KR102120658B1

KR102120658B1 - Ap1s1 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102120658B1
Application number: KR1020170063101A
Authority: KR
Inventors: 이상명; 정장호
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-22
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2020-06-09
Also published as: KR20180127837A

Abstract

본 발명은 AP1S1(Adaptor Related Protein Complex 1 Sigma 1 Subunit) 유전자 발현 억제제 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기질금속단백질분해효소의 활성을 제어하는 AP1S1은 데스모플라시아가 동반된 암조직에서 현저하게 과발현되며, AP1S1의 발현 억제에 의해 악성 종양 세포주의 이동성 및 침투성이 저해됨을 알 수 있다. 따라서, AP1S1 유전자의 발현 억제제 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제는 암세포의 치료 또는 전이 억제용 약물로 개발될 수 있을 것으로 기대되며, 또한, 본 발명은 암 치료제 또는 암 전이 억제제 후보 약물의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

AP1S1 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for cancer treatment or suppression of metastasis comprising inhibitor of AP1S1 as an active ingredient}

본 발명은 AP1S1(Adaptor Related Protein Complex 1 Sigma 1 Subunit) 유전자 발현 억제제 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

AP1S1(Adaptor Related Protein Complex 1 Sigma 1 Subunit)은 단백질을 코딩하는 유전자로서, 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 클라트린(clathrin)을 코팅된 소수포(vesicle)의 수용체와 연결시키는 clathrin coat assembly complex의 일부가 된다. AP1S1과 관련된 질병에는 메드닉 증후군(Mednik Syndrome), 선천성 설사(Chirsta diarrhea)가 알려져 있으며, 상기 질병은 면역계 및 소포 매개 수송과 관련이 있다고 알려져 있다.

기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)는 세포외막의 모든 구성성분들을 총체적으로 분해할 수 있는 아연 (Zn) 의존적 엔도펩티다제 계열 효소의 한 종류이다. 기질금속단백질분해효소는 처음에 올챙이 꼬리를 분해하는 효소로 알려졌으나, 그 이후의 연구에서 결합 조직 세포들에 의해 합성되는 기질금속단백질분해효소가 생리적 변화 과정에서 일어나는 세포외막의 재구성에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 기질금속단백질분해효소에 의해서 매개되는 질환으로는 동맥경화증, 재협착증, 기질금속단백질분해효소-매개 골감소증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 폐혈증성 관절염, 각막궤양, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤 및 전이 등이 알려져 있다[(Wossener Jr., Annals NY Acad. Sci., 732, 11-21 (1994); Warner et al., Am. J. Pathol., 158, 2139-44(2001); Stetler-Stevenson, Surg. Oncol. Clin. N. Am., 10, 383-92 (2001)].

한편, AP1S1에 의해 코딩되는 단백질이 엔도사이토시스(endocytosis) 및 골지(golgi) 형성 과정에 관여한다는 것은 이미 알려져 있으나, AP1S1 유전자 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 기질금속단백질분해효소의 활성을 제어한다는 등의 연관관계는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 AP1S1 억제에 의한 암 치료 및 암 전이 억제 효과에 대해 연구하던 중 AP1S1 유전자 발현 억제제 및 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제를 발견하였고, 이들이 AP1S1의 발현을 하향 조절해 기질금속단백질분해효소의 활성을 억제하여 암세포의 증식 및 침투를 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AP1S1 유전자 발현 억제제 또는 AP1S1 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 AP1S1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 이용하여 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AP1S1 유전자 발현 억제제 또는 AP1S1 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 AP1S1 유전자 발현 억제제 또는 AP1S1 단백질 활성 억제제는 기질금속단백질분해효소의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 구현예로, 상기 AP1S1 유전자 발현 억제제는 AP1S1 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드(antisense nucleotide), 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 리보자임(ribozyme), 및 유전자 가위(CRISPR/Cas-9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예로, 상기 AP1S1 단백질의 활성 억제제는 AP1S1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 압타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(1) AP1S1 유전자 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 세포주에서 AP1S1 유전자의 발현 정도 또는 AP1S1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

