EA014649B1 - Вакцина - Google Patents

Вакцина Download PDF

Info

Publication number
EA014649B1
EA014649B1 EA200801374A EA200801374A EA014649B1 EA 014649 B1 EA014649 B1 EA 014649B1 EA 200801374 A EA200801374 A EA 200801374A EA 200801374 A EA200801374 A EA 200801374A EA 014649 B1 EA014649 B1 EA 014649B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
saccharide
vaccine
immunogenic composition
conjugated
Prior art date
Application number
EA200801374A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801374A1 (ru
Inventor
Ральф Леон Бьеман
Натали Мари-Жозеф Гаркон
Филипп Винсент Эрман
Ян Пулман
Марсель Полетт Ван Мешлен
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39133667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA014649(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0526232A external-priority patent/GB0526232D0/en
Priority claimed from GBGB0607088.2A external-priority patent/GB0607088D0/en
Priority claimed from GB0607087A external-priority patent/GB0607087D0/en
Priority claimed from GB0609902A external-priority patent/GB0609902D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Priority claimed from GB0620816A external-priority patent/GB0620816D0/en
Priority claimed from GB0620815A external-priority patent/GB0620815D0/en
Priority claimed from PCT/GB2006/004634 external-priority patent/WO2007068907A2/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200801374A1 publication Critical patent/EA200801374A1/ru
Publication of EA014649B1 publication Critical patent/EA014649B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области вакцин на основе конъюгатов пневмококковых капсульных сахаридов. В частности, предложена иммуногенная композиция для младенцев, содержащая поливалентную вакцину против Streptococcus pneumoniae, содержащую два или более конъюгата капсульных сахаридов из разных серотипов, где указанная композиция содержит конъюгат сахарида серотипа 22F. Такая вакцина может быть использована в детских популяциях для уменьшения частоты возникновения пневмококкового заболевания, такого как обострения хронической обструктивной болезни легких (COPD) и/или инвазивного пневмококкового заболевания (IPD), у пожилых людей.

