KR100906145B1

KR100906145B1 - Ｔｍｐｒｓｓ4 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제

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Publication number: KR100906145B1
Application number: KR1020060048685A
Authority: KR
Inventors: 박영우; 김세미; 조기원; 박지현; 정희경; 이광표; 박소정; 장영순; 최소영; 정준구; 홍효정; 윤정호; 박종호
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2009-07-03
Also published as: US20110318361A1; WO2007139260A1; KR20070114970A; US8778901B2; EP2037939A4; EP2037939B1; EP2037939A1

Abstract

본 발명은 TMPRSS4(transmembrane protease, serine 4) 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것으로, 구체적으로 TMPRSS4의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 항암제는 암 세포 내에서 TMPRSS4의 발현을 효과적으로 저해하여 암세포의 이동 능력 및 성장을 억제함으로써 항암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

암전이, TMPRSS4

Description

ＴＭＰＲＳＳ4 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제{A anticancer drug comprising inhibitor of TMPRSS4}

도 1은 정상 조직과 암 조직에서의 TMPRSS4의 발현을 조사한 RT-PCR 사진이다:

N : 정상 조직; 및

T : 암 조직.

도 2는 각각의 암 세포주에서 TMPRSS4의 발현을 조사한 RT-PCR 사진이다.

도 3은 293T 세포주에서 siRNA에 의한 TMPRSS4의 발현을 조사한 웨스턴 블롯 사진이다:

레인 1: 293T 세포;

레인 2: pCMV-myc-TMPRSS4 형질전환한 293T 세포;

레인 3 : pCMV-myc-TMPRSS4, 음성 대조군 siRNA 형질전환한 293T 세포;

레인 4: pCMV-myc-TMPRSS4, siRNA-TMPRSS4-01 형질전환한 293T 세포;

레인 5 : pCMV-myc-TMPRSS4, siRNA-TMPRSS4-02 형질전환한 293T 세포; 및

레인 6 : pCMV-myc-TMPRSS4, siRNA-TMPRSS4-03 형질전환한 293T 세포.

도 4는 siRNA를 형질전환한 NCI-H322 세포주의 침윤 능력을 조사한 사진이 다.

도 5는 siRNA를 형질전환한 NCI-H322 세포주의 침윤하여 이동한 세포수를 비교한 그래프이다.

도 6은 TMPRSS4 과발현 세포주(SW480 세포주)에서의 침윤 능력을 조사한 도면이다:

A: RT-PCR을 통한 TMPRSS4 과발현 세포주의 TMPRSS4 발현 조사;

B: 웨스턴 블롯을 통한 TMPRSS4 과발현 세포주의 TMPRSS4 발현 조사; 및

C: 마트리젤 어세이를 통한 TMPRSS4 과발현 세포주의 침윤 정도 조사.

도 7은 TMPRSS4 과발현 세포주(A549 세포주)에서의 침윤 능력을 조사한 도면이다:

A: 웨스턴 블롯을 통한 TMPRSS4 과발현 세포주의 TMPRSS4 발현 조사; 및

B : 마트리젤 어세이를 통한 TMPRSS4 과발현 세포주의 침윤 정도 조사.

도 8은 siRNA를 형질전환한 NCI-H322 세포주를 세럼이 존재하는 배지에서 배양한 조건으로 세포 증식 조사를 수행한 그래프이다.

도 9는 siRNA를 형질전환한 NCI-H322 세포주를 세럼이 존재하지 않는 배지에서 배양한 조건으로 세포 증식 조사를 수행한 그래프이다.

도 10은 TMPRSS4 과발현 세포주(SW480)의 형태 조사 사진이다.

도 11은 면역세포화학을 통한 세포내 액틴 재배치를 조사한 사진이다:

A : 공벡터를 형질전환한 SW480세포주;

B : SW480-T4 세포주; 및

C: SW380-T17 세포주.

도 12는 TMPRSS4 과발현 세포주(SW480)에서의 E-cadherin 발현 조사한 RT-PCR 사진이다.

본 발명은 TMPRSS4(transmembrane protease, serine 4) 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TMPRSS4의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다.

단백질 분해 효소(Protease)는 종양 및 암 질환에 있어서 중요한 인자로서 그 중요성이 점점 증가하고 있다. 암 세포는 단백질 분해 효소의 다양한 단백질 가수분해 활성도(proteolytic activities) 및 세포신호전달조절을 통해 세포성장, 신혈관 생성(angiogenesis), 침윤, 이동, 전이, 생존, 확장(expansion), 진행(progression)이 이루어진다. 이 중 가장 대표적인 특징은 비조절 단백질 분해효소(unregulated protease)에 의해 세포간극기질 및 기저막(basement membrane)을 구성하는 세포외기질의 분해(degradation), 리모델링(remodeling)을 들 수 있고, 이를 통해 암세포는 주변조직을 국소적으로 침윤하고 또한 멀리 떨어진 곳으로 전 이하게 된다. 이러한 암 세포의 침윤 및 전이는 암 환자의 치료 예후를 결정하므로써 임상적으로 매우 중요하다. 따라서 암 세포의 전이능력을 조절하거나 이와 관련된 유전자들은 임상 예후 마커(prognostic marker)로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 암 치료 타겟으로서도 매우 중요하다. 대표적인 전이관련 단백질로 MMPs(matrix metalloproteinases), 카텝신 B(cathepsin B), 카템신 D 및 uPA(urokinase plasminogen activator)를 포함한 세린 단백질 분해효소(serine protease)를 들 수 있다(DeClerck, Y.A. and Imeren, S. Eur . J. Cancer 30A(14):2170-2180, 1994).

