CN116751258B - Mdm2/mdmx靶向多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种MDM2/MDMX靶向多肽及其应用，多肽序列为：Ac‑PEG4‑Leu‑Thr‑Phe‑R8‑Glu‑Tyr‑Trp‑Ala‑Gln‑Cba‑S5‑Ser‑Ala‑Ala‑NH2或Ac‑PEG2‑(Arg)6‑Leu‑Thr‑Phe‑R8‑Glu‑Tyr‑Trp‑Ala‑Gln‑Cba‑S5‑Ser‑Ala‑Ala‑NH2。本发明的MDM2/MDMX靶向多肽具有良好的体内稳定性、特异性，其与诊断性或者治疗性放射性核素标记合成的分子探针对MDM2/MDMX均具有良好的亲和力和诊疗效果，有望成为具有良好应用前景的靶向MDM2/MDMX显像用及肿瘤治疗用放射性药物。
Description
技术领域
本发明属于有机化学、放射性核素标记的放射性化学和临床核医学技术领域，具体地说，涉及MDM2/MDMX靶向多肽及其应用。
背景技术
核医学分子影像是精准医学诊疗领域重要组成部分，依托核素诊疗探针的高敏感性、高特异性、高可修饰性等功能，其在多种新型肿瘤靶点中获得广泛应用和较好的效果。目前，肿瘤特异性靶点数以千计，但能够成药并开展临床试验的靶点仍然较少，这一方便归结于药物研发的艰辛和复杂，而药物功能性检测方法的非可视化也大大影响了药物评估的进度。随着核医学与分子生物学的深入发展，针对特定靶点构建高精准度放射性探针成为肿瘤诊疗的新方式，为肿瘤的早期诊断、临床分期、疗效评估提供依据，并对预后进行评价。另外放射性核素标记药物进行在体高分辨PET/CT或PET/MRI显像也开始逐步用于新型药物体内分布及安全性评测。因此，如果能有效的利用核医学分子影像技术在难以成药靶点的药物研发及诊疗方便提供新的契机。
人类转录因子p53蛋白是一种肿瘤抑制因子，是基因组的守护者。正常情况下，p53蛋白功能被关闭；而在应对细胞应激和DNA损伤时，p53蛋白的功能被激活，诱导细胞周期阻滞和凋亡，从而阻止恶性转化。因此，p53的下调/抑制是人类癌症的常见缺陷。MDM2/MDMX癌蛋白是p53的抑制剂，它与p53的转录激活域（TAD）结合，进而下调p53介导的转录激活。MDM2/MDMX在多种肿瘤中均有扩增，包括多种肉瘤、黑色素瘤、肾癌等，MDM2/MDMX升高会抑制p53的“保护”功能。因此，MDM2/MDMX抑制剂能够阻断p53与MDM2/MDMX之间的相互作用，从而恢复p53的功能，是一种潜在的肿瘤治疗药物。有研究发现p53的一个15残基TAD片段能与MDM2/MDMX结合，该15残基肽与MDM2/MDMX的N端结构域结合的晶体结构已被解析，基于这种复杂的结构，许多MDM2/MDMX抑制剂被开发出来，但是目前仍未应用于临床试验，主要是由于该种抑制剂的生物学功能仍未明朗，不能盲目用于肿瘤治疗，而利用该结合域构建MDM2/MDMX特异性分子探针将有望大大加快该领域的研究进程，为药物研发或人体试验提供多种支持。目前尚未有具备临床转化潜力的MDM2/MDMX靶向放射性分子探针获得研究，这无疑是较为可惜的科研空白。
在寻找和设计与重要生物靶点（如具有高亲和力和特异性的蛋白质）相结合的分子的过程中，多肽一直占据一席之地且多被率先研发使用，特别是构建识别调节蛋白质相互作用（PPIs）的分子。然而，天然多肽由于其固有的缺点（如易发生蛋白水解降解）而被认为不适合治疗发展，为了缓解这一问题，非天然序列特异性拟肽已成为可行的替代策略。与天然多肽相比，拟肽体不仅能保留或模拟多肽的折叠结构域，如螺旋结构域，而且具有独特的结构和功能。此外，由于易于引入多种和非天然的功能侧链，化学多样性得到增强。
多肽经过双功能偶联剂DOTA、NOTA等修饰之后，可以进行诊断性放射性核素68Ga、18F标记，68Ga是目前临床应用较为广泛的正电子放射性核素，通常由医用68Ge-68Ga发生器制备，68Ga能够直接与双功能偶联剂进行化学配位，标记操作方法简单且高效。与回旋加速器生产放射性核素相比，68Ga在应用过程中成本可控，放射性量相对较小，便于随时进行质量控制；68Ga半衰期较短，能够快速进行PET成像，一定程度上减少辐射，从而被广泛应用于新型放射性探针的研发和应用。另一方面，作为一种理想的PET放射性核素，18F具有较长的半衰期（T1/2=109 min）和较高的产量（回旋加速器生产），更适用于放射性药物的批量应用，同时也更适合开发自动化合成的制备方法。
