，结果分别如图2a、图2b所示。
需要说明的是，本发明的目的是应用于肿瘤特异性核医学分子影像，因此必须使用双功能偶联剂对目标分子（原亲和体片段）进行修饰，修饰后亲合体的亲和力、稳定性及体内生物分布将受影响。另外，在对原始亲合体片段的研究中，探针的体内生物半衰期太短，难以获得充分的肿瘤内聚集，因此需要再次对其进行修饰，提高放射性标记后亲合体的亲和力、稳定性及体内生物半衰期，并获得更适合核医学诊疗的体内分布。结果显示：修饰之后的亲合体标记核素探针，亲和力显著增加，体外稳定性相近或略有增加，体内药代动力学参数改善（生物半衰期明显增加），体内分布肾脏摄取减低、排泄加快，肿瘤PET显像中，肿瘤部位摄取明显高于未修饰前探针。
实施例3
本实施例提供68Ga标记RESCA-B7H3亲和体及68Ga标记原亲和体片段的制备方法。
对制备得到的RESCA-B7H3亲和体进行68Ga（T1/2=68 min；β+:89%；E=511 keV）核素的标记，68Ga用68Ge-68Ga发生器进行制备。取1 mL 0.05 M HCl溶液淋洗68Ga至65 μL 1MNaAc中；将0.1 mL（100 μg）的RESCA-B7H3亲和体前体加入上述体系，混匀，37oC反应15min，反应液冷却至室温后，将产物加载到C18分离柱上，用4 mL生理盐水洗脱放射性杂质，用0.5 mL无水乙醇将目标化合物68Ga-B7H3亲和体淋出并通过0.22 μm无菌滤膜；N2吹干溶剂后用生理盐水配制得产品制剂，用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度，经测定得到的68Ga-B7H3亲和体标记率约为60%，放射性化学纯度大于95%。68Ga标记原亲和体片段方法基本同上，仅将反应温度调整为95oC，标记率约为50%，放化纯约为95%。
以上实验结果表明，68Ga-B7H3亲和体结构具有较高的标记率和放化纯。
实施例4
本实施例提供纯化后的68Ga-B7H3亲和体和68Ga标原亲和体片段的体外稳定性分析对比。
取10 µL含1.11 MBq（30 µCi）的纯化后产物68Ga-B7H3亲和体加入到200 µL生理盐水（或者5% HSA溶液）中，4 ℃条件下孵育；分别在孵育0 h、2 h、12 h、24 h、36 h和60 h时取出37-74 kBq（1-2 µCi）样品进行radio-TLC分析；分析方法：分别取2 µL含37-74 kBq（1-2 µCi）放射性活度的68Ga-B7H3亲和体生理盐水溶液或者68Ga-B7H3亲和体5% HSA溶液加至20 µL饱和EDTA中混匀，进行radio-TLC分析。取2 µL样品滴在距新华一号滤纸底端1 cm处，置于生理盐水展开体系中，待完全展开后，取出滤纸并晾干，进行radio-TLC检测，游离68Ga和68Ga-B7H3亲和体的Rf值分别为9-10 cm，0-1 cm；结果显示，在生理盐水溶液或者5% HSA溶液中，68Ga-B7H3亲和体和68Ga标原亲和体片段在4小时内均具有较好的体外稳定性，同时，结果还显示68Ga-B7H3亲和体体外放化纯略高于68Ga标原亲和体片段，具体结果见图3a及图3b。
以上实验结果表明，68Ga-B7H3亲和体结构具有良好的稳定性。
实施例5
本实施例提供纯化后的68Ga-B7H3亲和体和68Ga标原亲和体片段的靶向亲和力分析对比。
用碳酸盐包被缓冲液将B7H3蛋白稀释至1-2 μg/mL工作浓度，包被96孔酶标板，每孔100 μL，4oC孵育过夜（16-24 h）。隔日取出孔板，弃去孔中液体，每孔加入200~300 μL的PBST（0.01mol/L，pH值7.4）清洗5遍，弃去洗涤液，吸水纸上拍干。加入封闭液，每孔200 μL，37℃孵育1.5-2 h。弃去孔中液体，吸水纸上拍干。每孔加入200 μL PBST洗5遍，待用。取出包被的孔板，加入不同浓度（0.001-200 μCi/mL，n=4）放射性标记的探针，每孔100μL。室温孵育1 h，PBST洗5遍（200 μL/孔），分离每个小孔，放入计数管中，用伽马计数器进行计数分析。统计分析后获得平衡解离常数（Kd）。结果如图4a和图4b所示，68Ga-B7H3亲和体的平衡解离常数Kd=4.5 nM，明显低于68Ga标原亲和体片段（Kd=8.3 nM）。
以上实验结果表明，68Ga-B7H3亲和体结构经过双功能偶联剂的修饰以及放射性核素的标记后，仍然保持了对B7H3靶点的高亲和力。同时，经过对亲和体两端进行修饰，获得了较原亲和体片段更高的亲和力。