그 중 가장 잘 알려진 MMPs는 암 침윤 및 전이 관련하여 그 기능이 잘 정립되어 있다. MMPs는 구조적으로 관련된 아연-의존 앤도펩티다아제( zinc-dependent endopeptidase) 과(family)로서 종종 종양 미소 서식 환경(tumor microenvironment)에서 과발현되며 세포외 기질의 거의 모든 단백질의 구성성분을 분해할 수 있다. MMPs는 암 진행(cancer progression)에 있어서 기저막 및 기질(stroma)로의 침윤, 혈관 침투, 전이 등을 유도하는 핵심적인 역할을 할 뿐만 아니라, 세포 증식, 성장 인자 방출, 세포 이동 등 에도 중요한 역할을 한다(Stetler-Stevenson, W.G., Yu, A.E. Semin . Cancer Biol. 11(2):143-152, 2001). MMP는 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암, 대장암, 췌장암 등 다양한 종류의 암에서 정상조직 대비 암 조직에서 과발현되는 것이 보고되었으며, 다양한 MMP 멤버들의 높은 발현 정도는 종양 침윤(tumor aggressiveness)과 밀접한 관계가 있는 것으로 보고되었다(Nelson, A.R., et al., J. Clin . Oncol . 18(5):1135-1149, 2000). 예를 들어, MMP-1, MMP-7은 대장암에 있어서 전이와 관련된 예후 인자(prognostic factor)로서의 가능성이 제시되었다. 몇몇 MMP 저해자(inhibitor)들은 전임상 및 임상 단계에서 암전이를 감소시키는 효과를 보인 바 있다.

한편, uPA는 uPAR(urokinase plasminogen activator receptor)과 더불어 초기 종양(primary tumor)에서의 높은 발현율이 나쁜 치료예후와 관련되어 있음이 보고되었다. 또한, 암전이 동물모델에서 uPA에 의해 암전이가 유도되며 uPA 저해제는 일부 전이억제 효과가 있음이 보고 되었다(Andreasen, P.A. et al ., Int . J. Cancer 72(1):1-22, 1997). 따라서 uPA는 강력하고 독립적인 예후 마커이며 또한 침윤 및 전이억제 타겟으로서 가능성이 있다(Andreasen P.A. et al ., Int . J. Cancer 72(1):1-22, 1997). 그 외 다른 세린 단백질 분해효소의 암에서의 역할은 비교적 잘 알려져 있지 않다.

최근 수 년 사이에 세린 단백질 분해효소의 새로운 계열로서 제 2형 TMSP 족(type II transmembrane serine protease family)이 새롭게 동정되었는데, 주로 전립선암 및 난소암 등에서 과발현되고 있는 것이 보고되었다(Netzel-Arnett, S., et al ., Cancer Metastasis Rev. 22(2-3):237-258, 2003). TMPRSS4는 제 2형 TMSP 족 계열에 속하는 새로운 멤버로서, 췌장암, 대장암, 위암 등에서 발현되는 것이 보고된 바 있다(Wallrapp, C., et al ., Cancer Res . 15:60(10):2602-2606, 2000). TMPRSS4는 437 개의 아미노산으로 구성되어 있고 아미노산 서열 분석상 트립신 유사 활성도(trypsin-like activity)를 가지는 것으로 예상된다. TMPRSS4는 N-말단(terminal)의 신호-고정 서열(signal-anchor sequence)을 통해 막에 결합되어 있 고, 세린 단백질 분해 효소 도메인(serine protease domain)을 포함한 세포외 지역(extracellular region)이 글라이코실화(glycosylation) 되어 있다고 보고된 바 있다(Wallrapp, C., et al ., Cancer Res . 15:60(10):2602-2606, 2000). TMPRSS4가 췌장암 침윤 및 전이에 관여할 가능성이 예상되지만, 재조합 TMPRSS4 단백질 발현이 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo) 췌장암모델에서 종양 침윤 및 암 진행에 영향을 주지 않은 결과가 보고된 바 있다(Wallrapp, C., et al ., Cancer Res . 15:60(10):2602-2606, 2000). 그 외, TMPRSS4의 암세포의 성장, 침윤, 전이 등과 관련하여 생체 내 정확한 기능에 대해서는 아직 연구 및 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 TMPRSS4의 발현을 저해하는 억제제를 제작하여 암세포주에 형질전환시켜 암 세포의 침윤 및 성장 능력이 저해됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암세포의 침윤 능력에 중요 역할을 하는 TMPRSS4의 활성을 저해하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TMPRSS4 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

또한, 본 발명은 TMPRSS4에 특이적인 siRNA 분자를 암호화하는 DNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 형질전환된 세포주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 항생제를 암전이를 억제할 정도의 투여량으로 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 암 조직에서의 TMPRSS4 발현을 조사하기 위하여, 정상 조직과 암 조직을 대상으로 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, TMPRSS4는 정상 조직과 비교했을 때, 암 조직에서 발현이 뚜렷이 증가됨을 확인하였다(도 1 참조). 이후 대장암(HCT15, HCT116, HT29, COLO205, SW480, SW620, Caco2 및 WiDr), 폐암(NCI-H266, NCI-H460, NCI-H322, 및 A549), 유방암(MCF-7) 및 뇌암(U87MG) 세포주를 대상으로 TMPRSS4의 발현을 조사하였다. 그 결과, 인간 정상세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 세포주에 비하여 대장암, 폐암, 유방암 등의 세포주에서 높은 발현도가 관찰되었으며, 세포주에 따라 다양한 발현 정도를 관찰할 수 있었다(도 2 참조). 이 후, 본 발명자들은 TMPRSS4를 표적으로 발현을 저해할 수 있는 siRNA(SiRNA-TMPRSS4-01, siRNA-TMPRSS4-02, siRNA-TMPRSS4-03)를 합성하였다. 또한, 재조합 TMPRSS4 발현벡터와 합성한 siRNA를 293T 세포에 함께 형질전환한 후 TMPRSS4의 발현 저해 정도를 단백질 수준에서 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 siRNA는 모두 효과적으로 TMPRSS4의 발현을 저해함을 확인하였다(도 3 참조). 이 후 상기 siRNA 중 SiRNA-TMPRSS4-01과 siRNA-TMPRSS4-02를 TMPRSS4 과발현 세포주인 폐암 세포주 NCI-H322 세포에 형질전환하고 침윤 어세이를 수행하였다. 그 결과 대조군과 비교했을 때 암세포 침윤 능력을 저해시킴을 확인하였다(도 4 참조). 상기 침윤 어세이 수행시 이동 세포 수를 관찰한 결과, 대조군 대비 33 ~ 60% 정도 저해시킴을 알 수 있었다(도 5 참조). 형질전환 효율이 60%인 것을 고려해 볼 때, TMPRSS4의 발현 저해는 거의 100%에 가까운 암세포의 침윤과 전이 억제를 보임을 확인하였다. 이를 통해 TMPRSS4가 암세포의 침윤, 전이에 있어 결정적인 역할을 함을 알 수 있다.