通过构建MDM2/MDMX靶向多肽诊断用放射性分子探针用于MDM2/MDMX靶点检测、成药可行性分析以及特异性核素治疗，为MDM2/MDMX高表达阳性肿瘤患者的筛选、MDM2/MDMX-P53表达情况的监测提供无创有效的分子影像学手段；MDM2/MDMX靶向多肽核素治疗探针为MDM2/MDMX阳性肉瘤、黑色素瘤患者靶向治疗耐药后提供新的治疗手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的MDM2/MDMX靶向多肽，以及基于所述多肽开发的诊疗核素标记物及其应用，特别是在核医学中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种MDM2/MDMX靶向多肽，所述多肽的结构如下：
第二方面，本发明提供一种修饰的MDM2/MDMX靶向多肽，其为双功能偶联剂修饰的所述MDM2/MDMX靶向多肽，所述双功能偶联剂包括但不限于DOTA、NOTA、HBED-CC、DTPA或3pC-NETA-NCS。
进一步地，所述双功能偶联剂修饰在所述MDM2/MDMX靶向多肽的N端。
第三方面，本发明提供一种诊疗核素标记物，所述诊疗核素标记物为放射性核素标记的所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽。
进一步地，所述放射性核素为诊断用放射性核素，所述诊断用放射性核素优选为68Ga和/或18F。
进一步地，所述放射性核素为治疗用放射性核素，所述治疗用放射性核素优选自90Y、177Lu、225Ac和213Bi等中的至少一种。
第四方面，本发明提供所述诊疗核素标记物在制备MDM2/MDMX靶向多肽的肿瘤PET显像试剂中的应用。
第五方面，本发明提供所述诊疗核素标记物在制备MDM2/MDMX靶向多肽的肿瘤核素治疗药物中的应用。
第六方面，本发明提供所述诊疗核素标记物的制备方法，所述放射性核素为68Ga，包括以下步骤：
1）采用68Ge-68Ga发生器制备68Ga；
2）采用0.04-0.06 M HCl溶液淋洗68Ga至0.8-1.2 M NaAc溶液中；
3）将所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽加入步骤2）所得含68Ga的NaAc溶液中，混匀，于90-100℃反应10-20min；
4）用生理盐水洗脱步骤3）反应体系中的放射性杂质，然后用无水乙醇洗脱，得到产物68Ga标记的MDM2/MDMX靶向多肽。
所述放射性核素为18F，包括以下步骤：
1）采用回旋加速器制备18F-；
2）将回旋加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.45-0.55 mL生理盐水冲洗上述QMA柱，洗脱18F-；
3）取步骤2）得到的0.09-0.11 mL含18F-的生理盐水与KHP和AlCl3溶液混合，震荡摇匀后室温放置4-6 min，再加入所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽，于100-120℃反应10-20min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，用生理盐水洗涤，然后用无水乙醇洗脱，得到产物18F-标记的MDM2/MDMX靶向多肽。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明提供的MDM2/MDMX靶向多肽（BCH-P53-1、BCH-P53-2）具有较好的体内外稳定性、亲和力和特异性。
（二）诊断用放射性分子探针可用于68Ga/18F-MDM2/MDMX靶向多肽的PET显像；68Ga/18F-MDM2/MDMX靶向多肽可用于MDM2/MDMX阳性肉瘤、黑色素瘤等肿瘤患者的筛选，手术引导，治疗预判和疗效监测。
（三）68Ga/18F-MDM2/MDMX靶向多肽PET显像可以判断患者对于MDM2/MDMX靶向治疗的疗效响应，判断患者是否适合用MDM2/MDMX靶向药物或治疗性核素90Y/177Lu/225Ac/213Bi替代68Ga/18F进行核素靶向治疗。
（四）90Y/177Lu/225Ac/213Bi- MDM2/MDMX靶向多肽等核素靶向治疗，可以为耐药的MDM2/MDMX阳性肉瘤、黑色素瘤患者提供新的治疗手段。
（五）本发明的68Ga/18F-MDM2/MDMX靶向多肽的制备方法简单，标记率高，68Ga标记率可达70%以上，18F标记率可达20%以上。
附图说明
图1a和图1b分别为本发明实施例中DOTA-BCH-P53-1和DOTA-BCH-P53-2两种MDM2/MDMX Peptide的质谱表征图。
图2a和图2b分别为本发明实施例中DOTA-BCH-P53-1和DOTA-BCH-P53-2两种MDM2/MDMX Peptide的结构式。
图3a和图3b分别为本发明实施例中68Ga-BCH-P53-1和68Ga-BCH-P53-2的体外稳定性分析。
图4a和图4b为本发明实施例中68Ga-BCH-P53-1和68Ga-BCH-P53-2的平衡解离常数（Kd值）检测结果。