(3) 상기 AP1S1 유전자의 발현 정도 또는 상기 AP1S1 단백질의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (2)에서, 상기 AP1S1 유전자 발현 정도는 면역침강법(Immunoprecipitation), 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역세포화학(Immunocytochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blot), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 구현예로, 상기 단계 (2)에서, 상기 AP1S1 단백질 발현 정도는 웨스턴 블랏, 방사선면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법, 면역침강법, 유세포분석법, 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 역전사 중합효소 연쇄반응, 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 구현예로, 상기 암은 비소폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 AP1S1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 치료 또는 암 전이 억제 용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, 기질금속단백질분해효소의 활성을 제어하는 AP1S1은 데스모플라시아가 동반된 암조직에서 현저하게 과발현되며, AP1S1의 발현 억제에 의해 악성 종양 세포주의 이동성 및 침투성이 저해됨을 알 수 있다. 따라서, AP1S1 유전자의 발현 억제제 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제는 암세포의 치료 또는 전이 억제용 약물로 개발될 수 있을 것으로 기대되며, 또한, 본 발명은 암 치료제 또는 암 전이 억제제 후보 약물의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 다양한 암세포주에서 세포 외 기질의 경도 증가에 따른 AP1S1의 유전자 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 1b는 비소폐암 및 유방암 세포에서 AP1S1의 단백질 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 2a는 AP1S1 발현저해 세포주의 AP1S1 유전자 발현저해 정도를 데이터로 나타낸 도이다.
도 2b는 AP1S1 발현저해 세포주의 세포 이동 및 침투 정도를 데이터로 나타낸 도이다.
도 3a는 AP1S1 발현저해 세포주의 세포 내(세포용해액)에서 기질금속단백질분해효소 활성 정도를 데이터로 나타낸 도이다.
도 3b는 AP1S1 발현저해 세포주의 세포 외(조정배지)에서 기질금속단백질분해효소 활성 정도를 데이터로 나타낸 도이다.

본 발명자들은 AP1S1 유전자의 발현 및 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 활성 억제를 통해 기질금속단백질분해효소의 활성을 제어하여 세포의 이동성 및 침투성을 저해한다는 점을 발견하였고, 이에, 본 발명은 AP1S1 유전자 발현 억제제 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 및 암 치료 및 암 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 AP1S1은 정상 조직의 경도에 비해 암조직의 경도에서 발현이 증가됨을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 AP1S1의 유전자 발현 저해에 따라 암세포의 이동 및 침투성이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 AP1S1의 유전자 발현 저해에 의해 기질금속단백질분해효소의 활성이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 AP1S1 유전자 발현 억제제 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "암(cancer)"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.

본 발명에서 사용되는 암은 대장암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 비소폐암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 AP1S1 유전자의 발현 억제제 또는 AP1S1 단백질의 활성 억제제와 함께 항암 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

본 발명의 AP1S1 유전자의 발현 억제제 또는 AP1S1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육, 자궁 내 경막, 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법 또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

상기 조성물은 암세포의 증식, 이동, 침투 또는 전이의 저해 활성을 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 AP1S1 유전자의 발현 억제제는 αTAT1 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA, 리보자임, 및 유전자 가위로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 작은 헤어핀 RNA이나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 AP1S1 단백질의 활성 억제제는 AP1S1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 압타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)"는 AP1S1 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서, AP1S1 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기는 β-턴 디펩티드 코어, 케토-메틸렌 슈도펩티드류, 아제핀, 벤조디아제핀, β-아미노알콜, 및 치환 감마락탐환을 사용하여 생성할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "압타머"는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 폴리클론날(polyclonal) 항체 및 모노클론날(monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

또한, 본 발명은 AP1S1 유전자를 이용한, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은,

(1) AP1S1 유전자 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 세포주에서 AP1S1 유전자의 발현 정도 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

(3) 상기 AP1S1 유전자의 발현 정도 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 AP1S1 유전자 발현 정도는 면역침강법, 역전사 중합효소 연쇄반응, 효소면역분석법, 면역세포화학, 웨스턴 블랏, 및 유세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 유전자 또는 전사체의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 AP1S1 단백질 발현 정도는 웨스턴 블랏, 방사선면역분석법, 방사 면역 확산법, 효소면역분석법, 면역침강법, 유세포분석법, 면역형광염색법, 오우크테로니, 보체 고정 분석법, 역전사 중합효소 연쇄반응, 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 단백질 발현양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 세포 배양

인간의 암세포주 H1299(폐암 유례 세포주), MDA-MB-231(유방암 유례 세포주), HCT116(대장암 유례 세포주) 및 SKOV-3(난소암 유례 세포주)는 한국의 세포주 은행에서 구매하였으며, 상기 암세포주는 10%(v/v) 소 태아 혈청 (FBS; Young in Frontier), 100 units/ml 페니실린(penicillin), 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(RPMI1640; Gibco-BRL, Grand Island, NY) 에서, 5% CO₂, 37℃의 습한 환경에서 배양하였다.

1-2. 폴리아크릴아마이드겔 제작

실험에 필요한 정상조직의 경도인 0.5 kPa 및 암조직의 경도인 40 kPa에 맞는 acrylamide-bisacrylamide 혼합용액을 제작하여 2% 3-아미노프로필-트리메톡시실란으로 코팅된 25 mm 커버슬립 위에 겔을 굳혔다. 폴리아크릴아마이드겔은 0.5 mg/mL sulfo-sulfosuccinimidyl-6-[4′-azido-2′-nitrophenylamino] hexanoate (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 처리한 후 365 nm UV를 10분씩 두 번 처리 하였다. 그 후 50 ㎍/ml Type Ⅰ 콜라겐(collagen; BD Bioscience, Bedford, MA, USA)으로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다.

1-3. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

총 RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa)을 사용하여 수득하였고, cDNA 합성은 M-MLV (M. Biotech, Seoul, Korea) 역전사효소를 통해 제작하였으며, RT-PCR은 Ex-Taq DNA 중합 효소(takara)를 사용하여 하기 표 1에 열거된 프라이머로 수행하였다. 밴드 밀도는 Quantity One 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다.

이 연구에서 사용하는 RT-PCR 프라이머
	Forward (5' to 3')	Reverse (5' to 3')
AP1S1	CCGATACGTGGAGCTCTTAG	CTCCTCTTGCAGTAGGTCAG
GAPDH	GAGTCAACGGATTTGGTCGT	TGTGGTCATGAGTCCTCCCA

1-4. 웨스턴블랏 분석(Western blot analysis)

세포를 용해 버퍼(lysis buffer) [105 mM NaCl, 6 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄, 2 mM EDTA, 1% sodium deoxycholate, 1% NP-40, 50 mM NaF, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM Na₃VO₄, and 10 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]에서 균질화한 후 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮긴 후, 항-AP1S1, 항-GAPDH, 또는 항-pMLC 항체 (1차 항체)와 배양한 다음, HRP가 결합된 항-IgG 항체(2차 항체)와 함께 배양하였다.

1-5. 렌티바이러스 시스템을 이용한 AP1S1 Knock down 세포주 제작

AP1S1의 mRNA내의 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)를 표적으로 삼는 21 bp의 유도 서열(#1: 5′-GAGCTCTTAGACAAATACTTT-3′ #2: 5′-GCCAAGACAATGAGCTCATCA-3′)을 포함한 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA)와 EcoR1 또는 AGe1(NEB, Beverly, Ma)의 라이게이션 어뎁터(ligation adaptor)를 포함하는 2개의 상보적 올리고(oligo)를 합성하였으며, 각각의 올리고는 T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 인산화 및 어닐링(annealing)하였다. 상기 어닐링 된 올리고를 EcoR1 또는 Age1-digested pLko.1 벡터에 결착하였고 상기 벡터의 서열은 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)을 통해 확인하였다. 렌티바이러스를 제작하기 위해 HEK293T 세포를 70-80% 컨플루언스(confluence)로 100 mm 플레이트에 시딩(seeding)하였으며, pLko.1-ctl 또는 pLko.1-shRNA construct를 psPAX 및 pMD2.G vector와 함께 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)으로 24시간 동안 형질 전환시켜 세포에 도입하였고, 8 ml의 무혈청배지(serum free medium)로 교체한 다음 48시간 동안 배양하여 바이러스가 포함된 배양액을 수확하였다.

H1299 세포는 70-80% 컨플루언스(confluence)로 6웰 플레이트에 시딩(seeding)하였으며, 24시간 동안 배양 후 200 ㎕의 상기 바이러스 배양액을 넣어준 뒤 48시간 동안 배양하여 바이러스를 감염시켰다. 감염 후 250 ng/ml 퓨로마이신(puromycin, Sigma-Aldrich)에서 2주 동안 배양하여 안정한 세포주를 선발하였다.

1-6. 세포 이동성 및 침투성 분석

세포의 이동 효과를 확인하기 위하여 코팅을 하지 않은 트렌스웰(8㎛ 기공 크기의 24-웰 트렌스웰 플레이트; Costar, Corning, NY, USA)을 사용하였고, 세포의 침투 효과를 확인하기 위하여 트렌스웰을 25 ㎍/ml Type Ⅰ 콜라겐(collagen)으로 코팅하였다. 트렌스웰의 상부 챔버에는 200 ㎕의 무혈청배지(serum free medium)에 대조군 H1299 세포와 AP1S1 발현저해 H1299 세포(2×10⁵cells)를 시딩하였고, 하부 챔버에는 10% FBS를 부가한 RPMI를 주입하였다. 24시간 후, 세포를 메탄올로 고정시키고 0.1% crystal violet으로 염색하였다. 비침투세포를 면봉으로 제거한 후 침투세포 숫자를 최소 5개의 임의장(random field)에서 집계하여 수치화하였다.

1-7. 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 활성 분석

상기 실시예 1-2에서 제작한 경도가 다른 겔 위에 대조군 H1299 세포와 AP1S1 유전자 발현 저해 H1299 세포를 4×10⁵개를 시딩한 후 24시간 동안 배양하였다. 조정배지(conditioned medium)는 배양액을 수확한 후 4℃, 13000 RPM에서 5분 동안 원심분리 한 후 상층액을 옮겨 수확하였으며 세포는 1×로 희석된 cell culture lysis 5x Reagent (promega, Madison, WI)를 이용하여 용해시켰다. 각각의 조정배지와 세포용해액에 Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 Fluorogenic MMP Substrate (ES001; R&D systems, Minneapolis, MN)가 10 ㎛가 되도록 처리한 후 기질금속단백질분해효소에 의해 형성되는 형광물질을 Bio-Tek Synergy Mx microplate reader (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 여기(Excited)파장은 305 nm를 사용하였고 방출(Emission)파장은 430 nm를 사용하였다.

실시예 2. 경도 의존적 AP1S1 유전자 및 단백질 발현 증가 확인

상기 실시예 1-2에 따라 0.5 kPa과 40 kPa 경도의 폴리아크릴아마이드겔을 제작하고, 상기 실시예 1-1의 방법을 통하여 배양한 다양한 암세포주를 각각 시딩하여 서로 다른 경도의 환경에 상기 암세포주들을 배양하여, 상기 실시예 1-3을 통하여 AP1S1 유전자의 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 인간 비소폐암 세포주인 H1299와 유방암 세포주인 MDA-MB-231에서 정상조직의 경도인 0.5 kPa에 비해 암조직의 경도인 40 kPa에서 AP1S1의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

추가적으로 상기 유전자 발현의 따라 단백질의 양이 변화하는지 확인하기 위해 상기 도 1a의 유전자 발현이 변동된 H1299와 MDA-MB-231에서 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현양을 상기 실시예 1-4의 방법을 통하여 확인하였다.

그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 0.5 kPa에 비해 40 kPa의 경도에서 배양한 세포의 AP1S1의 발현양이 증가됨을 단백질 단계에서 확인하였다. 이는, 정상조직의 경도에 비해 암조직의 경도에서 AP1S1의 발현양이 증가됨을 의미한다.

실시예 3. AP1S1의 발현 저해에 따른 암세포의 이동 및 침투성 변화 효과 확인

경도 의존적으로 발현양이 증가하는 AP1S1의 암세포에서의 역할을 확인하기 위하여 상기 실시예 1-5를 통하여 AP1S1의 발현이 저해되는 세포주를 제작하였다. 상기 제작된 세포주를 상기 실시예 1-3에 따라 AP1S1 유전자의 발현 저해 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 렌티바이러스 시스템으로 제작한 2개의 AP1S1 유전자 발현 저해 세포주는 각각 60%, 35%의 AP1S1 유전자 발현 저해 효과가 있으며 이 중 #1 세포주가 감소량이 더 높기 때문에 #1 세포주를 이용하여 하기의 실험들을 진행하였다.

또한, AP1S1 유전자의 발현 저해가 암세포의 이동성 및 침투성에 영향을 미치는지 상기 실시예 1-5를 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, AP1S1 유전자 발현 저해 세포주가 대조군 세포주에 비해 이동성(좌측패널) 및 침투성(우측패널)이 모두 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 4. AP1S1의 발현 저해가 기질금속단백질분해효소 활성에 미치는 영향 확인

AP1S1의 발현이 기질금속단백질분해효소의 활성 및 분비에 영향을 미치는지 확인하기 위해 상기 실시예 1-7의 방법을 통하여 상기 실시예 1-2에서 제조한 서로 다른 경도의 겔에서 대조군 세포와 AP1S1 유전자의 발현 저해 세포주의 기질금속단백질분해효소의 활성도를 세포 내(세포용해액)에서와 세포 외(조정배지)에서 확인하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 세포 내에서 기질금속단백질분해효소의 활성은 세포의 경도 및 AP1S1의 발현저해 여부에 대하여 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 그러나, 도 3b에 나타난 바와 같이, 세포 외의 경우 대조군 세포는 세포의 경도가 증가함에 따라 기질금속단백질분해효소의 활성이 증가되나, AP1S1 유전자의 발현 저해 세포주에서는 세포 경도에 따라 기질금속단백질분해효소의 활성이 증가가 일어나지 않는 것을 확인하였다. 이는, 세포의 경도에 따른 기질금속단백질분해효소 활성의 증가에 AP1S1이 관여한다는 것을 의미한다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

AP1S1(Adaptor Related Protein Complex 1 Sigma 1 Subunit) 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드(antisense nucleotide), 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA), 리보자임(ribozyme), 및 유전자 가위(CRISPR/Cas-9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 AP1S1 유전자 발현 억제제; 또는
AP1S1 단백질에 상보적으로 결합하는 압타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 AP1S1 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 AP1S1 유전자 발현 억제제는 기질금속단백질분해효소의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 AP1S1 단백질 활성 억제제는 기질금속단백질분해효소의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은 비소폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
삭제
삭제
하기 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법으로,
상기 암은 비소폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법:
(1) AP1S1 유전자 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;
(2) 상기 세포주에서 AP1S1 유전자의 발현 정도 또는 AP1S1 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(3) 상기 AP1S1 유전자의 발현 정도 또는 상기 AP1S1 단백질의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계.
삭제
제7항에 있어서,
상기 단계 (2)에서, 상기 AP1S1 유전자 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction), 효소면역분석법(ELISA), 면역세포화학(Immunocytochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blot), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (2)에서, 상기 AP1S1 단백질 발현 정도는 웨스턴 블랏, 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법, 면역침강법, 유세포분석법, 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 역전사 중합효소 연쇄반응, 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.