CN103071152B

CN103071152B - 动脉粥样硬化疫苗

Info

Publication number: CN103071152B
Application number: CN201210432805.4A
Authority: CN
Inventors: 胡凝珠; 曹济民; 胡云章; 徐启华; 郝维; 王海漩
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2012-11-03
Filing date: 2012-11-03
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2032-11-03
Also published as: CN103071152A

Abstract

本发明提供一种动脉粥样硬化疫苗，包括T7噬菌体以及人类胆固醇酯转运蛋白CETP，其特征在于将人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端，使人类胆固醇酯转运蛋白CETP展示于T7噬菌体的表面，从而构建出动脉粥样硬化疫苗。该疫苗接种后，能够有效降低血浆中的胆固醇水平，达到预防动脉粥样硬化的目的，并且具有安全无毒，遗传稳定性好等特点。

Description

动脉粥样硬化疫苗

技术领域

本发明涉及一种疫苗，尤其是一种动脉粥样硬化疫苗，属于医学生物技术领域。

背景技术

心血管疾病位列当前威胁人类健康的三大疾病，即心血管疾病、肿瘤和传染性疾病之首，而动脉粥样硬化又是心血管疾病的最重要的病理学基础之一，是引起心肌梗塞、脑梗塞以及冠心病等心脑血管疾病死亡的主要原因，与许多疾病的发生发展都有关系。防治动脉粥样硬化是防治心血管疾病的根本性措施。研制抗动脉硬化疫苗，将有助于抑制动脉硬化的发生与发展，有助于降低心肌梗塞、脑梗塞的发病率，减少冠心病的死亡率，减少这些疾病对人类的危害。

胆固醇酯转运蛋白CETP（即cholesteryl ester transfer protein），为疏水性糖蛋白，能调节高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)向低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的转运，能介导高密度脂蛋白(HDL)、胆固醇酯(CE)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、甘油三酯(TG)之间的交换，还能控制HDL及LDL的质和量的变化。而HDL作为胆固醇的接受体，通过与HDL受体的相互作用，能介导胆固醇从外周组织和AS斑块中流出，并转运至肝进行代谢，从而降低血浆中的胆固醇水平，抑制AS的发生、发展，与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。因此，抑制CETP的活性，可减少HDL-C向LDL-C的转化，升高血液中的HDL水平，促进胆固醇逆向转运，降低血液中的胆固醇水平，从而减轻动脉粥样硬化病变。

利用噬菌体展示技术来研制基因工程疫苗，是近年来的研究热点，具有下列多种优势：（1）噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原、抗体免疫反应；（2）噬菌体有较强的免疫原性，是天然的免疫佐剂，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；（3）噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；（4）由于噬菌体颗粒是由感染的细菌细胞分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；（5）纯化简单、花费少；（6）噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。由于应用噬菌体展示技术研究基因工程疫苗具有以上的优点，弥补了传统疫苗和其它基因工程疫苗产量不高、纯化复杂等缺陷，对新型疫苗的开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全、有效、稳定的，能够预防动脉粥样硬化的疫苗。

本发明通过下列技术方案完成：一种动脉粥样硬化疫苗，包括T7噬菌体以及人类胆固醇酯转运蛋白CETP，其特征在于将人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端，使人类胆固醇酯转运蛋白CETP展示于T7噬菌体的表面，从而构建出动脉粥样硬化疫苗。

所述插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列为：

atgCTGGCGGCGACCGTGCTGACCCTGGCGCTGCTGGGCAACGCGCATGCGTGCAGCAAAGGCACCAGCCATGAAGCGGGCATTGTGTGCCGTATTACCAAACCGGCGCTGCTGGTGCTGAACCATGAAACCGCGAAAGTGATTCAGACCGCGTTTCAGCGTGCGAGCTATCCGGATATTACCGGCGAAAAAGCGatgatgCTGCTGGGCCAGGTGAAATATGGCCTGCATAACATTCAGATTAGCCATCTGAGCATTGCGAGCAGCCAGGTGGAACTGGTGGAAGCGAAAAGCATTGATGTGAGCATTCAGAACGTGAGCGTGGTGTTTAAAGGCACCCTGAAATATGGCTATACCACCGCGTGGTGGCTGGGCATTGATCAGAGCATTGATTTTGAAATTGATAGCGCGATTGATCTGCAGATTAACACCCAGCTGACCTGCGATAGCGGCCGTGTGCGTACCGATGCGCCGGATTGCTATCTGAGCTTTCATAAACTGCTGCTGCATCTGCAGGGCGAACGTGAACCGGGCTGGATTAAACAGCTGTTTACCAACTTTATTAGCTTTACCCTGAAACTGGTGCTGAAAGGCCAGATTTGCAAAGAAATTAACGTGATTAGCAACATTatgGCGGATTTTGTGCAGACCCGTGCGGCGAGCATTCTGAGCGATGGCGATATTGGCGTGGATATTAGCCTGACCGGCGATCCGGTGATTACCGCGAGCTATCTGGAAAGCCATCATAAAGGCCATTTTATTTATAAAAACGTGAGCGAAGATCTGCCGCTGCCGACCTTTAGCCCGACCCTGCTGGGCGATAGCCGTatgCTGTATTTTTGGTTTAGCGAACGTGTGTTTCATAGCCTGGCGAAAGTGGCGTTTCAGGATGGCCGTCTGatgCTGAGCCTGatgGGCGATGAATTTAAAGCGGTGCTGGAAACCTGGGGCTTTAACACCAACCAGGAAATTTTTCAGGAAGTGGTGGGCGGCTTTCCGAGCCAGGCGCAGGTGACCGTGCATTGCCTGAAAatgCCGAAAATTAGCTGCCAGAACAAAGGCGTGGTGGTGAACAGCAGCGTGatgGTGAAATTTCTGTTTCCGCGTCCGGATCAGCAGCATAGCGTGGCGTATACCTTTGAAGAAGATATTGTGACCACCGTGCAGGCGAGCTATAGCAAAAAAAAACTGTTTCTGAGCCTGCTGGATTTTCAGATTACCCCGAAAACCGTGAGCAACCTGACCGAAAGCAGCAGCGAAAGCATTCAGAGCTTTCTGCAGAGCatgATTACCGCGGTGGGCATTCCGGAAGTGatgAGCCGTCTGGAAGTGGTGTTTACCGCGCTGatgAACAGCAAAGGCGTGAGCCTGTTTGATATTATTAACCCGGAAATTATTACCCGTGATGGCTTTCTGCTGCTGCAGatgGATTTTGGCTTTCCGGAACATCTGCTGGTGGATTTTCTGCAGAGCCTGAGC