实施例6
本实施例提供纯化后的68Ga-B7H3亲和体和68Ga标原亲和体片段在人源肿瘤细胞A549、H1975及B7H3蛋白转染后的A549CD276、H1975CD276细胞中的摄取及抑制摄取实验。
生长至对数期的人源肺癌细胞A549、H1975、A549CD276及H1975CD276以2×105个/孔均匀铺到24孔板中，向每孔加入500 μL不含胎牛血清的PRIM 1640培养基，培养箱孵育24h。将一定量68Ga-B7H3亲和体或68Ga标原亲和体片段均匀加入到孔板中（每孔20μCi），放入培养箱孵育一段时间，分别于5min、30min、60min、120min将孔板取出，使用1M NaOH裂解细胞（n=5）并收集，放入γ-Counter进行测量。细胞竞争抑制实验：实验步骤与细胞摄取实验大致相同，仅在加入68Ga-B7H3亲和体之前30 min向部分孔内（n=4）加入20 μg/孔B7H3亲和体，然后每孔加入探针溶液（每孔20μCi），于60min收集裂解后的细胞溶液，放入γ-Counter进行测量。
摄取统计结果分别如图5a（68Ga-B7H3亲和体）、图5b（68Ga标原亲和体片段）所示，68Ga-B7H3亲和体探针在B7H3转染后的细胞中均有较高的摄取，明显高于转染前肿瘤细胞摄取值，68Ga-B7H3亲和体探针在A549CD276、H1975CD276细胞的摄取均可被B7H3亲和体抑制，而非转染细胞的抑制效果不明显，证明探针对B7H3的特异靶向性。
以上实验结果同时表明，68Ga-B7H3亲和体探针较68Ga标原亲和体片段获得了更高的摄取，以60分钟、A549CD276细胞摄取值为例，68Ga-B7H3亲和体探针摄取值为3.7±0.2%ID/g，明显高于68Ga标原亲和体片段的摄取值2.4±0.2%ID/g。
实施例7
本实施例提供纯化后的68Ga-B7H3亲和体及68Ga标原亲和体片段在正常KM小鼠体内药代动力学分析。
准备5只KM小鼠（雌性，5-6周龄，18-20 g），将纯化后的68Ga-B7H3亲和体或68Ga标原亲和体片段用生理盐水稀释成18.5 MBq/mL（0.5 mCi/ml），每只小鼠经尾静脉注射3.7MBq（0.1 mCi，200 µL）标记产物；分别在注射标记产物之后相应的时间点（1 min、3 min、5min、10 min、15 min、30 min、45 min和1h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、36 h）使用毛细管经小鼠眼周静脉丛取血；取注射剂量活度的1%即0.037 MBq（1 µCi，2 µL）作为测定参考活度。使用Gamma counter将参考活度同收集的血液样品一起测定，经衰减校正后进行数据分析，计算每克血样百分注射剂量率，结果用%ID/g ± SD表示。具体结果见图6a、图6b，68Ga-B7H3亲和体清除相半衰期为28.34 min，分配相半衰期1.34 min，明显高于68Ga标原亲和体片段的清除相半衰期（10.31 min）和分配相半衰期（0.81 min）。
以上实验结果表明，68Ga-B7H3亲和体获得修饰后，较原亲和体片段体现出更优的药代动力学特性，增加了药物体内循环时间，这将在一定程度上避免探针被快速清除，增加靶点的摄取值。
实施例8
本实施例提供68Ga-B7H3亲和体及68Ga标原亲和体片段在正常昆明鼠中体内分布实验对比分析。
准备30只正常昆明小鼠（雌性，5-6周龄，18-20 g），随机分成2个实验组，每组又随机分成5个时间组（n=3）。分别尾静脉注射7.4 MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-B7H3亲和体或68Ga标原亲和体片段之后，分别于5min、30min、60min、120min、240min将小鼠麻醉处死，取血液、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠道、肌肉、骨、脑进行称量，使用γ-counter检测各器官放射性计数，衰减校正后统计分析各器官不同时间点的体内生物分布。
结果如图7a、图7b显示，68Ga-B7H3亲和体及68Ga标原亲和体片段在小鼠体内均主要通过肾脏代谢，其余全身组织、器官非特异性摄取极低，体现出优秀的药物体内分布特性，与B7H3靶点体内分布相匹配。同时，68Ga-B7H3亲和体在肾脏摄取最高值明显低于68Ga标原亲和体片段（161±13%ID/g vs 721±22%ID/g），同时68Ga-B7H3亲和体的肾脏摄取值能够迅速下降，至240min，肾脏摄取值降为27±8.4%ID/g，明显低于68Ga标原亲和体片段肾脏摄取值（442±110%ID/g）。