Description

Настоящее изобретение относится к области вакцин на основе конъюгатов пневмококковых капсульных сахаридов. В частности, предложена иммуногенная композиция для младенцев, содержащая поливалентную вакцину против 81тер1ососси8 рпеитошае, содержащую два или более конъюгата капсульных сахаридов из разных серотипов, где указанная композиция содержит конъюгат сахарида серотипа 22Е. Такая вакцина может быть использована в детских популяциях для уменьшения частоты возникновения пневмококкового заболевания, такого как обострения хронической обструктивной болезни легких (СОРЭ) и/или инвазивного пневмококкового заболевания (ΙΓΌ), у пожилых людей.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине против 81гер1ососсик рпеитошае.
Предшествующий уровень техники
Дети в возрасте менее 2 лет не генерируют иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому требовалось сделать эти полисахариды иммуногенными путем химического конъюгирования с белком-носителем. Связывание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает этому полисахариду свойства Т-зависимости, включая переключение изотипов, созревание аффинности и индуцирование памяти.
Однако могут возникать проблемы с повторным введением конъюгатов полисахарид-белок или комбинации конъюгатов полисахарид-белок с образованием поливалентных вакцин. Например, сообщалось, что вакцину на основе полисахаридов Наеторйбик шПиепхае типа Ь (Н1Ь) (РКР (полирибозилрибитол-фосфатный капсульный полисахарид)), в которой в качестве белка-носителя использован столбнячный анатоксин (ТТ), тестировали в диапазоне доз с одновременной иммунизацией (свободным) ТТ и вакциной на основе конъюгата пневмококковый полисахарид-ТТ, следуя стандартной схеме для детей. По мере увеличения дозы пневмококковой вакцины иммунный ответ на РКР полисахаридную часть Н1Ь конъюгатной вакцины снижался, что указывает на иммунное вмешательство полисахарида, возможно через использование одного и того же белка-носителя (Эадап е1 а1., шГесР 1ттип. (1998), 66: 2093-2098).
Было также доказано, что влияние дозы белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок является разносторонним. Как сообщалось, у маленьких детей увеличение дозы тетравалентного конъюгата на основе столбнячного анатоксина приводило к снижению ответа на столбнячный носитель (Падав е( а1., см. выше). Классический анализ таких эффектов комбинированных вакцин был описан как индуцированная носителем супрессия эпитопов, что не совсем понятно, но представляется результатом избыточного количества белка-носителя (РаНот. Уассше, 17: 126 (1999)). По всей вероятности, это приводит к конкуренции за Тй-клетки между В-клетками к белку-носителю и В-клетками к полисахариду. Если преобладают В-клетки к белку-носителю, то Тй-клеток, способных обеспечить необходимую помощь специфичным к данному полисахариду В-клеткам, оказывается недостаточно. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты оказались противоречивы, так как в некоторых случаях общее количество белканосителя увеличивало иммунный ответ, а в других случаях снижало иммунный ответ.
Таким образом, остаются технические трудности при комбинировании множества полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.
81тер1ососсик рпеитошае является грамположительной бактерией, ответственной за значительную заболеваемость и смертность (особенно среди детей и пожилых людей), вызывающей инвазивные заболевания, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, ассоциированные с колонизацией, такие как острый средний отит. Установлено, что частота заболеваемости пневмококковой пневмонией в США для людей в возрасте старше 60 лет составляет 3-8 на 100000 человек. В 20% случаев это приводит к бактериемии и другим проявлениям, таким как менингит, с процентом смертности, близким 30%, даже при лечении антибиотиками.
Пневмококк окружен капсулой из связанного химическими связями полисахарида, который придает ему серотипическую специфичность. Существует 90 известных серотипов пневмококков, и такая капсула представляет собой ключевую детерминанту вирулентности для пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерии от комплемента, но и сама проявляет слабые иммуногенные свойства. Полисахариды являются Т-независимыми антигенами и не могут процессироваться или быть представленными на молекулах МНС (главного комплекса гистосовместимости) для взаимодействия с Т-клетками. Однако они могут стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, включающего перекрестное связывание поверхностных рецепторов на В-клетках.
В некоторых экспериментах было показано, что защита от инвазивного пневмококкового заболевания коррелирует наиболее сильно с антителом, специфичным к данной капсуле, и такая защита является серотипически специфичной.
81тер1ососсик рпеитошае представляет собой самую распространенную причину инвазивного бактериального заболевания и среднего отита у младенцев и маленьких детей. Аналогично, пожилые люди генерируют слабые ответы на пневмококковые вакцины [Кодйтапп е( а1. (1987), 1. Сетоп1о1. 42: 265-270], отсюда - возрастающая частота заболеваемости бактериальной пневмонией в этой популяции [Уегдйеке апб Вегк (1983), Мебюше (ВаШтоте), 62: 271-285].
Основные клинические синдромы, вызываемые 8.рпеитошае, хорошо известны и изучены во всех стандартных медицинских руководствах (Ребкоп Ό.8., Миксйег Ό.Μ. В: Р1о1к1п 8.А., Отепк1еш \У.А. (ебк.). Уассшек, 4‘ь ебйюп. Р1и1абе1р1иа\УВ 8аипбегк Со., 2004а: 529-588). Например, инвазивное пневмококковое заболевание (1РИ) определяется как любая инфекция, при которой из крови или другого обычно стерильного места выделяют 8.рпеитошае (Миксйег Ό.Μ. 81тер1ососсик рпеитошае. В: Мапбе11 С.Ь., Вейлей РЕ., Эо1ш К. (ебк). Ртшар1ек апб Ртасбсе оГ 1пГес1юик б1кеакек (54Ь еб.). №\ν Уотк, СйитсйШ ЬМпдкФпе, 2001, р. 2128-2147). Признано, что хроническая обструктивная болезнь легких (СОРЭ) включает в себя несколько состояний (обструкцию дыхательных путей, хронический бронхит, бронхиолит или заболевание малых дыхательных путей и эмфизему), которые часто сосуществуют друг
- 1 014649 с другом. Пациенты страдают от обострений своего состояния, обычно ассоциированных с возросшей одышкой, и часто имеют усиленный кашель, в результате которого может продуцироваться слизь или гнойная мокрота (ЛУбюп. Еиг. Кекрп. 1., 2001, 17: 995-1007). Физиологически СОРЭ определяют по наличию необратимой или частично обратимой обструкции дыхательных путей у пациентов с хроническим бронхитом и/или эмфиземой (Стандарты диагностики и лечения пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Американское торакальное общество (31апбагб8 Рог 1Пе άίαβηοδίδ апб саге οί рабепй \νί11ι οΙίΓοηίο оЬ51гис11уе ри1топагу бщеаке. Атепсап Тйогаас 3ос1е1у. Ат. 1. Кекрп. Сгй. Саге Меб., 1995 Νον.; 152 (5 Р1. 2): 3. 77-121)). Причиной осложнений СОРЭ часто является бактериальная (например, пневмококковая) инфекция (3е11п 3., Мигрйу Т.Е. Вас(ег1а1 шРесбоп ш сйгошс оЬ^гисбте ри1топагу б^еаке ш 2000: а 51а1е-оГ-1йе-аг1 гет1е\т. С1ш. МюгоЬюР Кет. 2001 Арг.; 14(2): 336-63).
Поэтому целью настоящего изобретения является разработка улучшенной композиции конъюгатной вакцины на основе полисахаридов 31гер1ососси8 рпеитошае многих серотипов.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (уровни анти-Р3 1дС после двух инокуляций (рой-П)). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность 11-валентного конъюгата у пожилых макак-резус. Более светлые столбцы представляют собой СМС (средние геометрические концентрации) после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в алюминий-фосфатном адъюванте. Более темные столбцы представляют собой СМС после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в адъюванте С.
Фиг. 2. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (частота встречаемости анти-Р33 В-клеток памяти ро81-П). Гистограмма, на которой продемонстрированы В-клетки памяти в отношении Р33 после инокуляции 11-валентного конъюгата в адъюванте С или алюминий-фосфатном адъюванте.
Фиг. 3. Р319Е-иммуногенность у Ва1Ь/С мышей (рой-Ш уровни 1дС). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 19Е у Ва1Ь/С мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных бР1у конъюгатов.
Фиг. 4. Р322Е-иммуногенность у Ва1Ь/С мышей (рой-Ш уровни 1дС). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 22Е у Ва1Ь/С мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных Р111Э конъюгатов.
Фиг. 5. Уровни сывороточных анти-Р3 1дС антител. Гистограмма, на которой продемонстрирован анти-22Е ЦС-ответ у Ва1Ь/С мышей.
Фиг. 6. Опсонофагоцитарные титры. Гистограмма, на которой продемонстрированы анти-22Е опсонофагоцитарные титры у Ва1Ь/С мышей.
Фиг. 7. Сравнение 1дС-ответов, индуцированных при использовании новых адъювантов, по сравнению с ответом, вызываемым при использовании А1РО4. Гистограмма для сравнения 1дС-ответов, индуцированных у молодых С57В1 мышей после иммунизации 13-валентной конъюгатной вакциной, приготовленной в разных адъювантах.
Фиг. 8. Защитная эффективность комбинации белков РйФ+бР1у против легочной колонизации типом 19Е у макак-резус. Гистограмма, на которой продемонстрирована защитная эффективность разных вакцинных комбинаций в модели пневмонии у обезьян.
Фиг. 9. Сывороточный анти-РйРО 1дС-ответ. Гистограмма, на которой продемонстрированы антиРЫЭ 1дС-ответы у Ва1Ь/С мышей после иммунизации конъюгатами 22Е-РН1Э или 22Ρ-ΛΗ-ΡΗΙΩ.
Фиг. 10. Защита против контрольного заражения пневмококками типа 4 у мышей после иммунизации 22Е-РЙЮ или 22Е-АН-РЙРО.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция для младенцев, содержащая поливалентную вакцину против 31гер1ососси5 рпеитошае, содержащую два или более (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) коньюгата капсульных сахаридов разных серотипов, где указанная композиция содержит конъюгат сахарида 22Е.
Хотя детская инфекция пневмококком серотипа 22Е не является широко распространенной, авторы изобретения полагают, что присутствие 22Е в пневмококковой вакцине для детей будет благоприятным в индуцировании иммунитета у населения, так что можно предупредить или уменьшить тяжесть такого серьезного заболевания, вызываемого этим серотипом (такого как пневмония и/или инвазивное пневмококковое заболевание (РРИ), и/или обострения хронического обструктивного заболевания легких (СОРИ)) у пожилых людей. Для целей данного изобретения иммунизация человека-реципиента против обострений СОРИ, или лечение или предупреждение обострений СОРИ, или уменьшение тяжести обострений СОРИ относится к уменьшению возникновения или частоты обострений СОРИ (например, уменьшение частоты на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% или более) либо уменьшению тяжести обострений СОРИ, как определено выше, например, в группе пациентов, иммунизированных композициями или вакцинами по изобретению.
- 2 014649
Таким образом, в одном из воплощений предложен способ предупреждения (или уменьшения его тяжести) пневмококкового заболевания, вызываемого инфекцией 81гер1ососси5 рпеитошае серотипа 22Р, у пожилых людей, включающий введение ребенку (или детской популяции) иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по изобретению. Иммуногенную композициию или вакцину по изобретению в изготовлении лекарственного средства применяют для предупреждения или уменьшения тяжести заболевания, вызываемого инфекцией 81гер1ососси5 рпеитошае сертипа 22Т, у пожилых пациентов, где иммунопротективную дозу композиции или вакцины вводят младенцу (или детской популяции).
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты капсульных сахаридов 81гер!ососси5 рпеитошае серогрупп 19А и 19Р, возможно где 19А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, а 19Р конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином.
Термин капсульный сахарид включает капсульные полисахариды и олигосахариды, полученные из капсульного полисахарида. Олигосахарид содержит по меньшей мере 4 сахарных остатка.
Термин бактериальный анатоксин включает бактериальные токсины, которые инактивированы либо посредством генетической мутации, химической обработки, либо посредством конъюгации. Подходящие бактериальные анатоксины включают столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, коклюшный анатоксин, бактериальные цитолизины или пневмолизин. Описаны мутации пневмолизина (Р1у), которые уменьшают токсичность пневмолизина (\УО 90/06951, XVО 99/03884). Аналогично, известны генетические мутации дифтерийного токсина, уменьшающие его токсичность (см. ниже). Генетически детоксифицированные аналоги дифтерийного токсина включают СВМ197 и другие мутанты, описанные в И8 4709017, И8 5843711, И8 5601827 и И8 5917017. СВМ197 представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически не отличимую от дифтерийного токсина. СКМ197 продуцируется С.б|р11111епае. инфицированной нетоксикогенным фагом 31971ох, созданным посредством нитрозогуанидинового мутагенеза токсикогенного коринефага Ь (ИсЫба е! а1. Иа!иге Νο\ν Вю1о§у (1971), 233: 8-11). Белок СКМ197 имеет такую же молекулярную массу, как и дифтерийный токсин, но отличается от него заменой одного основания в структурном гене. Это приводит к замене аминокислоты глицина на глутамин в положении 52, что делает фрагмент А неспособным связываться с ΝΑΌ и, следовательно, нетоксичным (Раррепйетег 1977, Апп. Веу., Вюсйет. 46; 69-94, Варриой Аррйеб апб Епу1гоптеп1а1 М1сгоЬю1о§у, 8ер1. 1983, р. 560-564).
Первый и второй бактериальные анатоксины могут быть одинаковыми или разными. Когда первый и второй бактериальные токсины разные, тогда это означает, что они имеют разные аминокислотные последовательности.
Например, 19А и 19Р могут быть конъюгированы со столбнячным анатоксином и столбнячным анатоксином, дифтерийным анатоксином и дифтерийным анатоксином; Сгт197 и СВМ197, пневмолизином и пневмолизином, столбнячным анатоксином и дифтерийным анатоксином; столбнячным анатоксином и СВМ197; столбнячным анатоксином и пневмолизином; дифтерийным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и СВМ197, дифтерийным анатоксином и пневмолизином; СВМ197 и столбнячным анатоксином, СВМ197 и дифтерийным анатоксином; СВМ197 и пневмолизином; пневмолизином и столбнячным анатоксином; пневмолизином и дифтерийным анатоксином или пневмолизином и СВМ197 соответственно.
В одном воплощении в дополнение к сахаридному конъюгату 8.рпеитоп1ае кассйапбе 22Р (и возможно 19А и 19Р) иммуногенная композиция дополнительно содержит конъюгаты капсульных сахаридов 8.рпеитошае 4, 6В, 9У, 14, 18С и 23Р.
В одном воплощении в дополнение к сахаридному конъюгату 8.рпеитошае 22Р (и возможно 19А и 19Р) иммуногенная композиция дополнительно содержит конъюгаты капсульных сахаридов 8.рпеитошае 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С и 23Р.
В одном воплощении в дополнение к сахаридному конъюгату 8.рпеитошае 22Р (и возможно 19А и 19Р) иммуногенная композиция дополнительно содержит конъюгаты капсульных сахаридов 8.рпеитошае 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 22Р и 23Р.
В одном воплощении в дополнение к сахаридному конъюгату 8.рпеитошае 22Р (и возможно 19А и 19Р) иммуногенная композиция дополнительно содержит конъюгаты капсульных сахаридов 8.рпеитошае 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 22Р и 23Р.
В одном воплощении в дополнение к сахаридному конъюгату 8.рпеитошае 22Р (и возможно 19А и 19Р) иммуногенная композиция дополнительно содержит конъюгаты капсульных сахаридов 8.рпеитошае 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 22Р и 23Р.
Типично вакцина против 81гер1ососси5 рпеитошае по настоящему изобретению содержит антигены капсульного сахарида (предпочтительно конъюгированные), где сахариды происходят по меньшей мере из десяти серотипов 8.рпеитошае. Количество капсульных сахаридов 8.рпеитошае может варьировать от 10 разных серотипов (или У, валентностей) до 23 разных серотипов (23У).
В одном из воплощений существуют 10, 11, 12, 13, 14 или 15 разных серотипов.
В другом воплощении по изобретению вакцина может содержать конъюгированные сахариды 8.рпеитошае и неконъюгированные сахариды 8.рпеитошае.
- 3 014649
Предпочтительно, чтобы общее число сахаридных серотипов было меньше или равно 23. Например, изобретение может содержать 10 конъюгированных серотипов и 13 неконъюгированных сахаридов. Аналогично, вакцина может содержать соответственно 11, 12, 13, 14 или 16 конъюгированных сахаридов и 12, 11, 10, 9 или 7 неконъюгированных сахаридов.
В одном из воплощений поливалентная пневмококковая вакцина по изобретению будет выбрана из следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р, хотя очевидно, что один или два других серотипа могут быть заменены в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и географического места, где эту вакцину будут вводить. Например,
10- валентная вакцина может содержать полисахариды серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р;
11- валентная вакцина также может содержать сахариды серотипа 3;
12- или 13-валентная вакцина для детей (младенцев) также может включать 10- или 11-валентный препарат, дополненный серотипами 6А и 19А, или 6А и 22Р, или 19А и 22Р, или 6А и 15В, или 19А и 15В, или 22Р и 15В, где 13-валентная вакцина для пожилых людей может включать 11-валентный препарат, дополненный серотипами 19А и 22Р, 8 и 12Р, или 8 и 15В, или 8 и 19А, или 8 и 22Р, или 12Р и 15В, или 19А, или 12Р и 22Р, или 15В и 19А, или 15В и 22Р;
14-валентная вакцина для детей может включать 10-валентный препарат, описанный выше, дополненный серотипами 3, 6А, 19А и 22Р; серотипами 6А, 8, 19А и 22Р; серотипами 6А, 12Р, 19А и 22Р; серотипами 6А, 15В, 19А и 22Р; серотипами 3, 8, 19А и 22Р; серотипами 3, 12Р, 19А и 22Р; серотипами 3, 15В, 19А и 22Р; серотипами 3, 6А, 8 и 22Р; серотипами 3, 6А, 12Р и 22Р или серотипами 3, 6А, 15В и 22Р.
В одном воплощении композиция включает капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (предпочтительно конъюгированные).
В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 11 сахаридных антигенов (предпочтительно конъюгированных), например капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р.
В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 12 или 13 сахаридных антигенов, например вакцина может содержать капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р, или капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р, хотя и другие сахаридные антигены, например 23-валентной вакцины (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11 А, 12Р, 14, 15В, 17С, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р), также охвачены изобретением.
Вакцина по настоящему изобретению может содержать белок Ό (ΡΌ) из НаеторЫ1и5 тПиепхае (см., например, ЕР 0594610). НаеторЫ1и5 тПиепхае представляет собой организм-возбудитель среднего отита, и авторы настоящего изобретения показали, что включение этого белка в вакцину на основе 81гер1ососси5 рпеитошае будет обеспечивать уровень защиты в отношении среднего отита, связанного с НаеторЫ1и5 тПиепхае (ссылка на публикацию РОЕТ). В одном из воплощений вакцинная композиция содержит белок Ό (ΡΌ). В одном аспекте ΡΌ присутствует в качестве белка-носителя одного или более сахаридов. В другом аспекте ΡΌ может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В следующем аспекте белок Ό присутствует как в качестве белка-носителя, так и в виде свободного белка. Белок Ό может быть использован в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (\УО 0056360). В следующем аспекте белок Ό представлен в качестве белка-носителя для большинства сахаридов, например 6, 7, 8, 9 или более сахаридов могут быть конъюгированы с белком Ό. В этом аспекте белок Ό также может быть представлен в виде свободного белка.
Вакцина по настоящему изобретению содержит два или более разных типов белка-носителя. Каждый тип белка-носителя может выступать в качестве носителя более чем для одного сахарида, причем сахариды могут быть одинаковыми или разными. Например, серотипы 3 и 4 могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном из воплощений два или более разных сахаридов могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя.
Любые капсульные сахариды 81гер1ососси5 рпеитошае, присутствующие в иммуногенной композиции по изобретению, могут быть конъюгированы с белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, ΌΤ, СК.М197. фрагмента С ТТ, ΡΡίΌ, слияний ΡΡίΌΕ (в частности, описанных в \УО 01/98334 и \УО 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка Ό. Более полный перечень белковых носителей, которые могут быть использованы в конъюгатах по изобретению, представлен ниже.
Белок-носитель, конъюгированный с одним или более капсульными сахаридами 8.рпеитошае в конъюгатах, присутствующих в иммуногенных композициях по изобретению, возможно является членом белков полигистидинового триадного семейства (ΡΡ1), их фрагментами или слитыми белками. Белки ΡΡ1Α, ΡΡίΒ, Ρ111Ω или Ρ111Ε могут иметь аминокислотную последовательность, идентичную на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% последовательности, раскрытой в \УО 00/37105 или \УО 00/39299 (например, с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 из 8ΕΟ ΙΌ NО: 4 в \УО 00/37105 для ΡΠΌ). Напри
- 4 014649 мер, слитые белки состоят из полноразмерных 2, 3 или 4 РЫЛ, РЫВ, РЫГО, РЫБ или их фрагментов. Примерами слитых белков являются РЫА/В, РЫАГО, РЫЛ/Е, РЫВ/А, РЫВ/Э, РЫВ/Е, РЫГО/А, РЫГО/В, РЫГО/Е, РЫЕ/А, РЫЕ/В и РЫЕ/Э, причем белки связаны с белком, упомянутым первым на Ν-конце (см., например, АО 01/98334).
Там, где используются фрагменты РЫ-белков (по отдельности или в виде части слитого белка), каждый фрагмент возможно содержит один или более чем один гистидиновый триадный мотив и/или участок двойной спирали таких полипептидов. Гистидиновый триадный мотив представляет собой часть полипептида, имеющего последовательность НххНхН, где Н является гистидином; х является аминокислотой, отличной от гистидина. Участок двойной спирали представляет собой участок, спрогнозированный на основании алгоритма Собк (Ьирик, А. е! а1. (1991), Зс1еисе 252: 1162-1164).
В одном из воплощений этот или каждый фрагмент включает один или более чем один гистидиновый триадный мотив, а также по меньшей мере один участок двойной спирали.
В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 гистидиновых триадных мотивов (возможно с нативной РЫ! последовательностью между 2 или более триадами либо внутритриадной последовательностью, более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентичной нативной внутритриадной РЫ-последовательности пневмококков, например внутритриадной последовательности, показанной в ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 4 из АО 00/37105 для РЫГО).
В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3 или 4 участка двойной спирали.
В одном из воплощений РЫ-белок, раскрытый в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), существующие в природе варианты РЫ-белка и иммуногенные фрагменты РЫ-белка (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в АО 00/37105 или АО 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфический для аминокислотной последовательности, указанной в АО 00/37105 или АО 00/39299).
В частности, термин РЫГО, как он использован в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), существующие в природе варианты РЫГО и иммуногенные фрагменты Р11ГО (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности РЫГО в АО 00/37105 или АО 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для Р11ГО аминокислотной последовательности, указанной в АО 00/37105 или АО 00/39299 (например, ЗЕТ) ГО 4 из АО 00/37105 для РЫВ).
Если белковый носитель является одинаковым для двух или более сахаридов в композиции, эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (при этом молекулы носителя будут иметь еще два разных сахарида, конъюгированных с ним) [см., например, АО 04/083251]. Альтернативно, каждый из сахаридов по отдельности может быть конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (при этом с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован только один тип сахарида).
Примерами белков-носителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются ΌΤ (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмент С из ТТ, ΌΤ СИМ197 (мутант ΌΤ), другие точечные мутанты ΌΤ, такие как СИМ176, СИМ228, СИМ 45 (ИсЫба е! а1. 1. Вю1. СЫет. 218: 3838-3844, 1973); СИМ 9, СИМ 45, СИМ 102, СИМ 103 и СИМ107, и другие мутации, описанные в №сйо11к аиб Уои1е, СеиебсаПу Еидтеегеб Τοχίηκ, Еб.: Егапке1, Маесе1 Эеккег 1пс., 1992; делеция или мутация С1и-148 на Акр, Сш или Зег и/или А1а 158 на С1у и другие мутации, раскрытые в ИЗ 4709017 или ИЗ 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Ьук 516, Ьук 526, РЫе 530 и/или Ьук 534 и другие мутации, раскрытые в ИЗ 5917017 или ИЗ 6455673; или фрагмент, раскрытый в ИЗ 5843711, пневмококковый пневмолизин (Кио е! а1. (1995) ЫГесЕ 1ттии. 63: 2706-13), включая Р1у, детоксифицированный каким-либо образом, например бРЬУ-СМВЗ (СМВЗ означает №[д-малеимидобутирилокси]сульфосукцинимидный эфир) (АО 04081515, РСТ/ЕР2005/010258) или бРЬУ-формол, РЫХ, включая РЫА, РЫВ, РЫЫ, РЫЕ, и слитые конструкции РЫ-белков, например слитые конструкции РЫГОЕ, слитые конструкции РЫВЕ (АО 01/98334 и АО 03/54007) (РЫ А-Е описаны более подробно ниже), ОМРС (менингококковый белок наружной мембраны - обычно экстрагируемый из Ν. тешидЫбщ серогруппы В - ЕР 0372501), РогВ (протохлорфиллид-оксидоредуктаза В) (из Ν. тешидйтбк), РЭ (белок Ό НаеторЫ1ик шПиепхае - см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (АО 93/17712, АО 94/03208), коклюшные белки (АО 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, ростовые факторы или гормоны (АО 91/01146), искусственные белки, содержащие многочисленные человеческие СГО4' Т-клеточные эпитопы из различных антигенов, происходящих из патогенов (Еа1ищ е! а1. (2001), Еиг. 1. 1ттиио1. 31: 3816-3824), такие как белок Ν19 (Вага1бо1 е! а1. (2004), 1Ыес!. 1ттии. 72:
- 5 014649
4884-7), пневмококковый поверхностный белок РкрЛ (\УО 02/091998), железосвязывающие белки (\УО 01/72337), токсин А или В из С.й1£йсйс (\УО 00/61761). В Ыиткка с1 а1., РсЙ1а1г1с 1п£ссйои8 ОЕса^с 1оитпа1, 2004 №у. 23(11): 1008-14 описана 11-валентная пневмококковая вакцина со всеми серотипами, конъюгированными с ΡΌ. Однако авторы настоящего изобретения показали, что опсонофагоцитарная активность была улучшенной в отношении антител, индуцированных конъюгатами, имеющими 19Р, конъюгированный с ΌΤ, по сравнению с 19Р, конъюгированным с ΡΌ. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что более высокая перекрестная реактивность в отношении 19А наблюдается при использовании 19Р, конъюгированного с ΌΤ.
Следовательно, особенностью композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19Р конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ, пневмолизином, ΌΤ или СЯМ 197. В одном из аспектов серотип 19Р конъюгирован с ΌΤ.
Еще одна особенность изобретения заключается также в том, что серотип 19А конъюгирован с бактериальным анатоксином, например пневмолизином, ΌΤ или СЯМ197.
Все остальные сахаридные серотипы иммуногенной композиции могут быть конъюгированы с одним или более белком-носителем, не являющимся ΌΤ (т.е. только 19Е конъюгирован с ΌΤ), или могут быть распределены между одним или более белками-носителями, не являющимися ΌΤ, и самим ΌΤ.
В одном воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, а все остальные серотипы конъюгированы с ΡΌ.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ и ТТ, или ΌΤ, или СЯМ197.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197 и не более чем один сахарид конъюгирован с ТТ.
В одном аспекте этого воплощения одним указанным сахаридом является 18С или 12Е.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197 и не более чем два сахарида конъюгированы с ТТ.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и ΌΤ или СЯМ197.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и пневмолизином.
В еще одном воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и СЯМ197.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ω или слитым белком Ρ111Ω/Ε.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ω или слитым белком Ρ111Ω/Ε.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, еще один сахарид конъюгирован с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с Ρ111Ω или Ρ111Ω/Ε. а все остальные сахариды конъюгированы с ΡΌ.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЯМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином, еще один сахарид конъюгирован с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с пневмолизином, еще 2 других сахарида конъюгированы с Ρ111Ω или ΡΗίΌ/Ε, а все остальные сахариды конъюгированы с ΡΌ.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит белок Ό из НасшорИйик тПисп/ас. В этом воплощении, если ΡΌ не является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования с любыми сахаридами, отличными от 19Е, например 19Е конъюгирован с ΌΤ, в то время как другие серотипы конъюгированы с одним или более другими белками-носителями, не являющимися ΡΌ, тогда ΡΌ будет присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. Если ΡΌ является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования сахаридов, отличных от 19Е, тогда ΡΌ возможно может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка
Термин сахарид в данном описании может указывать на полисахарид или олигосахарид и включает в себя их оба. Полисахариды выделяют из бактерий и они могут быть до некоторой степени доведены до определенного размера известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525) и предпочтительно микрофлюидизацией. Полисахариды могут быть доведены до определенного размера с целью снижения вязкости полисахаридных образцов и/или для улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся единиц (обычно 5-30 повторяющихся единиц) и обычно представляют собой гидролизованные полисахариды.
Капсульные полисахариды 81гср1ососсик рпсишошас содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать вплоть до 8 сахарных остатков. Обзор по олигосахаридным единицам ключевых серотипов 81гср1ососсп8 рпсишошас см. в 1ΟΝΕ8, СйпкЮрйст, Уассшск Ьаксй оп 111с сс11 кигГасс сатЬойуйгаЬск о£ раЮдсшс Ьас1спа. Ап. Асай. Вгак. С1спс., 1ипс 2005, νо1. 77, № 2, р. 293-324. Ι88Ν 0001-3765. В одном воплощении капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, однако в других воплощениях это может быть одна олигосахаридная единица
- 6 014649 или более короткая, чем длина нативной цепи, сахаридная цепь из повторяющихся олигосахаридных единиц. В одном воплощении все сахариды, присутствующие в вакцине, являются полисахаридами. Полноразмерные полисахариды могут быть доведены до определенного размера, т.е. их размер может быть уменьшен различными способами, такими как обработка посредством кислотного гидролиза, обработка перекисью водорода, уменьшение размера с помощью ешпЫПех® с последующей обработкой перекисью водорода для образования олигосахаридных фрагментов или микрофлюидизация.
Авторы изобретения также отмечают, что в данной области техники внимание было сфокусировано на применении олигосахаридов для облегчения получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружили, что в результате использования нативных или слегка уменьшенных в размере полисахаридных конъюгатов может быть реализовано одно или более из следующих преимуществ:
1) конъюгат с высокой иммуногенностью, являющийся фильтруемым;
2) соотношение полисахарида и белка в конъюгате может быть изменено таким образом, чтобы увеличить отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате (что может влиять на эффект супрессии носителем);
3) иммуногенные конъюгаты, имеющие склонность к гидролизу, могут быть стабилизированы посредством применения больших по размеру сахаридов для конъюгирования.
Применение больших по размеру полисахаридов может приводить к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. В конъюгатных вакцинах, описанных в предшествующем уровне техники, имеется тенденция к деполимеризации полисахаридов перед конъюгированием для улучшения конъюгирования. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сахаридные конъюгатные вакцины, сохраняющие больший размер сахарида, могут вызывать хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания.
Таким образом, иммуногенная композиция по изобретению может содержать один или более сахаридный конъюгат, где средний размер (например, средневзвешенная молекулярная масса; М„) каждого сахарида перед конъюгированием составляет более 80, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 кДа.
В одном воплощении один или более сахаридный конъюгат по изобретению имеет средний размер сахарида перед конъюгированием, равный 50-1600, 80-1400, 100-1000, 150-500 или 200-400 кДа (отметим, что когда средний размер представляет собой М„, единицы кДа следует заменить в данном описании на х103). В одном воплощении конъюгат после конъюгирования должен легко фильтроваться через фильтр 0,2 мкм, так чтобы после фильтрации получался выход более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрации.