所述人类胆固醇酯转运蛋白CETP的氨基酸序列为：MetLeuAlaAlaThrValLeuThrLeuAlaLeuLeuGlyAsnAlaHisAlaCysSerLysGlyThrSerHisGluAlaGlyIleValCysArgIleThrLysProAlaLeuLeuValLeuAsnHisGluThrAlaLysValIleGlnThrAlaPheGlnArgAlaSerTyrProAspIleThrGlyGluLysAlaMetMetLeuLeuGlyGlnValLysTyrGlyLeuHisAsnIleGlnIleSerHisLeuSerIleAlaSerSerGlnValGluLeuValGluAlaLysSerIleAspValSerIleGlnAsnValSerValValPheLysGlyThrLeuLysTyrGlyTyrThrThrAlaTrpTrpLeuGlyIleAspGlnSerIleAspPheGluIleAspSerAlaIleAspLeuGlnIleAsnThrGlnLeuThrCysAspSerGlyArgValArgThrAspAlaProAspCysTyrLeuSerPheHisLysLeuLeuLeuHisLeuGlnGlyGluArgGluProGlyTrpIleLysGlnLeuPheThrAsnPheIleSerPheThrLeuLysLeuValLeuLysGlyGlnIleCysLysGluIleAsnValIleSerAsnIleMetAlaAspPheValGlnThrArgAlaAlaSerIleLeuSerAspGlyAspIleGlyValAspIleSerLeuThrGlyAspProValIleThrAlaSerTyrLeuGluSerHisHisLysGlyHisPheIleTyrLysAsnValSerGluAspLeuProLeuProThrPheSerProThrLeuLeuGlyAspSerArgMetLeuTyrPheTrpPheSerGluArgValPheHisSerLeuAlaLysValAlaPheGlnAspGlyArgLeuMetLeuSerLeuMetGlyAspGluPheLysAlaValLeuGluThrTrpGlyPheAsnThrAsnGlnGluIlePheGlnGluValValGlyGlyPheProSerGlnAlaGlnValThrValHisCysLeuLysMetProLysIleSerCysGlnAsnLysGlyValValValAsnSerSerValMetValLysPheLeuPheProArgProAspGlnGlnHisSerValAlaTyrThrPheGluGluAspIleValThrThrValGlnAlaSerTyrSerLysLysLysLeuPheLeuSerLeuLeuAspPheGlnIleThrProLysThrValSerAsnLeuThrGluSerSerSerGluSerIleGlnSerPheLeuGlnSerMetIleThrAlaValGlyIleProGluValMetSerArgLeuGluValValPheThrAlaLeuMetAsnSerLysGlyValSerLeuPheAspIleIleAsnProGluIleIleThrArgAspGlyPheLeuLeuLeuGlnMetAspPheGlyPheProGluHisLeuLeuValAspPheLeuGlnSerLeuSer。

所用基因工程载体为T7噬菌体。

本发明具有以下优点和效果：采用上述方案获得的动脉粥样硬化疫苗安全、无毒，遗传稳定性好，能够有效诱导机体产生抗胆固醇酯转运蛋白CETP的抗体，减少HDL-C向LDL-C的转化，升高血液中HDL水平，促进胆固醇逆向转运，降低血液中的胆固醇水平，从而减轻动脉粥样硬化病变，达到预防动脉粥样硬化的目的。

附图说明

图1为用CETP-1疫苗包被检测抗CETP抗体的产生情况，样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，W表示week。

图2为用CETP-2疫苗包被检测抗CETP抗体的产生情况，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，W表示week。

图3为用CETP-C26包被酶标板检测CETP抗体的产生情况，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，W表示week，如图所示CETP1、CETP2组与phage组相比有差异，P <0.05差异具有统计学意义。

图4为注射疫苗后CETP活性的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，图中纵坐标表示CETP活性单位pmmol/μl sample/1 hr。CETP-1组即AS+CETP-1疫苗免疫组；CETP2组即AS+CETP2疫苗免疫组；phage组即AS+噬菌体空载体组；adjuvant组即AS+佐剂组（下同）。CETP1组、CETP2组与phage组、adjuvant组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义；CETP1组、CETP2 组与phage组、adjuvant 组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义； phage组、adjuvant 组与control组相比有显著差异， P<0.01，差异具有统计学意义。

图5为注射CETP疫苗后血中甘油三酯（mmol/L）的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，如图 CETP1组、CETP2组与 phage 组相比差异显著，P<0.01，差异具有统计学意义。

图6为注射CETP疫苗后血中总胆固醇（mmol/L）的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，如图 CETP1组与 phage 组相比有差异，P<0.05；差异具有统计学意义； phage组、adjuvant组与 control 组比有显著差异，P<0.01，差异具有统计学意义。.

图7为注射CETP疫苗后血中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)（mmol/L）的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，如图phage组、adjuvant组与 control组相比有显著差异, P<0.01，差异具有统计学意义。

图8为注射CETP疫苗后血中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)（mmol/L）的变化每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM。

图9为注射CETP疫苗后血中HDL-C/total-C比值的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM，如图phage组、adjuvant 组与 control 组比有显著差异，P<0.01，差异具有显著性。

图10为注射CETP疫苗后血中LDL-c/total-c比值的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM， CETP1组、CETP2组与phage 组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义； CETP1组、CETP2组与adjuvant 组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义；phage组、adjuvant组与 control 组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义；phage组与control 组相比有差异，P<0.01，差异具有统计学意义。

图11为注射CETP疫苗后血中HDL-C/LDL-C的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM， CETP2组与adjuvant 组相比有差异， P<0.05，差异具有统计学意义; phage组、adjuvant组与 control 组相比有显著差异，P<0.01，差异具有统计学意义。

图12为注射CETP疫苗后血中Apo-A1(g/L)的变化，每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM， CETP1组与phage组、adjuvant组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义； phage组、adjuvant组与 control 组相比P<0.01.差异具有统计学意义；CETP1组与 phage 组相比有差异，P<0.05，差异具有统计学意义。