以上实验结果表明，68Ga-B7H3亲和体修饰后较原亲和体片段获得了更好的体内生物分布，大大加快了探针在肾脏非特异性摄取后的排泄速度，肾脏清除速度的加快即能减少患者所受辐射剂量，也能一定程度上增加靶本比，在PET显像中将获得更好的肿瘤成像效果。
实施例9
本实施例提供68Ga-B7H3亲和体及68Ga标原亲和体片段在B7H3转染阳性人肺癌细胞H1975CD276模型中的micro-PET/CT动态显像。
准备2只移植有人肺癌细胞H1975CD276的裸鼠动物模型（雌性，5-6周龄，18-20 g，肿瘤直径达到0.8-1.0cm）。以3 L/min的异氟烷气体麻醉小鼠，将动物模型以俯卧位固定于Micro-PET扫描床的中心，尾静脉分别注射7.4 MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-B7H3亲和体及68Ga标原亲和体片段之后，立即采用动态扫描模式扫描小鼠，能量窗350-700 keV，动态扫描时间为1 h，并延长2h、4h静态扫描，采用有序子集最大期望值（ordered subsetsexpectation maximization，OSEM）软件进行图像重建。
具体结果见图8a（68Ga-B7H3亲和体）、图8b（68Ga标原亲和体片段）：68Ga-B7H3亲和体在B7H3转染阳性H1975CD276肿瘤模型中1 h动态成像显示出较好的体内稳定性和摄取分布，该分子探针主要通过肾脏代谢，余全身组织非特异性摄取极低；在10 min动态显像中，68Ga-B7H3亲和体在肿瘤组织中就出现特异性的放射性累积，且随时间延长逐渐增加并持续滞留（超过2 h），68Ga标原亲和体PET成像分布与68Ga-B7H3亲和体类似，但其肿瘤部分摄取程度明显低于68Ga标原亲和体片段。
以上实验结果表明，68Ga-B7H3亲和体PET成像肿瘤特异性显像效果明显优于原亲和体片段，这得益于68Ga-B7H3亲和体所具备的更高的亲和力、更适合的药代动力学参数以及更优的体内生物分布，可作为合格的PET成像探针进行临床转化研究。
实施例10
本实施例提供68Ga-B7H3亲和体在多种肿瘤模型（人膀胱癌模型SW780、人结肠癌模型LS174T、人脑胶质瘤模型U87、人肺癌模型H3122及H1975）中micro-PET/CT显像。
每种肿瘤模型鼠各准备三只（雌性，5-6周龄，18-20 g，肿瘤直径达到0.8-1 cm）。每只经尾静脉注射7.4 MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-B7H3亲和体；每组每只动物模型均在注射后1 h及2 h进行micro-PET成像，以3 L/min的异氟烷气体麻醉小鼠，将小鼠模型以俯卧位固定于micro-PET扫描床的中心，采用静态扫描模式扫描小鼠，能量窗350-700 keV，扫描时间为10 min，随着探针的代谢和衰变适当延长扫描时间，扫描过程中以1 L/min的异氟烷气体维持麻醉小鼠，采用有序子集最大期望值（ordered subsets expectationmaximization，OSEM）软件进行图像重建，并在进行衰减校正后采用MMWKS软件进行图像分析处理。具体结果如图9所示。68Ga-B7H3亲和体经尾静脉注射后于1 h和2 h在多种肿瘤中均有不同程度放射性摄取，符合B7H3肿瘤细胞广谱表达的特征，说明68Ga-B7H3亲和体具有多种肿瘤特异性诊断潜力。
以上实验证明，本发明设计合成的B7H3（CD276）亲和体序列具有高亲和力、良好的体内稳定性和药代动力学性质，其与诊断性或者治疗性放射性核素标记合成的分子探针对B7H3（CD276）分子均具备高特异性和功能活性，有望成为具有良好应用前景的靶向B7H3（CD276）显像用及肿瘤治疗用放射性药物。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.B7H3亲和体，其特征在于，所述B7H3亲和体的序列为：Ac-PEG4-AEAKYAKEKIAALSEIIWLPNLTHGQIMAFIAALNDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK[(Acp)-(Acp)]；