Для целей данного изобретения нативный полисахарид относится к сахариду, который не был подвергнут обработке (например, последующей очистке), целью которой является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может стать немного меньшим по размеру в ходе обычных процедур очистки. Такой сахарид все еще является нативным. Только если полисахарид был подвергнут процедурам уменьшения размера, такой полисахарид не считается нативным.
Для целей данного изобретения уменьшенный в размере вплоть до 2 раз означает, что сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого сахарида, но с сохранением размера, равного более чем половина размера нативного полисахарида. х3, х4 и т.д. следует интерпретировать таким же образом, т.е. сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого полисахарида, но с сохранением размера, равного более чем треть, четверть и т.д. размера нативного полисахарида.
В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 81тер1ососси5 рпеитошае по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид Б.рпеитошае представляет собой нативный полисахарид.
В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 81тер1ососси5 рпеитошае по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все сахариды Б.рпеитошае уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз. В одном воплощении этого аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более, уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.
Молекулярная масса или средняя молекулярная масса (или размер) сахарида в данном описании относится к средневзвешенной молекулярной массе (М„) сахарида, измеренной до конъюгирования, и ее измеряют с помощью МАЬЬ8 (многоуглового рассеяния лазерного света).
Методика МАЬЬ8 хорошо известна в данной области техники, и ее обычно выполняют, как описано в примере 2. Для МАЬЬБ-анализа пневмококковых сахаридов можно использовать в комбинации две колонки (Т8КС6000 и 5000Р^х1) и сахариды элюируют в воде. Сахариды детектируют, используя детектор рассеяния света (например, \Ууа11 Эаип Ό8Ρ, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и инферометрический рефрактометр (например, \Ууа11 ОШаЬ Ό8Ρ, оборудованный ячейкой Р100 и красным светофильтром на 498 нм).
В одном из воплощений сахариды 8.рпеитошае представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, размер которых был уменьшен в процессе обычного процесса экстракции.
- 7 014649
В одном из воплощений сахариды 8.рпеитошае уменьшены в размере посредством механического расщепления, например микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Микрофлюидизация и воздействие ультразвука имеют преимущество, уменьшая размер более крупных нативных полисахаридов в степени, достаточной для получения фильтруемого конъюгата. Уменьшение в размере осуществляют не более чем в 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 или 2 раза.
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты 8.рпеитошае, которые приготовлены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые уменьшены в размере не более чем в 20 раз. В одном аспекте этого воплощения большая часть сахаридов, например 6, 7, 8 или более, уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5 или 6 раз.
В одном из воплощений сахарид 8ХгерХососси5 риеитошае конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоновокислотную группу, две реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные карбоновокислотные группы. Линкер имеет, например, 4-20, 4-12, 5-10 атомов углерода. Возможным линкером является ΆΌΗ (дигидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают В-пропионамидо (\УО 00/10599), нитрофенилэтиламин (Сегег е! а1. (1979), Меб. М1сгоЬю1. 1ттипо1. 165: 171-288), галогеноалкилгалогениды (И8 4057685), гликозидные связи (И8 4673574, И8 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (И8 4459286).
В одном из воплощений в качестве линкера для конъюгирования сахарида из серотипа 18С используют ΆΌΗ.
В одном из воплощений в качестве линкера для конъюгирования сахарида из серотипа 22Р используют ΆΌΗ.
Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, могут быть получены любым известным методом сочетания. Способ конъюгирования может быть основан на активации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (СЭАР) с образованием сложного цианатного эфира. Таким образом, активированный сахарид может быть подвергнут сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно связать с носителем через простую тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с малеимид-активированным белком-носителем (например, с использованием СМВ8) или галогеноацетилированным белком-носителем (например, с использованием иодацетимида [например, этил-йодацетимида НС1] или Ν-сукцинимидил-бромацетат или 81АВ (И-сукцинимидил-(4-йодацетат)аминобензоат), или 81А (Ν-сукцинимидил-йодацетат), или 8ВАР (№сукцинимидил-3-(бромацетатамидо)пропионат)). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно полученный посредством СЭАР-химии) подвергают сочетанию с гексан-диамином или ΑΏΗ и амино-производный сахарид конъюгируют с белком-носителем, используя карбодиимидную (например, БОАС или БОС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)) химию, через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке \¥О 93/15760 (ИпЛогтеб 8егу1се§ Ишуегайу) и \УО 95/08348 и \УО 96/29094.
В других подходящих методиках используются карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборнан, паранитробензойная кислота, Ν-гидроксисукцинимид (ΝΗ8), 8-ΝΗ8 (сульфо-ΝΗδ), БОС, ΤδΤϋ (О-(№сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат). Многие методики описаны в XV О 98/42721. В конъюгирование может быть вовлечен карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с СЭ1 (1,1'-карбонилдиимидазол) (ВеХ1хе11 е! а1. 1. Вю1. С1хет. 1979, 254: 2572-4; ^ат е! а1. 1. ОхготаХощ. 1981, 218: 509-18) и последующего взаимодействия с белком с образованием карбаматной связи. Этот способ может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможное введение защиты/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с СЭ1 с образованием СЭ1-карбаматного промежуточного соединения и сочетание СЭ1-карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.
Конъюгаты также могут быть получены методами прямого восстановительного аминирования, как описано в И8 4365170 Депшпдк) и И8 4673574 (Апбегаоп). Другие методы описаны в ЕР 0161188, ЕР 208375 и ЕР 0477508.
Другой способ включает сочетание активированного бромцианом (или СЭАР) сахарида, дериватизированного с использованием дигидразида адипиновой кислоты (АОИ), с белковым носителем посредством карбодиимидной конденсации (Сйи С. е! а1. 1пГесХ. 1ттипйу, 1983, 245-256), например с использованием ЕЭАС.
В одном из воплощений гидроксильную группу (предпочтительно активированную гидроксильную группу, например гидроксильную группу, активированную с целью получения цианатного сложного эфира [например, используя СЭАР|) на сахариде связывают с аминогруппой или карбоксильной группой на белке либо непосредственно, либо опосредовано (через линкер). Если присутствует линкер, то гидроксильную группу на сахариде предпочтительно связывают с аминогруппой на линкере, например ис
- 8 014649 пользуя СПЛР-конъюгирование. Другая аминогруппа в линкере (например, ΆΌΗ) может быть конъюгирована с группой карбоновой кислоты на белке, например, с использованием карбодиимидной химии, например путем использования ΕΩΛΟ. В одном из воплощений пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) конъюгируют с линкером до того, как линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно, линкер может быть конъюгирован с носителем до конъюгирования с сахаридом.
Также можно применять комбинацию методик, при этом некоторые конъюгаты сахарид-белок получают с использованием ΟΌΑΡ, а некоторые - путем восстановительного аминирования.
В общем случае для связывания/конъюгирования могут быть использованы следующие типы химических групп на белковом носителе:
а) карбоксильная (например, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу связывают с аминогруппами на сахаридах непосредственно или с аминогруппой на линкере, используя карбодиимидную химию, например ΕΌΑΟ;
б) аминогруппа (например, через лизин). В одном воплощении эту группу связывают с карбоксильными группами на сахаридах непосредственно или с карбоксильной группой на линкере, используя карбодиимидную химию, например ΕΌΑΟ. В другом воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными ΟΌΑΡ или ΟΝΒτ на сахаридах непосредственно или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими сукцинимидную эфирную группу;
в) сульфгидрил (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу связывают с бром- или хлор-ацетилированным сахаридом или линкером, используя малеимидную химию. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
г) гидроксильная группа (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
д) имидазолильная группа (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
е) гуанидильная группа (например, через аргинин);
ж) индолильная группа (например, через триптофан).
В общем случае для связывания на сахариде можно использовать следующие группы: ОН, СООН или ΝΗ2. Альдегидные группы могут быть образованы в результате разных обработок, известных в данной области техники, таких как обработка периодатом, кислотный гидролиз, обработка перекисью водорода и т.д.
Подходы на основе прямого связывания:
сахарид-ОН+ΟΝΒτ или СЭЛР^цианатный эфир+NΗ2-белок^конъюгат; сахарид-альдегид+NΗ2-белок^основание Шиффа+№СЯВН3 ^конъюгат; сахарид-СΟΟΗ+NΗ2-белок+Ε^ΑС^конъюгат;
сахарид-NΗ2+СΟΟΗ-белок+Ε^ΑС^конъюгат.
Подходы на основе непрямого связывания через спейсер (линкер):
сахарид-ОН+СЯВг или С^ΑΡ ^цианатный эфир+ΝΗ^—NΗ2^сахарид-—ЯН2+СООНбелок+Ε^ΑС^конъюгат;
сахарид-ОН+СЯВг или СОΑΡ^цианатный эфир+ΝΗ^—8Н^сахарид-—8Н+8Н-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например 8РОР(Н-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат))^сахарид-8-8-белок;
сахарид-ОН+СЯВг или С^ΑΡ^цианатный эфир+ЯН2-—8Н^сахарид-—8Н+малеимид-белок (модификация аминогрупп)^конъюгат;
сахарид-ОН+СИВт или С^ΑΡ^цианатный эфир+ЯН2-—8Н^сахарид8Н+галогенацетилированный белок^конъюгат;
сахарид-СΟΟΗ+Ε^ΑС+NΗ2-—НН2^сахарид-—NΗ2+Ε^ΑС+СΟΟΗ-белок^конъюгат;
сахарид-СΟΟΗ+Ε^ΑС+NΗ2-—8Н ^сахарид-—8Н+8Н-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например, 8РЭР)^сахарид-8-8-белок;
сахарид-СΟΟΗ+Ε^ΑС+NΗ2-—8Н ^сахарид-—8Н+малеимид-белок (модификация аминогрупп) ^-конъюгат;
сахарид-СΟΟΗ+Ε^ΑС+NΗ2-—8Н^сахарид-8Н+галогенацетилированный белок^конъюгат; сахарид-альдегид+ЯН2-—НН2^сахарид-—NΗ2+Ε^ΑС+СΟΟΗ-белок^конъюгат.
Примечание: вместо указанного выше Ε^ΑС можно использовать любой подходящий карбодиимид.
Таким образом, типами химических групп белкового носителя, которые обычно могут быть использованы для сочетания с сахаридом, являются аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы 8Н (если это приемлемо) (например, на остатках цистеина).
- 9 014649
Предпочтительно соотношение белка-носителя и сахарида 8.рпеишошае составляет от 1:5 до 5:1, например 1:0,5-4:1, 1:1-3,5:1, 1,2:1-3:1, 1,5:1-2,5:1; например 1:2-2,5:1; 1:1-2:1 (мас./мас.). В одном воплощении большинство конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или более, имеют соотношение белка-носителя к сахариду выше 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1.
В одном из воплощений по меньшей мере один сахарид 8.рпеишошае конъюгирован с белкомносителем через линкер с использованием СПАР и ЕЭАС. Например, 18С или 22Р может быть конъюгирован с белком через линкер (например, линкер с двумя группами гидразино на концах, такой как ΑΌΗ) с использованием СПАР и ЕЭЛС. как описано выше. При использовании линкера СПАР можно использовать для конъюгирования сахарида с линкером, и БОАС затем можно использовать для конъюгирования линкера с белком или, альтернативно, сначала БОАС может быть использован для конъюгирования линкера с белком, после чего СПАР может быть использован для конъюгирования линкера с сахаридом.
В общем случае иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата 0,1-20 мкг, 1-10 мкг или 1-3 мкг сахарида.
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид 8.рпеишошае в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида.
В одном из воплощений капсульные сахариды могут быть представлены в разных дозировках, например, некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 1 мкг или некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 3 мкг.
В одном из воплощений сахариды из серотипов 3, 18С и 19Р (или 4, 18С и 19Р) представлены в более высокой дозе, чем другие сахариды.
В одном аспекте этого воплощения серотипы 3, 18С и 19Р (или 4, 18С и 19Р) представлены в дозе приблизительно или точно 3 мкг, в то время как другие сахариды в иммуногенной композиции представлены в дозе приблизительно или точно 1 мкг.
Около или приблизительно определяют как нахождение в пределах больше или меньше 10% от приведенной цифры для целей данного изобретения.
В одном из воплощений по меньшей мере один из капсульных сахаридов 8.рпеишошае непосредственно конъюгирован с белком-носителем (например, с использованием одного из описанных выше химических превращений). Предпочтительно по меньшей мере один из капсульных сахаридов 8.рпеишошае непосредственно конъюгирован с использованием СПАР. В одном из воплощений большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, непосредственно связаны с белкомносителем с использованием СПАР (см. \УО 95/08348 и \УО 96/29094).
Иммуногенная композиция может содержать белки 81гер!ососси8 рпеишошае, называемые в данном описании как белки 81гер1ососсик рпеишошае по изобретению. Такие белки могут быть использованы в качестве белков-носителей, или могут быть представлены в виде свободных белков, или могут быть представлены как в качестве белков-носителей, так и в виде свободных белков. Белки 81гер!ососси8 рпеишошае по изобретению либо экспонированы на поверхности по меньшей мере в течение части жизненного цикла пневмококка, либо являются белками, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Предпочтительно белки по изобретению выбраны из следующих категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности II типа БХХС (где X представляет собой любую аминокислоту, например полигистидиновое триадное семейство (Р11Х)), холинсвязывающие белки (СЬрХ), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности I типа (например, 8р101), белки, имеющие мотив БРХТО (где X представляет собой любую аминокислоту, например 8р128, 8р130) и токсины (например, Р1у). Предпочтительными примерами среди этих категорий (или мотивов) являются следующие белки или их иммунологически функциональные эквиваленты.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере 1 белок, выбранный из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (Р11Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Бу1Х-семейства, укороченных Бу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный СЬрХ-укороченный Бу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (Р11Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Бу1Х-семейства, укороченных Бу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный СЬрХ-укороченный Бу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА и 8р128.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит два или более белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (Р11Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Бу1Х-семейства, укороченных Бу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный СЬрХ-укороченный Бу1Х, пневмолизина (Р1у) и 8р128.
Р1Ц (полигистидиновое триадное)-семейство включает белки Р11А, РЫБ, Рй1И и Р111Е. Это семейство характеризуется липидированной последовательностью, двумя доменами, разделенными пролинобогащенным участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативную активность, (3-5)-участками двойной спирали, консервативным Ν-концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестируемых штаммах пневмо
- 10 014649 кокков. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и нейсеррий. В одном из воплощений изобретения ΡΙιΙ-белок по изобретению представляет собой Ρ111Ό. Однако понятно, что термины Р111 А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также к их существующим в природе (и искусственным) вариантам, имеющим гомологию последовательностей, которая по меньшей мере на 90% идентична белкам из ссылок. Предпочтительно она идентична по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно идентична на 97%.
Что касается белков РЫХ, то РЫА раскрыт в \УО 98/18930, и также упоминается как 8р36. Как указано выше, он является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС.
Ρ111Ό раскрыт в \УО 00/37105 и также упоминается как 8ρ036Ό. Как указано выше, он также является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС.
РЫВ раскрыт в \УО 00/37105 и также упоминается как 8р036В. Другим членом РЫВ-семейства является С3-деградированный полипептид, как раскрыто в XVО 00/17370. Этот белок также принадлежит полигистидиновому триадному семейству и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в XV О 98/18930. Укороченный РЫВ (приблизительно 79 кДа) раскрыт в XV О 99/15675 и также считается членом РЫХ-семейства.
РЫЕ раскрыт в XV О 00/30299 и упоминается как ВУН-3. Когда в данном описании упоминается РЫ-белок, это означает, что могут быть использованы иммуногенные фрагменты или слитые конструкции этого РЫ-белка. Например, ссылка на РЫХ включает в себя иммуногенные фрагменты или слитые конструкции любого РЫ-белка. Ссылка на РЫЭ или РЫВ также является ссылкой на слитые конструкции РЫОЕ или РЫВЕ, которые можно обнаружить, например, в ^О 0198334.
Пневмолизин представляет собой многофункциональный токсин с явно выраженными цитолитической (гемолитической) активностью и активностью активации комплемента (РиЫпк е1 а1., Ат. Рекрг С/ίΙ. Саге Меб., 153: 1339-1346 (1996)). Этот токсин не секретируется пневмококками, но он высвобождается при лизисе пневмококков под действием аутолизина. Его эффекты включают, например, стимуляцию продуцирования воспалительных цитокинов человеческими моноцитами, ингибирование пульсации ресничек на эпителии дыхательных путей человека и уменьшение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее явным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, который включает связывание с холестерином. Поскольку он является токсином, его необходимо детоксифицировать (т.е. сделать нетоксичным для человека, получающего его в дозе, пригодной для защиты), до того как его можно будет вводить ίη νίνο. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмолизина известны в данной области техники. См., например, \ν;·ι11<0Γ е1 а1. Шес!. ^тип., 55: 11841189 (1987), Мйсйе11 е! а1. ВюсЫт. ВюрЬуз. Ас!а, 1007: 67-72 (1989) и Мйсйе11 е! а1. ΝΑΡ, 18: 4010 (1990). Детоксификация Р1у может быть проведена химическим образом, например обработкой формалином или обработкой глутаровым альдегидом или комбинацией обоих (^О 04081515, РСТ/ЕР2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области для различных токсинов.
Альтернативно, Р1у может быть генетически детоксифицирован. Таким образом, данное изобретение охватывает производные пневмококковых белков, которые могут быть, например, мутантными белками. Термин мутантный использован в данном описании для обозначения молекулы, подвергнутой делеции, вставке или замене одной или более аминокислоты с использованием хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза или любого другого традиционного метода. Например, как описано выше, мутантный белок Р1у может быть изменен таким образом, что он будет биологически неактивен, в то же время сохраняя свои иммуногенные эпитопы (см., например, XVО 90/06951, Веггу е! а1. !пГес1. ^тип., 67: 981-985 (1999) и ХХ'О 99/03884).
Очевидно, что используемый в данном описании термин Р1у относится к мутантному или детоксифицированному пневмолизину, подходящему для медицинского применения (т.е. нетоксичному).
Что касается семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), то члены этого семейства первоначально были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно было очистить холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки связаны нековалентными связями с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты из клеточной стенки и мембран-ассоциированной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько участков, общих для всего семейства, хотя точная природа белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьироваться. В общем случае холинсвязывающие белки содержат Ν-концевой участок (Ν), консервативные повторяющиеся участки (КТ и/или К2), пролин-обогащенный участок (Р) и консервативный холинсвязывающий участок (С), составленный из множественных повторов, который составляет приблизительно половину белка. При использовании в данной заявке термин семейство холинсвязывающих белков (СЬрХ) выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, которые идентифицированы в ^О 97/41151, РЬсА, ЗркА, РкрС, СЬрА, СЬрЭ и СЬрО. СЬрА раскрыт в ^О 97/41151. СЬрЭ и СЬрО раскрыты в ^О 00/29434. РкрС раскрыт в ^О 97/09994. РЬсА раскрыт в ^О 98/21337. 8р§А представляет собой холинсвязывающий белок, раскрытый в ^О 98/39450. Предпочтительно, чтобы холинсвязывающие белки были выбраны из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8р§А и РкрС.
- 11 014649
Другим предпочтительным воплощением являются укороченные СЬрХ, где СЬрХ определен выше, а термин укороченные относится к СЬрХ белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка (С) или более. Предпочтительно, чтобы у таких белков отсутствовал весь холинсвязывающий участок. Более предпочтительно, чтобы у таких укороченных белков отсутствовал (1) холинсвязывающий участок, а также (2) часть Ν-концевой половины данного белка, при этом оставался по меньшей мере один повторяющийся участок (К.1 или К2). Еще более предпочтительно, чтобы укороченная структура имела 2 повторяющихся участка (К1 и К2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются ΝΚ1χΚ2 и К1хК2, как проиллюстрировано в АО 99/51266 или АО 99/51188, однако другие холинсвязывающие белки, у которых отсутствует аналогичный холинсвязывающий участок, также считаются входящими в объем данного изобретения.
Ьу1Х-семейство представляет собой мембран-ассоциированные белки, связанные с лизисом клеток. Ν-концевой домен содержит холинсвязывающий(е) домен(ы), однако Ьу1Х-семейство не имеет всех признаков, обнаруженных у СЬрА-семейства, как указано выше, и, таким образом, для настоящего изобретения Ьу1Х-семейство считается отличающимся от СЬрХ-семейства. В противоположность СЬрХсемейству, С- концевой домен содержит каталитический домен Ьу1Х белкового семейства. Это семейство включает в себя Ьу1А, В и С. Что касается Ьу1Х-семейства, то Ьу1А раскрыт в КоиБа е! а1., Еиг. 1. Вюсйет., 164: 621-624 (1987). Ьу!В раскрыт в АО 98/18930, где он также обозначен как 8р46. Ьу1С также раскрыт в АО 98/18930 и также упоминается как 8р91. Предпочтительным членом этого семейства является Ьу1С.
Другим предпочтительным воплощением являются укороченные Ьу1Х. где Ьу1Х определен выше, и укороченные относится к Ьу1Х-белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка или более. Предпочтительно, чтобы у таких белков отсутствовал весь холинсвязывающий участок. Еще одним предпочтительным воплощением данного изобретения являются химерные белки (или слитые конструкции) - укороченные СЬрХ-укороченные Ьу1Х. Предпочтительно, чтобы они содержали ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2) от СЬрХ и С-концевую часть (С1егш, т.е. чтобы отсутствовали холинсвязывающие домены) от Ьу1Х (например, Ьу1СС1егш или 8р91 С1егш). Более предпочтительно СЬрХ выбран из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС. Еще более предпочтительно, чтобы он представлял собой СЬрА. Предпочтительно, чтобы Ьу1Х представлял собой Ьу1С (также упоминаемый как 8р91). Другим воплощением настоящего изобретения является укороченный РкрА или РкаА, у которого отсутствует холинсвязывающий домен (С) и который экспрессируется в виде слитого белка с Ьу1Х. Предпочтительно Ьу1Х представляет собой Ьу1С.
Что касается РкаА и РкрА, то оба известны в данной области. Например, РкаА и его варианты с трансмембранной делецией описаны в Веггу & Ра!оп, 1пГес1. 1ттип., 1996, Иес., 64(12): 5255-62. РкрА и его варианты с трансмембранной делецией раскрыты, например, в И8 5804193, XVО 92/14488 и АО 99/53940.
8р128 и 8р130 раскрыты в АО 00/76540. 8р125 является примером пневмококкового поверхностного белка с заякоренным в клеточной стенке мотивом ЬРХТС (где Х представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок из этого класса пневмококковых поверхностных белков с таким мотивом полезен в контексте данного изобретения и, следовательно, считается дополнительным белком по изобретению. Сам 8р125 раскрыт в АО 98/18930 и также известен как 2трВ - цинковая металлопротеиназа. 8р101 раскрыт в АО 98/06734 (где он упоминается как #у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью I типа. 8р133 раскрыт в АО 98/06734 (где он упоминается как #у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью I типа.
Примерами предпочтительных белковых антигенов Могахе11а са1аггйа11к, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), являются:
ОМР106 [АО 97/41731 (Ап!ех) и АО 96/34960 (РМС)];
ОМР21 или его фрагменты (АО 0018910);
ЬЬрА и/или ЬЬрВ [АО 98/55606 (РМС)];
ТЬрА и/или ТЬрВ [АО 97/13785 и АО 97/32980 (РМС)];
СорВ [Не1тшеп М., е! а1.] (1993), 1пГес1. 1ттип., 61: 2003-2010];
ИкрА1 и/или ИкрА2 [АО 93/03761 (Университет Техаса)];
ОтрСИ; НакК (РСТ/ЕР99/03824);
РИО (РСТ/ЕР99/03823);
ОМР85 (РСТ/ЕР00/01468);
11ро06 (ОВ 9917977.2);
11ро10 (ОВ 9918208.1);
11ро11 (ОВ 9918302.2);
11ро18 (ОВ 9918038.2);
Р6 (РСТ/ЕР99/03038);
Ό15 (РСТ/ЕР99/03822);
Отр1А1 (РСТ/ЕР99/06781);
- 12 014649
Н1у3 (РСТ/ЕР99/03257) и
ОтрЕ.
Примеры антигенов нетипируемых штаммов НаеторЕПик тПиепхае или их фрагментов, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), включают белок фимбрин [(И8 5766608 - ОЫо 81а1е ЕекеагсЕ РоипбаЕоп)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например, ЬВ1(£)-пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или νθ 99/64067];
ОМР26 [№О 97/01638 (Сойеск)];
Р6 [ЕР 281673 (Государственный университет Нью-Йорка)];
ТЬрА и/или ТЬрВ;
Н1а; Нк£; Нш47; Н1£; Нш\у1; Нш\у2; Нш\у3; Нш\у4; Нар;
Ό15 (№О 94/12641); Р2 и Р5 (№О 94/26304).
Кроме того, белки по изобретению могут быть с пользой скомбинированы. Под комбинированием понимается, что иммуногенная композиция включает в себя все белки из следующих комбинаций, либо в качестве белков-носителей, либо в виде свободных белков, либо смесей двух белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено ниже, оба белка могут быть использованы в качестве белковносителей, или оба белка могут быть представлены в виде свободных белков, или оба могут быть представлены в качестве носителя и в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя и свободного белка, в то время как другой представлен только в качестве белка-носителя или только в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя, а другой в виде свободного белка. Когда приведена комбинации трех белков, то существуют аналогичные возможности.
Предпочтительные комбинации включают РЕФ+МК1хК2, химерные или слитые белки РЕ!П+МЕ1хЕ2-8р91С!егт, РНЮ+Р1у, РЕФ+8р128, РЕФ+РкаА, РЕФ+РкрА, РЕΐΑ+NΕ1χΕ2, химерные или слитые белки РЕ!А+МЕ1хЕ2-8р91С!егт, РЕ!А+Р1у, РЕ!А+8р128, РЫА+РкаА, РЫА+РкрА, ΝΒ1χ Е2+Ьу!С, МЕ1хЕ2+Р8рА, МЕ1хЕ2+Р8аА, ЯЕ1хЕ2+8р128, Е1хЕ2+Ьу!С, Е1хЕ2+РкрА, Е1хЕ2+РкаА, Е1хЕ2+8р128, В1хЕ2+РЕФ, Е1хЕ2+РЕ!А, но не ограничиваются ими.
Предпочтительно ΝΕΡΕ2 (или Е1хЕ2) происходит из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно он происходит из СЬрА. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как ΕΗΙΩ+ΝΕ1 хЕ2+Р1у и РЕιΑ+NΕ1xΕ2+РЕΦ.
В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РЕФ или Р1ЦЕ в качестве белков-носителей. В другом воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РЕФ или РЕ(Е в виде свободных белков.
В независимом аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере четыре конъюгата капсульных сахаридов 8.рпеитошае, содержащих сахариды разных серотипов 8.рпеитошае, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с РЕФ или его слитым белком, и иммуногенная композиция способна вызывать эффективный иммунный ответ против Р1П1).
Эффективный иммунный ответ против РЕФ или его слитого белка измеряют, например, с помощью анализа защиты, такого как описанный в примере 15. Эффективный иммунный ответ обеспечивает по меньшей мере 40-, 50-, 60-, 70-, 80- или 90%-ное выживание через 7 дней после иммунизации гетерологическим штаммом. Поскольку иммунизирующий штамм является гетерологическим, защита достигается за счет иммунного ответа против РЕФ или его слитого белка.
Альтернативно, эффективный иммунный ответ против РЕФ измеряют с помощью ЕЬ18А (твердофазного иммуноферментного анализа), как описано в примере 14. Эффективный иммунный ответ обеспечивает 1дС ответ против РЕФ по меньшей мере при 250, 300, 350, 400, 500, 550 или 600 мг/мл СМС.
Например, иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 капсульных сахаридов 8.рпеитошае разных серотипов, конъюгированных с РЕФ или его слитым белком. Например, серотипы 22Р и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дополнительно выбранных из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 23Р и 33Р, конъюгированы с РЕФ. В одном воплощении два или три серотипа 3, 6 А и 22Р конъюгированы с РЕФ или его слитым белком.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один капсульный сахарид 8.рпеитошае, конъюгированный с РЕФ или его слитым белком через линкер, например АЭН.
В одном воплощении используют один из способов конъюгации, перечисленных ниже.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один капсульный сахарид 8.рпеитошае, конъюгированный с РЕФ или его слитым белком, где соотношение РЕФ к сахариду в конъюгате составляет от 6:1 до 1:5, от 6:1 до 2:1, от 6:1 до 2,5:1, от 6:1 до 3:1, от 6:1 до 3,5:1 (мас./мас.) или более (т.е. содержит большую долю РЕФ) 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 3,5:1 или 4,0:1 (мас./мас).
- 13 014649
В одном воплощении иммуногенная композиция содержит пневмолизин.
В настоящем изобретении также предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Вакцины по настоящему изобретению могут быть адъювантными, особенно при применении в популяции пожилых людей, а также при применении в детских популяциях. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, или фосфат алюминия, или алюминиевые квасцы, но также могут представлять собой соли других металлов, такие как соли кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных сахаридов или полифосфазены.
Предпочтительно, чтобы выбранный адъювант преимущественно индуцировал Т111-тип ответа. Такие высокие уровни цитокинов Т111-типа способствовуют индуцированию клеточно-опосредованных иммунных ответов на данный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов Тй2-типа способствовуют индуцированию гуморальных иммунных ответов на этот антиген.
Разница между иммунными ответами Т111- и Тй2-типа не является абсолютной. В действительности индивидуум будет поддерживать иммунный ответ, который описывается как преимущественно Тй1 или преимущественно Тй2. Тем не менее часто бывает удобно рассматривать семейства цитокинов в терминах, используемых в описании мышиных СЭ4 +уе Т-клеточных клонов Мосманном и Коффманом (Моктаии, Т.Н. аиб СоДшаи, К.Ь (1989) ТН1 аиб ТН2 се1к: б1ГГегеп( рабегик о! 1утрйокте кесгеДои 1еаб ΐο б1ГГегеп1 Гиис1юиа1 ргорегДек. Аиииа1 Ре\зе\\· оГ 1ттиио1о§у, 7, р. 145-173). Традиционно, ответы Тй1-типа ассоциированы с продуцированием Т-лимфоцитами цитокинов ΙΕΝ-γ (интерферон-γ) и 1Ь-2 (интерлейкин-2). Другие цитокины, часто напрямую ассоциированные с индуцированием иммунных ответов Т111-типа. не продуцируются Т-клетками, как, например 1Ь-12. Напротив, ответы Тй2-типа ассоциированы с секрецией 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10. Подходящие системы адъювантов, которые стимулируют преимущественно Тй-ответ, включают монофосфориллипид А или его производные, в частности 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3Ό-ΜΡΕ) (его получение см. в СВ 2220211 А); и комбинацию монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе либо с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло-в-воде. В таких комбинациях антиген и 3Ό-ΜΡΕ содержатся в структурах одних и тех же частиц, что позволяет осуществлять более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3Ό-ΜΡΕ способен дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена [Тйое1еи е! а1. Уассше (1998), 16: 708-14; ЕР-В1-689454].
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, которая раскрыта в \νϋ 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой 0821 погашен холестерином, как описано в νθ 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая 0821, 3Ό-ΜΡΕ и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описана в νθ 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821. Эта композиция также может содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (νθ 95/17210). Неметилированные СрС-содержащие олигонуклеотиды (νθ 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (νθ 0226757 и νθ 03507822) также являются преимущественными индукторами Тй1-ответа и подходят для использования в настоящем изобретении.