이 후 본 발명자들은 TMPRSS4를 과발현하는 세포주를 제작하였다. 대장암 세포주인 SW480 세포주는 TMPRSS4의 발현이 낮은 세포주로서, 본 발명의 재조합 TMPRSS4 발현벡터를 형질전환하여 SW480-T4, SW480-T17 세포주를 제작하였다. 상기 세포주를 대상으로 RT-PCR과 웨스턴 방법으로 TMPRSS4가 과발현함을 확인하였다(도 6A 및 6B 참조). 이후 SW480-T4, SW480-T17 세포주를 대상으로 침윤 어세이를 수행한 결과, 공벡터를 형질전환한 대조군 SW480 세포주와 비교했을 때, 각각의 세포주가 5배, 14배 증가된 이동 능력을 보여주었다(도 6C 참조). 특히 RT-PCR과 웨스턴 블롯에서 높은 TMPRSS4 발현을 보인 SW480-T17 세포주의 경우 높은 세포 이동 능력을 보였다. 또한, 폐암 세포주인 A549 세포주를 대상으로 TMPRSS4의 과발현하는 세포주를 제작하였고, A549-T5, A549-T12 세포주를 획득하였다. 상기 세포주를 대상으로 웨스턴 블롯을 수행하여 TMPRSS4의 과발현을 확인하였다(도 7A 참조). A549-T5, A549-T12 세포주를 대상으로 침윤 어세이를 수행한 결과, 대조군 세포주 또는 공벡터를 형질전환한 세포주에 비교했을 때, 이동 능력이 월등히 증가됨을 확인하였다(도 7B 참조). 이를 통해 TMPRSS4가 암 세포의 침윤, 전이에 결정적인 역할을 함을 알 수 있었다.

TMPRSS4의 발현 저해가 암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 폐암 세포주인 NCI-H322 세포주에 siRNA 를 형질전환한 후 배지에 세럼이 존재 또는 존재하지 않은 조건에서 세포증식을 조사하였다. 그 결과, 세럼이 존재하는 배지에서 배양했을 때, 72시간 동안 세포 성장에는 큰 차이가 보이지 않았다(도 8 참조). 이와 상반되게 세럼이 존재하지 않은 배지에서 배양했을 때, 세포 증식이 대조군 세포주 또는 음성 대조군 siRNA를 형질전환한 세포주와 비교했을 때 감소됨을 확인하였다(도 9 참조). 즉, TMPRSS4 의 발현저해에 의해 암세포의 성장 및/또는 생존의 억제가 유도됨이 관찰되었다. 이를 통해 TMPRSS4가 암세포 성장의 성장인자(growth factor) 의존성을 감소시킴으로 암 세포의 비정상적인 성장을 유도함을 알 수 있었다.

이 후, 본 발명자들은 TMPRSS4의 과발현이 세포 형태에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 대조군에 비하여 TMPRSS4 과발현 세포주는 세포 퍼짐(cell spreading)이 뚜렷하게 증가하며, 세포 가장자리에 층상구조(lamellipoidia)가 형성됨이 관찰되었다(도 10 참조). 또한, 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 통하여 세포 내의 액틴 재배치(actin rearrangement) 를 조사하였다. 그 결과, 공 벡터를 형질전환한 세포주는 액틴이 세포 내에 전체적으로 퍼져있으며 뚜렷한 필라멘트(filament) 형성이 관찰되지 않았으나, TMPRSS4 과발현 세포주(SW480-T4, SW480-T17)의 경우 스트레스 파이버(stress filber)형성이 관찰되었으며, 세포-세포간의 사상족(filopodia) 유사 구조가 관찰되었다(도 11 참조). 이를 통해 TMPRSS4의 과발현이 액틴 세포골격(cytoskeleton)의 재배치를 통해 세포의 형태를 변화시키고, 이러한 과정을 통해 세포 침윤이 증가되는 것으로 보인다.

이 후, TMPRSS4 과발현이 세포 침윤과 관려된 다른 중요한 인자들의 발현을 조절하는지 조사하기 위하여 세포간 부착을 유도하는 E-cadherin의 발현 정도를 조사하였다. 그 결과 TMPRSS4 과발현 세포주(SW480-T4, SW480-T17)에서 E-cadherin의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 12). 이를 통해 TMPRSS4의 과발현이 E-cadherin의 발현을 감소시켜 세포-세포 간 부착을 감소시키고, 액틴 세포골격의 재배열과 함께 상피-간엽 변화(epithelial-mesenchymal transition)를 유도함을 알 수 있다.

본 발명은 TMPRSS4 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

상기 TMPRSS4 억제제는 TMPRSS4의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: 이하 “siRNA"라 칭함) 분자, TMPRSS4 단백질에 결합하는 기질 유사체, 및 항체, TMPRSS4의 활성을 저해하는 작은 화합물(small compound)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

안티센스 뉴클레오티드

안티센스 뉴클레오티드는 많은 인테 질병의 치료에 전망을 갖는 치료약제로서 현재 인정되고 있다. 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전 정보의 흐름을 방해한다. 표적 서열에 특이성이 있게 하는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al ., J. Natl . Cancer Inst ., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포 흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 치료제로 고려될 수 있다. 예를 들어, cmyb에 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용은 골수성 백혈병 환자로부터 유도된 골수로부터 골수성 백혈병 세포를 완전히 제거하기 위해 사용되어 왔다(Gewirtz and Calabreta, 미합중국 특허 제 5,098,890호). 안티센스 뉴클레오티드는 시토메갈로바이러스 망막염 감염 치료의 인체내 진료 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 당업자에 알려진 TMPRSS4의 mRNA 서열을 이용하여 안티센스 뉴클레오티드를 제작할 수 있으며, 특이적으로 TMPRSS4의 mRNA에 결합하여 TMPRSS4의 발현을 억제할 것을 기대할 수 있다.

siRNA 분자

본 발명은 센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 TMPRSS4 mRNA 중 약 19개 내지 25개의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자를 제공한다.

상기 siRNA 분자는 TMPRSS4의 염기서열 내에서 선택되는 19 내지 25개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하다며, 24개의 염기로 구성되는 것이 더욱 바람직하고, 서열번호 7, 9, 11로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열이 더욱 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, TMPRSS4의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.

TMPRSS4 단백질을 기능을 억제하는 물질로는 상기 단백질에 결합하는 펩티드, 항체 및 기질 유사체, TMPRSS4 단백질의 활성을 저해하는 작은 화합물(small compound) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

항체

TMPRSS4에 대한 항체는 TMPRSS4에 특이적이고 직접적으로 결합하여 TMPRSS4의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 TMPRSS4에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하며, 모노클로날 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 TMPRSS4 단백질을 외부 숙주에 주사 함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

기질 유사체

TMPRSS4의 결합 도메인을 억제하는 유사체(예: 펩티드 또는 비펩티드성 약제)를 제작하여 TMPRSS4의 활성을 억제할 수 있다. 특히 상기 펩티드 유사체 또는 TMPRSS4의 기질인 작은 펩티드 기질(short peptide substrate: 미합중국 특허 제 7,650,034호)의 단편의 비가수분해형 펩티드 유사체가 사용될 수 있다.

상기 비가수분해성 펩티드 유사체는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al ., Tetrahedron. Lett . 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al., J. Med . Chem . 29:295, 1986; Ewenson et al ., in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al ., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al ., in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun. 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al ., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988) 을 사용하여 생성할 수 있다.

또한, 본 발명은 TMPRSS4 에 특이적인 siRNA 분자를 암호화하는 DNA를 제공한다.

상기 DNA 서열은 상기 siRNA 센스 서열을 코딩하는 DNA 염기서열, 4 내지 10 염기 길이의 루프 서열, 및 상기 DNA 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 염기서열로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 재조합 발현벡터는 특별히 제한되지 않으나, 통상적인 siRNA 발현용 백터인 psiRNA(Invitogen, USA). pRNA(GenScript, USA), psLentGene(Promega, USA), pSIREN(Clontech, USA), pU6shX(VectorCoreA, Korea), 또는 pSilencer(Ambion, USA)로 구성된 군으로부터 선택된 벡터에 상기 siRNA에 대응하는 DNA 염기서열을 삽입하여 세포에 형질전환하는 것이 바람직하다. 벡터의 컨스트럭스를 형질전환될 형태, 시간 및 siRNA 발현 수준 등과 같은 특정 환경에 의해 결정된다.

벡터는 순수 플라스미드 DNA 또는 형질전환 시약 또는 표적-전달 물질과 함께 복합체로 또는 재조합 바이러스 벡터의 형태로 세포내 핵으로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 렌티 바이러스를 포함하는 레트로바이러스 등의 바이러스 등이 사용될 수 있다.

TMPRSS4의 발현 저해용 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 발현벡터는 정상 세포 또는 암 세포에 형질전환하여 세포주를 제작할 수 있다. 형질전환 방법은 당업자에게 알려진 방법을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 암세포주는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, HCT-15, HCT116, HT29, Colo205, SW480, SW620, Caco2, WiDr, NCI-H226 , NCI-H322, NCI-H460, A549, MCF-7로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 항암제는 상기 TMPRSS4 억제제를 포함하거나 상기 재조합 발현벡터를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 항암제는 총 중량에 대하여 상기 TMPRSS4 억제제를 0.0001 내지 50 중량부로 포함한다. 본 발명의 항암제는 상기 TMPRSS4 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 항암제는, 투여를 위하여 상기 기재한 유효성분 이외에 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 명균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 참가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환 약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton, PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또한 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 항암제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥 내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 본 발명의 항암제의 경우 약 0.01 내지 12.5 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 1.25 내지 2.5 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항암제를 마우스에 정맥 내 주사로 투여하려 독성 실험을 수행한 결과, 독성 실험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 항암제는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있 다.

아울러, 본 발명은 상기 항암제를 암전이 및/또는 암성장를 억제할 정도의 투여량으로 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

상기 암은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 대장암, 폐암 및 유방암인 것이 바람직하며, TMPRSS4을 과발현하는 암은 모두 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> TMPRSS4 발현 조사

<1-1> 암조직에서의 TMPRSS4 발현 조사

본 발명자들은 정상조직 대비 암조직에서 상대적으로 발현율이 증가되어 있는지 조사하기 위하여 폐암 환자의 조직으로부터 RT-PCR 방법을 이용하여 TMPRSS4 발현 정도를 측정하였다. 8개의 폐암 조직와 정상 조직은 원자력 병원(서울, 대한민국)에서 제공받았고, 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA는 TRIZOL^R(Invitrogen, USA)을 사용하여 분리하였다. RNA 1 ㎍을 70℃에서 10분간 변성한 후 올리고 dT 프라이머와 SuperScript II reverse transcriptase(Invitrogen, USA)를 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 효소(reverse transcriptase)는 90℃에서 2분간 가열하여 불활성화시켰다. 453 bp 크기의 TMPRSS4 단편을 증폭하기 위하여 서열번호 1로 기재되는 TMPRSS4 단편 정방향 프라이머(5'-TAC AAT GTC TGG AAG GCT GAG-3')와 서열번호 2로 기재되는 TMPRSS4 단편 역방향 프라이머(5'-TTC TTG CTC TAG TAG GCT TGG-3')를 사용하였다. 사용한 프라이머는 TMPRSS4에만 특이적으로 반응함으로 타입 Ⅱ 막전위 세린 단백질 분해효소(type Ⅱ transmembrane serine protease) 계열의 다른 맴버들을 증폭하지 않도록 제작하였다. PCR 조건은 하기와 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 30초간 24회 반복 수행한 후 72℃에서 5분간 연장 반응을 수행하였다.

그 결과, TMPRSS4가 정상 조직에 비하여 암 조직에서 뚜렷하게 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 1).

<1-2> 암 세포주에서의 TMPRSS4 발현 조사

본 발명자들은 각각의 암 세포주(대장암 세포주: HCT15, HCT116, HT29, COLO205, SW480, SW620, Caco2, WiDr; 폐암 세포주: NCI-H226, NCI-H322, NCI-H460, A549; 유방암: MCF-7; 뇌암: U87MG)에서 High Pure RNA Isolation kit(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 상기 세포주 배양 조건은 하기와 같다. 모든 인간 세포주는 American Type Culture Collection(USA)에서 제공받았다. WiDr, Caco-2 및 U-87MG 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum: GIBCO, USA), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), L-글루타민(L-glutamine), 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(nonessential amino acids)이 포함된 MEM(minimal essential medium: GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. HCT116, HT29, Colo205, SW480, SW620, HCT15, NCI-H322, A549, NCI-H460, NCI-H226, 및 MCF-7 세포주는 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민, 소디움 피루베이트, HEPES, 글루코오스(glucose)가 포함된 RPMI1640(GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. 293T 세포주는 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민, 소디움 피루베이트, 글루코오스가 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium: GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. HUVEC 세포주(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)는 EGM-2 BulletKit(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA)로 제작사의 방법대로 배양하였다. 세포주는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였고, 세포주가 마이코플라즈마(Mycoplasma)에 오염되지 않았음을 확인하였다. 상기 조건으로 배양한 세포주에서 분리한 전체 RNA 5 ㎍을 70℃에서 10분간 변성한 후 올리고 dT 프라이머와 SuperScript II reverse transcriptase(Invitrogen, USA)를 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 효소(reverse transcriptase)는 90℃에서 2분간 가열하여 불활성화시켰다. cDNA의 PCR 증폭을 위해 서열번호 3으로 기재되는 TMPRSS4 정방향 프라이머(5'-CCG ATG TGT TCA ACT GGA AG-3' )와 서열번호 4로 기재되는 TMPRSS4 역방향 프라이머(5'-CCC ATC CAA TGA TCC AGA GT-3')를 이용하였다. 대조군인 GAPDH의 프라이머는 서열번호 5로 기재되는 GAPDH 정방향 프라이머(5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G-3‘)와 서열번호 6으로 기재되는 GAPDH 역방향 프라이머(5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3')를 사용하였다. TMPRSS4의 PCR 조건은 하기와 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 2분간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. GAPDH의 PCR 조건은 하기와 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. PCR 생성물은 2% 아가로오스 겔 또는 8% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였고, 모든 반응은 최소한 2회 반복하였다.

그 결과, 대장암, 폐암, 유방암 등의 세포주에서 높은 발현 정도가 관찰되었다(도 2). 세포주에 따라 다양한 발현 정도가 나타났으며 대체적으로 인간 정상세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)세포주에 대비하여 높은 발현율을 보였다.

< 실시예 2> TMPRSS4 대상 작은 간섭 RNA ( small interfering RNA : 이하 “ siRNA "라 칭함)에 의한 암세포주 전이 능력 조사

<2-1> siRNA 제작

TMPRRSS4 발현을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 합성 siRNA 이중체 올리고머를 제작하였다. 3 종류의 화학적으로 변형한 합성 siRNA 이중체는 Invitrogen사(USA)에 의뢰하여 제작하였다. siRNA 이중체 서열은 하기와 같다: siRNA-TMPRSS4- 01: 5'-AAG UUG UCG AAA CAG GCA GAG AAC C-3'(서열번호 7), 5'-GGU UCU CUG CCU GUU UCG ACA ACU U-3'(서열번호 8); siRNA-TMPRSS4-02: 5'- CAG ACG UGC UGU UUG UCG UAC UGG A-3'(서열번호 9), 5'-UCC AGU ACG ACA AAC AGC ACG UCU G-3'(서열번호 10); siRNA-TMPRSS4-03: 5'-UAU GUU UCC UGA AGC AGU GGG CUG C-3'(서열번호 11), 5'-GCA GCC CAC UGC UUC AGG AAA CAU A-3'(서열번호 12)(표 1). 비특이적 siRNA 이중체 올리고머는 음성 대조군으로 사용하였다.

siRNA 서열

이름	서열	서열번호
siRNA-TMPRSS4-01	5'-AAG UUG UCG AAA CAG GCA GAG AAC C-3'	7
siRNA-TMPRSS4-01	5'-GGU UCU CUG CCU GUU UCG ACA ACU U-3'	8
siRNA-TMPRSS4-02	5'-CAG ACG UGC UGU UUG UCG UAC UGG A-3'	9
siRNA-TMPRSS4-02	5'-UCC AGU ACG ACA AAC AGC ACG UCU G-3'	10
siRNA-TMPRSS4-03	5'-UAU GUU UCC UGA AGC AGU GGG CUG C-3'	11
siRNA-TMPRSS4-03	5'-GCA GCC CAC UGC UUC AGG AAA CAU A-3'	12

<2-2> 플라스미드와 cDNA 구축

pCMV-myc 태그(tag) 발현 벡터는 Stratagene사(USA)에서 구입하였다. 전체 길이 인간 TMPRSS4 cDNA는 국립유전체정보센터(대전, 대한민국)에서 제공받았다. TMPRSS4을 주형으로 PCR을 수행하여 증폭하였다. TMPRSS4를 증폭하기 위하여 서열번호 13으로 기재되는 TMPRSS4 정방향 프라이머(5'-CCC AAG CTT ATG TTA CAG GAT CCT GAC AGT G-3')와 서열번호 14로 기재되는 TMPRSS4 역방향 프라이머(5'-CCG CTC GAG TTA CAG CTC AGC CTT CCA GAC-3')를 사용하였다. TMPRSS4의 PCR 조건은 하기와 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 2분간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. PCR 생산물을 Hind Ⅲ와 Xho Ⅰ로 절단하고, pCMV-myc 태그(tag) 발현 벡터에 삽입하여 “pCMV-myc-TMPRSS4" 벡터를 제작하였다. 추가: 제작한 벡터는 염기서열결정을 통해 wild type 임을 확인하였다. 모든 플라스미드는 대장균에 형질전환 후 Plasmid midi kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 분리하였다.

<2-3> 형질전환

293T 세포주에 실시예 2-2에서 제작한 pCMV-myc-TMPRSS4 발현벡터 3 ㎍과 실시예 2-1에서 제작한 siRNA 이중체 200 pmol를 Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen, USA) 5 ㎕를 Opti-MEM 배지 2.5 ㎖에 혼합한 후 제조사의 방법대로 형질전환 하였다(Invitrogen, USA). 293T 세포는 6 웰 플레이트에 3× 10⁵ 세포/웰 농도로 분주하였으며, 형질전환한 지 48 시간 후, 세포를 용해하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

<2-4> 웨스턴 블롯

TMPRSS4 단백질의 발현도는, myc 단백질이 태그된 TMPRSS4 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 방법으로 분석되었다. 웨스턴 블롯 방법은 하기와 같다. 형질전환된 세포를 RIPA 버퍼(10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)로 용해하였고, 용해물을 Bradford 방법(Bradford, MM., Anal . Biochem . 72:248-254, 1976)으로 정량하였다(Bio-Rad Laboratories, USA). 단백질 시료는 SDS 시료 버퍼와 50 ㎍ 용해물과 혼합하여 가열하였고, 10% SDS-PAGE 겔에 영동하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 이동시키고, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 차단하였다. 이후 myc 항체 4A6(1:1000 희석: Upstate, Lake Placid, USA) 또는 항-actin 항체(1:1000 희석: Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)와 함께 반응시켰고, 홀스레디쉬 퍼올시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이 후 ECL 키트(ECL Plus , Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하였다.

그 결과, 3종의 합성 siRNA 모두 뚜렷한 TMPRSS4의 발현 저해 효과를 나타내었다(도 3).

<2-6> 침윤 어세이 ( invasion assay )

본 발명자들은 3종의 합성 siRNA 중 siRNA-TMPRSS4-01과 siRNA-TMPRSS4-02를 선택하여, TMPRSS4를 고발현하는 폐암세포주인 NCI-H322에 형질전환 하였다. NCI-H322 세포주를 6 웰 플레이트에 50% 정도 면적을 차지할 정도로 배양하고 siRNA 이중체 180 pmol, Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen, USA) 6 ㎕ 를 Opti-MEM 배지 2.5 ㎖에 혼합한 후 제조사의 방법대로 형질전환 하였다(Invitrogen, USA). 이 때 무작위 염기서열을 가진 siRNA를 음성 대조군으로 사용하였고, 형광물질이 부착된 올리고 RNA를 사용하여 형질전환 효율을 가늠하였으며, 형질전환 효율은 약 60%였다. 상기 형질전환한 NCI-H322 세포주를 이용하여 하기와 같은 방법으로 마트리젤(matrigel) 어세이를 수행하였다. 24-웰 트렌스웰 플레이트(8 ㎛ pore size; Costar, Corning , USA)의 다공성 막은 무혈청(serum free) 배지로 희석된 250 ㎍/㎖ 농도의 100 ㎕ 마트리젤(BD Biosciences, Bedford, USA)로 코팅되었고, 실온에서 1시간 동안 방치하여 코팅시켰다. 트렌스젤 플레이트의 하층은 화학유인물(chemoattractant)로 10 g/㎖ 농도의 인간 콜라겐 타입 Ⅰ(Chemicon, Temecula, USA) 100 ㎕을 코팅하였다. 무혈청 배지에서 배양한 1× 10⁵ 개의 세포를 상층 챔버에 분주하였고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 72시간 동안 배양하면서 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동하도록 하였다. 전이되지 않은 세포는 상층 챔버의 표면에서 제거하였다. 하층 챔버로 전이한 세포는 3.7% PFA(paraformaldehyde; PBS)로 고정하였고, 2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이올렛 용액을 증류수로 세척하였고, 선택 면적(× 200)의 사진을 찍었고, 전이한 세포수는 3개의 선택 면적(× 200)을 계수하였다. 실험은 동일한 조건의 2개로 최소 2회 이상 반복한 수 대표결과를 나타내었다. 데이터 값은 전이세포 ± 표준편차의 수를 반영하였다.

그 결과, 합성 siRNA에 의하여 암세포 침윤이 뚜렷하게 저해됨이 관찰되었다(도 4). 이에 비하여 음성 대조군인 siRNA는 암세포 침윤에 큰 영향을 미치지 않았다. 마트리젤을 분해하고 이동한 암세포 수는 TMPRSS4의 발현 억제 siRNA을 형질전환한 경우, 음성 대조군에 비하여 33 ~ 60% 저해되었다(도 5). siRNA-TMPRSS4-02가 siRNA-TMPRSS4-01에 비해 더 높은 저해 효과를 보이는 것은 시간에 따른 각 siRNA 이중체 간의 안정성 및 효율성의 차이 등에 기인하는 것으로 보인다. 형질전환 효율이 60%인 것은 고려할 때, TMPRSS4 발현저해로부터 거의 완벽한 암세포의 침윤, 저해 억제가 가능할 것으로 보인다. 이를 통해 TMPRSS4가 암세포의 침윤, 전이에 있어서 결정적 역할을 함을 알 수 있다.

< 실시예 3> TMPRSS4 과발현에 의한 암세포 전이 조사(대장암 세포주: SW480 )

<3-1> TMPRSS4 과발현 세포주 제작

대장암 세포주 SW480에 실시예 2-2에서 제작한 pCMV-myc-TMPRSS4 발현벡터 4 ㎍ 과 Lipofectamine^TM(Invitrogen, USA) 10 ㎕를 Opti-MEM 배지 2.5 ㎖에 혼합한 후 제조사의 방법대로 형질전환 하였다(Invitrogen, USA). 세포는 6 웰 플레이트에 3× 10⁵ 세포/웰 농도로 분주하였으며, 형질전환한지 48시간 후에 선택 배지(600 ㎍/㎖ G418 배지)로 옮겼다. G418-저항 클론을 분리하였으며, 2주 동안 배양하면서 선별함으로써, TMPRSS4 과발현 세포주를 제작하였다.

<3-2> TMPRSS4 과발현 세포주에서 TMPRSS4 발현 정도 조사

실시예 3-1에서 제작한 TMPRSS4 과발현 SW480 세포주를 대상으로 실시예 1-2와 같은 방법으로 PT-PCR을 수행하여 RNA 레벨의 TMPRSS4 발현 정도를 조사하였다. RT-PCR 수행시 서열번호 15로 기재되는 액틴(actin) 정방향 프라이머(5'-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3') 및 서열번호 16으로 기재되는 액틴 역방향 프라이머(5'-CAA ACA TGA TCT GGG TCA TCT TCT C-3’)를 이용하였고, 액틴의 PCR 조건은 실시예 1-2의 GAPDH와 동일하게 수행하였다. 또한, 실시예 2-4와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 레벨의 TMPRSS4 발현 정도를 조사하였다.