图13为注射CETP疫苗后血中Apo-B(g/L)的变化每组样本数n=12，数值表示为均值±标准差，即mean±SEM。

具体实施方式

下面结合实施对发明进行进一步描述，但发明之内容并不局限于此。

实施例1

A 动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体的构建

由商业公司合成人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列在pGEM-T载体上，DNA序列的5’端含限制性内切酶EcoRI的酶切位点，3’端含限制性内切酶Hind III的酶切位点。

用限制性内切酶EcoRI和Hind III处理pGEM-T载体，得到含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列，用市售小量胶回收试剂盒回收该片段；用限制性内切酶EcoRI和Hind III处理T7噬菌体载体T7 select 10-3b，用市售小量胶回收试剂盒回收经限制性内切酶EcoRI和Hind III处理的T7噬菌体载体T7 select 10-3b大片段；用T4连接酶体系将含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列与经限制性内切酶EcoRI和Hind III处理的T7噬菌体载体T7 select 10-3b大片段连接，即将含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列插入T7 select 10-3b的克隆位点EcoRI和Hind III之间，该插入点正好位于T7噬菌体10B基因的3’端；将连接所得的重组噬菌体核酸，用T7噬菌体包装试剂盒T7 Select Packaging Kit包装为完整噬菌体；按每100μl包装反应物与250μl菌液的量，将包装反应物接种于用LB培养基37℃新鲜培养的OD600为1.0的BLT5403菌液上混匀后，迅速与5ml融化后42℃温浴的上层琼脂混合均匀，并铺氨苄抗性LB琼脂培养平板，37℃倒置培养至形成噬菌斑；其中：

所用LB培养基配法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5g，溶于约900ml注射用水中，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，再定容至1000ml，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min；

所用上层琼脂配法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10 g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5 g，琼脂 6 g，加入注射用水约900ml，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20min后，分装成5ml每支，4℃存放备用；当中，所用细菌培养用胰化蛋白胨以及细菌培养用酵母提取物和琼脂，均购自英国OXOID LTD公司，NaCl购自中山化学试剂公司；

所用氨苄抗性LB琼脂培养平板制法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5g，细菌培养用琼脂15g，加入注射用水约900ml，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，再定容至1000ml，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃以下加入氨苄青霉素，混匀后铺平板；

B动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体的筛选、鉴定

从步骤A所得长有噬菌斑的平板挑取单个噬菌斑，用PCR方法和测序方法综合鉴定筛选出含人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码基因的阳性噬菌体克隆得到含人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码基因的重组噬菌体，作为动脉粥样硬化疫苗种子；

C 动脉粥样硬化疫苗原液的制备

将步骤B所得单克隆化的含人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码基因的重组噬菌体作为疫苗种子接种于用LB培养基37℃新鲜培养的OD600为1.0 的BLT5403菌液进行大量扩增，得到动脉粥样硬化疫苗原液；

D 动脉粥样硬化疫苗的浓缩纯化

在步骤C所得动脉粥样硬化疫苗原液中加入氯化钠固体，加入量为：每1L动脉粥样硬化疫苗原液中加入58.6g氯化钠，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4℃，4000rpm离心20min，收集上清加入PEG8000，加入量为：每1L动脉粥样硬化疫苗原液中加入100gPEG8000，振荡至完全溶解后，4℃过夜；4℃，10000rpm离心30min，弃上清，取沉淀，将每1L动脉粥样硬化疫苗原液所得沉淀用20ml噬菌体稀释液剧烈抽提沉淀，4℃、10000rpm离心15min，收集上清，再重复抽提1次，将两次抽提离心所得上清液合并，即为动脉粥样硬化疫苗的浓缩液，并用噬斑法测定该浓缩液中重组噬菌体滴度；其中，所述噬菌体稀释液成分如下：每1L噬菌体稀释液含1molNaCl，10mmolTris-HCl（pH8.0），1mmol EDTA；

E 动脉粥样硬化疫苗的甲醛灭活

将步骤D所得动脉粥样硬化疫苗浓缩液按照每4000ml动脉粥样硬化疫苗的浓缩液加入1g甲醛的比例加入甲醛，37℃ 100rpm振荡灭活4天后检测滴度为0，按每1ml噬菌体溶液加入100μl NaHSO₃的比例，中和动脉粥样硬化疫苗浓缩液中的残余甲醛，得到动脉粥样硬化疫苗灭活液；

F 将步骤E所得动脉粥样硬化疫苗灭活液用生理盐水稀释至所需浓度，得到动脉粥样硬化疫苗使用液，用于疫苗接种。

所用限制性内切酶购自大连宝生物公司。

所用小量胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

所用限制性内切酶购自大连宝生物公司。

所用T7噬菌体载体T7 select 10-3b购自Novagen公司。

所用T4连接酶体系购自大连宝生物公司。

所用T7噬菌体包装试剂盒T7 Select Packaging Kit购自Novagen公司。

所用菌种BLT5403购自Novagen公司。

所用细菌培养用胰化蛋白胨购自英国OXOID LTD公司。

所用细菌培养用酵母提取物购自英国OXOID LTD公司。

所用琼脂购自英国OXOID LTD公司。

所用NaCl购自广州市番禺力强化工厂。

所用氨苄青霉素购自Amresco。

PEG6000购自Merck，Tris-HCl购自Amresco；EDTA购自Amresco，甲醛购自广州市番禺力强化工厂，NaHSO₃购自广州市番禺力强化工厂。

本发明经一系列生物学实验，结果如下：

1、动脉粥样硬化疫苗的遗传稳定性试验

动脉粥样硬化疫苗种子经连续传代20次,于原代、第5代、第10代、第20代分别用PCR方法及测序方法检测是否表达动脉粥样硬化CETP蛋白。

实验证明，动脉粥样硬化疫苗种子经连续传代20次之后仍能稳定表达CETP蛋白。

结果见表1。

、动脉粥样硬化疫苗种子的热稳定性试验

1）疫苗种子37℃保存的稳定性

37℃条件下，动脉粥样硬化疫苗种子滴度下降很快，无甘油组第7 天时由10¹¹pfu／ml 下降至10⁹ pfu／ml，而添加甘油组则在第7 天时降至10⁸ pfu／ml，添加甘油未见明显的保护作用，结果见表2。

2）疫苗种子25℃保存的稳定性

25℃条件下，动脉粥样硬化疫苗种子滴度无甘油组第15 天时下降至10⁹ pfu／ml，而添加甘油组则下降至10⁸ pfu／ml，添加甘油未见明显的保护作用，见表3。