Конкретными адъювантами являются адъюванты, выбранные из группы солей металлов, эмульсий масло-в-воде, агониста То11-подобных рецепторов (в частности, агониста То11-подобного рецептора 2, агониста То11-подобного рецептора 3, агониста То11-подобного рецептора 4, агониста То11-подобного рецептора 7, агониста То11-подобного рецептора 8 и агониста То11-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций.
Адъювантом, который может быть использован с вакцинными композициями по изобретению, является пузырьковый препарат или препараты везикул наружной мембраны грамотрицательных бактериальных штаммов, например, описанные в νθ 02/09746, в частности везикулы Ктешидйгбк. Адъювантные свойства везикул можно усилить путем сохранения ЬО8 (липоолигосахарида) на их поверхности (например, посредством экстракции низкими концентрациями детергентов [например, 0-0,1%-ным дезоксихолатом]). ЬО8 могут быть детоксифицированы посредством ткЬВ(-) или йДВ(-) мутаций, рассмотренных в νθ 02/09746. Адъювантные свойства также можно усилить путем сохранения Ρο^В (и возможно удаления Ρο^А) из менингококковых везикул. Адъювантные свойства также можно усилить путем укорочения сахаридной структуры внешнего ядра ЬО8 на менингококковых везикулах, например, посредством мутации 1д!В(-), рассмотренной в νθ 2004/014417. Альтернативно, вышеупомянутые ЬО8 (например, выделенные из ткЬВ(-)- и/или 1д!В(-)-штамма) можно очистить и использовать в качестве адъюванта в композициях по изобретению.
Другой адъювант, который может быть использован с композициями по изобретению, может быть выбран из группы: сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид, алкилглюкозаминидфосфат, эмульсия масло-в-воде или их комбинации. Другим предпочтительным адъювантом является соль металла в комбинации с другим адъювантом. Предпочтительно, чтобы адъювант представлял собой агонист То11-подобного рецептора 4, в частности агонист То11-подобного рецеп
- 14 014649 тора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности 0821. Также предпочтительно, чтобы адъювантная система содержала два или более адъюванта из приведенного выше перечня. В частности, комбинации предпочтительно содержат сапониновый (например, 0821) адъювант и/или агонист То11-подобного рецептора 9, такой как СрС-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Другие предпочтительные комбинации содержат сапонин (в частности 0821) и агонист То11-подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А или его 3-деацилированное производное, 3Л-МРЬ, или сапонин (в частности, 0821) и лиганд То11-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминидфосфат.
Особенно предпочтительными адъювантами являются комбинации 3Л-МРЬ и 0821 (ЕР 0671948 В1), эмульсии масло-в-воде, содержащие 3Л-МРЕ и 0821 (νϋ 95/17210, νϋ 98/56414), или 3Л-МРЕ приготовленный в виде препарата с другими носителями (ЕР 0689454 В1). Другие предпочтительные адъювантные системы содержат комбинацию 3Ό-ΜΡΕ, 0821 и СрС олигонуклеотида, которая описана в И8 6558670, И8 6544518.
В одном воплощении адъювант представляет собой (или содержит) лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК) 4, предпочтительно агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А, или более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (3Ό-ΜΡΕ).
3Ό-ΜΡΕ может быть приобретен у 61ахо8тййК1ше Вю1одюа1з ΝοΠίι Атепса и стимулирует, главным образом, СЛ4' Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΕΝ-γ (Т111). Он может быть получен способами, раскрытыми в СВ 2220211А. С химической точки зрения он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы 3Ό-ΜΡΕ. Небольшие частицы 3Ό-ΜΡΕ имеют такой размер частиц, что их можно подвергать стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в международной заявке на патент νϋ 94/21292. Синтетические производные липида А известны и, по-видимому, являются антагонистами ТЬК. 4. Они включают, без ограничения ими:
ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетра-деканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Лглюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-О-глюкопиранозилдигидрофосфат) (νϋ 95/14026);
ОМ294 ΌΡ (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис(дигидрофосфат) (νϋ 99/64301 и νϋ 00/0462);
ОМ197 ΜΡ-Ас ΌΡ (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (νϋ 01/46127).
Другими лигандами ТЬК4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (ΑΟΡ), например, раскрытые в νϋ 9850399 или И8 6303347 (также раскрыты способы получения ΑΟΡ), или фармацевтически приемлемые соли ΑΟΡ, которые раскрыты в И8 6764840. Некоторые ΑΟΡ являются агонистами ТЬК.4, а некоторые являются антагонистами ТЬК4. Полагают, что и те и другие полезны в качестве адъювантов.
Другим предпочтительным иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является 0ш1 А и его производные. 0ш1 А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южноамериканского дерева 0ш11а.)а заропапа тойпа, и впервые был описан как обладающий адъювантной активностью Ла1здаатб и др. в 1974 г. (8арошп абщсагИз. АтсЫу. Гит Ле дезат1е УйизГогзсйипд. Уо1. 44, 8ртшдет Уег1ад, Вет1ш, р. 243-254). Очищенные фрагменты 0ш1 А были выделены с помощью НГЬС что сохраняет адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с 0ш1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известными как 0А7 и 0А21). 08-21 является природным сапонином, выделенным из коры 0ш11а)а заропапа тойпа, который индуцирует СЛ8' цитотоксические Т-клетки (СТЬ), Тй1-клетки и преимущественный 1дС2а-антительный ответ, и в контексте настоящего изобретения представляет собой предпочтительный сапонин.
Были описаны конкретные композиции 0821, которые являются особенно предпочтительными, эти композиции дополнительно содержат стерин (νϋ 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть отделены в форме мицелл, смешанных мицелл (предпочтительно, но не исключительно, с солями желчных кислот) или могут находиться в форме I8СϋΜ (иммуностимулирующий комплекс) матриц (ЕР 0109942 В1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцеобразные мультимерные комплексы либо липидные/слоевые структуры и ламеллы, когда их приготавливают вместе с холестерином или липидом, или в форме эмульсии масло-в-воде (например, как в νϋ 95/17210). Сапонины предпочтительно могут быть ассоциированы с солью металла, например гидроксидом алюминия или фосфатом алюминия (νϋ 98/15287).
Предпочтительно сапонин представлен в форме липосомы, I8СϋΜ или эмульсии масло-в-воде.
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡ^ которая раскрыта в νϋ 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой 0821 погашен холестерином, как описано в νϋ 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая в себя токоферол с 0821 и/или 3Ο-ΜΡ6· в эмульсии типа масло-в-воде или без них, описана в νϋ 95/17210. В одном вопло
- 15 014649 щении такая иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой Р821.
Кроме того, могут быть использованы иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист То11-подобного рецептора (ТЬК) 9. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению представляют собой СрС-содержащие олигонуклеотиды, предпочтительно содержащие два или более динуклеотидных СрС мотивов, отделенных по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрС представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. СрС-олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно являются дезоксинуклеотидами. В предпочтительном воплощении межнуклеотидной структурой в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или более предпочтительно фосфоротиоатная связь, хотя в объем данного изобретения включены фосфодисложноэфирная и другие межнуклеотидные связи. Также в объем изобретения включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в И8 5666153, И8 5278302 и \УО 95/26204.
Примеры предпочтительных олигонуклеотидов имеют следующие далее последовательности. Эти последовательности предпочтительно возможно содержат фосфоротиоат-модифицированные межнуклеотидные связи.
ОЛИГО 1 (81 Г) ГО N0: 1): ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826);
ОЛИГО 2 (81 Г) ГО N0: 2): ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758);
ОЛИГО 3 (81 Г) ГО N0: 3): АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС;
ОЛИГО 4 (81 Г) ГО N0: 4): ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ СТС СТТ (СрС 2006);
ОЛИГО 5 (81 Г) ГО N0: 5): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668);
ОЛИГО 6 (81 Г) ГО N0: 6): ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456).
Альтернативные СрС-содержащие олигонуклеотиды могут содержать предпочтительные последовательности, приведенные выше, в которых имеются незначительные делеции или вставки.
СрС-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники (например, см. ЕР 468520). Удобно, что такие олигонуклеотиды можно синтезировать, используя автоматизированный синтезатор.
Адъювант может представлять собой эмульсию масло-в-воде или может содержать эмульсию масло-в-воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы предпочтительно содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в данной области техники. Метаболизируемый можно определить как который может быть превращен посредством метаболизма (Иот1аиб'к Шик1та1еб Меб1са1 Икйопату, XV.В. 8апбегк Сотрапу, 25-е изд. (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животный жир или синтетическое масло, которое не токсично для реципиента и может быть превращено посредством метаболизма. Орехи, зерна и крупа являются традиционными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть этого изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла, такие как ИЕ0ВЕЕ® и др. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом масле, масле из семян пшеницы, масле из рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло ввиду того, что является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Мегск 1пбех, 10-е изд., входной № 8619).
Токолы (например, витамин Е) также часто используют в масляных эмульсионных адъювантах (ЕР 0382271 В1; И8 5667784; ν0 95/17210). Токолы, используемые в масляных эмульсиях (предпочтительно эмульсиях масло-в-воде) по изобретению, могут быть приготовлены в виде препарата, как описано в ЕР 0382271 В1, где токолы могут представлять собой дисперсии токоловых капелек, возможно содержащие эмульгатор, диаметром предпочтительно менее 1 мкм. Альтернативно, токолы можно использовать в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, описаны в данном изобретении, например описанные выше метаболизируемые масла.
Полагают, что адъюванты в виде эмульсии масло-в-воде сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843 В), кроме того, комбинации эмульсий масло-в-воде и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (ν0 95/17210; ν0 98/56414; ν0 99/12565; ν0 99/11241). Описаны другие адъюванты в виде масляных эмульсий, такие как эмульсии вода-в-масле (И8 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (И8 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют предпочтительные масляные эмульсионные системы (в частности при включении токолов) с образованием адъювантов и композиций по настоящему изобретению.
Наиболее предпочтительно масляная эмульсия (например, эмульсии масло-в-воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Твин 80, и/или стерин, например холестерин.
Предпочтительная масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) содержит метабо
- 16 014649 лизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как α-токоферол (и предпочтительно и сквален, и α-токоферол), и возможно эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Твин 80. Также может быть включен стерин (предпочтительно холестерин).
Способ приготовления эмульсии масло-в-воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание токол-содержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор РВ3/Т\УЕЕШ0'|Л1. с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники очевидно, что способ, включающий прохождение смеси дважды через иглу шприца, будет пригодным для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (установка М1103 М1сгоЯи1б1С8, максимум 50 прогонов, в течение периода времени 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (0,6 МПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85 МПа))) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для приготовления меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть проведена путем осуществления рутинных экспериментов, включающих определение параметров получаемой эмульсии до тех пор, пока не будет получен препарат с необходимым диаметром капелек масла.
В эмульсии масло-в-воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ3).
Размер капелек масла, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло-вводе, предпочтительно составляет менее 1 мкм, может находиться в основном в диапазоне 30-600 нм, предпочтительно в основном составлять приблизительно 30-500 нм в диаметре и наиболее предпочтительно в основном 150-500 нм в диаметре и в частности приблизительно 150 нм в диаметре, как измерено с помощью фотоннокорреляционной спектроскопии (РС3). В этом отношении 80% капелек масла по количеству должны находиться в указанных диапазонах, более предпочтительно более 90% и наиболее предпочтительно более 95% капелек масла по количеству находятся в диапазонах указанных размеров. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно находятся в диапазоне 0,5-20% или 2-10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если он присутствует, 2-10% α-токоферола; и 0,3-3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Предпочтительно соотношение масло (предпочтительно сквален):токол (предпочтительно α-токоферол) равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Эмульгатор, такой как Твин 80 или 3рап 85, также может присутствовать, например, на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях полезно, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
Примеры предпочтительных эмульсионных систем описаны в XVО 95/17210, XVО 99/11241 и XVО 99/12565, где раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и Твина 80, возможно приготовленные с иммуностимуляторами 0321 и/или 30-МРЬ.
Так, в особенно предпочтительном воплощении по настоящему изобретению адъювант по изобретению может дополнительно содержать другие иммуностимуляторы, такие как ЬР3 (липополисахарид) или его производные и/или сапонины. Примеры других иммуностимуляторов приведены в данном описании и в Уассше Оекщп - Т1е 3иЬипй апб Аб)итап1 Арргоаск, 1995, РЬагтасеийса1 Вю1есЬпо1о§у. Уо1. 6. Ебк. Ро\уе1Е М.Е., апб ^λγπη-ιΐ! М.Т, Р1епит Ргекк, №\ν Уогк апб Ьопбоп, Ι3ΒΝ 0-306-44867-Х.
В предпочтительном аспекте адъювант и иммуногенные композиции по изобретению содержат сапонин (предпочтительно 0321) и/или производное ЬР3 (предпочтительно 3П-МРЬ) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стерином (предпочтительно холестерином). В дополнение к этому масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) может содержать крап 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в АО 99/12565.
Обычно для введения людям сапонин (предпочтительно 0321) и/или ЬР3-производное (предпочтительно 3П-МРЬ) будут присутствовать в предназначенной для человека дозе иммуногенной композиции 1-200 мкг, например 10-100 мкг, предпочтительно 10 мкг-50 мкг на дозу. Обычно масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) будет содержать 2-10% метаболизируемого масла. Предпочтительно она будет содержать 2-10% сквалена, 2-10% α-токоферола и 0,3-3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно Твин 80 [полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат]). Если присутствуют и сквален, и α-токоферол, то предпочтительно, чтобы соотношение сквален^-токоферол было равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. 3рап 85 (сорбитантриолеат) также может присутствовать на уровне 0,5-1% в эмульсиях, используемых в данном изобретении. В некоторых случаях может быть полезно, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностноактивные вещества, включая каприловую кислоту (Мегск шбех, 10-е изд., номер по списку 1739), из которых особенно предпочтителным является трикаприлин.
- 17 014649
Когда включены сквален и сапонин (предпочтительно 0821), также полезно включать в композицию стерин (предпочтительно холестерин), так как это позволяет уменьшить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости изготовления, улучшению общего комфорта при вакцинации, а также качественным и количественным улучшениям получаемых иммунных ответов, таких как усиленное продуцирование ΙΕΝ-γ. Соответственно адъювантная система по настоящему изобретению обычно имеет соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, кроме того, настоящее изобретение может быть применено в форме с низким содержанием масла, с предпочтительным диапазоном 1:1-200:1, предпочтительно 20:1-100:1 и наиболее предпочтительно 48:1; эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов со значительно сниженным профилем реактогенности. Соответственно особенно предпочтительные воплощения имеют соотношение сквален:О821 (мас./мас.) в диапазоне 1:1-250:1, также предпочтительным диапазоном является 20:1200:1, предпочтительно 20:1-100:1 и наиболее предпочтительно 48:1. Предпочтительно стерин (наиболее предпочтительно холестерин) также включен и присутствует в соотношении сапонин:стерин, приведенном в данном описании.
Эмульсионные системы по настоящему изобретению предпочтительно имеют капельки масла небольшого размера в субмикронном диапазоне. Наиболее предпочтительно размеры капелек масла находятся в диапазоне 120-750 нм и наиболее предпочтительно 120-600 нм в диаметре.
Особенно эффективная адъювантная композиция (для окончательной комбинации с А1₽О4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает сапонин (предпочтительно 0821), производное ΕΡ8 (предпочтительно 3Ό-ΜΡΕ) и масляную эмульсию (предпочтительно сквален и α-токоферол в эмульсии масло-в-воде), как описано в \УО 95/17210 или в \УО 99/12565 (в частности, адъювантная композиция 11 в примере 2, табл. 1).
Примеры агониста ТЕК 2 включают пептидогликан или липопротеин. Известными агонистами ТЬК7 являются имидазохинолины, такие как имиквимод или резиквимод. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом ТЬК (ТЬК8 у людей и ТЬК7 у мышей), в то время как двухцепочечная РНК и поли-1С (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - имеющийся в продаже синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов ТЬК3. 3Ό-ΜΡΕ является примером агониста ТЬК4, тогда как СрС является примером агониста ТЬК9.
Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соль металла. Вакцинные композиции на основе алюминия, в которых антиген и иммуностимулятор 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3Ό-ΜΡΕ) адсорбированы на одной и той же частице, описаны в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1 и ЕР 0633784 В1. Тогда в этих случаях сначала адсорбируют антиген на соль алюминия с последующей адсорбцией иммуностимулятора 3Ό-ΜΡΕ на тех же частицах соли алюминия. В таких процессах сначала суспензию 3Ό-ΜΡΕ подвергают воздействию ультразвука на водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера 80-500 нм. Обычно антиген адсорбируют на соль алюминия в течение одного часа при комнатной температуре при перемешивании. Затем к адсорбированному антигену добавляют суспензию 3Ό-ΜΡΕ и композицию инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и затем хранят при 4°С до использования.
В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах соли металла, как описано в ЕР 1126876. Улучшенный способ включает абсорбцию иммуностимулятора на частицах соли металла с последующей абсорбцией антигена на другую частицу соли металла, затем смешивание отдельных частиц соли металла с образованием вакцины. Адъювант для использования в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающейся тем, что данная частица соли металла, по существу, не содержит другой антиген. Кроме того, вакцины, предложенные согласно настоящему изобретению, отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, по существу, не содержащих другой антиген, и что частицы соли металла, на которых адсорбируется антиген, по существу, не содержат другой иммуностимулятор.
Соответственно согласно настоящему изобретению предложена адъювантная композиция, содержащая иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, характеризующейся в композиции как, по существу, не содержащей другой антиген. Кроме того, эта адъювантная композиция может представлять собой промежуточный продукт, который, если используют такой адъювант, требуется для изготовления вакцины.
Соответственно предложен способ изготовления вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, представляющей собой один или более чем один иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла с антигеном. Предпочтительно антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Указанная соль металла может быть идентичной или аналогичной соли металла, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Предпочтительно соль металла представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.
- 18 014649
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первые и вторые частицы соли металла являются отдельными частицами.
ЬР8 или ЬО8 производные или мутации или производные липида А, описанные в данном изобретении, сконструированы с меньшей токсичностью (например, 30-МРЬ). чем нативные липополисахариды, и представляют собой взаимозаменяемые эквиваленты в отношении любых применений этих групировок, описанных в данном изобретении. Они могут представлять собой лиганды ТЬК4, которые описаны выше. Другие такие производные описаны в XVО 020786737, XVО 9850399, XVО 0134617, XVО 0212258, АО 03065806.
В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит липосомный носитель (приготавленный известными методами из фосфолипидов (таких как диолеоилфосфатидилхолин [ЭОРС]) и возможно стерин [такого как холестерин]). Такие липосомные носители могут нести производные липида А [такие как 3Э-МРБ - см. выше] и/или сапонины (такие как 0821 - см. выше). В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,1-10 мг, 0,2-7 мг, 0,3-5 мг, 0,4-2 мг или 0,5-1 мг (например, 0,4-0,6 мг, 0,9-1,1 мг, 0,5 или 1 мг) фосфолипида (например, ЭОРС), 0,025-2,5 мг, 0,05-1,5 мг, 0,075-0,75 мг, 0,1-0,3 мг или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3 мг, 0,1-0,15 мг, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60 мг, 10-50 мг или 20-30 мкг (например, 5-15 мг, 40-50 мг, 10, 20 мг, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Э-МРЬ) и 5-60 мг, 10-50 мг или 20-30 мкг (например, 5-15 мг, 40-50 мг, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, Р821).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает в себя сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19А и 22Е), при этом ОМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит эмульсию масло-в-воде, приготовленную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно токола (такого как α-токоферол).
В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,5-15 мг, 1-13 мг, 2-11 мг, 4-8 или 5-6 мг (например, 2-3 мг, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10 мг, 0,3-8 мг, 0,6-6 мг, 0,9-5 мг, 1-4 или 2-3 мг (например, 0,9-1 мг,1, 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно 0,5-20 мг, 1-15 мг, 2-12 мг, 4-10 мг, 5-7 мг (например, 11-13 мг, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как α-токоферол).
Этот адъювант возможно может дополнительно содержать 5-60 мг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15 мг, 40-50 мг, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Э-МРЬ).
Такие адъюванты, в частности, подходят для вакцинных композиций, предназначенных для маленьких детей или пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие по меньшей мере из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Е), где ОМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
Этот адъювант возможно может содержать 0,025-2,5 мг, 0,05-1,5 мг, 0,075-0,75 мг, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3 мг, 0,1-0,15 мг, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60 мг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15 мг, 40-50 мг, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3О-МРЬ) и 5-60 мг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, 0821).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает сахаридные конъюгаты, происходящие по меньшей мере из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Е), при этом ОМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3Э-МРЬ). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750 мг, 200-500 или 300-400 мкг А1 в виде фосфата алюминия и 5-60 мг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15 мг, 40-50 мг, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Э-МРЬ).
- 19 014649
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей или маленьких детей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие по меньшей мере из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), при этом ОМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Ргеуиаг® у вакцинированных людей.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы для защиты или лечения восприимчивого к инфекции млекопитающего путем введения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Такие способы введения могут включать введение посредством внутримышечной (в/м), внутрибрюшинной, внутрикожной (в/к) или подкожной инъекции или введение на слизистую оболочку в пероральный/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракты. Для лечения пневмонии или среднего отита предпочтительно интраназальное (и/н) введение вакцин (так как носоглоточный перенос пневмококков может быть предупрежден с большей эффективностью, тем самым инфекция ослабляется на самой ранней ее стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты также можно совместно вводить одновременно или в разные моменты времени (например, пневмококковые сахаридные конъюгаты можно вводить по отдельности, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Для совместного введения возможный ΤЫ1-адъювант может присутствовать в любом или во всех разных способах введениях. В дополнение к одному способу введения можно использовать 2 разных способа введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты можно вводить в/м (или в/к), а бактериальные белки можно вводить и/н (или в/к). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить в/м для примирующих доз и и/н для бустерных доз.
Содержание белковых антигенов в вакцине обычно будет находиться в диапазоне 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, наиболее типично в диапазоне 5-25 мкг. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки времени.
Изготовление вакцин в общем описано в Уассте Эек^и (Ню кийиш! аиб аб)иуаи1 арргоасЫ (ебк Ро\ге11 М.Е. & Хе^таи М.1.) (1995), Р1еиит Ргекк, Νο\ν Уогк). Инкапсулирование в липосомы описано РиПейои в патенте США 4235877. Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизованном состоянии. Предпочтительно раствор лиофилизуют в присутствии сахара, такого как сахароза или лактоза. Еще более предпочтительно, что их лиофилизуют и разводят непосредственно перед использованием. В результате лиофилизации можно получить более стабильную композицию (вакцину) и возможно можно придти к более высоким титрам антител в присутствии 3В-МРЬ и в отсутствие адъюванта на основе алюминия.
В одном аспекте данного изобретения предложен вакцинный набор, содержащий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизованной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, который описан в данном изобретении. Очевидно, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для разведения лиофилизованной иммуногенной композиции.
Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описываемых вакцин в кожу (в/к) составляет одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит наружную ороговевшую кутикулу, называемую роговым слоем, которая лежит поверх эпидермиса. Под эпидермисом лежит слой, называемый дермой, который в свою очередь лежит поверх подкожной ткани. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанной в данном изобретении вакциной образует предпочтительный аспект настоящего изобретения.
Традиционная методика внутрикожной инъекции, процедура манту, включает стадии, на которых очищают кожу, затем натягивают ее одной рукой и фаской иглы малого размера (размер 26-31), направленной вверх, вводят иглу под углом 10-15°. Как только фаска иглы введена, цилиндрическую часть иглы углубляют и продвигают дальше, одновременно осуществляя легкое надавливание, чтобы поднять иглу под кожей. Затем очень медленно вводят жидкость, получая таким образом пузырь или выпуклость на поверхности кожи, после чего медленно извлекают иглу.
Совсем недавно были описаны устройства, специально разработанные для введения жидких агентов в кожу или через нее, например устройства, описанные в АО 99/34850 и ЕР 1092444, а также безыгольные инъекционные устройства, описанные, например, в АО 01/13977, ИЗ 5480381, ИЗ 5599302, ИЗ 5334144, ИЗ 5993412, ИЗ 5649912, ИЗ 5569189, ИЗ 5704911, ИЗ 5383851, ИЗ 5893397, ИЗ 5466220, ИЗ 5339163, ИЗ 5312335, иЗ 5503627, ИЗ 5064413, ИЗ 5520639, ИЗ 4596556, ИЗ 4790824, ИЗ 4941880, ИЗ 4940460, АО 97/37705 и АО 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных композиций могут включать традиционные шприцы и иглы или устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (АО 99/27961), или трансдермальные пластыри (АО 97/48440;
- 20 014649 ν0 98/28037); или накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, ν0 98/20734, ν0 98/28037).
Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или более конкретно в дерму, вакцина представлена в малом объеме жидкости, в частности в объеме от приблизительно 0,05 до 0,2 мл.
Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, установленным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако особенностью кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти композиции могут быть низкодозовыми. Соответственно белковые антигены в низкодозовых вакцинах возможно присутствуют в таких небольших количествах, как 0,1-10 мкг, предпочтительно 0,1-5 мкг на дозу; а сахаридные (предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг и предпочтительно 0,01-0,5 мкг сахарида на дозу.
При использовании в данном описании термин внутрикожная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно будет локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мм от поверхности кожи человека, однако существует определенное количество вариаций между индивидуумами и в разных частях тела. В общем случае можно ожидать достижения дермы, пройдя на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем, лежащим ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может окончательно локализоваться исключительно или в основном в дерме или она может окончательно распределиться в эпидермисе и дерме.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления среднего отита, вызываемого НаеторйПик πιΠικ^·^ путем добавления белков НаеторйПик ^иГ1иеиζае, например белка Ό в свободной или конъюгированной форме. В дополнение к этому согласно настоящему изобретению также предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления пневмококковой инфекции у маленьких детей (например, среднего отита), основанная на добавлении одного или двух пневмококковых белков в виде свободного или конъюгированного белка к конъюгатным композициям 8.рпеитошае по изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут быть одинаковыми или разными по сравнению с любыми белками 8.рпеитошае, используемыми в качестве белков-носителей. Кроме того, в комбинированную вакцину может быть включен один или более белковый антиген Могахе11а са1аггйаПк в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа против среднего отита у маленьких детей.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа у маленьких детей (определенных как дети в возрасте 0-2 лет в контексте настоящего изобретения) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению [педиатрической вакцины]. Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложены антигенные конъюгатные композиции 8.рпеитошае по изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов 8.рпеитошае по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения (или лечения) пневмококкового заболевания.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациент считается пожилым, если его возраст составляет 50 лет или старше, обычно старше 55 лет и в более общем случае старше 60 лет) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению, предпочтительно вместе с одним или двумя белками 8.рпеитошае, присутствующими в виде свободного или конъюгированного белка, причем свободные белки 8.рпеитошае могут быть одинаковыми или разными, как любые белки 8.рпеитошае, используемые в качестве белков-носителей.