图5为本发明较佳实施例中68Ga-BCH-P53-1在MDM2/MDMX阳性细胞93T449和HT-29中的细胞摄取和竞争摄取对比实验。
图6为本发明较佳实施例中68Ga-BCH-P53-1在小鼠体内药代动力学结果。
图7为本发明较佳实施例中68Ga-BCH-P53-1在正常昆明鼠中主要脏器放射性分布统计结果。
图8本发明较佳实施例中68Ga-BCH-P53-1在MDM2/MDMX阳性人肾透明细胞癌PDX模型中1 h内micro-PET/CT动态分布图像及脏器ROI勾画统计结果。
图9为本发明实施例中68Ga-BCH-P53-1、68Ga-BCH-P53-2在MDM2/MDMX阳性人肾透明细胞癌PDX模型中多时段micro-PET/CT图像及阻断显像。
具体实施方式
本发明提供一种靶向MDM2/MDMX靶向多肽，MDM2/MDMX靶向多肽分子结构的修饰物，以及进一步得到的诊断、治疗核素标记物及制备方法与应用，并进行了诊断性和治疗性放射性核素的标记与评价。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供MDM2/MDMX靶向多肽，该MDM2/MDMX靶向多肽为BCH-P53-1（式I）或BCH-P53-2（式II），结构分别如下：
本发明中的MDM2/MDMX靶向多肽的结构是基于类P53结合域序列ATSP-7041（Ac-Leu-Thr-Phe-R8-Glu-Tyr-Trp-Ala-Gln-Cba-S5-Ser-Ala-Ala-NH2）结构设计的，在ATSP-7041结构的N端增加PEG-4二硬脂酸酯结构，从而提高多肽分子在体内的稳定性，优化体内代谢情况，或在N端增加PEG-2硬脂酸酯及六精氨酸提高多肽分子水溶性及体内稳定性，还可以避免合成的放射性分子探针出现放射性自分解。
本发明的MDM2/MDMX靶向多肽可通过本领域各种多肽合成/修饰方法制得，比如先合成氨基酸序列，再与PEG4或PEG2反应，将反应所得产物乙酰化后即得。
本发明还提供一种修饰的MDM2/MDMX靶向多肽，该修饰的MDM2/MDMX靶向多肽为双功能偶联剂修饰的所述MDM2/MDMX靶向多肽，所述双功能偶联剂为DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）、NOTA（1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸）、HBED-CC（N,N"-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N"-二乙酸）、DTPA（二乙烯三胺五乙酸）或3pC-NETA-NCS（{4-[2-(双-羧甲基氨基)-5-(4-硝基苯基)戊基]-7-羰基-二甲基-[1,4,7]三氮杂喃-1-基}乙酸-N-氯代丁二酰亚胺）。
优选地，所述双功能偶联剂修饰在所述MDM2/MDMX靶向多肽的N端。
为进一步解决多肽空间结构以及体内稳定性和水溶性等问题，优选在所述MDM2/MDMX靶向多肽的N端修饰有六精氨酸（Hexa-arginine）结构。
双功能偶联剂对MDM2/MDMX靶向多肽进行修饰的方法可采用本领域常规的各种方法，这些方法为本领域技术人员所熟知，本发明对此没有特别限定。例如，在pH8.5-9.0NaHCO3缓冲液体系中，将多肽与DOTA按照(5~10):1的摩尔比混合，常温反应30 min-2 h。
本发明还提供一种诊疗核素标记物，该诊疗核素标记物为放射性核素标记的所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽。
根据本发明的一种实施方式，所述放射性核素可以为诊断用放射性核素，所述诊断用放射性核素优选为68Ga和/或18F。
当所述放射性核素为68Ga时，放射性核素标记的MDM2/MDMX靶向多肽的制备方法可包括以下步骤：
1）采用68Ge-68Ga发生器制备68Ga；
2）采用0.04-0.06 M HCl溶液淋洗68Ga至0.8-1.2 M NaAc溶液中；
3）将所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽加入步骤2）所得含68Ga的NaAc溶液体系中，混匀，在90-100℃反应10-20min；
4）用生理盐水洗脱步骤3）反应体系中的放射性杂质，然后用无水乙醇洗脱，得到产物68Ga标记的MDM2/MDMX靶向多肽。
具体地，以进行双功能螯合剂DOTA修饰为例，68Ga对修饰后的MDM2/MDMX靶向多肽的标记可采用以下方法：
MDM2/MDMX靶向多肽序列进行双功能偶联剂DOTA修饰后，得到序列：DOTA-PEG4-Leu-Thr-Phe-R8-Glu-Tyr-Trp-Ala-Gln-Cba-S5-Ser-Ala-Ala-NH2（DOTA-BCH-P53-1）或DOTA-PEG2-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Phe-R8-Glu-Tyr-Trp-Ala-Gln-Cba-S5-Ser-Ala-Ala-NH2（DOTA-BCH-P53-2）；对制备得到的DOTA-BCH-P53-1或DOTA-BCH-P53-2进行68Ga（T1/2=68 min；β+:89%；E=511 keV）核素的标记，68Ga用68Ge-68Ga发生器进行制备。取1mL 0.05 M HCl溶液淋洗68Ga至65 μL 1M NaAc中；将0.1 mL（20 μg）的前体加入上述体系，混匀，90oC反应15 min，用3 mL生理盐水洗脱放射性杂质，再用0.5 mL 无水乙醇洗脱出目标化合物68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2，用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。得到的68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2放射性化学纯度大于95%。标记率小于90%时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，其中Sep-pak柱需用10 mL无水乙醇和10 mL高纯水活化以备用。取适量经无菌过滤的产品制剂进行质量控制检验，所有项目均合格后进行后续研究。
当所述放射性核素为18F时，放射性核素标记的MDM2/MDMX靶向多肽的制备方法可包括以下步骤：
1）采用回旋加速器制备18F；
2）将回旋加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.45-0.55 mL生理盐水冲洗上述QMA柱，洗脱18F-；
3）取步骤2）得到的0.09-0.11 mL含18F-的生理盐水与KHP和AlCl3溶液混合，震荡摇匀后室温放置4-6 min，再加入所述双功能偶联剂NOTA修饰的BCH-P53-1或BCH-P53-2，在100-120℃反应10-20 min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，用生理盐水洗涤，然后用乙醇洗脱，得到产物18F-标记的MDM2/MDMX靶向多肽。
具体地，以进行双功能螯合剂NOTA修饰为例，18F对修饰的MDM2/MDMX靶向多肽标记可采用以下方法：
MDM2/MDMX靶向多肽序列进行双功能偶联剂NOTA修饰后，得到序列：NOTA-PEG4-Leu-Thr-Phe-R8-Glu-Tyr-Trp-Ala-Gln-Cba-S5-Ser-Ala-Ala-NH2（NOTA-BCH-P53-1）或NOTA-PEG2-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Phe-R8-Glu-Tyr-Trp-Ala-Gln-Cba-S5-Ser-Ala-Ala-NH2（NOTA-BCH-P53-2）；对制备得到的NOTA-BCH-P53-1或NOTA-BCH-P53-2进行18F（T1/2=109.8 min；β+:96.7%；E=511 keV）核素的标记，18F利用回旋加速器制备。将加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.5 mL生理盐水冲洗上述QMA柱，将18F-洗脱到反应管中；取0.1 mL含18F-的生理盐水于反应管中，再加入11 µL10倍KHP和6 µL 2 mM AlCl3溶液，震荡摇匀后室温放置5 min；再加入0.1mL（20 μg）标记前体，110℃反应15 min；反应液冷却至室温后，将产物加载到C18分离柱上，用4 mL生理盐水洗涤后，用0.5mL无水乙醇将产物淋洗出并通过0.22 μm无菌滤膜；N2吹干溶剂后用一定量生理盐水稀释得产品制剂；用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。所述18F-BCH-P53-1或18F-BCH-P53-2经分离纯化后放射化学纯度大于95%。标记率小于90%时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，其中Sep-pak柱需用10mL无水乙醇和10mL高纯水活化以备用。取适量经无菌过滤的产品制剂进行质量控制检验，所有项目均合格后进行后期研究。
根据本发明，所述放射性核素也可以为治疗用放射性核素，以期达到MDM2/MDMX高表达肿瘤靶向核素治疗的目的。所述治疗用放射性核素优选为90Y、177Lu、225Ac和213Bi中的至少一种。
对MDM2/MDMX靶向多态序列用双功能偶联剂DOTA、双功能偶联剂DTPA、双峰双功能配体3pC-NETA-NCS修饰之后，进行治疗用放射性核素177Lu、90Y、225Ac或213Bi标记，得到177Lu-BCH-P53-1或177Lu-BCH-P53-2、90Y-BCH-P53-1或90Y-BCH-P53-2、225Ac-BCH-P53-1或225Ac-BCH-P53-2、213Bi-BCH-P53-1或213Bi-BCH-P53-2治疗用分子探针。
治疗用放射性核素的标记可以采用本领域常规的各种方法，根据本发明一种优选实施方式，所述177Lu，90Y，225Ac或者213Bi标记MDM2/MDMX 靶向多肽方法可采用如下方法：以177Lu为例，MDM2/MDMX 靶向多肽进行双功能螯合剂DOTA、DTPA、3pC-NETA-NCS修饰后，得到相应的标记前体。按照1 mL 0.05M HCl对应65 µL 1M NaAc来配制标记缓冲液，待用；100µL （100µg）标记前体中，加入100-150 µL标记缓冲液，然后加入177Lu；将pH调至5.5，70-95oC，反应10-15 min，标记率小于90%时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，得到177Lu-BCH-P53-1或177Lu-BCH-P53-2。用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。所制得的177Lu-BCH-P53-1或177Lu-BCH-P53-2经分离纯化后放射化学纯度大于95%。
采用诊断性放射性核素68Ga、18F标记本发明修饰后的MDM2/MDMX靶向多态，得到68Ga/18F-BCH-P53-1或68Ga/18F-BCH-P53-2靶向多肽分子探针，该探针体内稳定性良好，安全无毒，可以特异性与MDM2/MDMX分子结合，准确定位MDM2/MDMX高表达的肿瘤组织，表现出良好的靶向性和特异性。由此说明，本发明的MDM2/MDMX靶向多肽也具有良好的体内稳定性、靶向性和特异性。
本发明还提供上述诊疗核素标记物（诊断用放射性核素标记的MDM2/MDMXPeptide）在制备MDM2/MDMX靶向性的肿瘤PET显像试剂中的应用。
本发明还提供上述诊疗核素标记物（治疗用放射性核素标记的MDM2/MDMX靶向多肽）在制备MDM2/MDMX靶向性的肿瘤核素治疗药物中的应用。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 MDM2/MDMX靶向多肽
该MDM2/MDMX靶向多肽为BCH-P53-1或BCH-P53-2，结构分别如式I或式II所示。该MDM2/MDMX靶向多肽按照序列化学合成获得，经验证氨基酸序列正确。
实施例2 修饰的MDM2/MDMX靶向多肽的制备与表征
对BCH-P53-1、BCH-P53-2序列进行DOTA修饰，在pH8.8 NaHCO3缓冲液体系中，将MDM2/MDMX Peptide与DOTA（10 mg/mL）按照(8-10):1的摩尔比混合，常温反应1 h，得到修饰后的DOTA-BCH-P53-1、DOTA-BCH-P53-2，结构如图2a、图2b所示。对修饰后的MDM2/MDMX靶向多肽序列的分子结构进行质谱和HPLC表征；HPLC分析条件：Kromasil 100-5C18凝胶过滤/体积排阻色谱柱，流速1 mL/min；流动相A为含0.1%三氟乙酸TFA的水；流动相B为乙腈。流动相梯度设置：0.0min 45%的B和55%的A；20min 65%的B和35%的A；20.1min 100%的A和0%的B。其中，质谱结果分别如图1a、图1b所示。
实施例3 68Ga标记MDM2/MDMX靶向多肽的制备
对制备得到的DOTA-BCH-P53-1、DOTA-BCH-P53-2分别进行68Ga（T1/2=68 min；β+:89%；E=511 keV）核素的标记，68Ga用68Ge-68Ga发生器进行制备。取1 mL 0.05 M HCl溶液淋洗68Ga至65 μL 1M NaAc中；将0.1 mL（20 μg）的前体加入上述体系，混匀，90oC反应15 min，反应液冷却至室温后，将产物加载到C18分离柱上，用4 mL生理盐水洗脱放射性杂质，用0.5mL无水乙醇将目标化合物68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2淋出并通过0.22 μm无菌滤膜；N2吹干溶剂后用生理盐水配制得产品制剂，用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度，经测定得到的68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2标记率均约为70%，放射性化学纯度均大于95%。
实施例468Ga-BCH-P53-1、68Ga-BCH-P53-2的体外稳定性分析
取10 µL含0.74 MBq（20 µCi）的纯化后产物68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2加入到200 µL生理盐水（或5% HSA溶液）中，4 ℃条件下孵育；分别在孵育0 h、1 h、2 h、3 h和4 h时取出37-74 kBq（1-2 µCi）样品进行radio-TLC分析。分析方法如下：分别取2 µL含37-74 kBq（1-2 µCi）放射性活度的68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2生理盐水溶液或者5%HSA溶液加至20 µL饱和EDTA中混匀，进行radio-TLC分析。取2 µL样品滴在距新华一号滤纸底端1 cm处，置于生理盐水展开体系中，待完全展开后，取出滤纸并晾干，进行radio-TLC检测，游离68Ga的Rf值为0.9-1，68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2的Rf值为0-0.1；结果显示68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2在生理盐水溶液或5% HSA溶液中，4 h内均具有良好的稳定性。具体结果见图3a及3b。
上述实验结果说明，68Ga-BCH-P53-1及68Ga-BCH-P53-2具有良好的体外稳定性。
实施例568Ga-BCH-P53-1、68Ga-BCH-P53-2平衡解离常数（Kd）检测
将93T449细胞接种于48孔板中（每孔500µL RPMI 1640完全培养基/约1×105个细胞，n = 4），在37℃、5%CO2培养箱中培养24小时，待细胞贴壁后开始实验。实验开始前，将原培养基弃掉后用冷PBS清洗一遍后弃掉，将用RPMI 1640无血清培养基配好的探针68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2分别以浓度（0.2781nmol/L、0.5562nmol/L、1.1125nmol/L、2.225nmol/L、22.25nmol/L、44.5nmol/L）加入48孔板中，在37℃/5%CO2孵育2h后，将培养基弃掉，用冷PBS清洗2-3次后加入200µL 1M NaOH裂解10min左右，收集每孔的细胞裂解液用γ-counter测定解离常数。
结果如图4a及4b所示，68Ga-BCH-P53-1的Kd值约为6.79 nM，68Ga-BCH-P53-2的Kd值约为47.97 nM，68Ga-BCH-P53-1表现出更高的靶向性，但是考虑到PET成像的高敏感度，两种探针均较适合用于MDM2/MDMX靶向PET成像。
实施例668Ga-BCH-P53-1、68Ga-BCH-P53-2在MDM2/MDMX高表达人源脂肪肉瘤细胞93T449的摄取及竞争摄取
将生长至对数期的人源脂肪肉瘤细胞93T449以2×105个/孔均匀铺到24孔板中，向每孔加入500 μL不含胎牛血清的PRIM 1640培养基，培养箱孵育24h。将一定量68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2均匀加入到孔板中（每孔20μCi），放入培养箱孵育一段时间，分别于10min、30min、60min、120min将孔板取出，使用1M NaOH裂解细胞（n=6）并收集，放入γ-Counter进行测量。实验结果如图5所示，68Ga-BCH-P53-1和68Ga-BCH-P53-2探针在MDM2/MDMX高表达细胞中均有较高的摄取，其中68Ga-BCH-P53-1摄取值要略高于68Ga-BCH-P53-2。
细胞竞争抑制实验：实验步骤与细胞摄取实验大致相同，仅在加入68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2之前30 min向部分孔内（n=6）加入10 μg/孔BCH-P53-1或BCH-P53-2，然后每孔加入68Ga-BCH-P53-1或68Ga-BCH-P53-2溶液（每孔20μCi），分别于60min、120min收集裂解后的细胞溶液，放入γ-Counter进行测量。实验结果如图5所示，68Ga-BCH-P53-1和68Ga-BCH-P53-2探针在93T449细胞的摄取均可被MDM2/MDMX Peptide抑制，证明其对MDM2/MDMX特异靶向性。
实施例768Ga-BCH-P53-1体内药代动力学分析
取5只正常BALB/c小鼠（均为雄性，4周龄，16-18g）,将一定量68Ga-BCH-P53-1经生理盐水稀释，每只小鼠经尾静脉注射60 μCi探针溶液，并严格记录注射时间。分别于1 min、3 min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、2 h、8 h、24 h、48 h使用毛细取血针经眼底静脉取血，并分别置于γ计数管中。称量计数管中血液质量，使用γ-counter计数仪检测样品放射性活度，同时取每只小鼠注射药物量的1%作为测定参考标记品。结果使用单位组织的放射活度占注射总活度的百分比（%ID/g）显示，使用分析软件经衰减校正后计算药物生物半衰期。
分子探针特别是治疗型分子探针的药物代谢-时间曲线可以显示药物在生物体内循环时间，为药物毒性分析、治疗计划设定等提供指导。经检测，68Ga-BCH-P53-1的药代动力学曲线经Prism 6.0软件拟合后符合二室模型，所用公式如式1所示：
Ct=A1*exp(-αt)+A2*exp(-βt) 式1
式1中，A1和A2分别为中央室与外周室与纵轴的截距，α、β分别为中央室速率常数和外周室速率常数。统计结果如图6所示，经计算，68Ga-BCH-P53-1的分布相和清除相的生物半衰期分别为0.01 h和0.7 h。
实施例868Ga-BCH-P53-1正常昆明鼠体内分布检测
取昆明鼠15只（雌性，4周龄），将小鼠随机分为5组，每组3只，分别标记为15 min组、30 min组、60 min组、120 min组、240 min组。将68Ga-BCH-P53-1（60 μCi）经生理盐水稀释后尾静脉注射到小鼠体内，并取5份1%放射剂量的注射液作为参照物。分别于15 min、30min、60 min、120 min、240 min将各组小鼠麻醉后处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、脑、骨和血液，同时使用分析天平对各脏器进行称量。将各脏器放置于γ计数管中，然后分别对各脏器及参照物进行γ计数器检测，获得各部分的放射性活度。经过衰减矫正后的原始数据用GraphPad Prism 6.0软件进行分析并绘制直方图，生物分布数据(%ID/g)表示为平均值±标准差。结果如图7所示，探针在小鼠体内放射性分布主要集中在肝脏、肺脏，肾脏摄取较少，证明探针的清除以肝胆代谢方式为主。其他脏器摄取较少，与MDM2/MDMX在正常组织中分布较少基本一致。
实施例968Ga-BCH-P53-1在MDM2/MDMX阳性人肾透明细胞癌PDX模型ccRCC中micro-PET/CT动态显像
准备5只移植有人肾透明细胞癌组织块的裸鼠动物模型（雌性，5-6周龄，18-20 g，肿瘤直径达到0.8-1.0cm）。以3 L/min的异氟烷气体麻醉小鼠，将动物模型以俯卧位固定于Micro-PET扫描床的中心，尾静脉注射7.4 MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-MDM2/MDMX Peptide之后，立即采用动态扫描模式扫描小鼠，能量窗350-700 keV，扫描时间为1 h，扫描过程中以1 L/min的异氟烷气体维持麻醉小鼠，采用有序子集最大期望值（ordered subsetsexpectation maximization，OSEM）软件进行图像重建，并在进行衰减校正后采用MMWKS软件进行图像分析处理。具体结果如图8所示，68Ga-BCH-P53-1在MDM2/MDMX阳性ccRCC肿瘤模型中1 h内micro-PET/CT分布图像结果显示68Ga-BCH-P53-1在动物体内具有较好的体内稳定性和药代动力学性质，该分子探针主要通过肝代谢，全身组织非特异性摄取较低；随着全身代谢，在10 min肿瘤组织中就出现特异性的放射性累积，且随时间延长持续滞留。重要脏器ROI勾画统计结果与探针生物分布相类似，而在肿瘤部位的放射性摄取呈现较高的数值，并持续1 h。
实施例1068Ga-BCH-P53-1和68Ga-BCH-P53-2在MDM2/MDMX阳性人肾透明细胞癌PDX模型中多时间点micro-PET/CT显像、阻断显像以及体内分布
准备10只移植有人肾透明细胞癌组织块的裸鼠动物模型（雌性，5-6周龄，18-20g，肿瘤直径达到0.8-1 cm），随机分为实验组1、实验组2和阻断组，每组各3只。实验组1每只经尾静脉注射7.4 MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-BCH-P53-1；实验组2每只经尾静脉注射7.4MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-BCH-P53-2；阻断组共注射0.5 mg 68Ga-BCH-P53-1+7.4 MBq（0.2 mCi，200 µL）68Ga-BCH-P53-1；每组每只动物模型在注射后30min、1 h、2 h及4 h进行micro-PET成像；分别在相应时间进行micro-PET成像前，以3 L/min的异氟烷气体麻醉小鼠，将PDX模型以俯卧位固定于micro-PET扫描床的中心，采用静态扫描模式扫描小鼠，能量窗350-700 keV，扫描时间为15 min，随着探针的代谢和衰变，延长扫描时间，扫描过程中以1 L/min的异氟烷气体维持麻醉小鼠，采用有序子集最大期望值（ordered subsetsexpectation maximization，OSEM）软件进行图像重建，并在进行衰减校正后采用MMWKS软件进行图像分析处理。实验结果如图9所示。68Ga-BCH-P53-1和68Ga-BCH-P53-2在MDM2/MDMX阳性人肾透明细胞癌模型中micro-PET/CT图像结果显示，探针在1 h和2 h在肿瘤位置均有较高放射性摄取，4 h肿瘤部位摄取略有下降；脏器ROI勾画统计数据显示，68Ga-BCH-P53-1肿瘤摄取值要明显高于68Ga-BCH-P53-2，两者体内分布及代谢方式大致相似；经一定量BCH-P53-1阻断之后68Ga-BCH-P53-1肿瘤部分放射性摄取明显降低。说明68Ga-BCH-P53-1及68Ga-BCH-P53-2对MDM2/MDMX阳性肿瘤具有高度特异性靶向性。
以上实验结果表明，本发明设计合成的MDM2/MDMX靶向多肽序列具有良好的体内稳定性、靶向特异性，其与诊断性或者治疗性放射性核素标记合成的分子探针对MDM2/MDMX分子均具有良好的亲和力和功能活性，有望成为具有良好应用前景的肿瘤靶向MDM2/MDMX诊断及核素治疗用放射性药物。
本发明所构建的MDM2/MDMX靶向多肽为订书肽结构，具有更高的稳定性，更适于生物应用。对其进行双功能偶联剂修饰后应用于核医学肿瘤靶向诊疗，实验结果显示出极高的肿瘤特异性和PET成像效果，作为核医学诊疗探针能够发挥理想的应用效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.MDM2/MDMX靶向多肽，其特征在于，所述多肽的结构如下：
。
2.一种修饰的MDM2/MDMX靶向多肽，其特征在于，其为双功能偶联剂修饰的权利要求1所述的多肽，所述双功能偶联剂为DOTA、NOTA、HBED-CC、DTPA或3pC-NETA-NCS。
3.根据权利要求2所述的修饰的MDM2/MDMX靶向多肽，其特征在于，所述双功能偶联剂修饰在所述MDM2/MDMX靶向多肽的N端一侧。
4.一种诊疗核素标记物，其特征在于，所述诊疗核素标记物为放射性核素标记的权利要求2或3所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽。
5.根据权利要求4所述的诊疗核素标记物，其特征在于，所述放射性核素为诊断用放射性核素，所述诊断用放射性核素为68Ga或18F。
6.根据权利要求4所述的诊疗核素标记物，其特征在于，所述放射性核素为治疗用放射性核素，所述治疗用放射性核素选自90Y、177Lu、225Ac和213Bi中的一种。
7.权利要求5所述诊疗核素标记物在制备MDM2/MDMX靶向多肽的肿瘤PET显像试剂中的应用。
8.权利要求6所述诊疗核素标记物在制备MDM2/MDMX靶向多肽的肿瘤核素治疗药物中的应用。
9.权利要求5所述诊疗核素标记物的制备方法，其特征在于，所述放射性核素为68Ga，包括以下步骤：
1）采用68Ge-68Ga发生器制备68Ga；
2）采用0.04-0.06 M HCl溶液淋洗68Ga至0.8-1.2 M NaAc溶液中；
3）将所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽加入步骤2）所得含68Ga的NaAc溶液中，混匀，于90-100℃反应10-20min；
4）用生理盐水洗脱步骤3）反应体系中的放射性杂质，然后用无水乙醇洗脱，得到产物68Ga标记的MDM2/MDMX靶向多肽。
10.权利要求5所述的诊疗核素标记物的制备方法，其特征在于，所述放射性核素为18F，包括以下步骤：
1）采用回旋加速器制备18F；
2）将回旋加速器生产的含有18F的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F吸附在QMA柱上；用0.45-0.55 mL生理盐水冲洗上述QMA柱，洗脱18F；
3）取步骤2）得到的0.09-0.11 mL含18F的生理盐水与KHP和AlCl3溶液混合，震荡摇匀后室温放置4-6 min，再加入所述修饰的MDM2/MDMX靶向多肽，于100-120℃反应10-20 min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，用生理盐水洗涤，然后用无水乙醇洗脱，得到产物18F标记的MDM2/MDMX靶向多肽。
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