3）疫苗种子4℃保存的稳定性

4℃条件下，噬菌体疫苗种子滴度无甘油组与添加甘油组第47 天时均下降至10¹⁰pfu／ml，与在37℃和25℃条件下保存相比，下降速度较慢，在相对长的时间内仍保持较高的滴度，但添加甘油未见明显的保护作用，见表4。

4）疫苗种子－20℃保存的稳定性

在－20℃条件下，动脉粥样硬化疫苗种子滴度无甘油组第60 天时仍保持在10¹⁰pfu／ml，第90 天时下降至10⁷ pfu／ml；添加甘油组第90 天时仍保持在10¹⁰ pfu／ml，至第150 天时下降至10⁸ pfu／ ml，明显高于无甘油组，添加甘油可见较明显的保护作用，见表5。

试验证明动脉粥样硬化疫苗种子在4℃可短期保存，在－20℃可长期保存，并可添加甘油作为保护剂。

动脉粥样硬化疫苗的稳定性试验

测定2℃～8℃条件下保存不同时长的动脉粥样硬化疫苗pH值、免疫小鼠后的抗CETP抗体效价、异常毒性试验及无菌试验，结果见表6。

实验证明该疫苗在2-8℃条件下保存6个月，其免疫原性、异常毒性、无菌试验、理化性质均保持稳定。后续将进行更长保存时长的疫苗稳定性实验，以为疫苗最终效期制订提供实验依据。

、动脉粥样硬化疫苗的初步药效学研究

4.1利用新西兰大耳白兔高脂食物诱发动脉粥样硬化模型（以下简称AS模型）观察动脉粥样硬化疫苗（以下实验图表中简称CETP疫苗）防治动脉粥样硬化的效果。

4.1.1家兔动脉粥样硬化模型制备

新西兰大耳白兔，高脂饲料配方：基础饲料∶蛋黄粉∶猪油∶胆固醇 = 86∶10∶3∶1，每只每天定量给予饲料120g/天,饲喂2/3基础饲料,1/3高胆固醇饲料(含0.4g胆固醇)，自由饮水。连续喂养6个月，即可制备出较稳定的动脉粥样硬化模型。

4.2实验分组：

1）AS模型组，实验开始（n=10，下同）：高脂饲料喂养24周。该组又分为AS+佐剂（adjuvant）组和AS+噬菌体空载体（phage）组两种处理，以排除佐剂和空载体对AS形成的影响。

制备两个批次的动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体原液，分别称CETP-1和CETP-2。

2）CETP-1组，n=12：分别在第0周、4周、8周初注射I号CETP疫苗各一次，共注射3次，之后开始饲喂高脂饲料24周，总观察期32周。

3）CETP-2组，n=12：分别在第0周、4周、8周初注射I号CETP疫苗各一次，共注射3次，之后开始饲喂高脂饲料24周，总观察期32周。

4）正常对照组（n=12）：正常饲料喂养32周，同时在上述相同时间点注射佐剂3次。

疫苗剂量、给药时间、抗CETP抗体产生情况以及CETP活性的变化：

将动脉粥样硬化疫苗（加铝佐剂（1ml/1mg/只）和硫酸乙酰肝素2mg/只）混悬液）主动免疫，于0周、4周、8周初分别皮下注射，其中疫苗噬菌体浓度相当于1×10⁹ pfu/只。

4.3采用ELISA方法对家兔血清的CETP抗体和CETP活性进行了检测，方法稳定。结果如图1和图2所示，家兔在分别注射两种疫苗后的第4周抗体水平开始升高，到第16周达到顶峰，以后抗体水平开始缓慢下降，但仍明显高于adjuvant组和正常对照组（n=12，mean±SEM）。而用人工合成的含CETP羧基端26个氨基酸残基的多肽（CETP-C26）作为抗原包被酶标板，进一步证实家兔体内产生的抗体为CETP抗体（如图3），但用CETP-C26检测抗体的方法仅在第8周发现CETP-1组和CETP-2组动物的CETP抗体显示了有统计学意义的升高，而4周后的其余时间点尽管似有CETP抗体水平的升高，但无统计学差异。这里需要指出的是，由于CETP-C26检测方法的灵敏度或检查方法不同的问题，所检测出的抗体水平并不一定与用CETP疫苗主动免疫组CETP抗体产生水平一致，这里仅说明用CETP疫苗主动免疫动物后抗体产生的特异性（是否针对CETP）。

CETP抗体的产生抑制了CETP的活性：由图4可知，AS组家兔血清中的CETP活性从第16周开始逐渐升高，明显高于正常对照组。而CETP-1组和CETP-2组CETP活性虽有所升高，在第8周、第24周明显低于AS组。说明由动脉粥样硬化疫苗产生的抗CETP抗体能有效抑制家兔体内CETP的活性。

4.4采用酶法及免疫比浊法对血清中的血脂进行检测，CETP疫苗免疫后可不同程度地降低高脂家兔血脂的某些指标，包括甘油三酯（图5）、总胆固醇（图6）、LDL-c（图10）以及LDL-c/total-c比值（图8）显著降低，HDL-c/total-c比值（图9）、HDL-c/LDL-c比值（图11）和Apo-A1（图12）显著升高，但HDL-c（图7）和Apo-B1（图13）的水平与AS组相比无显著性变化。

4.5采用病理切片染色及免疫组化的方法对家兔动脉管壁的病变程度进行分析。结果表明，事先注射CETP疫苗免疫可在一定程度上减轻动脉粥样硬化病变。

主动脉大体油红O染色显示，正常对照组主动脉内膜光滑，未见粥样硬化斑块。模型组主动脉内膜有严重的粥样硬化病变，斑块呈点、斑、条状隆起，边缘清楚，表面无明显破溃，较严重者斑块融合成片，密布内膜面，以主动脉起始部为重。CETP疫苗1组和CETP疫苗2组主动脉内膜散在粥样斑块，多集中在主动脉起始部。病理图像分析系统定量测定主动脉斑块面积占主动脉总面积的百分比，疫苗I组和疫苗II组斑块面积分别较模型组减少30.8%和27.6%。通过大体观察进行病变分级：0级，内膜表面光滑，无红染；0.5级，内膜有轻度红染，但无凸出于表面的斑块；1级，有明显凸起红染斑块，面积小于3mm2; 2级，斑块面积大于3mm2；3级，斑块融合成片，大部分斑块面积大于3mm2；4级，斑块几乎覆盖整个动脉内膜。统计结果：CETP1组病变评分为3.00±0.71，CETP2组病变评分为2.60±0.90，模型组病变评分为3.40±1.34，正常对照组病变评分为0级。

其它组织学检查均显示用疫苗免疫后，动脉粥样硬化病变有一定程度减轻，从主动脉切片HE染色、弹力纤维染色、巨噬细胞免疫组化染色、主动脉切片油红O染色等均能得到看出以上效果。

疫苗药效学研究小结：

1）两个批次CETP噬菌体疫苗均能有效诱导动物体内CETP抗体的产生；

2）两个批次CETP噬菌体疫苗均能抑制动物体内CETP的活性；

3）CETP噬菌体疫苗在一定程度上能改善AS动物的血脂指标，包括升高动物血清中HDL-c/总胆固醇的比值，降低甘油三酯和LDL-c水平以及LDL-c/总胆固醇的比值，升高Apo-A1水平等；

4）CETP疫苗能在一定程度上抑制家兔动脉粥样硬化斑块的形成，与AS组相比，疫苗免疫平均可使动脉粥样硬化瘢块面积减少约25%左右，且两种疫苗的预防效果无明显差异；但CETP疫苗免疫并不能完全阻止粥样硬化病变的形成；

5）CETP疫苗能抑制巨噬细胞向血管壁的浸润，对血管内皮有一定保护作用。

疫苗猴体实验

疫苗经预防接种后，有效诱导恒河猴产生抗CETP蛋白的抗体，抗体滴度达到1:3012±21。

动脉粥样硬化疫苗免疫恒河猴后血清抗CETP抗体水平的检测：

用动脉粥样硬化疫苗免疫恒河猴，10¹⁰pfu/只/次，分别于第0、1、4月三次免疫，同时设空白对照组，注射生理盐水0.1 ml/只。分别于0、4、8、12、16、20、24、28周采集静脉血，分离血清，用ELISA法检测抗CETP抗体。

检测结果表明，动脉粥样硬化疫苗免疫恒河猴后，诱导了抗CETP抗体的产生，并且抗体水平在20周时升至最高，达到1：1396±21，与空白对照组相比，差异显著，P<0.01，之后开始下降，说明动脉粥样硬化疫苗能有效地诱导动物抗CETP抗体的产生，检测结果见附表7。

附表1 动脉粥样硬化疫苗遗传稳定性

附表2 在37℃条件下保存不同时间动脉粥样硬化疫苗种子的滴度

Adjusted value = Titer of glycerol-containing vaccine × 2.

附表3 在25℃条件下保存不同时间动脉粥样硬化疫苗种子的滴度

* Adjusted value = Titer of glycerol-containing vaccine × 2

附表4 在4℃条件下保存不同时间动脉粥样硬化疫苗种子的滴度

l Adjusted value = Titer of glycerol-containing vaccine × 2

附表5 在－20℃条件下保存不同时间动脉粥样硬化疫苗种子的滴度

* Adjusted value = Titer of glycerol-containing vaccine × 2.

附表6 动脉粥样硬化疫苗稳定性

附表7 抗CETP抗体滴度（）

序列表

人类CETP蛋白编码DNA序列

atgctggcgg cgaccgtgct gaccctggcg ctgctgggca acgcgcatgc gtgcagcaaa 60

ggcaccagcc atgaagcggg cattgtgtgc cgtattacca aaccggcgct gctggtgctg 120

aaccatgaaa ccgcgaaagt gattcagacc gcgtttcagc gtgcgagcta tccggatatt 180

accggcgaaa aagcgatgat gctgctgggc caggtgaaat atggcctgca taacattcag 240

attagccatc tgagcattgc gagcagccag gtggaactgg tggaagcgaa aagcattgat 300

gtgagcattc agaacgtgag cgtggtgttt aaaggcaccc tgaaatatgg ctataccacc 360

gcgtggtggc tgggcattga tcagagcatt gattttgaaa ttgatagcgc gattgatctg 420

cagattaaca cccagctgac ctgcgatagc ggccgtgtgc gtaccgatgc gccggattgc 480

tatctgagct ttcataaact gctgctgcat ctgcagggcg aacgtgaacc gggctggatt 540

aaacagctgt ttaccaactt tattagcttt accctgaaac tggtgctgaa aggccagatt 600

tgcaaagaaa ttaacgtgat tagcaacatt atggcggatt ttgtgcagac ccgtgcggcg 660

agcattctga gcgatggcga tattggcgtg gatattagcc tgaccggcga tccggtgatt 720

accgcgagct atctggaaag ccatcataaa ggccatttta tttataaaaa cgtgagcgaa 780

gatctgccgc tgccgacctt tagcccgacc ctgctgggcg atagccgtat gctgtatttt 840

tggtttagcg aacgtgtgtt tcatagcctg gcgaaagtgg cgtttcagga tggccgtctg 900

atgctgagcc tgatgggcga tgaatttaaa gcggtgctgg aaacctgggg ctttaacacc 960

aaccaggaaa tttttcagga agtggtgggc ggctttccga gccaggcgca ggtgaccgtg 1020

cattgcctga aaatgccgaa aattagctgc cagaacaaag gcgtggtggt gaacagcagc 1080

gtgatggtga aatttctgtt tccgcgtccg gatcagcagc atagcgtggc gtataccttt 1140

gaagaagata ttgtgaccac cgtgcaggcg agctatagca aaaaaaaact gtttctgagc 1200

ctgctggatt ttcagattac cccgaaaacc gtgagcaacc tgaccgaaag cagcagcgaa 1260

agcattcaga gctttctgca gagcatgatt accgcggtgg gcattccgga agtgatgagc 1320

cgtctggaag tggtgtttac cgcgctgatg aacagcaaag gcgtgagcct gtttgatatt 1380

attaacccgg aaattattac ccgtgatggc tttctgctgc tgcagatgga ttttggcttt 1440

ccggaacatc tgctggtgga ttttctgcag agcctgagc 1479

人类CETP蛋白氨基酸序列

Met Leu Ala Ala Thr Val Leu Thr Leu Ala Leu Leu Gly Asn Ala His Ala Cys Ser Lys

5 10 15 20

Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu

25 30 35 40

Asn His Glu Thr Ala Lys Val Ile Gln Thr Ala Phe Gln Arg Ala Ser Tyr Pro Asp Ile

45 50 55 60

Thr Gly Glu Lys Ala Met Met Leu Leu Gly Gln Val Lys Tyr Gly Leu His Asn Ile Gln

65 70 75 80

Ile Ser His Leu Ser Ile Ala Ser Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ala Lys Ser Ile Asp

85 90 95 100

Val Ser Ile Gln Asn Val Ser Val Val Phe Lys Gly Thr Leu Lys Tyr Gly Tyr Thr Thr

105 110 115 120

Ala Trp Trp Leu Gly Ile Asp Gln Ser Ile Asp Phe Glu Ile Asp Ser Ala Ile Asp Leu

125 130 135 140

Gln Ile Asn Thr Gln Leu Thr Cys Asp Ser Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Pro Asp Cys

145 150 155 160

Tyr Leu Ser Phe His Lys Leu Leu Leu His Leu Gln Gly Glu Arg Glu Pro Gly Trp Ile

165 170 175 180

Lys Gln Leu Phe Thr Asn Phe Ile Ser Phe Thr Leu Lys Leu Val Leu Lys Gly Gln Ile

185 190 195 200

Cys Lys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala

205 210 215 220

Ser Ile Leu Ser Asp Gly Asp Ile Gly Val Asp Ile Ser Leu Thr Gly Asp Pro Val Ile

225 230 235 240

Thr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser His His Lys Gly His Phe Ile Tyr Lys Asn Val Ser Glu

245 250 255 260

Asp Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Gly Asp Ser Arg Met Leu Tyr Phe

265 270 275 280

Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe His Ser Leu Ala Lys Val Ala Phe Gln Asp Gly Arg Leu

285 290 395 300

Met Leu Ser Leu Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr Trp Gly Phe Asn Thr

305 310 315 320

Asn Gln Glu Ile Phe Gln Glu Val Val Gly Gly Phe Pro Ser Gln Ala Gln Val Thr Val

325 330 335 340

His Cys Leu Lys Met Pro Lys Ile Ser Cys Gln Asn Lys Gly Val Val Val Asn Ser Ser

345 350 355 360

Val Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln Gln His Ser Val Ala Tyr Thr Phe

365 370 375 380

Glu Glu Asp Ile Val Thr Thr Val Gln Ala Ser Tyr Ser Lys Lys Lys Leu Phe Leu Ser

385 390 395 400

Leu Leu Asp Phe Gln Ile Thr Pro Lys Thr Val Ser Asn Leu Thr Glu Ser Ser Ser Glu

405 410 415 420

Ser Ile Gln Ser Phe Leu Gln Ser Met Ile Thr Ala Val Gly Ile Pro Glu Val Met Ser

425 430 435 440

Arg Leu Glu Val Val Phe Thr Ala Leu Met Asn Ser Lys Gly Val Ser Leu Phe Asp Ile

445 450 455 460

Ile Asn Pro Glu Ile Ile Thr Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe

465 470 475 480

Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser

485 490

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 动脉粥样硬化疫苗

<130> 案卷参考号

<140> 申请号

<141> 申请日

<150> 优先权日

<151> 优先权号

<160> 2

<210> 1

<211> 1479

人类CETP蛋白编码DNA序列

<212> DNA

<213>人工合成基因序列

<400> 1

atgctggcgg cgaccgtgct gaccctggcg ctgctgggca acgcgcatgc gtgcagcaaa 60

ggcaccagcc atgaagcggg cattgtgtgc cgtattacca aaccggcgct gctggtgctg 120

aaccatgaaa ccgcgaaagt gattcagacc gcgtttcagc gtgcgagcta tccggatatt 180

accggcgaaa aagcgatgat gctgctgggc caggtgaaat atggcctgca taacattcag 240

attagccatc tgagcattgc gagcagccag gtggaactgg tggaagcgaa aagcattgat 300

gtgagcattc agaacgtgag cgtggtgttt aaaggcaccc tgaaatatgg ctataccacc 360

gcgtggtggc tgggcattga tcagagcatt gattttgaaa ttgatagcgc gattgatctg 420

cagattaaca cccagctgac ctgcgatagc ggccgtgtgc gtaccgatgc gccggattgc 480

tatctgagct ttcataaact gctgctgcat ctgcagggcg aacgtgaacc gggctggatt 540

aaacagctgt ttaccaactt tattagcttt accctgaaac tggtgctgaa aggccagatt 600

tgcaaagaaa ttaacgtgat tagcaacatt atggcggatt ttgtgcagac ccgtgcggcg 660

agcattctga gcgatggcga tattggcgtg gatattagcc tgaccggcga tccggtgatt 720

accgcgagct atctggaaag ccatcataaa ggccatttta tttataaaaa cgtgagcgaa 780

gatctgccgc tgccgacctt tagcccgacc ctgctgggcg atagccgtat gctgtatttt 840

tggtttagcg aacgtgtgtt tcatagcctg gcgaaagtgg cgtttcagga tggccgtctg 900

atgctgagcc tgatgggcga tgaatttaaa gcggtgctgg aaacctgggg ctttaacacc 960

aaccaggaaa tttttcagga agtggtgggc ggctttccga gccaggcgca ggtgaccgtg 1020

cattgcctga aaatgccgaa aattagctgc cagaacaaag gcgtggtggt gaacagcagc 1080

gtgatggtga aatttctgtt tccgcgtccg gatcagcagc atagcgtggc gtataccttt 1140

gaagaagata ttgtgaccac cgtgcaggcg agctatagca aaaaaaaact gtttctgagc 1200

ctgctggatt ttcagattac cccgaaaacc gtgagcaacc tgaccgaaag cagcagcgaa 1260

agcattcaga gctttctgca gagcatgatt accgcggtgg gcattccgga agtgatgagc 1320

cgtctggaag tggtgtttac cgcgctgatg aacagcaaag gcgtgagcct gtttgatatt 1380

attaacccgg aaattattac ccgtgatggc tttctgctgc tgcagatgga ttttggcttt 1440

ccggaacatc tgctggtgga ttttctgcag agcctgagc 1479

<210> 2

<211> 493

人类CETP蛋白氨基酸序列

<212> PRT

<213>基因表达

<400> 2

Met Leu Ala Ala Thr Val Leu Thr Leu Ala Leu Leu Gly Asn Ala His Ala Cys Ser Lys

5 10 15 20

Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile Val Cys Arg Ile Thr Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu

25 30 35 40

Asn His Glu Thr Ala Lys Val Ile Gln Thr Ala Phe Gln Arg Ala Ser Tyr Pro Asp Ile

45 50 55 60

Thr Gly Glu Lys Ala Met Met Leu Leu Gly Gln Val Lys Tyr Gly Leu His Asn Ile Gln

65 70 75 80

Ile Ser His Leu Ser Ile Ala Ser Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ala Lys Ser Ile Asp

85 90 95 100

Val Ser Ile Gln Asn Val Ser Val Val Phe Lys Gly Thr Leu Lys Tyr Gly Tyr Thr Thr

105 110 115 120

Ala Trp Trp Leu Gly Ile Asp Gln Ser Ile Asp Phe Glu Ile Asp Ser Ala Ile Asp Leu

125 130 135 140

Gln Ile Asn Thr Gln Leu Thr Cys Asp Ser Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Pro Asp Cys

145 150 155 160

Tyr Leu Ser Phe His Lys Leu Leu Leu His Leu Gln Gly Glu Arg Glu Pro Gly Trp Ile

165 170 175 180

Lys Gln Leu Phe Thr Asn Phe Ile Ser Phe Thr Leu Lys Leu Val Leu Lys Gly Gln Ile

185 190 195 200

Cys Lys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala

205 210 215 220

Ser Ile Leu Ser Asp Gly Asp Ile Gly Val Asp Ile Ser Leu Thr Gly Asp Pro Val Ile

225 230 235 240

Thr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser His His Lys Gly His Phe Ile Tyr Lys Asn Val Ser Glu

245 250 255 260

Asp Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Gly Asp Ser Arg Met Leu Tyr Phe

265 270 275 280

Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe His Ser Leu Ala Lys Val Ala Phe Gln Asp Gly Arg Leu

285 290 395 300

Met Leu Ser Leu Met Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr Trp Gly Phe Asn Thr

305 310 315 320

Asn Gln Glu Ile Phe Gln Glu Val Val Gly Gly Phe Pro Ser Gln Ala Gln Val Thr Val

325 330 335 340

His Cys Leu Lys Met Pro Lys Ile Ser Cys Gln Asn Lys Gly Val Val Val Asn Ser Ser

345 350 355 360

Val Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg Pro Asp Gln Gln His Ser Val Ala Tyr Thr Phe

365 370 375 380

Glu Glu Asp Ile Val Thr Thr Val Gln Ala Ser Tyr Ser Lys Lys Lys Leu Phe Leu Ser

385 390 395 400

Leu Leu Asp Phe Gln Ile Thr Pro Lys Thr Val Ser Asn Leu Thr Glu Ser Ser Ser Glu

405 410 415 420

Ser Ile Gln Ser Phe Leu Gln Ser Met Ile Thr Ala Val Gly Ile Pro Glu Val Met Ser

425 430 435 440

Arg Leu Glu Val Val Phe Thr Ala Leu Met Asn Ser Lys Gly Val Ser Leu Phe Asp Ile

445 450 455 460

Ile Asn Pro Glu Ile Ile Thr Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe

465 470 475 480

Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser

485 490

Claims

1.一种动脉粥样硬化疫苗，包括T7噬菌体以及人类胆固醇酯转运蛋白CETP，其特征在于将人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端，使人类胆固醇酯转运蛋白CETP展示于T7噬菌体的表面，从而构建出动脉粥样硬化疫苗；

具体步骤如下：

A、动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体的构建：

由商业公司合成人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列在pGEM-T载体上，DNA序列的5’端含限制性内切酶EcoRI的酶切位点，3’端含限制性内切酶Hind III的酶切位点；

用限制性内切酶EcoRI和Hind III处理pGEM-T载体，得到含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列，用市售小量胶回收试剂盒回收该片段；用限制性内切酶EcoRI和Hind III处理T7噬菌体载体T7 select 10-3b，用市售小量胶回收试剂盒回收经限制性内切酶EcoRI和Hind III处理的T7噬菌体载体T7 select 10-3b大片段；用T4连接酶体系将含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列与经限制性内切酶EcoRI和Hind III处理的T7噬菌体载体T7 select 10-3b大片段连接，即将含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列插入T7select 10-3b的克隆位点EcoRI和Hind III之间，该插入点正好位于T7噬菌体10B基因的3’端；将连接所得的重组噬菌体核酸，用T7噬菌体包装试剂盒T7 Select Packaging Kit包装为完整噬菌体；按每100μL包装反应物与250μL菌液的量，将包装反应物接种于用LB培养基37℃新鲜培养的OD600为1.0的BLT5403菌液上混匀后，迅速与5mL融化后42℃温浴的上层琼脂混合均匀，并铺氨苄抗性LB琼脂培养平板，37℃倒置培养至形成噬菌斑；其中：

所用LB培养基配法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl5g，溶于900mL注射用水中，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，再定容至1000mL，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min；

所用上层琼脂配法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10 g，细菌培养用酵母提取物5 g，NaCl 5 g，琼脂 6 g，加入注射用水900mL，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，1.034×10⁵Pa高压下蒸汽灭菌20min后，分装成5mL每支，4℃存放备用；

所用氨苄抗性LB琼脂培养平板制法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5g，细菌培养用琼脂15g，加入注射用水900mL，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，再定容至1000mL，1.034×10⁵Pa高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃以下加入氨苄青霉素，混匀后铺平板；

B、动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体的筛选、鉴定：

C 、动脉粥样硬化疫苗原液的制备：

D 、动脉粥样硬化疫苗的浓缩纯化：

在步骤C所得动脉粥样硬化疫苗原液中加入氯化钠固体，加入量为：每1L动脉粥样硬化疫苗原液中加入58.6g氯化钠，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4℃，4000rpm离心20min，收集上清加入PEG8000，加入量为：每1L动脉粥样硬化疫苗原液中加入100g PEG8000，振荡至完全溶解后，4℃过夜；4℃，10000rpm离心30min，弃上清，取沉淀，将每1L动脉粥样硬化疫苗原液所得沉淀用20mL噬菌体稀释液剧烈抽提沉淀，4℃、10000rpm离心15min，收集上清，再重复抽提1次，将两次抽提离心所得上清液合并，即为动脉粥样硬化疫苗的浓缩液，并用噬斑法测定该浓缩液中重组噬菌体滴度；其中，所述噬菌体稀释液成分如下：每1L噬菌体稀释液含1molNaCl，10mmolTris-HCl，该Tris-HCl的pH为8.0，1mmol EDTA；

E 、动脉粥样硬化疫苗的甲醛灭活：

F、将步骤E所得动脉粥样硬化疫苗灭活液用生理盐水稀释至所需浓度，得到动脉粥样硬化疫苗使用液。

2.如权利要求1所述的动脉粥样硬化疫苗，其特征在于，所述插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列为：

atgCTGGCGGCGACCGTGCTGACCCTGGCGCTGCTGGGCAACGCGCATGCGTGCAGCAAAGGCACCAGCCATGAAGCGGGCATTGTGTGCCGTATTACCAAACCGGCGCTGCTGGTGCTGAACCATGAAACCGCGAAAGTGATTCAGACCGCGTTTCAGCGTGCGAGCTATCCGGATATTACCGGCGAAAAAGCGatgatgCTGCTGGGCCAGGTGAAATATGGCCTGCATAACATTCAGATTAGCCATCTGAGCATTGCGAGCAGCCAGGTGGAACTGGTGGAAGCGAAAAGCATTGATGTGAGCATTCAGAACGTGAGCGTGGTGTTTAAAGGCACCCTGAAATATGGCTATACCACCGCGTGGTGGCTGGGCATTGATCAGAGCATTGATTTTGAAATTGATAGCGCGATTGATCTGCAGATTAACACCCAGCTGACCTGCGATAGCGGCCGTGTGCGTACCGATGCGCCGGATTGCTATCTGAGCTTTCATAAACTGCTGCTGCATCTGCAGGGCGAACGTGAACCGGGCTGGATTAAACAGCTGTTTACCAACTTTATTAGCTTTACCCTGAAACTGGTGCTGAAAGGCCAGATTTGCAAAGAAATTAACGTGATTAGCAACATTatgGCGGATTTTGTGCAGACCCGTGCGGCGAGCATTCTGAGCGATGGCGATATTGGCGTGGATATTAGCCTGACCGGCGATCCGGTGATTACCGCGAGCTATCTGGAAAGCCATCATAAAGGCCATTTTATTTATAAAAACGTGAGCGAAGATCTGCCGCTGCCGACCTTTAGCCCGACCCTGCTGGGCGATAGCCGTatgCTGTATTTTTGGTTTAGCGAACGTGTGTTTCATAGCCTGGCGAAAGTGGCGTTTCAGGATGGCCGTCTGatgCTGAGCCTGatgGGCGATGAATTTAAAGCGGTGCTGGAAACCTGGGGCTTTAACACCAACCAGGAAATTTTTCAGGAAGTGGTGGGCGGCTTTCCGAGCCAGGCGCAGGTGACCGTGCATTGCCTGAAAatgCCGAAAATTAGCTGCCAGAACAAAGGCGTGGTGGTGAACAGCAGCGTGatgGTGAAATTTCTGTTTCCGCGTCCGGATCAGCAGCATAGCGTGGCGTATACCTTTGAAGAAGATATTGTGACCACCGTGCAGGCGAGCTATAGCAAAAAAAAACTGTTTCTGAGCCTGCTGGATTTTCAGATTACCCCGAAAACCGTGAGCAACCTGACCGAAAGCAGCAGCGAAAGCATTCAGAGCTTTCTGCAGAGCatgATTACCGCGGTGGGCATTCCGGAAGTGatgAGCCGTCTGGAAGTGGTGTTTACCGCGCTGatgAACAGCAAAGGCGTGAGCCTGTTTGATATTATTAACCCGGAAATTATTACCCGTGATGGCTTTCTGCTGCTGCAGatgGATTTTGGCTTTCCGGAACATCTGCTGGTGGATTTTCTGCAGAGCCTGAGC。

3.如权利要求1所述的动脉粥样硬化疫苗，其特征在于插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP的氨基酸序列为：MetLeuAlaAlaThrValLeuThrLeuAlaLeuLeuGlyAsnAlaHisAlaCysSerLysGlyThrSerHisGluAlaGlyIleValCysArgIleThrLysProAlaLeuLeuValLeuAsnHisGluThrAlaLysValIleGlnThrAlaPheGlnArgAlaSerTyrProAspIleThrGlyGluLysAlaMetMetLeuLeuGlyGlnValLysTyrGlyLeuHisAsnIleGlnIleSerHisLeuSerIleAlaSerSerGlnValGluLeuValGluAlaLysSerIleAspValSerIleGlnAsnValSerValValPheLysGlyThrLeuLysTyrGlyTyrThrThrAlaTrpTrpLeuGlyIleAspGlnSerIleAspPheGluIleAspSerAlaIleAspLeuGlnIleAsnThrGlnLeuThrCysAspSerGlyArgValArgThrAspAlaProAspCysTyrLeuSerPheHisLysLeuLeuLeuHisLeuGlnGlyGluArgGluProGlyTrpIleLysGlnLeuPheThrAsnPheIleSerPheThrLeuLysLeuValLeuLysGlyGlnIleCysLysGluIleAsnValIleSerAsnIleMetAlaAspPheValGlnThrArgAlaAlaSerIleLeuSerAspGlyAspIleGlyValAspIleSerLeuThrGlyAspProValIleThrAlaSerTyrLeuGluSerHisHisLysGlyHisPheIleTyrLysAsnValSerGluAspLeuProLeuProThrPheSerProThrLeuLeuGlyAspSerArgMetLeuTyrPheTrpPheSerGluArgValPheHisSerLeuAlaLysValAlaPheGlnAspGlyArgLeuMetLeuSerLeuMetGlyAspGluPheLysAlaValLeuGluThrTrpGlyPheAsnThrAsnGlnGluIlePheGlnGluValValGlyGlyPheProSerGlnAlaGlnValThrValHisCysLeuLysMetProLysIleSerCysGlnAsnLysGlyValValValAsnSerSerValMetValLysPheLeuPheProArgProAspGlnGlnHisSerValAlaTyrThrPheGluGluAspIleValThrThrValGlnAlaSerTyrSerLysLysLysLeuPheLeuSerLeuLeuAspPheGlnIleThrProLysThrValSerAsnLeuThrGluSerSerSerGluSerIleGlnSerPheLeuGlnSerMetIleThrAlaValGlyIleProGluValMetSerArgLeuGluValValPheThrAlaLeuMetAsnSerLysGlyValSerLeuPheAspIleIleAsnProGluIleIleThrArgAspGlyPheLeuLeuLeuGlnMetAspPheGlyPheProGluHisLeuLeuValAspPheLeuGlnSerLeuSer。