Другим аспектом данного изобретения является способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией 8.рпеитошае и возможно НаеторйПик шПиепхае, включающий введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению.
Другим аспектом данного изобретения является иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекцией 8.рпеитошае и возможно НаеторйПик шПиепхае.
Другой аспект данного изобретения заключается в применении иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией 8.рпеитошае и возможно НаеторйПик шПиепхае.
Авторами изобретения подразумевается, что термины содержащий, содержат и содержит в данном описании можно заменять в каждом случае соответственно на термины состоящий из, состоят из и состоит из.
- 21 014649
В данном описании изобретения воплощения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным композициям по изобретению, и наоборот.
Все ссылки и патентные заявки, приведенные в данном патенте, включены в описание посредством ссылки.
Для лучшего понимания изобретения приведены следующие ниже примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации и их никоим образом не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающие объем данного изобретения.
Примеры
Пример 1а. Экспрессия белка Ό.
Белок Ό №-^11^31111115 тПиепхае.
Генетическая конструкция для экспрессии белка Ό.
Исходные материалы.
ДНК, кодирующая белок Ό.
Белок Ό является высококонсервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов НЗпПиепхае. Вектор рШС348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую весь ген белка Ό, был получен от доктора А. Рогадгеи, ИерайтеиХ оГ Меб1са1 М1сгоЫо1о§у, ищуегшХу оГ Ьипб, Ма1то Сепега1 Ηо5р^!а1. Ма1то, 8\гебеп. Последовательность ДНК белка Ό была опубликована в .Тапкой е! а1. (1991), 1пРесХ. 1ттип. 59: 119-125.
Экспрессирующий вектор рМО1.
Экспрессирующий вектор рМО1 представляет собой производное рВК322 (Сго55 е! а1., 1985), куда были введены элементы контроля транскрипции и трансляции чужеродных встроенных генов бактериофага А (811а!хтап е! а1., 1983). В дополнение к этому, ген устойчивости к ампициллину был заменен на ген устойчивости к канамицину.
Штамм Е.соБ АК58.
Был сконструирован штамм Е.соБ АК58 посредством трансдукции Ν99 фагом линии Р1, предварительно выращенным на производном 8А500 (βη1Ε::ΤΝ10. 1атЬбаКБ- с1857 ΔΗ1). Ν99 и 8А500 представляют собой штаммы Е.соБ К12 из лаборатории доктора Майш КокепЬегд, №1Бопа1 1п5!1!и!е оГ ШаБК
Экспрессирующий вектор рМО1.
Для продуцирования белка Ό ДНК, кодирующая этот белок, клонировали в экспрессирующий вектор рМС1. Эта плазмида использует сигналы от ДНК фага лямбда для управления транскрипцией и трансляцией встроенных чужеродных генов. Вектор содержит промотор РЬ, оператор ОЬ и два сайта утилизации (ΝιιΐΕ и ΝπίΚ) для ослабления эффектов транскрипционной полярности при получении белка Ν (Сго55 е! а1., 1985). Для стабилизации плазмидной ДНК в лизогенный штамм хозяина Е.соБ введены векторы, содержащие промотор РЬ. Лизогенные штаммы хозяина содержат репликон-дефектную ДНК фага лямбда, интегрированную в геном (811а!хтап е! а1., 1983). Хромосомальная ДНК фага лямбда направляет синтез белка-репрессора с1, который связывается с ОЬ репрессором вектора и препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором РЬ и тем самым транскрипции встроенного гена. Экспрессирующий штамм АК58 представляет собой температурочувствительный мутант по гену с1, так что РЬ-направляемую транскрипцию можно регулировать путем изменения температуры, т.е. повышение температуры в культуре инактивирует репрессор, и инициируется синтез чужеродного белка. Эта система экспрессии позволяет регулировать синтез чужеродных белков, особенно таких, которые могут быть токсичными для клетки (8ЫтаХака & КокепЬегд, 1981).
Штамм Е.соБ АК58.
Лизогенный штамм Е.соБ АК58, используемый для продуцирования носителя - белка Ό, представляет собой производное стандартного штамма ΝΙΗ Е.соБ К12 Ν99 (Р- 5и- да1К2, 1ас2- !1г-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (да1Е::Т№0, 1атЬбаКБ- с1857 ΔΗ1). Фенотип КБ- препятствует выключению синтеза макромолекул хозяина. Мутация с1857 обусловливает температурочувствительное повреждение репрессора с1. Делеция Δ41 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы хозяина Ыо, иуг3 и с11А. Штамм АК58 был сконструирован посредством трансдукции Ν99 фагом линии Р1, предварительно выращенным на производном 8А500 (§ι1Ε::ΤΝ10, 1атЬбаКБ- с1857 Δ41). Введение дефектного лизогена в Ν99 отбирали с использованием тетрациклина на основании присутствия в соседнем гене да1Е транспозона ΤΝ10, кодирующего устойчивость к тетрациклину.
Конструирование вектора рМОМИРРтИ.
Вектор рМО1, содержащий ген, кодирующий неструктурный белок 81 вируса гриппа (рМО№1), использовали для конструирования рМОМИРРтИ. Ген белка Ό (РЮ) амплифицировали посредством ПЦР из вектора рШС348 Дап5оп е! а1. 1991, 1пГес!. 1ттип. 59: 119-125) с использованием ПЦРпраймеров, содержащих сайты рестрикции №о1 и ХЬа1 на 5'- и 3'-концах соответственно. Затем фрагмент Хсо1/ХЬа1 вводили в рМСХ81 между Исо1 и ХЬа1, создавая таким образом слитый белок, содержащий Ν-концевую 81 аминокислоту белка Ν81, потом белок Ό (РИ). Этот вектор помечали, как рМСХ81РгЭ.
- 22 014649
На основе описанной выше конструкции, создавали конечную конструкцию для экспрессии белка Ό. Фрагмент ВатН1/ВатН1 удаляли из рМСЖ1 РГО. В результате такого ДНК гидролиза удаляется ^{-кодирующий участок за исключением первых трех Ν-концевых остатков. После повторного лигирования вектора был создан ген, кодирующий слитый белок со следующей Ν-концевой аминокислотной последовательностью:
-----МОР 881188\\1А\Т---N81 Белок Ό
Белок Ό не содержит лидерного пептида или Ν-концевого цистеина, к которому обычно присоединяются липидные цепи. Следовательно, этот белок не выделяется в периплазму и не липидируется и остается в цитоплазме в растворимой форме.
Конечную конструкцию рМС-МЭРРГО вводили в штамм хозяина АК58 путем теплового шока при 37°С. Плазмидсодержащие бактерии отбирали в присутствии канамицина. Наличие вставки ДНК, кодирующей белок Ό, демонстрировали посредством расщепления выделенной плазмидной ДНК выбранными эндонуклеазами. Рекомбинантный штамм Е.сой обозначают как ЕСГО4.
Экспрессия белка Ό находится под контролем промотора Рь/оператора Оь (от фага) лямбда. Штамм хозяина АК58 содержит в геноме температурочувствительный ген с1, который блокирует экспрессию Р|. лямбда при низкой температуре посредством связывания с Оь. Как только температура повышается, с1 высвобождается от Оь и белок Ό экспрессируется.
Мелкомасштабное получение.
По окончании ферментации клетки концентрируют и замораживают.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли следующим образом. Замороженной осадок клеточной культуры оттаивают и ресуспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечной оптической плотности ОЭ650=60. Суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления при Р=1000 бар (100 МПа). Гомогенат клеточной культуры осветляют центрифугированием и клеточный дебрис удаляют фильтрацией. На первой стадии очистки отфильтрованный лизат наносят на катионообменную хроматографическую колонку (8Р 8ерйагоке Рак! Р1о\у). РЭ связывается с матрицей геля посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (О 8ерйагоке Рак! Р1о\у). РЭ не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке.
Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по ОЭ. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют ультрафильтрацией.
В конце ультрафильтрационный ретентат, содержащий белок Ό, пропускают через мембрану 0,2 мкм.
Крупномасштабное получение.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли следующим образом. Собранный бульон охлаждают и немедленно пропускают дважды через гомогенизатор высокого давления при давлении приблизительно 800 бар (80 МПа).
На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на катионообменную хроматографическую колонку (большие гранулы 8Р 8ерйагоке). РИ связывается с гелевой матрицей посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера и фильтруют.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (О 8ерйагоке Рак! Р1о\у). РЭ не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке.
Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по ОЭ. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют и подвергают диафильтрации посредством ультрафильтрации.
Наконец, удержанный при ультрафильтрации ретентат, содержащий белок Ό, пропускают через мембрану 0,2 мкм.
Пример 1б. Экспрессия Р11ГО.
Белок Р11ГО является членом пневмококкового гистидин-триадного (Р1!) белкового семейства, характеризующегося присутствием гистидин-триад (мотив НХХНХН). Р11ГО представляет собой молекулу из 838 аминокислотных (ак) остатков и несет 5 гистидиновых триад (см. МеШттипе XVО 00/37105 8ЕО ГО NО: 4 для аминокислотной последовательности и 8ЕЦ ГО NО: 5 для последовательности ДНК). Р11ГО также содержит пролин-обогащенный участок в середине (положение аминокислот 348-380). Р11ГО имеет состоящую из 20 аминокислотных остатков Ν-концевую сигнальную последовательность с мотивом ЬХХС.
Генетическая конструкция.
Генную последовательность зрелого белка Р11ГО от МеШттипе (от ак 21 до ак 838) переносили рекомбинантным способом в Е.со11, используя собственный вектор рТСМР14, несущий промотор р/-. Штаммом хозяина Е.со11 является АК58, который несет термочувствительный репрессор с1857, позво
- 23 014649 ляющий осуществлять тепловую индукцию промотора.
Для амплификации гена ρΙιΐΩ из плазмиды МеФтншпе (несущей ген ρΐιΐϋ из штамма 8!гер!ососси5 риеитошае Νοπναν 4 (серотип 4) - 8ЕО ГО NΟ: 5, как описано в АО 00/37105) осуществляли полимеразную цепную реакцию.
Праймеры, специфические только для гена рЫЭ. использовали для амплификации гена рЫЭ в двух фрагментах. Праймеры несут либо Ше1 и Крп1, либо Крп1 и ХЬа1 сайты рестрикции. Эти праймеры не гибридизуются ни с каким нуклеотидом из данного вектора, кроме специфических рЕЮ генных последовательностей. Вставляли искусственный стартовый кодон ΑΤΟ, используя первый праймер, несущий сайт рестрикции Ыйе1. Образованные ПЦР-продукты затем вставляли в клонирующий вектор рОЕМ-Т (Рготеда) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессирующий вектор ТСМР14, используя стандартные методики, и этим вектором трансформировали Е.сой ΑΚ58.
Очистка ΡΕίΌ.
Очистку ΡΕίΌ осуществляли следующим образом.
Рост клеток Е.сой в присутствии канамицина: рост в течение 30 ч при 30°С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5°С.
Разрушение клеток Е.сой из целой культуры при ОЭ±115 в присутствии ΕΌΤΑ (этилендиаминтетрауксусная кислота) (5 мМ) и ΡΜ8Ε (фенилметилсульфонилфторид) (2 мМ) в качестве ингибиторов протеаз: Капше, 2 прохода, 1000 бар (100 МПа).
Захват антигена и удаление клеточного дебриса при 8йеатйпе О ХЬ хроматографии в рыхлом слое при комнатной температуре (20°С): колонку промывают ЫаС1 (150 мМ)+Етр1деп (0,25%; рН 6,5) и элюируют №1С1 (400 мМ)+Етр1деп (0,25%) в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,4.
Фильтрация на картридже 8аг1оЬгап 150 (0,45+0,2 мкм).
Связывание антигена с использованием хроматографии IΜΑС (аффинная хроматография на иммобилизованном металле) на Ζπ-хелатирующей 8ерЕаго§е ЕЕ при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4°С; колонку промывают 5 мМ имидазоломом и 1% Етрщеп и элюируют 50 мМ имидазолом, все в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0.
Хроматография на слабом анионообменнике в режиме с положительным зарядом с использованием Егас1оде1 ΕΜΌ ΌΕΑΕ при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4°С; колонку промывают 140 мМ ЫаС1 и элюируют при 200 мМ ЫаС1, при этом примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменнике.
Концентрирование и ультрафильтрация с использованием 2 мМ Ыа/К-фосфата рН 7,15 на мембране 50 кДа.
Стерильная фильтрация очищенной нерасфасованной формы на фильтровальном картридже 0,2 мкм Мййрак-20.
Пример 1в. Экспрессия пневмодизина.
Пневмококковый пневмолизин получали и детоксифицировали, как описано в АО 2004/081515 и АО 2006/032499.
Пример 2. Получение конъюгатов.
В данной области хорошо известно как приготовить очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей данных примеров полисахариды приготавливали, по существу, как описано в ЕР 072513 или с использованием близких способов. Перед конъюгированием полисахариды могут быть уменьшены в размере посредством микрофлюидизации, как описано ниже.
Условия активации и связывания специфичны для каждого полисахарида и приведены в табл. 1. Уменьшенный в размере полисахарид (за исключением Ρ85, 6В и 23Е) растворяли в 2 М ХаС1, 0,2 М №С1 или в воде для инъекций (АЕ1). Для всех серотипов оценивали оптимальную концентрацию полисахарида. Все серотипы за исключением серотипа 18С были конъюгированы непосредственно с белкомносителем, как подробно описано ниже. Были получены два альтернативных конъюгата серотипа 22Е; один конъюгированный непосредственно, один через линкер ΑΌ^
К раствору полисахарида добавляли С^ΑΡ (соотношение С^ΑΡ/Ρ8 0,5-1,5 мг/мг Ρ8) из концентрированного раствора (100 мг/мл) в ацетонитриле или раствора в смеси ацетонитрил/вода (50%/50%). Через 1,5 мин добавляли 0,2-0,3 М №1ОН для получения конкретного рН активации. Активацию полисахарида проводили при этом рН в течение 3 мин при 25°С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок Ό, ΡΕίΌ, пневмолизин или ΌΤ) (количество зависит от начального соотношения Ρδ/белок-носитель) и реакцию сочетания проводили при конкретном рН в течение вплоть до 2 ч (в зависимости от серотипа), регулируя рН. Для гашения непрореагировавших групп цианатного эфира затем к смеси добавляли 2 М раствор глицина. рН подводили до рН гашения (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем в течение ночи при 2-8°С при постоянном медленном перемешивании.
- 24 014649
Подготовка 18С.
18С связывали с белком-носителем через линкер - дигидразид адипиновой кислоты (АЭН). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации.
Получение производных столбнячного анатоксина с использованием ЕЭАС.
Для получения производных столбнячного анатоксина очищенный ТТ разбавляли до 25 мг/мл в 0,2 М №1С1 и добавляли спейсер АЭН для достижения конечной концентрации 0,2 М. После полного растворения спейсера рН доводили до 6,2. Затем добавляли ЕЭАС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) для достижения конечной концентрации 0,02 М и смесь перемешивали в течение 1 ч, регулируя рН. Реакцию конденсации останавливали путем увеличения рН включительно до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С. Затем дериватизированный ТТ подвергали диафильтрации (мембрана с СО (отсечением) 10 кДа) для удаления оставшихся ΑΌΗ и реагента ЕЭАС.
Наконец, весь объем ТТАН подвергали стерильной фильтрации до проведения стадии сочетания и хранили при -70°С.
Химическое связывание ТТАН с Ρ818ί.'.
Подробное указание параметров конъюгирования можно найти в табл. 1.
г подвергнутого микрофлюидизации Ρ8 разбавляли в определенной концентрации водой и доводили до 2 М №1С1 путем добавления порошка №С1.
Добавляли раствор С^ΑΡ (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси 50/50 (об./об.) ацетонитрил/νΕΙ) для достижения подходящего соотношения С^ΑΡ/Ρ8.
рН повышали вплоть до рН активации 9,0 путем добавления 0,3 М №ЮН и стабилизировали при этом рН до добавления ТТАН.
Через 3 мин добавляли дериватизированный ТТАН (20 мг/мл в 0,2 М №1С1) для достижения соотношения ΊΤ^/Ρδ, равного 2, рН регулировали до рН связывания (рНс) 9,0. Раствор оставляли на 1 ч, регулируя рН.
Для гашения к смеси Ρ8/ТТΑΗ/С^ΑΡ добавляли 2 М раствор глицина.
рН подводили до рН гашения (рНч) (рН 9,0).
Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем оставляли на ночь при 2-8°С при постоянном медленном перемешивании.
Конъюгат ΡδΣΣΕ-,ιι-ΡΙιΙϋ.
Во втором способе конъюгирования этого сахарида (первый представляет собой способ прямого конъюгирования Ρ822Ε-ΡΜΟ, показанный в табл. 1) 22Ε связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (АЭН). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 22Ε подвергали микрофлюидизации.
Получение производных Ρ822Ε.
Активацию и связывание выполняли при 25°С при постоянном перемешивании в водяной бане с регулируемой температурой.
Подвергнутый микрофлюидизации Ρ822Ε разбавляли до получения конечной концентрации Ρ8 6 мг/мл в 0,2 М №1С1 и раствор доводили до рН 6,05±0,2, используя 0,1н. НС1.
Добавляли раствор С^ΑΡ (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси ацетонитрил/VΕ1, 50/50) для достижения подходящего соотношения С^ΑΡ/Ρ8 (1,5/1 мас./мас.).
рН повышали вплоть до рН активации 9,00±0,05 путем добавления 0,5 М №ЮН и стабилизировали при этом рН до добавления АЭН.
Через 3 мин добавляли АЭН для достижения соответствующего соотношения АЭН/Ρδ (8,9/1 мас./мас.); рН регулировали до рН связывания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч, регулируя рН.
Производное Ρ8^ концентрировали и подвергали диафильтрации.
Связывание.
Ρ111Ω в концентрации 10 мг/мл в 0,2 М №1С1 добавляли к производному Ρ822ΕΑΗ для достижения соотношения ΡΙιΐΩ/ΡδΣΣΕ-,Η 4/1 (мас./мас.). рН доводили до 5,0±0,05, используя НС1. Добавляли раствор ЕЭАС (20 мг/мл в 0,1 М Трис-НС1, рН 7,5) вручную в 10 мин (250 мкл/мин) для достижения 1 мг ЕЭАС/на 1 мг Ρ822ΕΑΗ. Полученный раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали 60 мин) при 25°С при перемешивании и регулировании рН. Раствор нейтрализовали путем добавления 1 М Трис-НС1, рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25°С.
Перед элюированием на 8ерйасгу1 8400НН конъюгат осветляли с использованием фильтра 5 мкм МшщагЕ
Полученный конъюгат имеет конечное соотношение Ρ111Ω/Ρ8 4,1 (мас./мас.), содержание свободного Ρ8 ниже 1% и антигенность (α-Ρ8/α-Ρ8) 36,3% и анти-ΡΜΟ антигенность 7,4%.
Очистка конъюгатов.
Конъюгаты очищали гель-фильтрацией, используя колонку для гель-фильтрации 8ерйасгу1 8400НН, уравновешенную 0,15 М №1С1 (8500НН для 18С) для удаления небольших молекул (включая ОМАР) и неконъюгированных Ρ8 и белка. Из-за разных молекулярных размеров компонентов реакционной смеси конъюгаты Ρ8-ΡΌ, Ρδ-ТТ, Ρ8-ΡΜΟ, Ρδ-пневмолизин или Ρδ-ОТ элюируются первыми, затем свободный Ρ8, затем свободный ΡΌ или свободный ОТ и, наконец, ОМАР и другие соли (№С1, глицин).
- 25 014649
Фракции, содержащие конъюгаты, определяли по УФ280 нм. Фракции собирали в соответствии с их Κά, подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм) и хранили при 2-8°С. В препаратах конъюгатов определяли соотношения Р8/белок.
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р8 З.рпеитошае-белок В/ТТ/ВТ/ВЬЮ/Р1у.
Если в заголовке колонки появляется микрофлюид., это указывает на то, что перед конъюгированием сахарид уменьшали в размере посредством микрофлюидизации. Размеры сахаридов после микрофлюидизации приведены в табл. 2.
Таблица 1
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р8 З.рпеитошае-белок
1)ТТ1)ТР1И1)Р1\
Серотип 1 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 6А 6В 7Р микрофлюид. 9У микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С микрофлюид. 19А микрофлюид. 19Р микрофлюид. 22Р микрофлюид. 23Г
Конц. Р5 (мг/мл) 2,5 2,5 7,1 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,5 15,0 9,0 6,0 2,38
Растворение Р5 ννπ ννπ ννπ 2 М №С1 2 М №С1 2М №С1 * 2 М ИаС! 2 М №С1 2 М №С1 2 М №С! 2 М №С1 0,2 М МаС! 2 М МаС!
Конц. РЭ (мг/мл) 10,0 10,0 5,0 5,0 5,0 10,0 10,0 10,0 20,0 (ТТ) 10,0 (Р!у) 20,0 (ОТ) 10,0 (ΡΜϋ) 5,0
Исходное соотношение Р0/Р8 (мас./мас.) 1,5/1 1,5/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1 1,2/1 1,2/1 2/1 2,5/1 1,5/1 3/1 1/1
Конц. СО АР (мг/мг Р5) 0,50 0,50 0,79 0,83 0,83 0,75 0,50 0,75 0,75 1,5 1,5 1,5 0,79
рНа=рНс=рНч 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Примечание: рНа, рНс, рНч соответствуют рН активации, связывания и гашения соответственно.
Определение характеристик.
Каждый конъюгат был охарактеризован и соответствовал характеристикам, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли резорциновым методом, а содержание белка (мкг/мл) - тестированием по Лоури. Конечное соотношение Р8/РБ (мас./мас.) определяют по соотношению этих концентраций.
Содержание свободного полисахарида (%).
Содержание свободного полисахарида в конъюгатах, выдерживаемых при 4°С или хранимых в течение 7 суток при 37°С, определяли на супернатанте, полученном после инкубации с антителами на α-белок-носитель и насыщенным сульфатом аммония с последующим центрифугированием.
Для количественного определения свободного полисахарида в супернатанте использовали ЕЬ18А а-Р8/а-Р8. Отсутствие конъюгата также контролировали с использованием ЕЫ8А для α-белокноситель/а-Р8.
Антигенность.
Антигенность вышеупомянутых конъюгатов анализировали в ЕИ8А сэндвич-типа, где антителами захвата и детекции были α-РЗ и α-белок соответственно.
Содержание свободного белка (%).
Неконъюгированный белок-носитель может быть отделен от конъюгата во время стадии очистки. Содержание свободного остаточного белка определяли, используя эксклюзионную (гель-проникающую) хроматографию (8ЕС) (Т8К 5000-РАХЬ) с последующим УФ-детектированием (214 нм). Условия элюирования позволяли разделять свободный белок-носитель и конъюгат. Затем определяли содержание свободного белка в нерасфасованном конъюгате по калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг белка-носителя в мл). Свободный белок-носитель в % выражали следующим образом:
% свободного носителя=(свободный носитель (мкг/мл))/(общая концентрация соответствующего белканосителя, измеренная по Лоури (мкг/мл))х100%.
Стабильность.
Молекулярно-массовое распределение (Кау) и стабильность определяли по результатам НРЬС-ЗЕС гель-фильтрации (Т8К 5000-РАХЬ) для конъюгатов, выдерживаемых при 4°С или хранимых в течение 7 суток при 37°С.
Определение характеристик 10/11/13/14-валентных конъюгатов приведено в табл. 2 (см. комментарий под ней).
Белковые конъюгаты могут быть адсорбированы на фосфате алюминия и объединены с образованием конечной вакцины.
Вывод.
Получены иммуногенные конъюгаты, которые, как затем было показано, являются компонентами многообещающей вакцины.
- 26 014649
Таблица 2
Характеристики конъюгатов
Конъюгаты Размер Р8 (ДахЮ3) Соотношение носитель/Р8 Свободный Р8 (ЕНва) Свободный носитель Антигенность Р8 (ЕНва) Размер конъюгата (кДа)
Ρ81-Ρϋ 349382* 1,5-1,6 1,0%- 1,2% 3,9-4,8% 87-95% 1499- 1715
Ρ84-Ρϋ 93-100* 1,5-1,6 4,7- 6,5% 3,2-4,0% . 90-96% 1303- 1606
Ρ85-Ρϋ*** 367-443 0,80 8,7- 11,2% 2,2-3,8% 93108% 19982352
Р86А-РО 11001540 0,61 4,5% Не определ. 45,9% Не определ.
Р86В-Р0*** 1069- 1391 0,7-0,8 1,3- 1,6% <2,0% 68-75% ' 4778- 5235
Ρ87Ρ-Ρϋ 255264* 1,1-1,2 <1% <1,4% 58% 3907- 4452
Ρ89ν-Ρϋ 258280* 1,3-1,5 <1% <1,3% 67-69% 9073- 9572
Ρ814-Ρϋ 232- 241* 1,4 <1% <1,5% 70% 3430- 3779
Р818С-ТТ 89-97* 2,2-2,4 1,5- 2,2% <4% 46-56% 5464- 6133
Р819А-Р1у* 151 3,2 <1% 29%
Ρ819Ρ-ΟΤ 133143* 1,4-1,5 4,1-5,9% <1,2%- <1,3% 82-88% 2059- 2335
Ρ822Ε- Ρίΐίϋ* 159-167 2,17 5,8 Не определ. 37% Не определ.
Ρδ22ΕΑΗРНЮ* 159-167 3,66-4,34 <1% Не определ. 28-31% Не определ.
Р823Ррр*** 914-980 0,5 1,4- 1,9% 3,7-4,9% 137- 154% 2933- 3152
* Размер Р8 после микрофлюидизации нативного Р8.
Приготавливали 10-валентную вакцину путем смешивания конъюгатов серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (например, в дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида соответственно на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 11-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгат серотипа 3 из табл. 5 (например, 1 мкг сахарида на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 13-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгаты серотипов 19А и 22Р, упомянутые выше (где 22Р либо непосредственно связан с РЕ1П, либо, альтернативно, через линкер АЭН) [например, в дозе 3 мкг каждого сахарида на дозу, предназначенную для человека].
14-валентная вакцина может быть приготовлена путем дополнительного добавления конъюгата серотипа 6А, упомянутого выше [например, в дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека].
Пример 3. Подтверждение того, что включение белка Ώ НаешорЕПиз тйиеп/ае в иммуногенную композицию по изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого среднего отита (АОМ).
Дизайн исследования.
В данном исследовании использовали вакцину ПРп-РЭ, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, каждый из которых конъюгирован с белком Ώ из НлпПиеп/ае (ссылка на табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали на две группы, получающие четыре дозы либо вакцины ПРп-РЭ, либо Наупх, в возрасте приблизительно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты получали вакцину 1п1аппх-Ееха (ПТРа-НВУ-1РУ/Н1Ь) фирмы Θ8Κ Вю1ощса18 одновременно в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. 1п1аппх-Ееха представляет собой комбинацию Реб1апх и Н1Ь, смешанных перед введением. Контрольное наблюдение эффективности для анализа согласно протоколу (АТР) начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до достижения возраста 24-27 месяцев. В выбранной подгруппе субъектов оценивали носоглоточный перенос 8.рпеишоп^ае и Нлпйиеп/ае.
Родителей приглашали на консультацию к исследователю, если их ребенок испытывал тошноту, имел боль в ушах, самопроизвольную перфорацию барабанной перепонки или самопроизвольные выделения из уха. Если у исследователя было подозрение на эпизод АОМ, ребенка немедленно отсылали к специалисту отоларингологу (ухо, нос, горло (Еаг, ^зе и ТЕгоа! (ΕΝΤ))) для подтверждения диагноза.
Клинический диагноз АОМ был основан либо на визуальной картине барабанной перепонки (т.е. покраснение, вздутие, потеря отражения света), либо на наличии выделения жидкости из среднего уха (как продемонстрировано с помощью простой или пневматической отоскопии или с помощью микроскопа). К тому же, должны были присутствовать по меньшей мере два из следующих признаков или симптомов: боль в ушах, выделения из уха, тугоухость, жар, вялость, возбудимость, анорексия, тошнота или диарея. Если специалист ΕNТ подтверждал клинический диагноз, отбирали посредством тимпаноцентеза пробу жидкости среднего уха для бактериологического тестирования.
- 27 014649
Для субъектов с повторными приступами тошноты устанавливали начало нового эпизода АОМ, если от начала предыдущего эпизода проходило более 30 суток. К тому же эпизод АОМ считался новым бактериальным эпизодом, если выделенные бактерия/серотип отличались от предыдущего изолята, какой бы ни был интервал между двумя последовательными эпизодами.
Результаты испытания.
Суммарно было охвачено 4968 маленьких детей, 2489 в группе 11 Рп-РО и 2479 в контрольной группе. Никаких больших различий в демографических характеристиках или факторах риска среди этих двух групп не имелось.
Клинические эпизоды и определение случаев АОМ.
В период контрольного наблюдения по протоколу суммарно было зарегистрировано 333 эпизода клинического АОМ в группе 11Рп-РР и 499 в контрольной группе.
В табл. 3 представлена защитная эффективность вакцины 11Рп-РР и обеих 7-валентных (7-ν) вакцин, ранее протестированных в Финляндии (Е§ко1а е! а1. Ν. Епд1. 1. Меб. 2001, 344: 403-409 и К11р1 е! а1. С11п. Шес!. Рщ. 2003, 37: 1155-64) в отношении любого эпизода АОМ и АОМ, вызываемого разными пневмококковыми серотипами, Н. тПиеп/ае, ΝΤΗί и М. саЫггйаШ.
Статистически значимое и клинически релевантное уменьшение на 33,6% общей тяжести заболевания АОМ было достигнуто при использовании 11Рп-РР, независимо от этиологии (табл. 3).
Общая эффективность в отношении эпизодов АОМ вследствие присутствия любых 11 пневмококковых серотипов, содержащихся в вакцине 11Рп-РР, составляла 57,6% (табл. 3).
Другим важным результатом в настоящем исследовании является 35,6%-ная защита, обеспечиваемая 11Рп-РР вакциной против АОМ, вызываемого Н.тПиепхае (и конкретно 35,3%-ная защита, обеспечиваемая ΝΤΗί). Этот результат имеет большую клиническую значимость, предполагая повышенную значимость Н.тПиепхае в качестве основной причины АОМ в эпоху пневмококковых конъюгатных вакцин. Параллельно с защитой, которую вакцина 11Рп-РР обеспечивала против АОМ, она также уменьшала носоглоточный перенос Н.тПиепхае после бустерной дозы на втором году жизни. Эти результаты противоречат предыдущим наблюдениям, полученным в Финляндии, где для обеих 7-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин наблюдалось увеличение количества эпизодов АОМ, обусловленных Н.тПиепхае (Е§ко1а и др. и К11р1 и др.), как свидетельство этиологического замещения.
Четкой корреляции между защитой против эпизодов АОМ, обусловленных Ηί, и уровнями антител против носителя белка Ό установить не удалось, поскольку концентрации анти-РР [дС-антител после первичной вакцинации у вакцинированных 11Рп-Рб, у которых не было Ηί АОМ эпизодов, по существу, были аналогичны уровням анти-РР ЦС антител после первичной вакцинации, измеренным у вакцинированных с примененим 11Рп-Рб, у которых развивался по меньшей мере один Ηί АОМ эпизод в течение периода контрольного наблюдения эффективности. Однако, несмотря на то что не удалось установить никакой корреляции между биологическим воздействием вакцины и ЦС анти-РР иммуногенностью после первичной вакцинации, разумно предположить, что белок-носитель РР, который является высококонсервативным среди штаммов Н.тПиеп/ае, внес большой вклад в индукцию защиты против Ηί.
Влияние на заболевание АОМ сопровождалось влиянием на носоглоточный перенос, которое имело аналогичную величину для пневмококков и РтПиеп/ае вакцинных серотипов (фиг. 1). Это уменьшение носоглоточного переноса РтПиеп/ае у вакцинируемых РР-конъюгатами поддерживает гипотезу прямого защитного эффекта РР-конъюгатной вакцины против Н.тПиеп/ае, даже если защитная эффективность не могла коррелировать с анти-РР ^С-иммунными ответами при измерении посредством ЕЫ8А.
В следующем эксперименте использовали модель среднего отита на шиншиллах с использованием сывороточных пулов от маленьких детей, иммунизированных 11-валентной композицией из этого примера или 10-валентной вакциной из примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и комментарии под ними). Оба пула вызывают значительное уменьшение процента животных со средним отитом по сравнению с сывороточным пулом до иммунизации. Нет никакого значимого различия между 10- и 11-валентными иммунными пулами. Это показывает, что обе вакцины имеют одинаковую эффективность в индуцировании защиты против среднего отита, вызываемого нетипируемым Н.тПиепхае в данной модели.
- 28 014649
Таблица 3
Тип эпизода АОМ 11РП-РО Ргечпаг в ΡϊηΟΜ ,ЬвКо,аидр ’ 7ν-ΟΜΡ в ΕίηΟΜ <к,’р,и«₽ >
η νε η νε η νε
11Рп- Ρϋ Контроль % ДИ 95% 7ν- СКМ Конт- роль % ДИ 95% 7ν- ОМР Контроль % ДИ 95%
ίί иь ίί υί ίί υί
N 2455 2452 786 794 805 794
Любой АОМ 333 499 33,6 20,8 44,3 1251 1345 6 -4 16 1364 1345 -1 -12 10
Любой АОМ с МЕР 322 474 32,4 19,0 43,6 1177 1267 7 -5 17 1279 1267 0 -12 10
Культурально подтвержденный 92 189 51,5 36,8 62,9 271 414 34 21 45 314 414 25 11 37
пневмококк
Вакцинные 60 141 57,6 41,4 69,3 107 250 57 44 67 110 250 56 44 66
пневмококковые
серотипы (*) Другие бактериальные
патогены
Η. ϊητΐυβηζθβ 44 68 35,6 3,8 57,0 315 287 -11 -34 8 315 287 -9 -32 10
Нетипируемый Н. тПиепгае (ΝΤΗί) 41 63 35,3 1,8 57,4 ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΟ ΝΡ ΝΡ
М. са/аггЬаПз 31 34 9,4 -52,5 46,1 379 381 -1 -19 15 444 381 -16 -36 2
ΝΡ = не опубликовано; N = количество субъектов в группе АТР определения эффективности; п = количество эпизодов.
* Вакцинные пневмококковые серотипы: для ΠΡ^ΡΌ = 11 серотипов, для ΡϊΌν^Γ и 7ν-ΟΜΡ = 7 серотипов. МЕР = жидкость среднего уха.
ЬЬ = нижний предел; ϋΣ = верхний предел; ДИ = доверительный интервал.
ΥΕ = эффективность вакцины.
Пример 4. Выбор белка-носителя для серотипа 19Р.
Используемый анализ ЕЙ18А.
Метод ЕЙ18А с ингибированием 22Р, по существу, основан на анализе, предложенном в 2001 г. Сопссрсюп и РгаксД и о котором сообщалось в Нспскасйк с! а1., 2006, Сйшса1 апй Уассшс 1ттипо1оду, 13: 356-360. В кратком изложении, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным сывороточным альбумином человека и адсорбировали на микротитрационных планшетах для сильного связывания Νιιιιο Мах1§огр™ (Коккййс, ΌΚ) в течение ночи при 4°С. Планшеты блокировали 10%-ной фетальной сывороткой теленка (РВ8) в ΡΒ8 в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Образцы сыворотки разбавляли ΡΒ8, содержащим 10% РВ8, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (88Ι) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22Р (АТСС (Американская коллекция типовых культур)) и потом разбавляли в микротитрационных планшетах, используя тот же буфер. Внутренний стандарт, откалиброванный относительно стандартной сыворотки 89-8Р с использованием серотип-специфических концентраций 1§С в 89-8Р, был обработан тем же способом и включен в каждый планшет. После промывки связавшиеся антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой моноклонального антитела против 1§С человека (81га1ссД 8с1спййс Ый., 8оДат, иК), разбавленного в 10%-ной РВ8 (в ΡΒ8), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Для развития окраски использовали готовый к употреблению однокомпонентный набор для иммуноанализа на основе субстрата для фермента пероксидазы тетраметилбензидина (ВюКай, Нсгси1с§, СА, И8) в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали, используя 0,18 М Н28О4, и оптическую плотность считывали при 450 нм. Концентрации серотип-специфических 1§С (в мкг/мл) в образцах рассчитывали путем соотнесения значений оптической плотности в определенных пределах с кривой для внутреннего сывороточного стандарта, смоделированой с использованием 4-параметрического логистического логарифмического уравнения, рассчитанного с применением программного обеспечения 8ойМах Ργθ™ (Мо1сси1аг Э^сск, 8иппууа1с, СА).