그 결과, 제작한 SW480 세포주 중 SW480-T4와 SW480-T17 세포주는 SW480 또는 공벡터가 형질전환된 음성대조군 세포주에 비교했을 때 TMPRSS4의 발현이 약 3배 증가함을 확인하였다(도 6A). 또한, 웨스턴 결과 RT-PCR 결과와 유사하게 TMPRSS4의 발현이 증가됨이 확인되었다(도 6B 참조). 특히 SW480-T17 세포주의 TMPRSS4 단백질 발현이 상대적으로 높은 것이 관찰되었다.

<3-3> TMPRSS4 과발현 세포주의 침윤 어세이

상기 SW480-T4와 SW480-T17 세포주를 대상으로 실시예 2-6의 방법대로 침윤 어세이를 수행하였다.

그 결과, SW480-T4와 SW480-T17 세포주는 대조군 세포주보다 각각 5배 및 14배 증가된 침윤 능력을 보여주었다(도 6C).

< 실시예 4> TMPRSS4 과발현에 의한 암세포 전이 조사(폐암 세포주: A549)

<4-1> TMPRSS4 과발현 세포주 제작

실시예 2-2에서 제작한 pCMV-myc-TMPRSS4 벡터를 폐암 세포주 A549에 실시예 3-1의 방법으로 형질전환하여 TMPRSS4 과발현 세포주를 제작하였다.

<4-2> TMPRSS4 과발현 세포주에서 TMPRSS4 발현 정도 조사

실시예 4-1에서 제작한 TMPRSS4 과발현 A549 세포주를 대상으로 실시예 2-4와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 레벨의 TMPRSS4 발현 정도를 조사하였다.

그 결과, 제작한 A549 세포주 중 A549-T5와 A549-T12 세포주는 A549 또는 공벡터가 형질전환된 음성대조군 세포주에 비교했을 때 TMPRSS4의 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도 7A).

<4-3> TMPRSS4 과발현 세포주의 침윤 어세이

상기 A549-T5와 A549-T12 세포주를 대상으로 실시예 2-6의 방법대로 침윤 어세이를 수행하였다.

그 결과, A549-T5와 A549-T12 세포주는 대조군 세포주보다 각각 최소 3배 이상 증가된 침윤 능력을 보여주었다 (도 7B). 이를 통해 TMPRSS4가 암세포의 침윤, 전이에 결정적인 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5> 세포 증식 어세이( Cell proliferation assay )

TMPRSS4의 발현 저해가 암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 세럼이 존재 또는 세럼이 존재하지 않은 조건에서 세포 증식을 조사하였다. 본 실험에는 실시예 2-6에서 제작된 siRNA-TMPRSS4-01 및 siRNA-TMPRSS4-02를 형질전환한 NCI-H322 세포주를 사용하였다. 상기 세포주를 96 웰 플레이트에 5× 10³ 세포/웰 농도로 분주하였고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 증식은 colorimetric WST(테트라졸리움 염) assay kit(Takara Bio Inc., Japan)로 측정하였다. 1/10 부피의 WST 시약을 각 웰에 첨가하였고 4시간 동안 방치한 후 플레이트를 440 nm 파장으로 리더기를 사용하여 측정하였다. 상기 측정은 동일한 3개의 샘플로 동시 수행하였으며, 최소한 2회 반복하였다. 같은 실험체에 세포를 분주한 지 24시간 후에 배지를 제거한 후 세포를 PBS로 세척하였다. 이후 배지를 무혈청 배지로 바꾸어 주었다. 세포를 3일 동안 추가 배양하였고 WST 시약을 사용하여 측정하였다. 데이터 값은 흡광도 ± 표준 편차로 나타내었다.

그 결과, 세럼 포함 배지에서 배양한 세포주는 처음 72시간 동안 큰 차이를 보이지 않았다(도 8). 이에 반해, 무혈청 배지에서 배양한 세포주는 세포 성장에 차이를 보여주었다(도 9). siRNA로 형질전환된 암세포를 96-웰 플레이트에 분주하여 세포가 플레이트에 부착된 후, 배양액을 제거하고, 세포를 세척하여 무혈청 배지에서 72시간 배양한 결과, 음성 대조군 siRNA를 형질전환한 세포의 경우 약 3,4배, 3,1배의 세포 성장을 보인 반면, siRNA-TMPRSS4-01 및 siRNA-TMPRSS4-02을 형질전환한 세포주의 경우 1.9배, 2배의 세포 성장에 그쳤다(도 9). 이를 통해 TMPRSS4가 암세포 성장의 성장 인자(growth factor) 의존성을 감소시킴으로 암세포의 비정상적인 성장을 유도함을 알 수 있었다.

< 실시예 6> 세포 형태 조사

본 발명자들은 암세포에서 TMPRSS4의 과발현이 세포의 형태(morphology)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, TMPRSS4를 과발현하는 대장암 세포주인 SW480-T4 및 SW480-T17 세포주를 광학 현미경으로 조사하였다. 세포는 세포 배양용기의 50 ~ 60% 정도 면적을 차지할 정도로 성장시키고, Nikon 광학 현미경(Japan)으로 100배 확장하여 관찰하였다.

그 결과, SW480 및 공벡터를 형질전환한 세포주에 비하여 SW480-T4 및 SW480-T17 세포주는 세포 퍼짐(cell spreading)이 뚜렷하게 증가되고 세포 가장자리에 층상구조(lamellipoidia)가 형성되어 있음을 관찰하였다(도 10).

< 실시예 7> 면역세포화학( Immunocytchemistry )을 통한 세포내 액틴 ( actin ) 재배치(rearrangement) 조사

1 mm 두께의 유리 커버슬립을 세럼으로 코팅한 후 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 이후 3% BSA(bovine serum albumin)으로 37℃에서 2시간 동안 방치하여 차단하였다. 세포는 트립신 처리하여 세포 디쉬에서 회수하였고, 코팅된 커버슬립에 옮기고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 72시간 동안 배양하였다. 세포는 3.7% 포름알데히드(formaldehyde: PBS)로 고정하였고, 0.3% Triton X-100로 3분간 처리하였다. 이후 세포를 10% NHS(normal horse serum : PBS; VECTOR Laboratories, Burlingame, USA)를 처리하여 실온에서 1시간 방치하였고, 로다민-팔로이딘(rhodamine-phalloidin: Molecular Probes, Inc., Eugene, USA)을 처리하여 습윤 챔버(Humidified chamber)에서 실온으로 1시간 방치하였다. 세포를 PBS로 세척하였고, 마운팅 용액(mounting solution, VECTOR Laboratories, USA)을 올려놓은 다음, 형광 현미경((Leica, Germany)으로 400배 확장하여 시각화하였다.

