KR101508634B1

KR101508634B1 - ＴＸＮＩＰ유전자의 프로모터 부위에 상보적인 ｄｓＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101508634B1
Application number: KR20130140961A
Authority: KR
Inventors: 강종순; 강무림; 박기환; 오수진; 윤지은; 이창우
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2015-04-07
Also published as: WO2015076481A1

Abstract

본 발명은 본 발명은 TXNIP 유전자의 전사활성 유도 및 암 세포 성장을 억제하는 dsRNA(double strand RNA)에 관한 것으로, TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA는 암세포주에서 종양억제 유전자인 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키고, 암세포 성장을 유의적으로 억제함으로, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA를 암 예방 및 치료용 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＴＸＮＩＰ유전자의 프로모터 부위에 상보적인 ｄｓＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for the prevention or treatment of cancer comprising complementary dsRNA to the promoter region of TXNIP gene}

본 발명은 TXNIP(thioredoxin-interaction proein, TXNIP) 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA(double strand RNA)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 인류의 지난 수십 년간의 부단한 노력에도 불구하고 난치병 중의 하나로 여전히 남아 있다. 암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한 적이고, 비 조절적 방식으로 증식 및 불사화되어 발생하는 질병이다. 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되어 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다.

이에 따라 암과 관련된 다양한 생체 내 분자의 동정 및 상기 분자를 표적으로 하는 약물의 개발에 대한 요구가 계속되고 있으며, 상기 약물 중 일부를 조합하여 암의 치료 효과를 증진하기 위한 노력 또한 계속되고 있다. 최근에 암세포생물학, 의약 화학 등의 제반 학문의 눈부신 발전과 더불어 탁솔, 라파마이신 및 17-알릴아미노젤다나마이신(17-allylaminogeldanamycin; 17-AAG)과 같은 다수의 항암제들이 개발되었으며, 글리벡(Gleevec)과 같은 새로운 작용 기전을 가진 항암제가 개발되고 있다.

폐암은 폐에 발생하는 암으로, 흡연, 공해 등이 가장 큰 원인인 선진국형 암으로, 20세기에 들어서면서 구미 각국에서 급격히 증가하기 시작하여 전 세계적으로 매년 130만 명 이상이 폐암으로 사망하며, 암으로 인한 사망에서 가장 높은 비중을 차지하고 있다. 한국의 경우에도, 매년 10여 만 명의 암 환자가 새로 발생하고 5 만여 명의 암 환자가 사망하고 있는 것으로 보고되었다. 더욱이 암의 발생 빈도는 최근 들어 더욱 증가하는 추세로 현재 암은 우리나라 성인 사망 원인의 2위를 차지하고 있다. 특히, 폐암은 한국 성인에서 발생하는 암중에서 약 12%를 차지하며 위암, 간암에 이어 제3위의 발생률을 보이며 매년 남녀 모두에서 발생율이 증가하고 있다. 폐암의 발생율은 여성보다 남성에서 현저히 높으며 상대적으로 45세 미만의 젊은 환자의 비율이 높은 것으로 보고 되었다. 더구나 폐암은 진단 당시 이미 다른 장기로 전이를 하였거나 전이가 없는 경우에도 국소적으로 진행되어 근치적절제술, 항암 화학 요법, 방사선 치료 등의 다양한 치료법에도 불구하고 치료 후 재발과 전이에 의해 5년 생존율이 5% 정도에 머무르는 완치율이 매우 낮은 종양으로 암에 의한 사망율 1위를 차지하고 있다.

TXNIP는 티오레독신(thioredoxin)과 상호작용하는 것으로, 항산화 활성 억제 및 산화 스트레스(oxidative stress), 세포 증식(cell proliferation) 및 세포 사멸(apoptosis)(Kim et al., 2007)을 포함하는 세포 과정에 관련되어 있는 단백질로 보고되고 있다(Nishiyama A et al., 1999; Junn E et al., 2000). 또한, 종양 억제 기능에 영향을 주는 단백질로써, TXNIP 단백질 발현이 여러 종류의 종양에서 유의적으로 감소되는 것으로 보고되고 있다. 아울러, 흑색종 세포에서 TXNIP가 과발현 될 때, 전이 억제가 되는 것으로 보고되고 있으나, TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 synthetic double strand RNA(dsRNA)를 이용한 항암요법에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 종양억제 유전자인 TXNIP 유전자의 전사활성 유도를 통한 암 치료 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA(double strand RNA)를 제작한 다음, 상기 dsRNA를 폐암세포에 처리한 결과, TXNIP 유전자의 전사활성 및 단백질 합성이 유의적으로 증가하고 암세포 성장을 현저히 억제시키는 것을 확인함으로써 TXNIP 유전자의 프로모터에 상보적인 dsRNA를 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 서열번호 1로 기재된 센스서열 및 서열번호 2로 기재되는 안티센스 서열로 구성된 TXNIP(thioredoxin-interaction proein, TXNIP) 유전자의 프로모터에 상보적인 dsRNA(double strand RNA)를 제공한다.

또한, 본 발명은 dsRNA를 유효성분으로 포함한 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다

또한, 본 발명은 dsRNA의 센스 또는 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 dsRNA를 숙주세포에 도입한 형질전환 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 dsRNA를 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명은 TXNIP(thioredoxin-interaction proein, TXNIP) 유전자의 전사활성 유도 및 암 세포 성장을 억제하는 dsRNA(double strand RNA)에 관한 것으로, TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA는 암세포주에서 종양억제 유전자인 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키고, 암세포 성장을 유의적으로 억제함으로, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA를 암 예방 및 치료용 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 hsaTXNIP-834를 제작하여 모식화한 도이다.
도 2는 hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 세포주 A549에 대한 TXNIP 유전자 발현 여부를 나타낸 도이다.
도 3은 hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 세포주 A549에 대한 TXNIP 유전자 발현을 나타낸 도이다.
도 4는 hsaTXNIP-834 형질감염에 의한 TXNIP 유전자의 CpG 섬(CpG island) 탈메틸화를 나타낸 도이다.
도 5는 hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 세포주 A549에 대한 세포 성장 억제를 나타낸 도이다.
도 6은 hsaTXNIP-834에 의해 형질감염된 세포주기 억제 확인을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 TXNIP 유전자의 프로모터는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 dsRNA는 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 TXNIP 유전자 프로모토 상의(-834) 부터 (-816)까지의 뉴클레오타이드(nucleotide)를 타겟으로 하여 TXNIP 유전자의 전사 활성을 증가시키는 synthetic double strand RNA(dsRNA)를 포함하고 있는 hsaTXNIP-834을 제작하였다(도 1 참조).

또한, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포주에서 TXNIP(thioredoxin-interaction proein, TXNIP) 유전자 발현 증가를 확인하기 위하여, 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)을 수행한 결과, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포에서 TXNIP 유전자의 발현 농도가 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 본발명의 dsRNA와 서열을 일부 다르게 제작한 hsaTXNIP-834-MM(mismatched)로 형질감염시킨 세포에서는 TXNIP 유전자의 발현이 증가하지 않음을 확인하였다(도 2 참조).

또한, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포주에서 시간 변화에 따른 TXNIP 유전자 발현 증가를 확인하기 위하여, 웨스턴 면역블랏(Western immunoblotting), 증강 화학발광 단백질법(enhanced chemiluminescent protein, ECL) 및 디텍션 시스템(detection system, Millipore)을 사용하여 수행한 결과, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포주와 대조군(double strand control RNA) 세포에서 TXNIP 유전자의 발현 농도를 비교하였을 때, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포에서 TXNIP 유전자의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3 참조).

또한, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포주에서 TXNIP 유전자에 존재하는 CpG 아일랜드(CpG island)의 메틸화 여부를 확인하기 위하여, 메틸화 특이 PCR(Methylation specific PCR, MSP)을 사용하여 수행한 결과, 형질감염 물질(transfection regent)만을 처리한 인간 폐암 A549 세포에서 CpG 아일랜드(CpG island) 부위가 메틸화된 것을 확인하였고, hsaTXNIP-834로 형질감염된 A549 세포에서 CpG 아일랜드(CpG island) 부위가 탈 메틸화 된 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포주에서 세포 성장 억제를 확인하기 위하여 XTT 분석 방법을 수행한 결과, hsaTXNIP-834를 사용하여 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포에서 세포 성장이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포주에서 세포주기 억제(cell cycle arrest)를 확인하기 위하여 FACScalibur를 수행한 결과, 10 nM hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포에서 G0/G1 및 G2/M phase 세포 주기가 억제되는 것을 확인하였다(도 6 참조).

따라서, 본 발명은 상보적인 dsRNA는 암세포주에서 종양억제 유전자인 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키고, 암세포 성장을 유의적으로 억제함으로, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA를 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 치료용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), MackPublishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 조성물은 추가적으로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 dsRNA를 유효성분으로 포함한 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 dsRNA를 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

상기 암은 폐암, 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 결핵암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA는 암세포주에서 종양억제 유전자인 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키고, 암세포 성장을 유의적으로 억제함으로, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA를 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, dsRNA의 센스 또는 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 폐암, 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 결핵암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명의 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키고, 암세포 성장을 유의적으로 억제함으로, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA의 센스 또는 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 숙주세포는 A549 세포, HEK-293E 세포, CHO(Chinese hamster ovary) 세포, BHK(baby hamsterkidney) 세포, NIH-3T3 세포, HEK-293T 세포 또는 COS-7 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 암은 폐암, 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 결핵암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 및 치료용 약학적 조성물.

따라서, 본 발명의 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA는 암세포주에서 종양억제 유전자인 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키고, 암세포 성장을 유의적으로 억제함으로, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA를 숙주세포에 도입한 형질전환 세포를 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양

인간 폐암 세포주 A549(CCL-185, ATCC)를 10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 100 U/ml 페니실린(penicilin) 및 100 μg/ml 스트렙토 마이신(streptomycin)이 포함된 RPMI-1640 (Gibco)를 사용하여 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였으며 2 내지 3일마다 새로운 배양액으로 계대배양하였다.

< 실시예 2> TXNIP 유전자의 프로모터 부위에 상보적인 dsRNA 의 제작

서열번호 15로 기재된 센스 서열 및 서열번호 16으로 기재된 안티센스 hsaTXNIP-834 벡터와 서열번호 17로 기재된 센스 서열 및 서열번호 18로 기재된 안티센스 hsaTXNIP-834-MM 벡터는 바이오니어 회사(BIONEER CORPORATION , 대전, 대한민국)에 의뢰하여 제작하였다.

서열번호	서열
hsaTXNIP-834 sense(서열번호15)	5'-CCCAACUUUGCAGGUAGAAdtdt-3'
hsaTXNIP-834 anti-sense(서열번호16)	5'-UUCUACCUGCAAAGUUGGGdtdt-3'
hsaTXNIP-834-MM sense(서열번호17)	5'-CCCAACUUUGCAGGACGUGdtdt-3'
hsaTXNIP-834-MM anti-sense(서열번호18)	5'-GACGUCCUGCAAAGUUGGGdtdt-3'

< 실시예 3> hsaTXNIP -834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포에서 TXNIP(thioredoxin-interaction proein , TXNIP ) 유전자 발현 증가 확인

<3-1> hsaTXNIP -834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포주 제작

hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포를 제작하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.

상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 세포를 배양한 후, 1.5 nM, 5 nM, 15 nM, 50 nM 더블 스탠드 대조군(double stand control), 50 nM hsaTXNIP-834, 50 nM hsaTXNIP-834-MM(mismatched) 및 3 μl lipofectamine RNAiMAX를 각각 250 μl의 Opti-MEM(invitrogen) 배지에 첨가하여 실온에서 5분간 방치하였다. 그런 다음, dsRNA가 포함된 배지와 리포펙타민(lipofectamine RNAiMAX)이 포함된 배지를 혼합하여 실온에서 20분간 방치하고 상기 세포를 6-웰 플레이트에 5ⅹ10⁴세포/웰 농도와 96-웰 플레이트에3.2ⅹ10⁴세포/웰의 농도로 각각 배양하였다.

<3-2> 암세포주에서 TXNIP 유전자 발현 여부 확인

상기 실시예 <3-1>에서 제조된 암세포 주에서 TXNIP(thioredoxin-interaction proein: TXNIP) 유전자 발현 증가를 확인하기 위하여, 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 배양한 세포에 트립신(Trypsin)을 처리하여 분리한 후, 상기 수득된 세포에 차가운 PBS를 사용하여 2회 세척하고 RNeasy Plus mini kit(74134, QIAGEN)를 사용하여 당업계에 알려진 방법으로 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 RNA와 PrimeScript^TMRT reagent Kit (RR037, TaKaRa)를 이용하여 제조사의 방법에 따라, cDNA를 합성한 후, Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)과 7500 Fast Real time-PCR system PCR machine(Applied Biosystems)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하였다. qPCR 조건은 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 및 72℃에서 30초로 45 사이클을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 수행하였다. 결과는 △△Ct법을 이용하여 mock(M)에 대한 상대 값으로 표현하였으며 인터널 대조군(internal control)은 β-actin을 사용하였다. 이때 PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 2에 기재된 서열번호 3 내지 6을 사용하여 PCR을 수행하였다(표 2).

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 A549 인간 폐암 세포에서 TXNIP 유전자의 발현 농도가 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, hsaTXNIP-834-MM(mismatched)로 형질감염시킨 세포에서는 TXNIP 유전자의 발현이 증가되지 않음을 확인하였다(도 2).

서열번호	서열
Human TXNIP sense(서열번호 3)	5’-TTC GGG TTC AGA AGA TCA GG-3’
Human TXNIP anti-sense(서열번호 4)	5’-TTG GAT CCA GGA ACG CTA AC-3’
human β-actin sense(서열번호 5)	5’-TCA AGA TCA TGC TCC TCC TGA GC-3’
human β-actin anti-sense(서열번호 6)	5’-TTG CTG ATC CAC ATC TGC TGG AAG-3’

<3-3> 암세포주에서 시간 변화에 따른 TXNIP 유전자 발현 여부 확인

상기 실시예 <3-1>에서 제조된 암세포 주에서 시간 변화에 따른 TXNIP 유전자 발현 증가를 확인하기 위하여, 웨스턴 면역블랏(Western immunoblotting), 증강 화학발광 단백질법(enhanced chemiluminescent protein, ECL) 및 디텍션 시스템(detection system, Millipore)을 사용하여 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서 제조된 암세포 주에 방사선면역 침전 분석 완충용액(radioimmuno precipitation assay buffer,RIPA buffer; 셀 시그날링 테크놀로지 사, 미국)을 이용해 각각의 세포를 파쇄하여 세포 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 세포 추출물에서 30 μg의 전체 단백질을 단백질 5 x 샘플 완충액(sample buffer, ELPIS BIOTECH)에 첨가하여 혼합한 뒤, 100℃에서 5분 동안 가열하고 10% SDS-PAGE 겔로 전기영동을 수행한 뒤, 단백질을 크기별로 분리한 후, PVDF 멤브레인에 이동시켰다. 이동된 멤브레인은 20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20이 포함된 TBST에 5% 무지방 탈지 우유(nonfat dried milk )을 포함한 블록킹 버퍼를 사용하여 상온에서 1 시간 동안 블록킹을 한 후, TBST로 20분 간격으로 3회 세척하였다. 그런 다음, 제조사에서 제공된 프로토콜에 따라 1차 항체(Anti-TXNIP/VDUP1 monoclonal antibody, MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO.,LTD, Cat No. K0205-3)는 5% BSA가 포함되어 있는 TBST에 희석하여 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 반응 시켰으며, TBST로 20분 간격으로 3회 세척하였다. 또한, 2차 항체(Anti-rabbit IgF, HRP-linked Antibody, Cell Signaling Technology, Inc., Cat No. 7074S)는 5% 무지방 탈지 우유(nonfat dried milk)가 포함되어 있는 TBST에 희석하여 1시간 동안 반응 시킨 후, 증강 화학발광 단백질법(enhanced chemiluminescent protein, ECL) 및 디텍션 시스템(detection system, Millipore)을 사용하여 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 인간 폐암 A549 세포에 hsaTXNIP-834를 사용하여 형질감염 시킨 후, TXNIP 유전자 발현을 측정한 결과, hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포에서 TXNIP 유전자의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3).

< 실시예 4> hsaTXNIP -834 형질감염에 의한 TXNIP 유전자의 CpG 섬( CpG island ) 탈메틸화 효과 확인

상기 실시예 <3-1>에서 제조된 암세포 주에서 TXNIP 유전자에 존재하는 CpG 아일랜드(CpG island)의 메틸화 여부를 확인하기 위하여, 메틸화 특이 PCR(Methylation specific PCR, MSP)을 사용하여 수행하였다.

구체적으로, Qiaamp DNA mini kit(QIAGEN)을 이용하여 제조사의 제공된 방법에 따라 gDNA를 준비하였다. 상기 준비된 500 ng gDNA는 EZ DNA methylation kit(zymo Research)를 이용하여 CT 변환(conversion)을 하였고, PCR을 수행하여 2% 아가로즈 겔(agarose gel)로 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 상기 PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 3에 기재된 서열번호 7 내지 14를 사용하여 PCR을 수행하였다(표 3).

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 형질감염 물질(Transfection regent)만을 처리한 인간 폐암 A549 세포에서 CpG 아일랜드(CpG island) 부위가 메틸화된 것을 확인하였고, hsaTXNIP-834로 형질감염된 A549 세포에서 CpG 아일랜드(CpG island) 부위가 탈 메틸화 된 것을 확인하였다(도 4).

서열번호	서열
Primer set 1: methylation specific primer #1 sense(서열번호 7)	5’-TTTTTTGCGTCGTTTTAGAGC-3’
methylation specific primer #1 anti-sense(서열번호 8)	5’-GATCCTTATTTACCAAAAACCCG-3’
unmethylation specific primer #1 sense(서열번호 9)	5’-TTTTTTTGTGTTGTTTTAGAGTGT-3’
unmethylation specific primer #1 anti-sense(서열번호 10)	5’- AATCCTTATTTACCAAAAACCCAAC-3’
Primer set 2: methylation specific primer #2 sense(서열번호 11)	5’-TTGGTTCGGGTTATTATATAGAGAC-3’
methylation specific primer #2 anti-sense(서열번호 12)	5’-AACTACTAAATTTTCGAAAAAACGC-3’
unmethylation specific primer #2 sense(서열번호 13)	5’-TGGTTTGGGTTATTATATAGAGATGT-3’
unmethylation specific primer #2 anti-sense(서열번호 14)	5’- ACTACTAAATTTTCAAAAAAACACC-3

< 실시예 5> hsaTXNIP -834에 의해 형질감염된 암세포 성장 억제 확인

상기 실시예 <3-1>에서 제조된 암세포 주에서 세포 성장 억제를 확인하기 위하여 XTT 분석 방법을 수행하였다.

구체적으로, 인간 폐암 A549 세포를 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에 2 ⅹ 10⁴ 세포/ml 농도로 160 μl/웰씩 분주하고, 형질감염 물질(transfection reagent)인 10 nM 더블 스트랜드 대조군(double strand control RNA), 10 nM hTXNIP-834-MM(mismatched) 및 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM hsaTXNIP-834으로 형질감염시켰으며 최종 양(volume)은 200 μl로 맞추었다. 형질감염 2 틀 후, 200 μl RPMI-1640으로 배지를 교체하였고, 형질감염 96시간 후에 세포 증식 키트 II(Roche Applied Science)를 이용하여 XTT 방법을 수행하였다. 1 mg/ml sodium 3’-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-ntro) benzene sulfonic acid hydrate와 0.0383 mg/ml N-methyldibenzopyrazime methyl sulfate를 50:1로 희석하여 XTT labeling 혼합물을 제조하였고, 배양액을 50 μl씩 제거한 후 XTT labeling 혼합물을 각 웰당 50 μl씩 첨가하여 1시간 30분 동안 상온에서 처리하였고 495 nm(refrefe wavelength, 650 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, hsaTXNIP-834를 사용하여 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포에서 세포 성장이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5).

< 실시예 6> hsaTXNIP -834에 의해 형질감염된 세포주기 억제( cell cycle arrest ) 확인

상기 실시예 <3-1>에서 제조된 암세포 주에서 세포주기 억제(cell cycle arrest)를 확인하기 위하여 FACScalibur를 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 배양한 세포에 트립신(Trypsin)을 처리하여 분리된 세포를 수득한 뒤, 차가운 PBS를 사용하여 상기 세포를 2회 세척하였고, 2 X 10⁵ 농도 세포를 70% 에탄올(EtOH)을 이용하여 -20℃에서 1시간 이상 고정한 후, 0.1% 구연산 나트륨(sodium citrate), 0.02 mg/ml RNase A, 0.3% triton X-100 및 50 μg/ml 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)가 포함된 100 μl 크리산 버퍼(Krishan buffer)를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 400 μl PBS를 첨가하여 볼텍스(vortex)를 하였고, 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 FACScalibur(BD bioscience)를 사용하여 세포 주기(cell cycle)를 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 10 nM hsaTXNIP-834로 형질감염시킨 인간 폐암 A549 세포에서 G0/G1 및 G2/M phase 세포 주기가 억제되는 것을 확인하였다(도 6).

< 실시예 7> 통계 분석

통계적 유의성을 평가하기 위하여 모든 결과는 평균(mean) ± 표준편차(SD)고 나타내었으며, Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 One-Way ANOVA를 수행한 후 듀네트 테스트(Dunnett's t-test)를 수행하여 P-값을 획득하였다. 상기 획득한 P-값은 0.05 이하 수준으로 유의성을 결정하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pharmaceutical Composition for the prevention or treatment of cancer comprising complementary dsRNA to the promoter region of TXNIP gene <130> 13p-10-25 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> sense 1 <400> 1 cccaacuuug cagguagaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> antisnese 2 <400> 2 uucuaccugc aaaguuggg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Human TXNIP sense <400> 3 ttcgggttca gaagatcagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Human TXNIP anti sense <400> 4 ttggatccag gaacgctaac 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> human beta actin sense <400> 5 tcaagatcat gctcctcctg agc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> human beta actin anti sense <400> 6 ttgctgatcc acatctgctg gaag 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> methylation specific primer sense <400> 7 ttttttgcgt cgttttagag c 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> methylation specific primer anti sense <400> 8 gatccttatt taccaaaaac ccg 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> unmethylation specific primer sense <400> 9 tttttttgtg ttgttttaga gtgt 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> unmethylation specific primer anti sense <400> 10 aatccttatt taccaaaaac ccaac 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> methylation specific primer sense <400> 11 ttggttcggg ttattatata gagac 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> methylation specific primer anti sense <400> 12 aactactaaa ttttcgaaaa aacgc 25 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> unmethylation specific primer sense <400> 13 tggtttgggt tattatatag agatgt 26 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> unmethylation specific primer anti sense <400> 14 actactaaat tttcaaaaaa acacc 25 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> hsaTXNIP 834 sense <400> 15 cccaacuuug cagguagaad tdt 23 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> hsaTXNIP 834 anti sense <400> 16 uucuaccugc aaaguugggd tdt 23 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> hsaTXNIP 834 MM sense <400> 17 cccaacuuug caggacgugd tdt 23 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> hsaTXNIP 834 MM anti sense <400> 18 gacguccugc aaaguugggd tdt 23

Claims

서열번호 1로 기재된 센스(sense)서열 및 서열번호 2로 기재되는 안티센스(anti-sense) 서열로 구성된 TXNIP(thioredoxin-interaction proein, TXNIP) 유전자의 프로모터에 상보적인 dsRNA(double strand RNA).
제 1항에 있어서, 상기 TXNIP 유전자의 프로모터는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
제 1항에 있어서, 상기 dsRNA는 TXNIP 유전자의 전사활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
제 1항의 dsRNA를 유효성분으로 포함한 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항의 dsRNA의 센스 또는 안티센스 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항의 dsRNA를 숙주세포에 도입한 형질전환 세포를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 숙주세포는 A549 세포, HEK-293E세포, CHO(chinese hamster ovary) 세포, BHK(baby hamsterkidney) 세포, NIH-3T3 세포, HEK-293T 세포 또는 COS-7 세포인 것을 특징으로 하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
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