Порог отсечения для ЕЙ18А составлял 0,05 мкг/мл 1§С для всех серотипов с учетом ограничения по детектированию и предела количественного определения.
Опсонофагоцитарный анализ (ΟΡА).
На совещании ВОЗ в июне 2003 г. было рекомендовано использовать анализ ОРА, изложенный в Котсго-81стсг с! а1. С1т. Эхадп. ЬаЬ. 1ттипо1. 2003, 10 (6): р. 1019-1024. Этот протокол использовали для тестирования ОРА активности серотипов в следующих тестах.
- 29 014649
Получение конъюгатов.
В исследования 11Ρη-Ρ^&^^-001 и 11Ρп-Ρ^&^^-007 были включены три 11-валентных вакцинных композиции (табл. 4), в которых 3 мкг полисахарида 19Р были конъюгированы с дифтерийным анатоксином (19Р-ЭТ) вместо 1 мкг полисахарида, конъюгированного с белком Ό (19Γ-ΡΌ). Параметры конъюгирования для исследований ΠΡ^ΡΌ, 11Ρη-Ρ^&^^-001 и 11Ρп-Ρ^&^^-007 описаны в табл. 5-7 соответственно.
Антипневмококковые антительные ответы и ОРА активность против серотипа 19Р через один месяц после первичной вакцинации этими 19Р-ЭТ композициями показаны в табл. 8 и 9 соответственно.
В табл. 10 приведены концентрации 22Р-ЕЫ8А-антител и проценты субъектов, достигших порога 0,2 мкг/мл до и после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной.
Показано, что опсонофагоцитарная активность антител, индуцированных этими 19Р-ЭТ композициями, явно усиливалась, что продемонстрировано более высокими уровнями серопозитивности (опсонофагоцитарные титры >1:8) и ΟΜΤ ОРА через один месяц после первичной вакцинации (табл. 9). Через один месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной опсонофагоцитарная активность 19Р-антител оставалась значительно лучшей у маленьких детей, примированных 19Р-ОТ композициями (табл. 11).
В табл. 12 представлены данные по иммуногенности после бустерного введения ΠΡ^ΡΌ начинающим ходить детям, ранее примированным конъюгатами 19Р-ЭТ или 19Γ-ΡΌ, по сравнению с 4-й последовательной дозой ΡϊΌν^Γ®. Приведенные обнаруженные случаи, отмеченные после введения ΡϊΌν^Γ® в США, улучшенная опсонофагоцитарная активность против серотипа 19Р при конъюгации с белком-носителем ОТ могут быть полезны для вакцины-кандидата.
В табл. 13 приведены данные ЕЬ18А и ОРА для конъюгата 19Р-ЭТ по отношению к перекрестнореактивному серотипу 19А. Было обнаружено, что 19Р-ЭТ индуцирует низкую, но значимую ОРА активность против 19А.
Таблица 4
Пневмококковые конъюгатные вакцинные композиции, использованные в клинических исследованиях
Композиция Пневмококковый серотип мкг/белок-носитель ΑΙ3+ ΜΓ
1 3 4 5 6Β 7Ρ 9ν 14 18С 19Ρ 23Ε
11Ρπ-Ρϋ 1/Ρϋ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/Ρ 0 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/ΡΟ < 0,8
19Е-ОТ Форма 1 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/ΡΟ Ю/ОТ 3/ΡΟ 3/Ρ 0 3/ΡΟ 3/ΡΟ 3/ΟΤ 5/ΟΤ <0,35
19Е-0Т Форма 2 3/Ρϋ 2/ΡΟ 2/ΡΟ 3/ΡΟ 5/ΟΤ 3/ΡΟ 2/Ρ 0 2/ΡΟ 2/ΡΟ 3/ΟΤ 5/ΟΤ < 0,35
19Е-ОТ Форма 3 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/ΡΟ 3/ΡΟ 3/Ρϋ 3/ΡΟ 3/Ρ 0 3/ΡΟ 3/ΡΟ 3/ΟΤ 3/ΡΟ = 0,5
Таблица 5
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Ρ8 8.рпеитошае-белок 1)/ТТ/1)Т
Серотип 1 Нативный 3 микрофлюид. 4 Нативный 5 Нативный 6В Нативный 7Р Нативный 9У Нативный 14 Нативный 18С Нативный I 19Р I Нативный 23Р Нативный
Конц. Ρδ (мг/мл) 1,5 2 2,0 7,5 5,5 3,0 1,75 2,5 1,75 4,0 2,5
Растворение Ρδ 150 мМ МаС1 2 М МаС! ννπ УУН 2 М МаС! 2МИаС1 2 М МаС! 2 М МаС! ννρι 2 М МаС! 2 М МаС!
Конц. РО (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Исх. соотн. Ρδ/Ρϋ (мас./мас.) 1/0,7 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/0,75 1/0,75 1/1,2 1/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг Ρδ) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рНа=рНс=рНа 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 45 мин 30 мин 60 мин
- 30 014649
Таблица 6
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р3 3.рпеитошае-белок Э/ЭТ для исследования 11Рп-РП&П1-001
Серотип 1 микрофлюйд. 3 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 микрофлюид. 6В микрофлюид. 7Р Нативный 9У Нативный 14 Нативный 18С микрофлюид. 19Е микрофлюид. 23Р микрофлюид.
Конц. Р8 (мг/мл) 4 2,0 2,5 7,5 10 3,0 1,75 2,5 5,0 9,0 10
Растворение Р8 2 М №С1 2 М №С1 2 М №С! 2 М №С! 2 М №С1 2 М №С1 2 М №С1 2 М №С! 2 М МаС! 2 М №С1 2 М №С1
Конц. РО (мг/мл) 10,0 5,0 5,0 5,0 2 М №С1 20 ЩТ) 2 М ЫаС1 5,0 5,0 5,0 5,0 20 (ОТ) 10 (ϋΤ)
Исх. соотн. Ρϋ/Ρ8 (мас./мас.) 1,2/1 1/1 1/1 1/1 1,5/1 1/1 0,75/1 0,75/1 1,2/1 1,5/1 1,5/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8) 1,50 0,75 1,5 2 1,5 0,75 0,75 0,75 1,5 1,5 0,75
рНа=рНс=рНа 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9/9/9 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 30 мин 60 мин 60 мин
Таблица 7
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р3 3.рпеитошае-белок Э/ЭТ для исследования 11Рп-РП&П1-007
Серотип 1 Нативный 3 микрофлюид. 4 Нативный 5 Нативный 6В Нативный 7Е микрофлюид. 9У микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С Нативный 19А микрофлюид. 19Р микрофлюид. 23Е микрофлюид.
Конц. Р8 (мг/мл) 1,5 2,0 2 7,5 5,5 5,0 5,0 5,0 1,75 9,0 10,0 9,5
Растворение Р8 150 мМ №С1 2 М МаС1 ννπ ννη 2 М №С1 2 М №С1 2 М №С1 2 М МаС1 ννπ 2 М ЫаС! 2 М №С1 2 М МаС1
Конц. Ρϋ (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5 10 10 10,0 5,0 20 (ОТ) 5,0 (Ρϋ) 10
Исх. соотн. Р0/Р8 (мас./мас.) 0,7/1 1/1 1 1/1 1/1 1,2/1
1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,5/1 1,2/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,5 0,75 0,75 1,5 0,75 0,75
рНа=рНс=рНа 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 45 мин 120 мин 120 мин 60 мин
11Рп-РО&ОЬ001
11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-007
Таблица 8 Процентное содержание субъектов с концентрацией 19Е-антител >0,20 мкг/мл и средними геометрическими концентрациями 19Е-антител (СМС с ДИ 95%; мкг/мл) через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Е-ЭТ или Ргетпаг (2 мкг 19Е-СКМ) (общая группа)
Группа N % > 20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N % > 20 мкг/мл (ДИ 95%) 6МС (мкг/мл) (ДИ 95%)
11Ρη-Ρϋ 152 98,7 (95,3-99,8) 1,93 (1,67-2,22) 50 100 (92,9-100) 2,78 (2,31-3,36)
19Ε-ϋΤ Форма 1* 146 (96^2-100) 2,88 (2,45-3,38) - - -
19Ε-ΌΤ Форма 2* 150 96,0 (91,5-98,5) (2,01^94) - - -
19Ε-ϋΤ Форма 3* - - 50 96,0 (86,3-99,5) 3,70 (2,58-5,30)
Ргеупаг 148 98,6 (95,2-99,8) 9 ОЯ (2,60-3,41) 41 97,6 (87,1-99,9) 2 91 (2,15-3,94)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
- 31 014649
Таблица 9 Процентное содержание субъектов с 19Т-ОРА-титром >1:8 и 19Т-ОРА ΟМΤ через один месяц после первичной вакцинации с использованием мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Ρ-ΏΤ или Ргеуиаг (2 мкг 19Р-СИМ) , (общая группа)
11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-001 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-007
Группа N %£1:8 (ДИ 95%) смт (ДИ 95%) N %£1:8 (ДИ 95%) омт (ДИ 95%)
11РП-РО 136 84,6 (77,4-90,2) 77,8 (58,1-104,4) 46 95,7 (85,2-99,5) 167,8 (118,1-238,6)
19Е-ОТ Форма 1* 137 95,6 (90,7-98,4) 263,2 (209,4-330,7) - - / -
19Е-ОТ Форма 2* 139 92,1 (86,3-96,0) 218,9 (166,5-287,9) - - -
19Ε-ΌΤ Форма 3* - - 49 91,8 (80,4-97,7) 403,1 (225,7-719,9)
Рге/паг 131 86,3 (79,2-91,6) 82,6 (61,1-111,6) 38 81,6 (65,7-92,3) 65,0 (37,7-112,2)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 10
Процентное содержание субъектов с концентрацией 19Т-антител >0,20 мкг/мл и ОМС 19Т-антител (мкг/мл) до и через один месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной детей, примированных с использованием 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Ρ-ΏΤ или Ргеуиаг (2 мкг 19Р-СИМ) (общая группа)
Первичная группа 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002 (22Е ЕЬ18А)
До бустерной вакцинации Через один месяц после бустерной иммунизации 23валентной Р8-вакциной
N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%)
11Ρη-Ρϋ 70 77,1 (65,6-86,3) 0,67 (0,45-0,98) 67 94,0 (85,4-98,3) 11,50 (7,76-17,03)
19ΕΌΤ Форма Г 68 91,2 (81,8-96,7) 0,71 (0,54-0,94) 69 98,6 (92,2-100) 14,50 (10,47-20,07)
19Е-ОТ Форма 2* 74 81,1 (70,3-89,3) 0,59 (0,43-0,80) 72 95,8 (88,3-99,1) 9,90 (6,74-14,54)
Ргеупаг 65 64,6 (51,8-76,1) 0,40 (0,27-0,60) 67 100 (94,6-100) 9,40 (6,95-12,71)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 11 Процентное содержание субъектов с титром 19Р-ОРА >1:8 и 19Р-ОРА ΟМΤ до и через один месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной детей, примированных 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Ρ-ΏΤ или Ргеуиаг (2 мкг 19Р-СИМ) (общая группа)
Первичная группа 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002
До бустерной вакцинации Через один месяц после бустерной иммунизации 23валентной Р8-вакциной
N %^1:8 (ДИ 95%) омт (ДИ 95%) N % 2» 1:8 (ДИ 95%) ОМТ (ДИ 95%)
11Ρη-Ρϋ 29 27,6 (12,7-47,2) 10,9 (5,0-23,7) 28 82,1 (63,1-93,9) 408,0 (157,3-1058,3)
19Ρ-ϋΤ Форма 1* 19 47,4 (24,4-71,1) 18,1 (7,2-45,7) 18 94,4 (72,7-99,9) 1063,8 (386,6-2927,5)
19Ε-ϋΤ Форма 2* 27 33,3 (16,5-54,0) 8,5 (4,7-15,3) 28 100 (87,7-100) 957,6 (552,8-1659,0)
Ргеупаг 24 12,5 (2,7-32,4) 8,1 (3,4-19,6) 23 82,6 (61,2-95,0) 380,9 (133,2-1089,5)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
- 32 014649
Таблица 12
Процентное содержание субъектов с концентрациями антител >0,2 мкг/мл,
ОРА >1:8 и СМС/СМТ против пневмококков 19Р через один месяц после бустерной иммунизации вакциной 11Рп-РБ или Ргеупаг детей, примированных 1 мкг 19Р-РБ, 3 мкг 19Е-РТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Первичная группа 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002
Анализ 22Е-ЕЫ8А Анализ ОРА
N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) емс (мкг/мл) (ДИ 95%) N %>1:8 (ДИ 95%) 6МТ (ДИ 95%)
ПРп-РО 70 100 (94,9-100) 4,52 (3,7-5,5) 21 100 (83,9-100) 255,6 (135,5-481,9)
19Е-0Т Форма 1* 66 98,5 (91,8-100) 3,45 (2,8-4,3) 23 95,7 (78,1-99,9) 374,0 (192,6-726,2)
19Е-0Т Форма 2* 70 98,6 (92,3-100) 3,80 (2,9-4,9) 29 96,6 (82,2-99,9) 249,1 (144,7-428,7)
Ргеупаг 69 97,1 (89,9-99,6) 2,56 (2,0-3,3) 31 96,8 (83,3-99,9) 528,7 (319,4-875,2)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 13
Процентное содержание субъектов с концентрациями антител >0,2 мкг/мл,
ОРА >1:8 и СМС/СМТ против пневмококков 19А через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Р-РБ, 3 мкг 19Р-БТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Группа 11Ρη-Ρϋ&Οϊ-001
Анализ 22Е-ЕЫ5А Анализ ОРА
N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) емс (мкг/мл) (ДИ 95%) N %>1:8 (ДИ 95%) ОМТ (ДИ 95%)
ПРп-РО 45 28,9 (16,4-44,3) 0,09 (0,07-0,11) 52 7,7 (2,1-18,5) 5,2 (4,0-6,8)
19Ε-ϋΤ Форма 2* 51 29,4 (17,5-43,8) 0,11 (0,08-0,16) 59 27,1 (16,4-40,3) 12,4 (7,6-20,3)
Ргеупаг 55 18,2 (9,1-30,9) 0,10 (0,08-0,12) 61 (0.4311,3) 4,6 (3,8-5,6)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Пример 5. Эксперименты с адъювантами в доклинических моделях: влияние на иммуногенность пневмококковых 11-валентных полисахаридных конъюгатов у пожилых макак-резус.
Для оптимизации ответа, вызываемого на конъюгатные пневмококковые вакцины у пожилого населения, С8К изготовила 11-валентную полисахаридную (Р8) конъюгатную вакцину с новым адъювантом - адъювантом С - см. ниже.
Группы из 5 пожилых макак-резус (в возрасте 14-28 лет) иммунизировали внутримышечно (в/м) на 0- и 28-е сутки, используя 500 мкл либо 11-валентных Р8-конъюгатов, адсорбированных на 315 мкг А1Р04, либо 11-валентных Р8-конъюгатов, смешанных с адъювантом С.
В обеих вакцинных композициях каждый из 11-валентных Р8-конъюгатов был составлен из следующих конъюгатов: Р81-РЭ, Р83-РЭ, Р84-РВ, Р85-РВ, Р87Р-РБ, Р89У-РБ, Р814-РВ, Р818С-РВ, Р819Р-РБ, Р823Р-БТ и Р86В-БТ. Доза применяемой вакцины составляла 1/5 дозы вакцины для человека (5 мкг каждого сахарида на дозу для человека за исключением 6В [10 мкг]), конъюгированной в соответствии с условиями табл. 6 (пример 4), за исключением того, что 19Р приготавливали в соответствии со следующими условиями способа с использованием СБАР: уменьшенный в размере сахарид 9 мг/мл, РБ 5 мг/мл, начальное соотношение РБ/Р8 1,2/1, концентрация СБАР 0,75 мг/мг Р8, рНа/рНс/рНд 9,0/9,0/9,0 и время связывания 60 мин.
Уровни анти-Р8 ЕЫ8А 1дС и опсонофагоцитарные титры измеряли в сыворотке, собранной на 42-е сутки. Частоту встречаемости анти-Р83 В-клеток памяти измеряли с использованием ЕНкро! в клетках периферической крови, собранных на 42-е сутки.
Согласно результатам, показанным в данном описании ниже, адъювант С значительно усиливал иммуногенность 11-валентных Р8-конъюгатов по сравнению с конъюгатами с А1Р04 на пожилых макаках. Новый адъювант усиливал 1дС-ответы на Р8 (фиг. 1) и опсонофагоцитарные титры антител (табл. 14). Также было доказательно очевидно, что частота встречаемости Р83-специфических В-клеток памяти возрастала в результате применения адъюванта С (фиг. 2).
- 33 014649
Таблица 14
Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (опсонофагоцитарные титры после второй иммунизации (роэ!-!!))
Р8 1 Р8 3 Р8 4 Р8 5 Р86 В Р87 Р Р89 V Р81 4 Р818 С Р819 Р Р82 ЗР
11- До <8 5 <8 5 <8 16 <8 <8 <8 <8 <8
валент. иммуниз.
А1РО4 14-е сут ροδί II 8 181 64 49 64 4096 42 37 169 64 <64
11- До 5 9 <8 '5 8 37 <8 <8 <8 <8 <8
валент. иммуниз.
Адъюв. С 14-е сут ροδί II 776 135 1 891 676 620 8 1638 4 111 161 7132 2048 <64
Εΐΐδροΐ В-клеток.
Принцип данного анализа основан на том факте, что В-клетки памяти созревают в плазматические клетки ΐη νΐΐΓο после культивирования с СрО в течение 5 суток. Генерированные ΐη νίίτο антигенспецифические плазматические клетки можно легко детектировать и, следовательно, их можно подсчитать с использованием еШроРанализа В-клеток. Количество специфических плазматических клеток отображает частоту встречаемости В-клеток памяти в культуре в начальный момент.
В кратком изложении, образованные ΐη νίίτο плазматические клетки инкубируют в культуральных планшетах, покрытых антигеном. Антигенспецифические плазматические клетки образуют пятна антитело/антиген, которые детектируют с использованием стандартной иммуноферментной методики и подсчитывают как В-клетки памяти. В настоящем исследовании для того, чтобы подсчитать соответствующие В-клетки памяти, для покрытия культуральных планшетов использовали полисахариды. Результаты выражают в виде частоты встречаемости Р8-специфических В-клеток памяти на миллион В-клеток памяти.
Это исследование показало, что адъювант С может смягчать известную проблему биостабильности Р83 (см. 5-й Международный симпозиум по пневмококкам и пневмококковым заболеваниям, 2-6 апреля 2006 г., Айсе 8рппдз, Центральная Австралия, Специфичность иммунных ответов против пневмококкового конъюгата серотипа 3. 8сйиегшап Ь., Ргути1а К., Роо1тап I. АЬз1гас1 Ьоок, р. 245, РО10.06).
Пример 6. Эффективность детоксифицированного пневмолизина (ПР1у) в качестве белкового носителя для усиления иммуногенности Р819Г у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 4-валентного простого Р8, либо 4-валентного бР1у-конъюгированного Р8, в обоих случаях в смеси с адъювантом С.
Обе вакцинные композиции содержали по 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из следующих Р8: Р88, Р812Р, Р819Р и Р822Р.
Уровни ΕΡΙ8Λ анти-Р8 1дО измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
Анти-Р819Р-ответ, показанный в качестве примера на фиг. 3, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные бР1у-конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными простыми Р8. Аналогичное улучшение наблюдалось для анти-Р88, 12Г и 22Г 1дО-ответов (данные не показаны).
Пример 7. Эффективность пневмококкового белка Ό гистидинового триадного семейства (Рй1Э) в качестве белкового носителя для усиления иммуногенности Р822Р у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 4-валентного простого Р8, либо 4-валентного РМЭ-конъюгированного Р8, в обоих случаях в смеси с адъювантом С.
Обе вакцинные композиции содержали по 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из следующих Р8: Р88, Р812Р, Р819Р и Р822Р.
Уровни анти-Р8 ЕЙ18А 1дО измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
Анти-Р822Р-ответ, показанный в качестве примера на фиг. 4, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные РКП)-конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными простыми Р8. Аналогичное улучшение наблюдали для анти-Р88, 12Г и 19Р 1дО-ответов (данные не показаны).
Пример 8. Иммуногенность 13-валентных Р8-конъюгатов, содержащих 19А-ПР1у и 22Р-Р1П1) у старых С57В1 мышей
Группы из 30 старых С57В1 мышей (в возрасте более 69 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 11-валентных Р8-конъюгатов, либо 13-валентных Р8-конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-валентная вакцинная композиция содержала по 0,1 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РЭ, Р83-РО, Р84-РО, Р85-РО, Р86В-РО, Р87Р-РЭ, Р89У-РО, Р814-РО, Р818С-ТТ, Р819Р-ОТ и Р823Р-Р1) (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2).
13-валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-ПР1у и Р822Р-Рй1Э (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Р]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой ОМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и
- 34 014649 для конъюгирования с Р822Е использовали Р11Е), в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию Р1ц[)-Е (конструкция УР147 из АО 03/054007). В группе 6 19А конъюгировали с дифтерийным анатоксином, а 22Е - с белком Ώ.
Уровни анти-Р819А и 22Е ЕЫ8А 1дО измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЫ8А 1дО-ответ, полученный на остальные Р8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
19А-с1Р1у и 22Е-Р11Е), введенные в составе 13-валентной конъюгатной вакцинной композиции, продемонстрировали иммуногенность у старых С57В1 мышей (табл. 15). Иммунный ответ, индуцированный против остальных Р8, не оказывал негативного воздействия на мышей, получавших 13-валентную композицию, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентной композицией.
Таблица 15 Р8-иммуногенность у старых С57В1 мышей (уровни 1дО после III иммунизации (ро81-Ш))
Старые С57 черные мыши
ЕЫ5А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал. 0,1 мкг/50мкл Λη-,ιαπ Г* г\Цопу0. чу 11-вал. 19А-с!Р1у дтЬз 22Е-РНЮ 0,1мкг/50мкл Ат |«*\п Λ* /АДогмо. чу 11-вал. 19А-6Р1у формол 22Р-Р11Ю 0,1мкг/50мкл Λ ΗΊ 1АГ» Г* гЧДогмо. чу 11-вал. 19А-с1Р1у дтЬз 22Е-РкЮ-Е 0,1мкг/50мкл А т ΙΑΑ Г* г\цогив. чу 11-вал. 19А-с1Р1у формол 22Е-РпЮ-Е 0,1мкг750мкл Λ т 1ХЧГ» Г* г\цэгио. чу 11-вал. 19А-ОТ 22Е-РО 0,1мкг/50мкл А -АМ Г* Чу
. средний пул 19,30 20,20 24,40 12,80 12,10 13,60
~ средний пул 6,32 4,84 5,21 6,74 2,38 2,54
. средний пул 60,9 67,1 51,4 47,4 45,5 41,1
_ средний пул 1,34 3,81 3,06 2,75 1,26 1,23
βΒ средний пул 4,41 4,12 5,88 1,58 2,31 5,64
средний пул 0,83 0,81 1,65 1,98 0,89 0,99
9ν средний пул 13,8 23,7 20,0 13,1 15,5 9,6
14 средний пул 25,73 42,96 34,12 32,53 23,97 15,60
18С средний пул 13,4 20,1 11,9 9,1 8,3 8,4
19р средний пул 57,5 90,0 63,8 36,5 47,0 69,1
о,с средний пул МП МП ΝΚ ΝΚ ΝΚ ΝΚ
емс 19А !С %серо 0,06 0,04-0,1 33% 0,09 0,05-0,14 47% 0,25 0,15-0,41 83% 0,08 0,06-0,12 53% 0,23 0,14-0,38 80% 0,19 0,09-0,3 73%
емс 22Е 1С %серо МП 0% 5,81 3,2-10,6 97% 3,76 1,8-7,9 90% 0,54 0,3-1,1 77% 0,85 0,4-1,7 87% 2,02 1,2-3,4 97%
Пример 9. Иммуногенность 13-валентных Р8-конъюгатов, содержащих 19А-бР1у и 22Е-РЕФ, у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 30 молодых Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 11-валентных Р8-конъюгатов, либо 13-валентных Р8-конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-валентная вакцинная композиция содержала по 0,1 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РО, Р83-РО, Р84-РО, Р85-РО, Р86В-РИ, Р87Е-РИ, Р89У-РИ, Р814-РО, Р818С-ТТ, Р819Е-ОТ и Р823Е-РИ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2).
13-валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Е-РЕФ (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой ОМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8221' использовали Р11Е), в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию Р1ц[)-Е (конструкция УР147 из АО 03/054007). В группе 6 конъюгировали 19А с дифтерийным анатоксином, а 22Е - с белком Ώ.
Уровни анти-Р819А и 22Е ЕЕ18А 1дО измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЫ8А 1дО-ответ, полученный на остальные Р8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
- 35 014649
19Α-άΡ1у и 22Ι'-ΡΙιΙ[), введенные в составе 13-валентной конъюгатной вакцинной композиции, демонстрировали иммуногенность у молодых Ва1Ъ/с мышей (табл. 16). Иммунный ответ, индуцированный против остальных Ρ8, не оказывал негативного воздействия на мышей, получавших 13-валентную композицию, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентной композицией.
Таблица 16
Ρ8 иммуногенность у молодых Ва1Ъ/с мышей (розЫП уровни 1дО)
Ва1ЬС мыши
ЕИ8А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал.
19А-йР1у 19А-с1Р1у 19А-с1Р1у 19А-бР)у
дтЬз формол дтЬз формол 19Α-ϋΤ
22Р-РКЮ 22Р-РКЮ 22Р-РКЮ-Е 22Е-РКЮ-Е 22Р-РО
0,1мкг750мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкп 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл
Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С
1 средний пул 131,70 101,20 83,00 82,40 67,90 85,50
3 средний пул 21,85 10,38 12,53 8,83 8,73 14,98
4 средний пул 147,4 127,0 104,4 95,0 113,6 114,2
5 средний пул 21,38 20,29 18,26 18,95 18,02 23,04
6В средний пул 1,97 4,76 3,72 2,35 1,43 1,05
7Р средний пул 7,69 4,58 4,77 4,24 3,92 3,94
9ν средний пул 30,1 30,7 26,5 21,4 23,4 28,3
14 средний пул 28,78 27,67 26,23 21,54 24,34 13,73
18С средний пул 53,4 52,37 46,5 57,8 47,8 75,8
19Е средний пул 186,6 157,7 169,3 178,9 181,9 223,2
23Г средний пул 4,98 3,9 5,11 0,57 3,13 4,57
СМС 0,4 32,8 25,1 21,6 18,9 23,5
19А 1С 0,2-0,6 26,6-40,7 20,6-30,6 17,5-26,7 15,1-23,5 19,5-28,5
%серо 93% 100% 100% 100% 100% 100%
СМС ΝΚ 3,99 3,76 6,27 8,70 18,76
22Р 1С 1,9-8,42 1,8-8 3,8-10,4 5,4-13,9 15,2-23,1
%серо 0% 93% 100% 100% 100% 100%
Пример 10. Иммуногенность 13-валентных Ρ8-конъюгатов, содержащих 19Α-άΡ1у и 22Γ-ΡΗΐΏ, у морских свинок.
Группы из 20 молодых морских свинок (линия НагЙеу; в возрасте 5 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 125 мкл либо 11-валентных Ρ8-конъюгатов, либо 13-валентных Ρ8конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-валентная вакцинная композиция содержала по 0,25 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Ρ81-ΡΏ, Ρ83-ΡΏ, Ρ84-ΡΏ, Ρ85-ΡΏ, Ρ86В-Ρ^, Ρ87Γ-ΡΏ, Ρ89ν-ΡΏ, Ρ814-ΡΏ, Ρ818ΩΓΓ, Ρ819Γ-^Т и Ρ823Γ-ΡΏ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2).
13-валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Ρ819Α-άΡ1у и Ρ822Γ-ΡΗΦ (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Г]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой ΘΜВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Ρ822Γ использовали ΡΙ11Ι), в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию ΡΙιΙ[)-Ε (конструкция УТ147 из νϋ 03/054007). В группе 6 конъюгировали 19А с дифтерийным анатоксином, а 22Г - с белком Ώ.
Уровни анти-Ρ819А и 221' ЕЫ8А 1дО измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЫ8А 1дО-ответ, полученный на остальные Ρ8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
- 36 014649
Таблица 17
Ρδ-иммуногенность у молодых морских свинок (ро81-Ш уровни 1дС)
Морские свинки
ЕЫ8А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал. 11-вал. 11-вал. 11 -вал. 11-вал. 11-вал.
19А-с1Р1у 19А-6Р1у 19А-с1Р1у 19А-с1Р1у
дгпЬз формол дтЬз формол 19А-ОТ
22Р-РЙЮ 22Р-Р11Ю 22Р-РНЮ-Е 22Ρ-Ρήίϋ-Ε 22Р-РО
0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1 мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1 мкг/50мкл
Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С
1 средний пул 78,00 77,21 76,15 68,77 68,59 81,04
3 средний пул 7,75 9,31 12,73 7,94 4,75 9,59
4 средний пул 130,7 94,4 132,6 166,8 85,0 101,3
5 средний пул 109,10 117,10 110,70 158,40 74,10 100,40
6В средний пул 3,14 4,26 14,4 7,63 6,3 7,52
7Р средний пул 154,2 216,0 240,0 181,0 142,0 179,1
9У средний пул 90,69 105,45 98,20 93,45 54,12 73,05
14 средний пул 71,19 77,18 46,53 59,67 38,47 53,69
18С средний пул 109,4 122,3 137,1 79,9 73,7 83,1
19Р средний пул 73,9 102,5 112,2 75,5 62,3 72,1
23Р средний пул 19,19 30,74 29,44 31,52 19,13 24,94
СМС 0,4 25,58 41,49 14,25 27,49 6,74
19А !С 0,24-0,68 12-54,5 24,4-70,5 5,9-34,6 16,6-45,4 4-11,3
%серо 75% 100% 100% 100% 100% 100%
СМС 0,12 2,51 3,67 45,74 30,68 96,38
22Р 1С 0,09-0,16 0,94-6,73 1,59-8,42 29,3-71,4 17-53,3 73,5-126,4
%серо 10% 95% 95% 100% 100% 100%
Пример 11. Приготовленные и протестированные композиции.
а) Приготавливают следующие композиции (используя 13-валентную вакцину из табл. 1 и серотип 3 из табл. 5 - см. комментарий к 14-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Ε или через линкер АБН]). Сахариды приготавливают с фосфатом алюминия и 3Ό-ΜΡ^ как показано в табл. 18.
Таблица 18
14-валентная 25 мкг МР1_ Суммарное содержание алюминия (РР) в 14-валентная 10 мкг ΜΡί Суммарное содержание алюминия (РР) в ВАС На дозу:
ВАС
На Дозу:
Р8 носитель ΜΚΓ Ρ8 ΜΚΓ ΜΡΙ_ ОТНОШ. Ρ8/ΑΙ 1/χ ΜΚΓ ΑΙ Р8 носитель мкг Р8 мкг МРЬ ОТНОШ. Ρ8/ΑΙ 1/х мкг ΑΙ
1 Ρϋ 1 10 10 1 РО 1 10 10
3 Ρϋ 1 10 10 3 РО 1 10 10
4 Ρϋ 3 10 30 4 РО 3 10 30
5 РО 1 10 10 5 ρσ 1 10 10
6А Ρϋ 1 10 10 6А ρσ 1 10 10
6В Ρϋ 1 10 10 6В ρσ 1 10 10
7Р Ρϋ 1 10 10 7Р ρσ 1 10 10
9У Ρϋ 1 10 10 9У РО 1 10 10
14 Ρϋ 1 10 10 14 РО 1 10 10
18С ТТдн 3 15 45 18С ТТдн 3 15 45
19А ар|у 3 10 30 19А с!Р1у 3 10 30
19Р ϋΤ 3 10 30 19Р ϋΤ 3 10 30
22Р ΡΗΐΟ 3 10 30 22Р РМО 3 10 30
23Р ΡΟ 1 10 10 23Р РО 1 10 10
ВАС ΜΡΙ. 50/200 25 4 100 ВАС МР1_ 50/200 10 4 40
Содержание алюминия в РР Сумма = 355 Содержание алюминия в РР Сумма = 295
ВАС = бактериальный антигенный комплекс.
- 37 014649
б) В ту же сахаридную композицию добавляют каждый из следующих адъювантов (в табл. 19 показана концентрация компонентов эмульсии на 500 мкл дозы).
Ингредиенты ал ьфа-Т окоферол Сквален
Твин 80
Адъювант А1
250 мкл водномасляной эмульсии 11,88 мг 10,7 мг 4,85 мг
Адъювант А2
125 мкл водномасляной эмульсии 5,94 мг 5,35 мг
2,43 мг
Таблица 19
Адъювант АЗ мкл водномасляной эмульсии 2,38 мг 2,14 мг
0,97 мг
Адъювант А4 250 мкл водно- Адъювант А5 250 мкл водно- Адъювант А6 125 мкл водно- Адъювант А7 50 мкл водно-
Ингредиенты масляной масляной масляной масляной
эмульсии эмульсии эмульсии эмульсии
альфаТокоферол 11,88 мг 11,88 мг 5,94 мг 2,38 мг
Сквален 10,7 мг 10,7 мг 5,35 мг 2,14 мг
Твин 80 4,85 мг 4,85 мг 2,43 мг 0,97 мг
ЗО-МРЬ 50 мкг 25 мкг 25 мкг 10 мкг
в) Сахариды также готовят в виде препарата с двумя адъювантами на основе липосом.
Состав адъюванта В качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Липосомы:
ЭОРС: 1 мг;
холестерин: 0,25 мг;
3П-МРЬ: 50 мкг;
9821: 50 мкг;
буфер: 3,124 мг КИЛО;
буфер: 0,290 мг \а211РО.|;
№С1: 2,922 мг (100 мМ);
νΡΣ добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,1.
1. Полная концентрация РО4=50 мМ.
Состав адъюванта В2 качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Липосомы:
ВОРС: 0,5 мг;
холестерин: 0,125 мг;
3П-МРЬ: 25 мкг;
9821: 25 мкг;
буфер: 3,124 мг КИЛО;
буфер: 0,290 мг ΜυΙ 1РО.|;
№С1: 2,922 мг (100 мМ);
νΡΣ добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,1.
г) Сахариды также готовят в виде препарата с адъювантом С (см. выше для других композиций, в которых был использован этот адъювант).
Состав адъюванта С качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Эмульсия масло-в-воде: 50 мкл:
Сквален: 2,136 мг; α-токоферол: 2,372 мг;
Твин 80: 0,97 мг;
холестерин: 0,1 мг;
3П-МРЬ: 50 мкг;
9821: 50 мкг;
буфер: 0,470 мг К^РОд;
буфер: 0,219 мг ΜυΙ 1РО.|;
№С1, 4,003 мг (137 мМ);
КС1: 0,101 мг (2,7 мМ).
νΡΣ добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя; рН 6,8.
- 38 014649
Пример 12. Влияние химии конъюгирования на иммуногенность конъюгата 22Ρ-ΡΗΙΌ у Ва1Ь/с мышей.
Группы из 30 самок Ва1Ь/с мышей иммунизировали внутримышечным (в/м) способом на 0-, 14- и 28-е сутки 13-валентными Ρδ-композициями, содержащими Ρδ 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 19А, 19Е, 22Е и 23Е (доза: 0,3 мкг сахарида/Ρδ для Ρδ 4, 18С, 19А, 19Е и 22Е и 0,1 мкг сахарида/Ρδ для остальных Ρδ).
Ρ818С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Е - с дифтерийным анатоксином, 19А - с детоксифицированным формолом Ρ1γ, 22Е - с ΡΕίΌ, а остальные Ρ8 - с ΡΌ.
Сравнивали две композиции, состоящие либо из 221^1110, полученного посредством прямой С^ΑΡ-химии, либо 22Е-ΑΗ-ΡΕί^ (Α^Η-дериватизированный Ρ8). Характеристики 13-валентной вакцины, приготовленной либо с использованием 22Е, конъюгированного непосредственно, либо через спейсер ΑΌΗ см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2. Вакцинные композиции были дополнены адъювантом С.
Уровни ΕΌΙδΑ анти-Ρ822Е 1дО и опсонофагоцитарные титры измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
22^^4^1110 показал себя намного более иммуногенным, чем 22Ρ-Ρ111Ό в исчислении как уровней 1дС (фиг. 5), так и опсонофагоцитарных титров (фиг. 6).
Пример 13. Влияние новых адъювантов на иммуногенность конъюгатов на основе капсульных Ρ8 81гер1оссоссн5 риеитошае.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей иммунизировали в/м способом на 0-, 14- и 28-е сутки 13-валентными Ρ8 композициями, содержащими Ρ8 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 19А, 19Е, 22Е и 23Е (доза: 0,3 мкг/Ρδ для Ρδ 4, 18С, 19А, 19Е и 22Е и 0,1 мкг/Ρδ для других Ρδ).
Ρδ18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Е - с дифтерийным анатоксином, 19А - с детоксифицированным формолом Ρ1γ, 22Е - с ΡΕίΟ, а остальные Ρδ - с ΡΌ. Характеристики 13-валентной вакцины, приготовленной с непосредственно конъюгированным 22Е, см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2.
Сравнивали четыре композиции, дополненные либо Α1ΡΟ4, адъювантом А1, адъювантом А4, либо адъювантом А5.
Уровни анти-Ρδ, Ρ1γ, ΡΕίΟ и ΡΟ ΕΌΙδΑ 1дО измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки и объединенных в группе. Для каждого антигена рассчитывали следующее соотношение: уровень 1дО, индуцированный новым протестированным адъювантом/уровень 1дО, индуцированный Α1ΡΟ4.
Все протестированные новые адъюванты улучшали по меньшей мере в 2 раза иммунные ответы на 13-валентные конъюгаты по сравнению с классической композицией Α1ΡΟ4 (фиг. 7).
Пример 14. Защитная эффективность комбинации (сотЬо) ΡΕίΟ/детоксифицированный Ρ1γ в модели пневмококковой пневмонии у обезьян.
Группы из 6 макак-резус (в возрасте от 3 до 8 лет), отобранных как имеющие самые низкие уровни анти-19Е антител до иммунизации, иммунизировали внутримышечно на 0- и 28-е сутки либо 11-валентными Ρδ-конъюгатами (т.е. 1 мкг Ρδ 1, 3, 5, 6В, 7Е, 9У, 14 и 23Е и 3 мкг Ρδ 4, 18С и 19Е), либо ΡΕίΟ (10 мкг)+детоксифицированный формолом Ρ1γ (10 мкг), либо только адъювантом.
Ρδ18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Е - с дифтерийным анатоксином, а остальные Ρδ - с ΡΌ. Характеристики 11-валентной вакцины см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2.
Все композиции были дополнены адъювантом С.
Пневмококки типа 19Е (5х108 КОЕ (колониеобразующих единиц)) инокулировали в правое легкое на 42-е сутки. Колонии подсчитывали в бронхоальвеолярных лаважах, собранных на 1-, 3- и 7-е сутки после контрольного заражения. Результаты выражали в виде количества животных на группу либо умерших, с колонизированным легким, либо с чистым легким на 7-е сутки после контрольного заражения.
Как показано на фиг. 8, хорошая защита, близкая к статистически значимой (несмотря на небольшое количество используемых животных) была получена при использовании 11-валентных конъюгатов и ΡΕίΌ+άΡ1γ сотЬо (р<0,12, точный тест Фишера) по сравнению с группой только с одним адъювантом.
Пример 15. Влияние химии конъюгирования на анти-ΡΕίΌ антительный ответ и защитную эффективность против контрольного заражения 4 типа, индуцированных конъюгатами 22Е-ΡΕίΡ.
Группы из 20 самок ОЕ1 мышей иммунизировали внутримышечным способом на 0- и 14-е сутки, используя 3 мкг либо 22Ρ-ΡΗΙΌ (приготовленного с применением прямой С^ΑΡ-химии), либо 22Е-ΑΗΡΕίΌ (Α^Η-дериватизированного Ρδ), либо только адъюванта. Оба моновалентных конъюгата на основе 22Е готовили способами примера 2 (см. также табл. 1 и 2). Каждая композиция была дополнена адъювантом С.
Уровни анти-ΡΕίΌ ΕΌΙδΑ 1дО измеряли в образцах сыворотки, собранных на 27-е сутки.
- 39 014649
Проводили контрольное заражение мышей, интраназально с использованием 5х106 КОЕ пневмококков IV типа на 28-е сутки (т.е. пневмококкового серотипа, потенциально не охватываемого Р8, присутствующим в тестируемой вакцинной композиции). Вызываемую смертность регистрировали до срока 8 суток включительно после контрольного заражения.
22Р-АН-РМО индуцировал значительно более высокий анти-РМЭ [дС-ответ и лучшую защиту против контрольного заражения IV типа по сравнению с 22Р-РМО.