其中，PEG4为氨基四聚乙二醇羧乙基，Acp为6-氨基己酸；
所述B7H3亲和体的结构如式I所示：
式I。
2.一种修饰的B7H3亲和体，其特征在于，其为双功能偶联剂修饰的权利要求1所述B7H3亲和体，所述双功能偶联剂为DOTA、H3RESCA-TFP、NOTA、HBED-CC、DTPA或3pC-NETA-NCS；
其中，H3RESCA-TFP修饰的B7H3亲和体的结构如式II所示：
式II。
3.根据权利要求2所述的修饰的B7H3亲和体，其特征在于，所述双功能偶联剂修饰在所述B7H3亲和体的N端。
4.一种放射性诊疗核素标记物，其特征在于，其为放射性核素标记的权利要求1所述B7H3亲和体或权利要求2或3所述修饰的B7H3亲和体。
5.根据权利要求4所述的诊疗核素标记物，其特征在于，所述放射性核素为诊断用放射性核素，所述诊断用放射性核素选自68Ga、18F和99mTc中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的诊疗核素标记物，其特征在于，所述放射性核素为治疗用放射性核素，所述治疗用放射性核素选自90Y、177Lu、225Ac和213Bi中的至少一种。
7.权利要求5所述诊疗核素标记物在制备B7H3靶向性的肿瘤PET或SPECT显像试剂中的应用。
8.权利要求6所述诊疗核素标记物在制备B7H3靶向性的肿瘤核素治疗药物中的应用。
9.权利要求5所述诊疗核素标记物的制备方法，其特征在于，当所述放射性核素为68Ga时，制备方法包括以下步骤：
1）通过柱式锗镓发生器制备68Ga核素；
2）使用0.04-0.06 M HCl溶液1-4 mL淋洗锗镓发生器，并混合0.8-1.2 M NaAc至68Ga淋洗液中；
3）将所述修饰的B7H3亲和体20-100 µg加入步骤2）所得68Ga溶液1-4 mL中，混匀后加热37-40℃或85-100℃反应10-20min；
4）对步骤3）所得产物进行纯化，无水乙醇洗脱产物，即得68Ga标记的B7H3亲和体；
当所述放射性核素为18F时，制备方法包括以下步骤：
1）采用医用回旋加速器制备18F溶液；
2）将回旋加速器生产的含有18F的H2 18O通过QMA离子交换柱进行吸附；使用0.45-0.55mL生理盐水冲洗所述QMA离子交换柱，洗脱18F至生理盐水中，得到含18F的溶液；
3）取步骤2）所得含18F的溶液50-150 µL与0.5 M KHP 10-15 µL和2 mM AlCl3溶液5-10µL混合，震荡摇匀后室温放置4-10 min，再加入所述修饰的B7H3亲和体20-100 µg，在37-40℃或100-120℃反应10-20 min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，生理盐水洗涤后乙醇洗脱，即得18F标记的B7H3亲和体；
当所述放射性核素为99mTc时，制备方法包括以下步骤：
1）通过钼锝发生器制备99mTcO4溶液；
2）取20-100 µg所述修饰的B7H3亲和体加入0.5-1 mL 0.2M Na2HPO4溶液，混匀；
3）取1mg/mL氯化亚锡0.01-0.02 mL加入到步骤2）所得溶液，然后加入99mTcO4溶液，混匀后加热90-100℃反应10-20min；
4）对步骤3）所得产物进行纯化，80%乙醇洗脱产物，即得99mTc标记的B7H3亲和体。
10.权利要求6所述诊疗核素标记物的制备方法，其特征在于，当所述放射性核素为177Lu时，制备方法包括以下步骤：
1）购置177Lu核素瓶，内含50-150 mCi核素；
2）取6 mL 0.05 M HCl，向其中加入0.39 mL 1.0M醋酸钠，作为标记缓冲液；
3）配制0.1 M NaHCO3，作为中和缓冲液，用于调节标记总产品样品pH至7.4；
4）向反应瓶中加入0.5 mL标记缓冲液，并加入所述修饰的B7H3亲和体20-100 µg；
5）向177Lu核素瓶中加入0.5 mL标记缓冲液，得到177Lu缓冲溶液，然后取0.6 mL 177Lu缓冲溶液，加入到步骤4）的反应瓶中，混匀后加热85-100℃反应10-20min；
6）对步骤5）所得产物进行纯化，无水乙醇洗脱产物，即得177Lu标记的B7H3亲和体。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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