액틴을 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 결과, SW480 또는 공벡터를 형질전환한 음성대조군 세포주의 경우 액틴이 세포 내 전체적으로 퍼져 있으며 뚜렷한 필라멘트(filament) 형성이 관찰되지 않았다. 그에 반하여 TMPRSS4를 과발현시킨 세포주의 경우, 스트레스 파이버(stress fiber) 형성이 관찰되었으며, 세포-세포 간의 사상족(filopodia) 유사 구조가 관찰되었다(도 11). 특히 SW480-T17 세포주의 경우, 그 효과가 더욱 현저하게 나타냈다. 이를 통해, TMPRSS4의 과발현이 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 재배치를 통해 세포의 형태를 변화시키고, 이러한 기작을 통해 세포 침윤이 증가되는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 8> E- cadherin 발현 조사

본 발명자들은 TMPRSS4 과발현이 세포 침윤과 관련된 다른 중요한 인자들의 발현을 조절하는지 조사하기 위하여, 세포 간 부착을 유도하는 E-cadherin의 발현 정도를 RT-PCR로 조사하였다. SW480-T4 및 SW480-T17 세포주를 대상으로 실시예 1-2와 같은 방법으로 RT-PCR을 수행하였으며, 서열번호 17로 기재되는 E-cadherin 정방향 프라이머(5'-GGT TAT TCC TCC CAT CAG CT-3')와 서열번호 18로 기재되는 E-cadherin 역방향 프라이머(5'-CTT GGC TGA GGA TGG TGT A-3')를 이용하였다. 실시예 1-2와 같이 대조군으로 GAPDH를 함께 증폭하였으며, PCR 조건은 각각 실시예 1-2의 GAPDH 조건과 동일하게 수행하였다.

그 결과, SW480 세포주 또는 공벡터를 형질전환한 음성대조군 세포주와 대비되게 SW480-T4 및 SW480-T17 세포주는 E-cadherin의 발현을 감소시켰다(도 12). 이를 통해, TMPRSS4의 과발현은 E-cadherin의 발현을 감소시켜 세포-세포간 부착 감소를 유도하며, 액틴 세포골격의 재배열과 함께 상피-간엽 변화(epithelial-mesenchymal transition)을 유도하는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 항암제는 TMPRSS4 억제제를 유효성분으로 포함하며, 암 세포 내에서 TMPRSS4의 발현을 효과적으로 저해하여 암세포의 이동 및 성장 능력을 억제함으로써 항암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A anticancer drug comprising inhibitor of TMPRSS4 <130> 6p-05-40 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> TMPRSS4 fragment sense primer <400> 1 tacaatgtct ggaaggctga g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> TMPRSS4 fragment antisense primer <400> 2 ttcttgctct agtaggcttg g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> TMPRSS4 sense primer <400> 3 ccgatgtgtt caactggaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> TMPRSS4 antisense primer <400> 4 cccatccaat gatccagagt 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> GAPDH sense primer <400> 5 tgatgacatc aagaaggtgg tgaag 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> GAPDH antisense priemr <400> 6 tccttggagg ccatgtgggc cat 23 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> siRNA-TMPRSS4-01 sense sequence <400> 7 aaguugucga aacaggcaga gaacc 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> siRNA-TMPRSS4-01 antisense sequence <400> 8 gguucucugc cuguuucgac aacuu 25 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> siRNA-TMPRSS4-02 sense sequence <400> 9 cagacgugcu guuugucgua cugga 25 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> siRNA-TMPRSS4-02 antisense sequence <400> 10 uccaguacga caaacagcac gucug 25 <210> 11 <211> 25 <212> RNA <213> siRNA-TMPRSS4-03 sense sequence <400> 11 uauguuuccu gaagcagugg gcugc 25 <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> siRNA-TMPRSS4-03 antisense primer <400> 12 gcagcccacu gcuucaggaa acaua 25 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> TMPRSS4 sense primer <400> 13 cccaagctta tgttacagga tcctgacagt g 31 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> TMPRSS4 antisense primer <400> 14 ccgctcgagt tacagctcag ccttccagac 30 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> actin sense primer <400> 15 gctcgtcgtc gacaacggct c 21 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> actin antisense primer <400> 16 caaacatgat ctgggtcatc ttctc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> E-cadherin sense primer <400> 17 ggttattcct cccatcagct 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> E-cadherin antisense primer <400> 18 cttggctgag gatggtgta 19

Claims

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TMPRSS4의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA) 분자 및 TMPRSS4 단백질에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 TMPRSS4 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암, 난소암 및 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 암 치료를 위한 항암제.
제 2항에 있어서, siRNA는 센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 TMPRSS4 mRNA중 19 내지 25개의 연속 뉴클레오티드의 표적서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 3항에 있어서, 센스 RNA는 서열번호 7, 9 또는 11을 염기서열로 갖는 것을 특징으로 하는 항암제.
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세포 내에서 RNA간섭 효과를 가지는 TMPRSS4에 특이적인 siRNA 분자를 암호화하는 하기의 염기서열을 포함하는 DNA:

1)제3항의 센스 RNA를 코딩하는 DNA 서열;

2) 헤어핀 루프를 코딩하는 3 내지 10개의 DNA 서열; 및

3) 1)의 DNA에 상보적으로 결합하는 안티 센스 DNA 서열.
제 6항의 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 7항에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 8 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스, 렌티 바이러스를 포함하는 레트로 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 7항의 재조합 발현벡터가 형질전환된 세포주.
제 10항에 있어서, 상기 세포주는 암세포 또는 정상세포인 것을 특징으로 하는 세포주.
제 11항에 있어서, 상기 암세포주는 HCT-15, HCT116, HT29, COLO205, SW480, SW620, Caco2, Widr, NCI-H322, NCI-H226, NCI-H460, A549, MCF-7로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 세포주.
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