Claims (16)

1. Иммуногенная композиция для младенцев, содержащая поливалентную вакцину против 8!гер!ососсик рпеитошае, содержащую два или более (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) конъюгатов капсульных сахаридов разных серотипов, где указанная композиция содержит конъюгат сахарида серотипа 22Р.
2. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая конъюгаты капсульных сахаридов 8.рпеитошае 4, 6В, 9ν, 14, 18С и 23Р.
3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где два разных белка-носителя отдельно конъюгированы по меньшей мере с двумя разными серотипами капсульных сахаридов 8.рпеитошае.
4. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-3, содержащая капсульный сахарид 22Р, конъюгированный с белком-носителем через линкер.
5. Иммуногенная композиция по п.4, где линкер представляет собой АИН.
6. Иммуногенная композиция по п.4 или 5, где линкер присоединен к белку-носителю посредством карбодиимидной химии, предпочтительно с использованием ЕИАС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид).
7. Иммуногенная композиция по любому из пп.4-6, где сахарид 22Р конъюгирован с белкомносителем или с линкером с использованием химии СИАР (1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборат).
8. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-7, содержащая конъюгат сахарида 22Р, где отношение белка-носителя к сахариду 22Р составляет от 5:1 до 1:5, от 4:1 до 1:1 или от 2:1 до 1:1 (мас./мас.).
9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, содержащая конъюгат сахарида 22Р, где средний размер (например, М„) сахарида 22Р составляет более 100 кДа.
10. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-9, дополнительно содержащая один или более неконъюгированных или конъюгированных белков 8.рпеитошае.
11. Иммуногенная композиция по п.10, где указанный один или более белок 8.рпеитошае выбран из белков полигистидинового триадного семейства (Р1!Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, семейства Ьу!Х, укороченных Ьу!Х, химерных белков укороченный СЬрХ-укороченный Ьу!Х, детоксифицированного пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и8р133.
12. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-11, дополнительно содержащая адъювант.
13. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп.1-12 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
14. Способ изготовления вакцины по п.13, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по любому из пп.1-12 с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
15. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-12 или вакцины по п.13 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией 8!гер!ососсик рпеитошае.
16. Иммуногенная композиция, включающая по меньшей мере четыре конъюгата капсульных сахаридов 8.рпеитоп1ае, содержащих сахариды разных серотипов 8.рпеитошае, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с РМЭ или его слитым белком, и указанная иммуногенная композиция способна индуцировать эффективный иммунный ответ против Р111Э.
EA200801374A 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина EA014649B1 (ru)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0526232A GB0526232D0 (en) 2005-12-22 2005-12-22 Vaccine
GBGB0607088.2A GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0607087A GB0607087D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0609902A GB0609902D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Novel composition
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620816A GB0620816D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 vaccine
GB0620815A GB0620815D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 Vaccine
PCT/GB2006/004634 WO2007068907A2 (en) 2005-12-13 2006-12-12 Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
PCT/EP2006/069979 WO2007071711A2 (en) 2005-12-22 2006-12-20 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801374A1 EA200801374A1 (ru) 2008-12-30
EA014649B1 true EA014649B1 (ru) 2010-12-30

Family

ID=39133667

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801367A EA014107B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA200801344A EA014165B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина
EA200801374A EA014649B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801367A EA014107B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA200801344A EA014165B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина

Country Status (37)

Country Link
US (10) US20090010959A1 (ru)
EP (10) EP1962899B1 (ru)
JP (7) JP5792920B2 (ru)
KR (5) KR101418240B1 (ru)
CN (6) CN101378779B (ru)
AR (3) AR058707A1 (ru)
AT (1) ATE520415T1 (ru)
AU (4) AU2006327040B2 (ru)
BR (3) BRPI0620193B8 (ru)
CA (5) CA2808919C (ru)
CL (1) CL2013002106A1 (ru)
CR (2) CR10119A (ru)
CY (5) CY1112677T1 (ru)
DK (5) DK1973564T3 (ru)
EA (3) EA014107B1 (ru)
ES (4) ES2630759T3 (ru)
HK (1) HK1120230A1 (ru)
HR (4) HRP20110685T1 (ru)
HU (3) HUE033081T2 (ru)
IL (5) IL191911A (ru)
JO (1) JO2813B1 (ru)
LT (3) LT1973564T (ru)
MA (3) MA30066B1 (ru)
MX (2) MX2008008140A (ru)
MY (4) MY147495A (ru)
NO (4) NO345368B1 (ru)
NZ (4) NZ569076A (ru)
PE (2) PE20071058A1 (ru)
PH (1) PH12014502544A1 (ru)
PL (5) PL2384765T3 (ru)
PT (5) PT2384765T (ru)
SG (1) SG168517A1 (ru)
SI (5) SI3017827T1 (ru)
TR (1) TR201900418T4 (ru)
TW (4) TWI465248B (ru)
UA (2) UA96934C2 (ru)
WO (3) WO2007071710A2 (ru)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1296715E (pt) * 2000-06-29 2012-01-19 Smithkline Beecham Biolog Composição vacinal multivalente
DE60117164T2 (de) * 2000-11-07 2006-08-03 Immuno Vaccine Technologies Inc., Halifax Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR101408113B1 (ko) 2005-06-27 2014-06-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신 제조 방법
CA2808919C (en) * 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
WO2008022298A2 (en) * 2006-08-17 2008-02-21 The Uab Research Foundation Immunogenic pcpa polypeptides and uses thereof
EP2155244B1 (en) * 2007-04-23 2017-03-22 Serum Institute of India Private Limited Antigenic polysaccharides and process for their preparation
EP2142211A1 (en) 2007-05-02 2010-01-13 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
JP5731198B2 (ja) 2007-09-27 2015-06-10 イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． インビボでのポリヌクレオチドの送達のための連続疎水相を含む担体におけるリポソームの使用
JP5701058B2 (ja) 2007-10-19 2015-04-15 ノバルティス アーゲー 髄膜炎菌ワクチン処方物
WO2009094730A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Newcastle Innovation Limited Vaccine compositions
EA201001478A1 (ru) * 2008-04-16 2011-06-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
KR20110009157A (ko) * 2008-04-16 2011-01-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
WO2009143413A1 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Children'smedical Center Corporation Synergistic immunogenic fusion protein-polysaccharide conjugate
JP5715051B2 (ja) 2008-06-05 2015-05-07 イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． リポソーム、抗原、ポリヌクレオチド及び疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
AU2009329193A1 (en) 2008-12-17 2011-07-14 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
CA2756398A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations including pneumococcal serotype 14 saccharide
NZ595234A (en) 2009-03-24 2013-12-20 Novartis Ag Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
CA2756533A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
WO2010125480A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010141312A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
CN102695523A (zh) 2009-09-10 2012-09-26 诺华有限公司 针对呼吸道疾病的组合疫苗
KR20110068831A (ko) * 2009-12-16 2011-06-22 재단법인 전라남도생물산업진흥재단 리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
GB201003924D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
EP2585106A1 (en) 2010-06-25 2013-05-01 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding proteins
CA2810971C (en) 2010-09-10 2020-11-03 Novartis Ag Developments in meningococcal outer membrane vesicles
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
EP2680885B8 (en) * 2011-03-02 2018-07-25 GlaxoSmithKline Biologicals SA Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
US20140072622A1 (en) * 2011-05-17 2014-03-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae
US10105435B2 (en) 2011-10-06 2018-10-23 Immunovaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of TLR2 and uses thereof
US10596246B2 (en) 2011-12-29 2020-03-24 Glaxosmithkline Biological Sa Adjuvanted combinations of meningococcal factor H binding proteins
DK2809349T3 (da) * 2012-01-30 2019-02-18 Serum Institute Of India Pvt Ltd Immunogen sammensætning
EP3299467B1 (en) 2012-02-02 2021-08-11 GlaxoSmithKline Biologicals SA Promoters for increased protein expression in meningococcus
ES2729967T3 (es) * 2012-02-07 2019-11-07 Infectious Disease Res Inst Formulaciones de adyuvante mejoradas que comprenden agonistas de TLR4 y métodos para usar las mismas
JP2015510872A (ja) * 2012-03-07 2015-04-13 ノバルティス アーゲー Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原の増強された製剤
CN104159603A (zh) 2012-03-08 2014-11-19 诺华股份有限公司 带有tlr4激动剂的联合疫苗
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
CN104487086B (zh) * 2012-07-07 2019-08-30 巴拉特生物技术国际有限公司 无动物源的不含酒精的疫苗组合物及其制备方法
HUE041381T2 (hu) * 2012-08-16 2019-05-28 Pfizer Glikokonjugációs eljárások és kompozíciók
RU2015106930A (ru) 2012-09-06 2016-10-20 Новартис Аг Комбинированные вакцины с менингококком серогруппы в и к/д/с
WO2014045621A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 国立大学法人大阪大学 肺炎球菌表面タンパク質ａを含む肺炎球菌ワクチン
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075196A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
EP2934574A1 (en) 2012-12-18 2015-10-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Conjugates for protecting against diphtheria and/or tetanus
WO2014097099A2 (en) * 2012-12-20 2014-06-26 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
RU2544168C1 (ru) * 2014-01-17 2015-03-10 Андрей Дмитриевич Протасов Способ формирования иммунологической памяти к антигенам streptococcus pneumoniae у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
RU2710393C2 (ru) 2014-01-21 2019-12-26 Пфайзер Инк. Способ получения иммуногенного конъюгата капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae-белок-носитель
PL3583947T3 (pl) * 2014-01-21 2024-04-02 Pfizer Inc. Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PL3096785T3 (pl) * 2014-01-21 2021-03-08 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne zawierające skoniugowane antygeny sacharydów otoczkowych i ich zastosowania
EP3443983B1 (en) * 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
CN103936842B (zh) * 2014-04-30 2016-03-23 重庆医科大学 肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EA035117B1 (ru) * 2014-11-20 2020-04-29 Байолоджикал И Лимитед Кодон-оптимизированный полинуклеотид для экспрессии crmна высоком уровне
AU2016236770B2 (en) * 2015-03-26 2022-03-10 Gpn Vaccines Pty Ltd Streptococcal vaccine
IL297740A (en) 2015-05-04 2022-12-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing the conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
BR112017026343A2 (pt) * 2015-06-08 2019-11-19 Serum Inst Of India Private Ltd métodos para aperfeiçoar a adsorção de conjugados de proteína-polissacarídeo e formulação de vacina multivalente assim obtida
RU2600838C1 (ru) * 2015-06-08 2016-10-27 Андрей Дмитриевич Протасов Способ усиления активности факторов неспецифической защиты у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
KR20160146240A (ko) 2015-06-12 2016-12-21 전관구 염기성 계면활성제를 이용한 산화은나노 및 은나노 제조 방법
DK3313436T3 (da) 2015-06-23 2021-03-08 Biological E Ltd Multivalent pneumokok-konjugatvaccine
MY192183A (en) * 2015-07-21 2022-08-05 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201522068D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
AU2017306708B2 (en) 2016-08-05 2021-08-26 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
SG11201900794PA (en) 2016-08-05 2019-02-27 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
MX2019002489A (es) 2016-09-02 2019-10-21 Sanofi Pasteur Inc Vacuna contra neisseria meningitidis.
EP3518963A4 (en) * 2016-09-27 2020-06-10 ImmunoVaccine Technologies Inc. METHOD FOR USE OF B-CELL EPITOP COMPOSITIONS WITH LOW DOSAGE VOLUME FOR INDUCING AN ANTIBODY IMMUNE REACTION IN PERSONS
EP3518965A1 (en) * 2016-09-30 2019-08-07 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
KR102388325B1 (ko) 2016-10-20 2022-04-18 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤 저분자화 PRP를 사용한 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법
KR102083973B1 (ko) * 2016-10-28 2020-04-23 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
CN108144052A (zh) * 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物及其制取方法和用途
EP3562838A2 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Henriques Normark, Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
WO2018126229A2 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Sutrovax, Inc. Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
CN110198735A (zh) * 2017-01-20 2019-09-03 辉瑞公司 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物
US20200222550A1 (en) 2017-01-31 2020-07-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f
US11246918B2 (en) 2017-02-03 2022-02-15 Eva Barbara Schadeck Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN107929728A (zh) * 2017-04-19 2018-04-20 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎球菌蛋白疫苗及其制备方法
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
BR112019026192B1 (pt) 2017-06-10 2022-05-10 Inventprise, Llc Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas
WO2019043245A1 (en) * 2017-09-04 2019-03-07 London School Of Hygiene And Tropical Medicine MICROBIAL CELLS EXPRESSING STREPTOCOCCAL SERROTYPES
CA3074714A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
CN111065387B (zh) 2017-09-07 2023-08-25 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
MX2020002557A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
GEP20227420B (en) 2017-12-06 2022-10-10 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
AU2019215216A1 (en) 2018-02-05 2020-07-23 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
MX2020007939A (es) 2018-02-05 2020-09-03 Sanofi Pasteur Inc Composicion del conjugado proteina-polisacarido multivalente nuemococica.
BR112020021296A2 (pt) 2018-04-18 2021-01-26 Sk Bioscience Co., Ltd. polissacarídeo capsular de streptococcus pneumoniae e conjugado imunogênico do mesmo
EP3787673A4 (en) 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. METHODS FOR PRODUCING CAPSULAR CARRIER PROTEIN-POLYSACCHARIDE CONJUGATES OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
US11896656B2 (en) 2018-04-30 2024-02-13 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
EP3787674A4 (en) * 2018-04-30 2022-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLYSACCHARIDE CAPSULAR PROTEIN CONJUGATES FROM LYOSPHERES
CN108524926B (zh) * 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
AU2019299836A1 (en) * 2018-07-04 2021-02-25 Vaxcyte, Inc. Improvements in immunogenic conjugates
JP2021535921A (ja) * 2018-09-12 2021-12-23 アフィニバックス、インコーポレイテッド 多価肺炎球菌ワクチン
JOP20210148A1 (ar) 2018-12-19 2023-01-30 Merck Sharp & Dohme تركيبات تشتمل على متقارنات بولي سكاريد-بروتين للمكورات العقدية الرئوية وطرق استخدامها
AU2020315673A1 (en) * 2019-07-18 2022-02-10 Celltrion, Inc. Immunogenic composition comprising multivalent Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
US20210070890A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Serum Institute Of India Private Limited Method for obtaining purified bacterial polysaccharides
BR112022002467A2 (pt) 2019-09-18 2022-07-19 Alcon Inc Insertos oculares de hidrogel suave embalados a úmido
EP4090364A4 (en) * 2020-01-17 2024-02-21 Inventprise, Inc. MULTIVALENT STREPTOCOCCAL VACCINES
KR20210117663A (ko) 2020-03-20 2021-09-29 주식회사 보고 수직형 침지식 dpf 세척장치
CN113293115B (zh) * 2021-07-08 2022-08-26 成都生物制品研究所有限责任公司 肺炎链球菌无动物源冻干保护剂
KR20240055283A (ko) 2022-10-20 2024-04-29 우남철 Ｄｐｆ용 순환펌프 연결구

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056360A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against antigens from bacteriae
WO2002000249A2 (en) * 2000-06-29 2002-01-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Multivalent vaccine composition
US20030099672A1 (en) * 2000-03-17 2003-05-29 Dominique Schultz Pneumococcus polysaccharide conjugates for use as vaccine against tetanus an diphtheria
WO2003051392A2 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine

Family Cites Families (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4619828A (en) 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
JP2851288B2 (ja) 1987-06-05 1999-01-27 アメリカ合衆国 癌診断および管理における自己分泌運動性因子
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5785973A (en) * 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JP3237842B2 (ja) 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
EP0382271B1 (en) 1989-02-04 1994-12-21 Akzo Nobel N.V. Tocols as adjuvant in vaccine
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
AU651949B2 (en) 1989-07-14 1994-08-11 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
IL98715A0 (en) 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
DK0571538T5 (da) 1991-02-15 2002-03-04 Uab Research Foundation Strukturgen for pneumokokprotein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
AU4230493A (en) 1992-05-06 1993-11-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
JP3428646B2 (ja) 1992-06-18 2003-07-22 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバードカレッジ ジフテリア毒素ワクチン
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
HU219056B (hu) 1993-03-23 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals Sa 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény
EP1300156A3 (en) 1993-05-18 2003-05-07 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
DK0729473T3 (da) 1993-11-17 2000-10-30 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Glucosamin-disaccharider, fremgangsmåde til deres fremstilling farmaceutisk sammensætning deraf og deres anvendelse
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
ATE241384T1 (de) 1995-03-22 2003-06-15 Jackson H M Found Military Med Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
AR008242A1 (es) 1996-06-18 1999-12-29 Alza Corp Dispositivo para atravesar el estrato corneo de una superficie corporal
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
EP0941335A2 (en) 1996-10-31 1999-09-15 Human Genome Sciences Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
US6291654B1 (en) 1996-11-12 2001-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Method for isolating a C3 binding protein of streptococcus pneumoniae
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
AU722574B2 (en) 1996-12-20 2000-08-10 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
AU739129B2 (en) 1997-06-03 2001-10-04 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
KR100619350B1 (ko) 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
DE69838992T2 (de) 1997-09-05 2008-12-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart Öl-in-Wasser Emulsionen mit Saponinen
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1017828A1 (en) 1997-09-24 2000-07-12 Regents Of The University Of Minnesota HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US5965714A (en) * 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
AU756828B2 (en) 1997-12-02 2003-01-23 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) * 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
TR200003498T2 (tr) 1998-04-07 2001-10-22 St. Jude Children's Research Hospital Amino asit sekansından oluşan bir polipetit, bunun aşıları ve kullanımları
EP1067962B1 (en) 1998-04-07 2010-03-24 MedImmune, LLC Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
AU770378B2 (en) 1998-04-23 2004-02-19 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C(PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
EP1089913A1 (fr) 1998-06-08 2001-04-11 SCA Emballage France Emballage a remise a plat rapide
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU761396B2 (en) 1998-06-30 2003-06-05 Om Pharma Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
CN1263510C (zh) 1998-08-19 2006-07-12 巴克斯特健康护理股份有限公司 多糖－蛋白质缀合物或寡糖－蛋白质缀合物、其制备方法及其应用
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
IL142017A0 (en) 1998-09-24 2002-03-10 Univ Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
DE69935606T9 (de) 1998-10-16 2021-03-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvanzsysteme und impfstoffe
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
JP4689044B2 (ja) 1998-12-21 2011-05-25 メディミューン，インコーポレーテッド ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片
KR100802198B1 (ko) 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원
EP1034792A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
WO2000062800A2 (en) 1999-04-19 2000-10-26 Smithkline Beecham Biologicals Sa Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
JP2003501110A (ja) 1999-06-10 2003-01-14 メディミューン，インコーポレーテッド 肺炎連鎖球菌タンパク質とワクチン
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) * 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
AU1581400A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
WO2001098334A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
ES2261453T3 (es) 2000-08-04 2006-11-16 Corixa Corporation Nuevos compuestos inmunoefectores.
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2298269T3 (es) 2000-09-26 2008-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales.
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
US20030035806A1 (en) 2001-05-11 2003-02-20 D'ambra Anello J. Novel meningitis conjugate vaccine
FR2827199B1 (fr) 2001-07-10 2004-07-09 Centre Nat Rech Scient Procede et machine de fabrication ex situ de reseaux de biopuces basse et moyennes integration
GB0123580D0 (en) 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
AU2002351623A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
KR100885008B1 (ko) 2002-02-04 2009-02-20 코릭사 코포레이션 신규 면역효과기 화합물
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
WO2004011027A1 (en) 2002-07-30 2004-02-05 Baxter International Inc. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
KR101239242B1 (ko) 2002-08-02 2013-03-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 항원 조합물을 포함하는 나이세리아 백신 조성물
GB0220198D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture
JP3754420B2 (ja) 2003-02-04 2006-03-15 三洋電機株式会社 二次電池用電極板及びその製造方法並びにこの電極板を用いた二次電池
US8084235B2 (en) 2003-03-13 2011-12-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
CA2530364C (en) 2003-06-23 2014-03-18 Baxter International Inc. Vaccines against group y neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof
US8048432B2 (en) * 2003-08-06 2011-11-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugate vaccines
GB0323103D0 (en) * 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) * 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
BRPI0510315A (pt) 2004-04-30 2007-10-16 Chiron Srl integração de vacinação com conjugado meningocócico
JP5174457B2 (ja) 2004-05-11 2013-04-03 デ スタート デール ネーダーランデン， フェルテヘンウォールディヒィト ドール デ ミニステール ファン フォルクスヘーゾンドハイド， フェルザイン アン スポルト アジュバントとしての髄膜炎菌ｌｇｔＢＬＯＳ
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
GB0502096D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Purification of streptococcal capsular polysaccharide
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) * 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
KR101408113B1 (ko) 2005-06-27 2014-06-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신 제조 방법
BRPI0615420A2 (pt) 2005-09-01 2011-05-17 Novartis Vaccines & Diagnostic vacinação múltipla que inclui meningococo do sorogrupo c
WO2007053781A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Novartis Ag Compositions with antigens adsorbed to calcium phosphate
TWI457133B (zh) * 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA2808919C (en) * 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
PL2019657T3 (pl) 2006-04-26 2015-10-30 Micell Technologies Inc Powłoki zawierające wiele leków
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
AU2009335824B2 (en) 2008-12-18 2013-07-04 Wyeth Llc Method for controlling Streptococcus pneumoniae polysaccharide molecular weight using carbon

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056360A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against antigens from bacteriae
US20030099672A1 (en) * 2000-03-17 2003-05-29 Dominique Schultz Pneumococcus polysaccharide conjugates for use as vaccine against tetanus an diphtheria
WO2002000249A2 (en) * 2000-06-29 2002-01-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Multivalent vaccine composition
WO2003051392A2 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEALL BERNARD ET AL.: "Pre- and postvaccination clonal compositions of invasive pneumococcal serotypes for isolates collected in the United States in 1999, 2001, and 2002". JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. MAR. 2006, vol. 44, no. 3, March 2006 (2006-03), pages 999-1017, XP002438872, ISSN: 0095-1137, the whole document *
HAUSDORFF W.P. ET AL.: "Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I". CLINICAL INFECTIOUS DISEASES, THE UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, CHICAGO, IL, US, vol. 30, no. 1, 6 January, 2000 (2000-01-06), pages 100-121, XP002393673, ISSN: 1058-4838, abstract; figure 4, page 117, paragraph 4-paragraph 5 *
HENCKAERTS ISABELLE ET AL.: "Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children". VACCINE, vol. 25, no. 13, March 2007 (2007-03), pages 2518-2527, XP002438881, ISSN: 0264-410X, The date of the oral presentation corresponding to XP002438871 is disclosed, page 2525, right-hand column, paragraph 4, page 2519, left-hand column, paragraph 2 *
LEXAU CATHERINE A. ET AL.: "Changing epidemiology of invasive pneumococcal disease among older adults in the era of pediatric pneumococcal conjugate vaccine". JAMA: THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 26 OCT., 2005, vol. 294, no. 16, 26 October, 2005 (2005-10-26), pages 2043-2051, XP009085570, ISSN: 1538-3598, abstract, page 2049, right-hand column, last paragraph - page 2050, right-hand column, last paragraph *
MOORE, MATHEW R.: "Epidemiology of invasive pneumococcal disease in adults". INTERNET ARTICLE, [Online]. 17 November, 2005 (2005-11-17), XP002438871, Retrieved from the Internet: URL:http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/05/slides/5-4188s2_3.ppt>[retrieved on 2007-06-20], page 6-page 8 *
PRYMULA ET AL.: "Pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both Streptococcus pneumoniae and non-typable Haemophilus influenzae: a randomised double-blind efficacy study". LANCET THE, LANCET LIMITED. LONDON, GB, vol. 367, no. 9512, 4 March, 2006 (2006-03-04), pages 740-748, XP005320292, ISSN: 0140-6736, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201350129A (zh) 2013-12-16
JP2012211165A (ja) 2012-11-01
EP2384765A3 (en) 2012-06-20
EP2402025A3 (en) 2012-03-07
CA2634887C (en) 2016-01-19
PT1962899E (pt) 2011-10-19
CA2634887A1 (en) 2007-06-28
TW200738257A (en) 2007-10-16
KR101441368B1 (ko) 2014-09-24
MA30066B1 (fr) 2008-12-01
BRPI0620163B8 (pt) 2021-05-25
NO20190104A1 (no) 2008-09-18
DK2384765T3 (en) 2017-01-09
SI1973564T1 (sl) 2017-02-28
AU2006327036B2 (en) 2012-11-15
PH12014502544A1 (en) 2015-12-14
US20090017072A1 (en) 2009-01-15
HRP20161682T1 (hr) 2017-01-27
ES2630759T3 (es) 2017-08-23
CN110179974B (zh) 2024-01-09
DK1973564T3 (da) 2017-01-16
DK3017827T3 (en) 2019-02-18
KR20080081061A (ko) 2008-09-05
CY1116407T1 (el) 2017-02-08
NO346529B1 (no) 2022-09-26
PT3017827T (pt) 2019-01-28
AR058707A1 (es) 2008-02-20
PT1973564T (pt) 2017-01-24
US20180250389A9 (en) 2018-09-06
MX2008008140A (es) 2008-09-24
SI1962899T1 (sl) 2011-11-30
EP1968631A2 (en) 2008-09-17
JP5461838B2 (ja) 2014-04-02
KR101367237B1 (ko) 2014-03-14
PL1973564T3 (pl) 2017-04-28
HRP20161681T1 (hr) 2017-01-13
EP3470080A1 (en) 2019-04-17
NO20082647L (no) 2008-09-18
US20150265702A1 (en) 2015-09-24
EP2382986A3 (en) 2012-08-22
CN101378779A (zh) 2009-03-04
EP1973564B1 (en) 2016-11-09
JP2009520761A (ja) 2009-05-28
CA2816182A1 (en) 2007-06-28
JP2009520759A (ja) 2009-05-28
AU2006327040B2 (en) 2010-08-19
EA200801344A1 (ru) 2008-12-30
KR20140036327A (ko) 2014-03-25
EP3017827B1 (en) 2018-11-07
CA2634885C (en) 2016-04-19
US20220354941A1 (en) 2022-11-10
AU2006327041A1 (en) 2007-06-28
BRPI0620193A2 (pt) 2011-11-01
IL191911A0 (en) 2008-12-29
US20160243219A1 (en) 2016-08-25
JP2009520760A (ja) 2009-05-28
CR10119A (ru) 2008-07-29
MY148141A (en) 2013-03-15
UA96934C2 (ru) 2011-12-26
AR058706A1 (es) 2008-02-20
JP2014205673A (ja) 2014-10-30
KR20130103831A (ko) 2013-09-24
PL1968631T3 (pl) 2015-08-31
SI1968631T1 (sl) 2015-07-31
US9107872B2 (en) 2015-08-18
LT3017827T (lt) 2019-01-10
EP2384765A2 (en) 2011-11-09
IL219641A0 (en) 2012-06-28
TWI465248B (zh) 2014-12-21
JP2012232985A (ja) 2012-11-29
CA2634885A1 (en) 2007-06-28
PL1962899T3 (pl) 2011-12-30
US20090010959A1 (en) 2009-01-08
US10646564B2 (en) 2020-05-12
AU2006327036A1 (en) 2007-06-28
CY1118535T1 (el) 2017-07-12
EP1962899B1 (en) 2011-08-17
EA014107B1 (ru) 2010-10-29
NO345368B1 (no) 2021-01-04
EP3020411A1 (en) 2016-05-18
UA96583C2 (ru) 2011-11-25
WO2007071707A2 (en) 2007-06-28
MY147495A (en) 2012-12-14
CA2633772C (en) 2015-09-15
BRPI0620163B1 (pt) 2019-08-13
AU2006327040A1 (en) 2007-06-28
CN103251940A (zh) 2013-08-21
EA200801374A1 (ru) 2008-12-30
US20190262447A1 (en) 2019-08-29
EP1962899A2 (en) 2008-09-03
CN103585623B (zh) 2016-09-28
PT1968631E (pt) 2015-07-20
CN103585623A (zh) 2014-02-19
DK1968631T3 (da) 2015-06-15
KR20080081060A (ko) 2008-09-05
JP2012229228A (ja) 2012-11-22
LT1973564T (lt) 2016-12-27
EP1968631B1 (en) 2015-04-08
TWI487534B (zh) 2015-06-11
JP5615323B2 (ja) 2014-10-29
EP3017827A1 (en) 2016-05-11
HUE032903T2 (hu) 2017-11-28
SI3017827T1 (sl) 2019-01-31
NO20082646L (no) 2008-09-16
NZ569076A (en) 2011-08-26
WO2007071710A3 (en) 2007-11-29
EP1973564A2 (en) 2008-10-01
BRPI0620193B1 (pt) 2019-12-31
WO2007071711A2 (en) 2007-06-28
HRP20110685T1 (hr) 2011-10-31
CN101378778B (zh) 2013-02-06
EP2402025A2 (en) 2012-01-04
EA200801367A1 (ru) 2008-12-30
PT2384765T (pt) 2017-02-06
AR058592A1 (es) 2008-02-13
ATE520415T1 (de) 2011-09-15
IL211664A0 (en) 2011-05-31
CN101374548B (zh) 2013-05-01
PL2384765T3 (pl) 2017-05-31
HUE041979T2 (hu) 2019-06-28
KR101515078B1 (ko) 2015-04-24
IL191911A (en) 2015-09-24
US20150190521A1 (en) 2015-07-09
CA2808919C (en) 2016-04-19
CA2816182C (en) 2018-02-20
JP5792920B2 (ja) 2015-10-14
US20100074922A1 (en) 2010-03-25
LT2384765T (lt) 2017-01-10
MY150719A (en) 2014-02-28
BRPI0620460B8 (pt) 2021-05-25
US10279033B2 (en) 2019-05-07
JO2813B1 (en) 2014-09-15
BRPI0620460A2 (pt) 2011-11-16
KR20080081063A (ko) 2008-09-05
WO2007071711A3 (en) 2007-11-08
JP5600337B2 (ja) 2014-10-01
WO2007071710A8 (en) 2008-09-04
NZ596500A (en) 2013-05-31
CN110179974A (zh) 2019-08-30
HRP20190037T1 (hr) 2019-02-22
WO2007071710A2 (en) 2007-06-28
SG168517A1 (en) 2011-02-28
MX354843B (es) 2018-03-22
KR101365001B1 (ko) 2014-02-21
HK1120230A1 (en) 2009-03-27
US9884113B2 (en) 2018-02-06
NO343981B1 (no) 2019-08-05
BRPI0620460B1 (pt) 2019-08-13
JP5849125B2 (ja) 2016-01-27
NZ569168A (en) 2012-02-24
SI2384765T1 (sl) 2017-03-31
US20180207262A1 (en) 2018-07-26
ES2707499T3 (es) 2019-04-03
IL192084A0 (en) 2008-12-29
US20090017059A1 (en) 2009-01-15
US11400147B2 (en) 2022-08-02
EP2384765B1 (en) 2016-11-23
TR201900418T4 (tr) 2019-02-21
BRPI0620193B8 (pt) 2021-05-25
MA30062B1 (fr) 2008-12-01
CR10122A (ru) 2008-08-21
HUE033081T2 (hu) 2017-11-28
MA30065B1 (fr) 2008-12-01
NO20082718L (no) 2008-09-16
EA014165B1 (ru) 2010-10-29
EP3130348A1 (en) 2017-02-15
IL191913A (en) 2012-07-31
CY1112677T1 (el) 2016-02-10
CY1118345T1 (el) 2017-06-28
CN101378779B (zh) 2015-09-02
BRPI0620163A2 (pt) 2011-11-01
IL191913A0 (en) 2009-02-11
DK1962899T3 (da) 2011-10-31
ES2539795T3 (es) 2015-07-06
CN101374548A (zh) 2009-02-25
CN101378778A (zh) 2009-03-04
EP2382986A2 (en) 2011-11-02
CY1121376T1 (el) 2020-05-29
MY160199A (en) 2017-02-28
WO2007071707A3 (en) 2007-09-13
KR101418240B1 (ko) 2014-07-16
JP5749689B2 (ja) 2015-07-15
CA2808919A1 (en) 2007-06-28
TW200738258A (en) 2007-10-16
AU2010241281A1 (en) 2010-11-25
AU2010241281B2 (en) 2012-12-06
NO344187B1 (no) 2019-09-30
PE20071305A1 (es) 2007-12-14
IL192084A (en) 2013-11-28
AU2006327041B2 (en) 2010-08-26
PL3017827T3 (pl) 2019-04-30
JP5579387B2 (ja) 2014-08-27
TWI415622B (zh) 2013-11-21
CA2633772A1 (en) 2007-06-28
NZ569077A (en) 2011-08-26
IL219641A (en) 2017-10-31
ES2614938T3 (es) 2017-06-02
CL2013002106A1 (es) 2014-03-07
PE20071058A1 (es) 2007-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014649B1 (ru) Вакцина
CA2690710C (en) Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
EA015551B1 (ru) Конъюгатные вакцины
ES2369604T3 (es) Vacuna de conjugado de polisacáridos de neumococos.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU