CN103157108A - 免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用 - Google Patents
免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103157108A CN103157108A CN2011104167895A CN201110416789A CN103157108A CN 103157108 A CN103157108 A CN 103157108A CN 2011104167895 A CN2011104167895 A CN 2011104167895A CN 201110416789 A CN201110416789 A CN 201110416789A CN 103157108 A CN103157108 A CN 103157108A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immune modulator
- vaccine
- extract
- modulator composition
- immune
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用。所述免疫调节剂组合物由多种细菌多糖提取物组成,其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。该免疫调节剂组合物可刺激机体产生持续和作用显著的免疫调节功能,特别是非特异性免疫应答能力以及在此基础上继发产生的特异性免疫反应,同已上市的免疫调节剂相比,可在整体上提高人或动物抗感染、抗肿瘤和抗过敏能力。
Description
技术领域
本发明涉及组合物,具体涉及免疫调节剂组合物及其药物组合物。该免疫调节剂组合物是由多种细菌多糖提取物组成,其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
背景技术
人体免疫机能的下降是导致细菌、病毒等病原生物感染的重要原因之一。非特异性免疫反应(也称固有免疫应答)是人和脊椎动物对抗病原生物的第一道防线,机体通过固有的非特异免疫系统的模式识别受体(patternrecognition receptors,PRRs)对病原生物的模式识别分子(pathogenassociated molecule patterns,PAMPs)进行识别而启动非特异性免疫反应,继而引发特异性免疫反应(也称获得性免疫反应)从而达到清除病原生物,保护机体的作用。
非特异性免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能,即出生后就已具备的非特异性防御功能。非特异性免疫反应在机体的整个免疫反应中占据关键地位:它是机体对抗外来病原微生物入侵的第一道防线和监视哨,在机体早期发现和杀死入侵病原微生物过程中发挥着关键作用;它是机体一切免疫应答的基础,是特异性免疫反应的前提和基础;因此,调节非特异性免疫反应是机体增强防病和抗病能力的一个最重要方面(Kawai,T.et al.The role of pattern-recognition receptors in innateimmunity:update on Toll-like receptors.Nature Immunol.11,373-384(2010)8212)。
当病原细菌入侵宿主体内时,宿主通过表达于中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)上的PRRs特异性识别来源于病原细菌的多糖类PAMPs,启动宿主的非特异免疫和炎症反应,继而引发宿主的特异性免疫反应。研究表明:哺乳动物具有复杂的模式识别受体系统,它们主要包括Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、NLRs(NOD-like receptors)、RLR(RIG-like receptor)和MDA5(Melanoma differentiation associated gene5)及C型凝集素家族(C-type lectin family),这些模式识别受体系统相互协调,启动宿主的天然免疫反应,进而激发获得性免疫反应,完成对入侵病原生物的控制和消灭(Hajishengallis G,et al.Microbial manipulation ofreceptor crosstalk in innate immunity.Nature Reviews Immunology.2011(11)187-200)。
细菌多糖是一类非常重要的病原体模式识别分子(PAMPs),它可引起机体产生非特异免疫反应。在大多数细菌,尤其是致病菌,在其生长过程中表达大量的多糖,这些多糖以荚膜、糖蛋白或糖脂的形式存在于微生物细胞的表面。在细菌细胞中,几乎所有的多糖都是由甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺等十几种单糖组成的,但是单糖之间有多种不同的连接方式,可形成不同构型的直链和支链结构,通过单糖分子间氢键及基团的相互作用进一步又形成不同形状的高级结构。在病原细菌与宿主(人或动物)共生的进化过程中,很多多糖结构高度特异的表达分布于病原菌中,它们成为病原细菌被宿主天然免疫识别系统识别的主要分子标志,既病原体模式识别分子(PAMPs),包括革兰阴性菌的LPS、革兰阳性菌的脂磷壁酸(LTA)、细菌和真菌的胞壁的肽聚糖以及细菌胞壁的糖蛋白和糖脂中的末端甘露糖、岩藻糖、葡聚糖等多糖、核酸和脂类。细菌多糖类PAMP高度保守,为病原微生物所特有,在病原微生物激发非特异性免疫应答过程中起着关键作用。同时,细菌多糖能够被MHC II分子呈递并被αβ-TCR直接或者间接识别,从而激活获得性细胞免疫应答;多糖类物质亦能够有效地激活B淋巴细胞,诱导特异性抗体的产生。
当机体(人或动物)的非特异性免疫反应被细菌多糖激活,机体一方面启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路,刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF-α、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌,从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应,增强机体抗感染、过敏能力;另一方面参与非特异性和特异性免疫的NK细胞、效应T细胞等免疫细胞被活化,增强了机体免疫系统抗抗感染和抗肿瘤的能力(Simpson J L,et al.Innatey immunity inasthma.Paediatr Respir Rev.2008(9)263-270;E.Vivier,et al.“Functions ofnatural killer cells,”Nature Immunology.2008(9)503-510;)。
综上所述,非特异性免疫应答是一切免疫反应的基础,是人和动物抵抗外来病原生物入侵的第一道防线,是机体增强抗微生物感染、抗肿瘤、抗过敏能力的最重要方面,因此,研制可用于调节人或哺乳动物免疫反应,特别是非特异性免疫应答能力的细菌多糖免疫调节剂将具有重要的社会意义和经济价值。
早在19世纪,人们已认识到引起人和动物结核病的是各型结核杆菌。后来又发现。另有一些非结核杆菌,也能引起人类结核病,但毒性较结核菌为弱,后来将这类菌称为非典型菌,并与腐物寄生杆菌和麻疯杆菌共为分枝杆菌属。卡介菌为牛型减毒结核菌,无致病性,有免疫原性,用卡介菌接种代替结核菌初次感染而获得对结核病的免疫力,是目前世界上应用最广泛的菌苗之一。1908年,法国巴斯德研究所的Calnette和Guerin成功培育出一株弱毒牛型结核杆菌,并命名为卡介菌(BCG)。1921年,Weill-Halle成功地将该菌应用于人体,防治结核病。另一方面,当时,人们还认识到,自身免疫力的提高,可抵抗其它疾病,20世纪20~40年代,曾有人用草分枝杆菌液治疗结核病以外的其他一些病原性疾病,如呼吸系统疾病,甚至性病。现在才认识到,这是非特异性免疫调节作用。
在中国,上世纪60年代,湖南医学院谭礼智和王慧人,首先用灭活卡介苗于上臂划痕,对结核病有一定疗效。但意外见到,这些划痕的肺结核患者,原有的慢性气管炎,感冒、哮喘、风湿性疾病或神经性慢性皮炎也有疗效。从而,使国内外很多研究者注意到,人体接种分枝杆菌属细菌,可产生良好的非特异性免疫,并可提高机体抗病能力,表现出对某些慢性常见病具有一定的治疗效果(死卡介苗防治慢性气管炎、感冒和流感的临床研究。中华内科杂志1976,1:286-290)。现代免疫学研究表明:在分支杆菌中,多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸)和脂类常结合在一起,构成细胞壁的主要成分。分支杆菌细胞壁和其他细胞器上存在多糖或糖结构的PAMPs可结合人和动物的免疫识别系统PRRs上,其中至少包括4种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)、NLRs和C型凝集素等。当它们相互特异识别并结合后,启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路,刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF-α、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌,从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应并增强NK等免疫活性细胞的功能,从而提高宿主的免疫机能(J Exp Med2003;197:403-411)。
近十几年来,国内外陆续批准多个分枝杆菌制剂上市,如治疗用卡介苗、卡介苗多糖核酸注射液、冻干卡介苗细胞壁,草分支杆菌注射液及母牛分枝杆菌冻干制剂,这些制剂均有免疫调节功能。治疗用卡介苗及卡介菌细胞壁主要用于治疗浅表性膀胱癌;卡介苗多糖核酸注射剂主要用于预防和治疗慢性气管炎、感冒和哮喘;草分枝杆菌及母牛分枝杆菌制剂以及卡介苗多糖核酸液主要用作结核病的辅助治疗。上世纪80年代批准已上市的卡介菌多糖核酸注射剂(BCG-PSN)是经热酚法提取卡介菌多糖核酸,配以灭菌生理盐水制成的免疫调节剂,在该制剂中为多糖、核酸及蛋白混合物,其中多糖为70%~80%左右,核酸为10%~20%。BCG-PSN具有免疫调节及抗炎作用,在提高机体的免疫功能、抗过敏、抗感染方面具有一定的疗效和较高的安全性,临床上已用于抗感染、抗病毒、抗肿瘤和抗过敏性疾病的治疗上。但也发现其免疫调节的作用不持久,治疗作用不显著。(黄建等,中国分支杆菌类免疫调节剂的评述与展望,微生物免疫学进展,2002;30:56-60;宁云山等,中国生物制品学杂志,2008;1:74-80,)。
肺炎球菌(也称肺炎链球菌)可引发多种侵袭性疾病(如菌血症、脑膜炎等)与非侵袭性疾病(如细菌性鼻窦炎、中耳炎、社区肺炎等)的致病病因。全球各年龄段人群的感染及相关性疾病中,肺炎球菌性疾病位居首位,尤其是幼儿、年迈者、免疫障碍患者以及患有各种慢性基础疾病患者中的发生率更高。WHO估计每年约有160万人死于肺炎球菌感染性疾病,其中包括70万~100万5岁以下儿童;此外,人类免疫缺陷病毒感染以及与免疫缺陷相关的其他疾病大大增加了感染肺炎球菌疾病的可能性(Pneumococcalconjugate vaccine for childhood immunization-WHO position paper.WklyEpidemiol Rec.2007(82):93-104),且随着日益广泛地使用抗生素,致使肺炎球菌耐药菌株达96%以上,且呈多重耐药性状况。
在肺炎球菌中,多糖是主要病原体相关模式分子和主要保护性抗原,通过识别TLR等表达人类或哺乳动物免疫细胞上的病原体模式分子识别受体系统,启动非特异性免疫系统,继而进一步激活特异性免疫系统。目前,全球已有多种肺炎细菌多糖疫苗被批注用于人体,包括14价、23价多糖疫苗和PCV-7多糖蛋白结合疫苗,在预防肺炎球菌感染中取得较好的保护性效果(唐静等,肺炎球菌疫苗的研究进展,国际呼吸杂志,2010(30):1392-1395)。
金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性致病菌,不但寄居于皮肤和粘膜表而,也能在多种组织及血液中生长繁殖,引起多种疾病,如人和动物的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒败血症等,同时金葡菌也是医院感染和社区感染的主要病原菌。随着广谱抗菌药物的广泛应用,医院内耐药性细菌已严重威胁人类的健康,特别是耐甲氧西林和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌往往导致现有抗生素治疗的失败;社区获得性金葡菌感染率和耐药率逐年增加,引起各国政府和感染控制学家的高度重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫调节剂组合物,该免疫调节剂组合物是由多种细菌多糖提取物组成,其至少包含分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
所述的免疫调节剂组合物,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比不低于20%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比不低于10%。
优选地,所述分支杆菌属细菌多糖提取物为卡介菌多糖提取物、草分枝杆菌多糖提取物或耻垢分枝杆菌多糖提取物。
所述的免疫调节剂组合物,还可以包可引发人或动物产生免疫反应,更优选包含可引起人或动物呼吸道、消化道或皮肤感染的细菌,更优选包含葡萄球菌属、链球菌属、埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、克雷伯菌属,特别优选包含金黄色葡萄球菌、卡他布兰汉氏菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、草绿色链球菌、化脓性链球菌的多糖提取物。具体可以为含金黄色葡萄球菌多糖提取物、卡他布兰汉氏菌多糖提取物、肺炎克雷伯杆菌多糖提取物、流感嗜血杆菌多糖提取物、草绿色链球菌多糖提取物或化脓性链球菌多糖提取物。
优选地,根据本发明所述的组合物包含所有血清型肺炎球菌,更优选包含1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F血清型,更优选包含1、5、6B、14、18C、19F、23F血清型。
优选地,所述的免疫调节剂组合物中,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为20~80%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10~70%,金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为0~20%。
一优选实施例中,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为50%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比为35%,金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为15%。
另一优选实施例中,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为70%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10%,金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为20%。
本发明还提供一种药物组合物,其包含上述的免疫调节剂组合物及药学上可接受的辅料。例如为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂,其中所用的药物组合物调节免疫反应,特别是非特异性免疫应答能力。
根据上述的免疫调节剂组合物或药物组合物,其还可以包含抗原或抗原决定簇。所述抗原或抗原决定簇选自以下一种或多种疫苗的抗原或抗原决定簇:细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、肿瘤疫苗。所述药物组合物和/或免疫调节剂组合物与抗原或抗原决定簇联合给药。
优选地,所述抗原或抗原决定簇为具体可以为:流感病毒A全病毒灭活疫苗,或A群脑膜炎球菌多糖疫苗,BCG(卡介苗)疫苗,白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、SARS疫苗和疟原虫抗原。
相适应地,本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以包括两种或多种所述抗原或抗原决定簇。
本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以通过许多不同途径进行给药,如注射(其包括非肠道,皮下,皮内和肌肉注射)鼻内,粘膜,口腔,阴道内,尿道或眼部给药。
优选地,在本发明中通过注射给药。更优选地,注射为皮内注射。
优选地,本发明中通过口服可接受的组合物来进行给药。
本发明还涉及上述的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备预防或治疗感染、过敏、肿瘤、免疫系统失衡、肺部相关慢性疾病的药物中的应用。这些细菌多糖可被表达于人或动物免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和DC细胞上的模式识别受体(PRR)特异性识别,启动宿主的非特异免疫和炎症反应,继而引发宿主的特异性免疫反应。由于非特异性免疫反应系统被激活,一方面启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路,刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF-α、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌,产生Th1占优势的免疫反应,调节Th1/Th2平衡,从而增强机体抗感染、过敏能力;同时部分多糖抗原在非特异性免疫反应的基础上,激活特异性免疫反应,产生特异性抗体从而杀灭入侵的微生物,消除感染;另一方面参与非特异性和特异性免疫的NK细胞、效应T细胞等免疫细胞被活化,增强了机体免疫系统抗肿瘤的活性,从而在整体上增强人或动物抗感染、抗过敏、抗肿瘤的能力。因此,可用于预防和治疗如下病症中的一种或多种:感染(如细菌感染、病毒感染,例如乳头瘤病毒造成的感染,或寄生虫感染例如弓形虫感染)、过敏(如包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等)、肿瘤(如膀胱癌、肺癌、胃癌、宫颈癌等)、免疫系统失衡(例如儿童和老人的免疫系统失衡)、肺部相关慢性疾病(COPD,即慢性阻塞性肺病等)。
具体地,所述感染为单纯疱疹病毒感染,所述过敏为被动皮肤过敏和哮喘,所述肿瘤为肺癌,所述免疫系统失衡为环磷酰胺所致白细胞减少症,所述肺部相关慢性疾病为呼慢性阻塞性肺病。
优选地,所述药物为疫苗。对于疫苗接种来说组合物能以0.1至0.2ml水溶液的形式来提供,优选生理盐水缓冲液,并进行非肠道注射给药,例如通过皮内接种。本发明所述的疫苗优选进行皮内注射。在注射部位可能会发现轻微的肿胀和发红,有时也会有搔痒。给药的模式、给药的剂量和次数可通过本领域普通技术人员已知的方式进行优化。
本发明的上述免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以以多种剂型通过多种途径进行给药,如注射(其包括非肠道、皮下、皮内和肌肉注射)鼻腔、粘膜、口腔、阴道内、尿道或眼部给药。
优选地,根据本发明所述的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备药物上的应用,其剂型可为经肠胃道给药剂型和非经肠胃道给药剂型,优选为注射剂、口服制剂、灌注剂以及滴剂,更优选为舌下片剂、舌下滴剂、滴鼻剂、喷雾剂。
本发明提供了的免疫调节剂组合物由多种细菌多糖提取物组成,其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。该免疫调节剂组合物可刺激机体产生持续和作用显著的免疫免疫调节功能,特别是非特异性免疫应答能力以及在此基础上继发产生的特异性免疫反应,同已上市的免疫调节剂相比,可在整体上提高人或动物抗感染、抗肿瘤和抗过敏能力。
另一个方面,本发明提供了的免疫调节剂组合物。其中至少包含来源于分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物,它们单独或同其他细菌多糖提取物按一定比例组成本发明所涉及的免疫调节剂,之所以选用分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物作为本发明所提供的免疫调节剂的最核心组成物,这是因为:①分支杆菌属的多种免疫制剂已批准上市。卡介菌是目前全球应用最广泛的菌苗之一,其安全性和有效性已获得广泛肯定,同时,由我国自行研制的卡介菌多糖核酸注射液(该制剂中多糖占70~80%)已批准上市近三十年,其在调节人体的非特异性免疫能力,提高人体抗感染、抗过敏、抗病毒方面显示了一定的疗效和较高的安全性;②肺炎球菌是目前呼吸道最常见的致病菌之一,也是最常感染儿童、老人、免疫障碍患者以及患有各种慢性基础疾病患者。肺炎球菌多糖疫苗已在预防肺炎球菌感染中取得较好的保护性效果,具有一定的非特异性免疫调节能力和较强的特异性免疫反应应答能力;③将分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物组合,并做为本发明所述免疫调节剂的核心成分,它们单独或同其他细菌多糖提取物按一定比例组成本发明所涉及的免疫调节剂不仅能刺激人或动物产生较强而持续的非特异性反应能力,而且也可产生较强而持续的特异性免疫反应,从而在整体提升人或动物抗感染、抗肿瘤、抗过敏能力;④相对于一种细菌多糖引发的免疫应答,通过多种细菌多糖引发的免疫调节作用(非特异性和特异性免疫)具有长期持续的特点;⑤相对于一种细菌多糖引发的免疫应答,通过多种细菌多糖引发的免疫调节,具有可同时对抗多种细菌感染的能力,具有广谱性。
本发明提供的免疫调节剂或药物组合物同目前已上市的干扰素、胸腺肽、灵芝多糖等免疫调节剂产品相比,它具有独特而不可替代的优势:①它是一类非常独特的免疫调节剂,它可主动持久刺激机体产生免疫调节作用,特别是提高了人和动物的非特异免疫反应能力,因此加强了机体抵抗外来病原入侵和监视肿瘤细胞免疫逃逸的第一道防线的能力,从而达到机体通过自身免疫调节作用来预防和治疗疾病的目的;②它在疾病的预防作用在阻止一些传染病疾病的发生和发展上更具有价值,特别是在类似SARS、H1N1等严重突发传染病的预防上将发挥独特而重要的作用。一种新发传染病从病原确认到疫苗批准上市,一般需要5年的时间,最短也需要1~2年。在疫苗未上市之前,特别是在病原体未确定之前,使用该制剂将可降低该传染病爆发和大流行的风险,降低该传染病对人民健康和社会经济的影响;③它在一些特殊人群的疾病预防作用上也同样更具有价值。儿童、老人、免疫障碍患者以及患有各种慢性基础疾病患者是一类特别容易罹患各类感染性疾病和肿瘤的人群,使用本制剂将提高这类人群的免疫功能,可以减少疾病的发生,改善患者的生活质量,减轻患者和社会的经济负担;④它是一种广谱的免疫调节剂和协同剂,它不仅对细菌、病毒等微生物引起的感染发挥作用,还可增强抗病毒制剂、抗生素、疫苗的治疗和预防作用,同时对机体自身免疫失衡所引发的疾病如过敏性疾病等发挥治疗和预防作用。
为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,作详细说明如下。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1:卡介菌的培养和多糖提取物的制备
1、菌体培养:将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302,中国药品生物制品检定所菌苗室提供)室温下溶解,接种于马铃薯苏通培养基,37℃连续培养14~20天;或在37℃连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基,37℃连续培养14~20天。
其中,马铃薯苏通培养基的制备方法可以是:
取洗净新鲜土豆(1个)用穿刺器穿成圆柱,再用刀切成4公分长斜面,用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时后用纯化水冲洗土豆斜面块;然后用苏通培养基冲洗斜面块。取苏通培养基20ml,加入100ml灭菌大管中;将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭茵大管中,0.11MPa的大气压121℃,灭菌20分钟。放冷至室温待接种。
苏通培养基配制比例:
每1000ml:
硫酸镁 0.5g 磷酸氢二钾 1.04g
味精 8.0g 枸橼酸 2.0g
甘油 60ml 10%柠檬酸铁铵 0.5ml
加纯化水至1000ml 氨水调至pH8.0左右
改良的液体苏通培养基配方配制比例:
每1000ml:
天冬素:4g 柠蒙酸:2g K2HPO4·3H2O(AR):
0.5g MgSO4·7H2O(AR):0.5g 柠檬酸铁铵:0.05g
甘油(药用):60ml
然后加1%(W/V)硫酸锌1ml,10磅20分钟灭菌。
2、菌体收集:待菌体生长至对数期时,对培养瓶逐瓶检查后,收集菌膜,加入适量去离子蒸馏水洗涤,压干后称重;
3、多糖提取物的制备:
(1)菌体破碎和热酚处理:
将收集的菌体按10∶1的比例加入纯化水,以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体,3min×3次,将菌体捣碎,然后再加入与破碎菌悬液等量的热苯酚(60~65℃),在低速搅拌中保温30分钟~1小时。
(2)卡介菌多糖提取物的制备:
可通过透析或凝胶过滤的方法除去苯酚。将热酚好的混合液自然沉淀1~10天,吸取上清液,管式离心机离心后,上清液装入透析袋(截流分子量>5000道尔顿)中在100倍体积的注射用水中透析1~10天,除去苯酚。或是上清液通过纯化系统按30%的体积上样于预先平衡的凝胶层析柱(层析用填料为GH-25或G-25,平衡液为0.9%生理盐水),采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液,收集多糖目标峰,除去苯酚。
将透析好的上清液或通过凝胶层析收集的多糖峰中加入适量乙醇使含醇量60~85%,自然沉淀1~10天后,沉淀物用无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次。然后用乙醚洗涤离心3次后,放至干燥器干燥,自然干燥后即为卡介菌多糖提取物。
(3)卡介菌多糖提取物的鉴定:
采用《中国生物制品规程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的标准方法对制备的多糖提取物进行鉴别和含量测定,结果表明,在制备的多糖提取物中,多糖含量大于70%(W/W),核酸含量为10~20%(W/W),蛋白含量小于0.5%(W/W)。
其中多糖含量的测定参考《中国生物制品规程》(2000)版的恩酮法,核酸含量的测定参考《分子克隆第三版》,蛋白含量的测定参考《中国生物制品规程》(2000)版的lowry法。
实施例2:肺炎球菌的培养和多糖的提取
1、肺炎球菌的培养:可采用培养瓶和发酵罐进行培养,培养条件为本领域公知的肺炎球菌培养条件。
将1、5、6B、14、18C、19F及23F血清型肺炎球菌冻干菌种接种于10%脱纤维羊血普通琼脂培养基,在36℃,5%的CO2环境中,静止培养后传种2代液体培养基,按接种量约108CFU/mL接种于一定体积得发酵罐中内,于36℃进行搅拌培养,自培养2h后起每隔1h取样一次,在600nm波长下测OD值,用50%葡萄糖溶液调节糖浓度,以7.5mol/L NaOH调节pH至7.5,间歇通入压缩空气,,待OD值到达1.5~1.7时(约7~9小时)终止培养。采用(V/V)重量体积比为1%的脱氧胆酸钠或O.5%苯酚灭活细菌,离心(9000g,30分钟),收集上清。
2、肺炎球菌多糖提取物的制备:上清液超滤浓缩到原体积的1/5~1/2时,加入乙醇使其终浓度走到40%,离心去除核酸;上清中继续加入乙醇使其终浓度达到70%,离心收集沉淀。重新溶解沉淀,加入2倍体积的冷酚抽提数次,去除蛋白;沉淀物用0.3mol/L乙酸钠溶解,以等体积苯酚一乙酸钠饱和液离心抽提,充分去除蛋白。吸取上清水相,用蒸馏水透析,透析后加入乙醇浓度使其终浓度达到80%以沉淀多糖,用无水乙醇洗2次,自然干燥后进行多糖测定。
3、肺炎球菌多糖提取物的鉴定
多糖按照(《欧洲药典》1997年版)相应要求进行测定。蛋白含量用Lowry氏法;核酸含量以分光光度法;甲基戊糖、氨基己糖及糖醛酸含量测定按照(《欧洲药典》1997年版)所述方法进行。
采用上述标准标准方法对制备的多糖提取物进行鉴别和含量测定,结果表明,在制备的多糖提取物中,多糖含量大于60%(W/W),核酸含量小于20%(W/W),蛋白含量小于20%(W/W)。
实施例3:金黄色葡萄球菌的培养和多糖的提取
1、金黄色葡萄球菌的培养:可采用培养瓶和发酵罐进行培养,培养条件为本领域公知的肺炎球菌培养条件。
将C5、C8血清型金黄色葡萄球菌冻干菌种接种于固体培养基上进行活化,37℃培养18小时,将该培养物再次在新琼脂培养上37℃培养4小时,以便获得指数生长期的微生物。然后在基本液体培养基(1g/L葡萄糖、120mg/L Fecl3·6H2O、400mg/LMgcl2·6H2O、10mg/L CaCl2·2H2O、5mg/LZnCl2、58.5g/L NaCl、6g NH4Cl、6.8g NH4Cl、PH6.2~7.5,最适6.5)进行培养。自培养2h后起每隔1h取样一次,在600nm波长下测OD值,待OD值OD600≥1.5时,终止培养。
培养物通过苯酚-乙醇(终浓度2%V/V)处理来灭活,然后在25000g下离心30分钟,收集沉淀物。
2、金黄色葡萄球茵多糖的提取:文献中描述了各种细菌多糖的提取技术,并且可以在本发明中使用。例如可参考Lee.J.C.Infect Immunu 1993;67:1853~1858;DassyB等J.Gen Microbiol.1991;137:1155~1162;Fattom A等人,Infect Immun 1990;58:2367~2374。下面方法主要采用苯酚-乙醇法提取金黄色葡萄球菌多糖:离心获得的细菌沉淀按10mg/ml溶度溶于生理盐水后,加入等体积苯酚一乙酸钠饱和液离心抽提,充分去除蛋白。吸取上清水相,用蒸馏水透析,透析后加入乙醇浓度使其终浓度达到40%,离心去除核酸,上清继续加入乙醇至终浓度为80%以沉淀多糖,用无水乙醇洗2次,自然干燥后进行多糖测定。
3、金黄色葡萄球菌多糖的鉴定
采用《中国生物制品规程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的标准方法对制备的多糖提取物进行鉴别和含量测定,结果表明,在制备的多糖提取物中,多糖含量为大于60%(W/W),核酸含量小于20%(W/W),蛋白含量小于为20%(W/W)。
除上述卡介菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌,相关文献中描述了其它细菌多糖的提取技术,并且可以在本发明中使用。
实施例4:免疫组合物的制备
从上述实施例中获得的三种细菌多糖提取物,按表1配比成A、B、C、D、E五种免疫组合物(见表1),然后将配比后的组合物溶解在生理盐水中,其浓度为1mg/ml,除菌分装后置于室温备用。
表1:不同细菌多糖组合的免疫调节剂组合物
实施例5:免疫调节剂组合物对免疫功能低下模型鼠的T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响
1、免疫功能低下模型鼠的建立
免疫功能低下小鼠模型参照《抗炎免疫药物药效学指导原则.新药(西药)临床前研究指导原则汇编》完成。
2、实验分组
试验分为七组:正常动物对照组、A、B、C、D、E免疫调节剂组合物组、免疫功能低下模型组,每组小鼠为9~10只。
免疫调节剂组合物组小鼠在造模前2周至造模期间,后肢股部肌内注射相应的样品(样品浓度为1mg/ml,剂量为0.1ml/10g体重),间日一次,末次给药后24小时进行试验。正常动物对照组后肢股部肌内每天注射生理盐水(0.1ml/10g体重),每日1次,共进行21天。
3、小鼠T淋巴细胞亚群和细胞因子的检测
①总T细胞%:常规制备淋巴细胞悬液,并用RPMI1640完全培养液调细胞浓度至4×109个/L。用生理盐水将SRBC洗3次,并用培养液调至1%浓度。在1ml塑料离心管中,每管加入淋巴细胞悬液和培养液各50μl,37℃水浴中保温1小时。再加入SRBC悬液100μl混匀,37℃水浴保温10分钟。离心(800rpm,5分钟)水浴2小时。将细胞轻轻悬起,加100μl 4%戊二醛固定液(用锌酸缓冲液配制)混匀。计数前将上清液全部移除,加生理盐水100μl和20倍稀释的1%美蓝染色液100μl染色,20分钟后计数,即得总T细胞%。
②茶碱抵抗细胞花环%:在50μl淋巴细胞悬液中加入100mmol/L茶碱的培养液50μl后混匀,其余步骤同上。
③Th、Ts细胞%:按下式计算。
Ts细胞%=100%-Th细胞%
④血清IFN-γ的测定:用ELISA方法,按试剂盒说明书进行。
4、实验结果:小鼠连续皮下注射氢化可的松(100mg/kg,1次/日)7天,可显著降低总T细胞、Th细胞、Ts细胞数以及血浆IFN-γ水平;五种免疫调节剂组合物均可升高总T细胞、Th细胞、Ts细胞数以及血浆IFN-γ水平,其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表2)。
*P<0.05,**P<0.01同正常动物对照组;+P<0.05,++P<0.01同免疫功能低下组。
#P<0.05同免疫调节剂组合物A和E组
实施例6:免疫调节剂组合物治疗环磷酰胺所制白细胞减少症
1.动物模型建立:选取体重为2.5~3.5kg,白细胞数6.0~9.0×109/L家兔,于耳缘静脉注射环磷酰胺5mg/kg,注射1周后,白细胞下降原水平的30%~35%,模型制备成功。
2.动物分组
造模成功的家兔随机分成7组,分为正常对照组、模型组、A、B、C、D、E免疫调节剂组合物治疗组,每组7~8只。
3.实验方法:正常组和模型组肌肉注射0.1ml/kg生理盐水,免疫调节剂组合物治疗组注射5种不同的免疫调节剂组合物(样品浓度为1mg/ml,剂量0.1ml/kg)。隔日注射一次,连续5次。每日采耳缘静脉血,末次注射后一天全部处死并取全血,进行血常规分析,包括WBC、RBC、HGB、PLTB和NC。
*P<0.05同正常动物对照组;+P<0.05,++P<0.01同模型组。
#P<0.05同免疫调节剂组合物A和E组
4.结果:
治疗组同模型组相比,5种免疫调节剂组合物均可提高环磷酰胺所致家兔白细胞、中性粒细胞、血小板水平(P<0.05,P<0.01),可治疗由环磷酰胺所致家兔白细胞减少症,其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表3)。
实施例7:免疫调节剂组合物对小鼠Th1/Th2细胞因子的调节
1.动物分组:将10~20克小鼠随机分为6组。每组8~10只,其中对照组为生理盐水组,试验组为免疫调节剂组合物A、B、C、D、E。
2.方法:用5种不同免疫调节剂组合物免疫小鼠(样品浓度为1mg/ml,剂量为0.1ml/10g体重)。对照组以等体积生理盐水,按相同免疫程序进行。末次免疫后1周,无菌取出脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,调整细胞浓度分别为2.0×106/ml和2.5×106/ml,分装24孔板,每孔1ml,并添加100mlConA,37℃、5%CO2培养72小时后离心,取上清,-20℃保存。
分别用小鼠IL-2、IL-4和IFN-γELISA测定脾淋巴细胞培养上清中细胞因子含量,用IL-12ELISA试剂盒测定腹腔巨噬细胞培养上清中IL-12含量。
3.结果:通过ELISA方法分别测定脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4和IFN-γ,腹腔巨噬细胞培养上清中IL-12含量。结果表明:同生理盐水对照组相比,5种免疫调节剂组合物均能提高Th1类细胞因子提高IL-2、IL-12、γ-干扰素的表达量,而降低Th2类细胞因子如IL-4的表达量,其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表4)。
由此可以推断,本发明提供了免疫调节剂组合物可以上调Th1类免疫应答、抑制Th2免疫反应,从而调节Th1/Th2平衡,这对于提高机体抗感染、抗过敏能力,防止细菌、病毒感染和过敏性疾病的发生,发展具有重要意义。
*同生理盐水组相比P<0.05,#同免疫调节剂组合物A和E组相比
实施例8:免疫调节剂组合物对速发型(I型)变态反应的影响--大鼠同种被动皮肤过敏反应
1、动物分组:
试验分为7组:生理盐水对照组、马来酸氯苯那敏阳性对照组(5mg/kg)组、A、B、C、D、E免疫调节剂组合物组。每组动物数为10只。
2、抗血清制备:取体重90~100g大鼠6只,天花粉蛋白以4%氢氧化铝凝胶配成5mg/ml的混悬液,给大鼠4个足跖注射各0.1ml,共0.4ml。于致敏后14天,颈总动脉插管采血,离心(3000rpm,15min,4℃)分离血清,置-20℃保存备用。
3、被动皮肤致敏及抗原攻击:大鼠乙醚麻醉后剪去背部脊柱两侧毛(每侧约3cm×3cm),将1∶20,1∶40稀释的抗血清皮内注射于大鼠背部,每一稀释度注射两点,每点0.1ml。48h后进行抗原攻击,即静脉注射0.5%伊文思蓝溶液1ml(内含天花粉蛋白1mg)。20min后断头处死动物,翻转背部皮肤,剪下蓝斑皮肤,每点以5ml丙酮生理盐水溶液(3∶7V/V)浸泡48h,离心(3000rpm,15min,4℃),取上清液,590nm波长下测定光密度值,计算蓝斑抑制百分率。
五种免疫调节剂组合物在抗原攻击前3周,后肢股部肌内注射(样品浓度为1mg/ml,0.3ml/100g体重),间日一次,末次给药后24小时进行抗原攻击。生理盐水和马来酸氯苯那敏对照组抗原攻击前1h后肢股部肌内注射生理盐水和马来酸氯苯那敏,给药体积为0.3ml/100g。
4、试验结果
与生理盐水组比较,五种不同的免疫调节剂组合物可抑制大鼠皮肤蓝斑形成,表现为吸光度显著降低(P<0.05,表5),其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表5)。
*P<0.05,**P<0.01vs生理盐水对照组;#P<0.05vsP<0.05vs免疫组合物A和E组
实施例9:免疫调节剂组合物对哮喘小鼠的治疗作用
1、动物模型建立:
哮喘模型组利用卵蛋白(OVA)致敏和激发BALB/c小鼠,第0,7,14天腹腔注射20μg OVA+150μl Al(OH)3+50μl NS(100μg/ml)混合液致敏,于第28天开始分别给与不同次数激发,激发采用激发液(2mg/ml OVA-NS溶液)滴鼻,激发48h后采用体积描记法检测小鼠气道反应性。观察300μl倍增浓度的乙酰胆碱(Mch)雾化激发后增强的呼气间隙(Penh)的变化,将每个Mch激发浓度下的Penh值转换为与生理盐水(NS)激发时Penh值的百分比即Penh%作为小鼠气道反应性的评价指标。测定肺功能后再用PBS缓冲液支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞学分析。所有哮喘组气道反应性和BALF嗜酸性粒细胞比例(Eos%)与正常组相比均有显著差异(p<0.05),表明成功建立过敏性哮喘小鼠模型。
2、动物分组及用药
已制备的哮喘模型小鼠随机分为7组,即OVA哮喘模型组、激素治疗组、A、B、C、D、E免疫调节剂组合物治疗组,同时设正常对照组,每组10只小鼠。
激素治疗组在每次滴鼻激发前腹腔注射5mg/kg地塞米松。免疫调节剂组合物在致敏前第7d腹腔注射(样品浓度为1mg/ml,剂量0.1mg/10g)。
3、实验结果
气道炎症:同哮喘模型组相比,5种免疫调节剂组合物均能降低BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞的百分比,其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表6)。
*与哮喘模型组相比,p<0.05
#与免疫调节剂组合物A、B、E组相比,p<0.05
气道高反应性:同哮喘模型组相比,5种免疫调节剂组合物除Mch浓度在0.78mg/ml时,均能降低哮喘小鼠的气道高反应性(P<0.05,表5),其中在Mch浓度在3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml,C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表7)。
*与哮喘模型组相比,p<0.05,#与免疫调节剂组合物A、B、E组相比,p<0.05
哮喘是一种以嗜酸性粒细胞浸润为特征的气道炎症性疾病,伴有多种炎症介质和细胞因子参与,同时具有气道高反应性的特点。本发明所提供的免疫调节剂组合物能降低哮喘模型小鼠气道高反应性,减少支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞总数,因此对哮喘小鼠有治疗作用,更为重要的是,本发明所提供的免疫调节剂组合物是在小鼠致敏前七天给药,因此对于哮喘的早期预防也具有一定的作用。
COPD患者具有多种症状,包括咳嗽、呼吸短促和痰生成过多。COPD涵盖两种最重要的症状是慢性支气管炎和肺气肿。目前,用于治疗COPD的治疗剂主要为糖皮质激素。它可减少炎性细胞的数量、活性和向支气管粘膜下层的运动降低,引起气道反应性降低。虽然使用糖皮质激素在治疗COPD有益处,但其疗效远不能令人满意,特别是使用糖皮质激素所产生的较严重的副作用和抗性问题。本发明所提供的免疫调节剂组合物可以降低气道高反应性,减少BALF中细胞总数,因此在预防COPD的发生,减轻COPD症状具有特别的潜力。
实施例10:免疫调节剂组合物对小鼠体内一氧化氮(NO)产生的影响
1.动物分组:将10~20克小鼠随机分为6组。每组8~10只,其中对照组为生理盐水组,试验组为免疫调节剂组合物A、B、C、D、E。
2.方法:用免疫调节剂组合物(样品浓度为1mg/ml,免疫剂量为0.1ml/10g体重),对照组以等体积生理盐水,按相同免疫程序进行。末次免疫后1周,无菌取出脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,调整细胞浓度为2.5×106/ml,分装24孔板,每孔1ml,并添加100ml LPS,37℃、5%CO2培养,24小时后离心收集上清,-20℃保存备用。用Griess试剂显色法检测上清中NO的含量。
3.实验结果:同生理盐水组相比,5种免疫调节剂组合物均能促进机体NO产生(P<0.05,表6),其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表6)。
*与生理盐水组相比,p<0.05,#与免疫调节剂组合物A、B、E组相比,p<0.05
NO是体内一种重要的信号分子和效应分子,其水平提高有利于机体对寄生在细胞内的细菌、病毒的杀伤和清除作用。
实施例11:免疫调节剂组合物对豚鼠生殖器单纯疱疹病毒(HSV-2)感染的影响
1、动物模型的建立:
建模方法参见(Bernatein DI,et al.J Infect Dis,2001;183(6):844),既首先用生理盐水清洗外阴,干棉签磨擦阴道数次,造成阴道粘膜损伤,然后用接有灌胃针头的注射器吸取HSV-2(效价为10-4~-6TCID50,由中国科学院武汉病毒研究所提供)0.1ml,将针头插入豚鼠阴道内约3~4cm将病毒注入阴道穹窿后缓慢退出,用明胶海绵塞入阴道以维持毒液,针头上少许毒液滴在外阴,用玻璃棒轻轻涂抹均匀,使病毒渗入皮肤。
2、动物分组及试验方法:
注入病毒14天后根据皮损程度分层随机分为6组:模型组、A、B、C、D、E免疫调节剂组合物组。每组动物数为15~16只。
第15天开始,模型组后肢股部肌内注射生理盐水(剂量为0.1ml/100g体重),A、B、C、D、E组后肢股部肌内注射五种免疫调节剂组合物(样品浓度为1mg/ml,剂量为0.2ml/100g体重),间日1次,共3周;观察给药期间复发率(出现皮损的次数和天数)和皮损情况,末次给药后24h采血测定血清IFN-γ水平。
皮损程度参考文献(Bernatein DI,et al.J Infect Dis,2001;183(6):844)方法进行评分。
3、实验结果
HSV-2接种14天后,根据皮损程度把豚鼠分层随机分为6组,分别给予生理盐水和五种不同的免疫调节剂组合物进行治疗。
*P<0.05,**P<0.01vs模型组;P<0.05vs免疫组合物A、B、E组
结果表明:五种不同的免疫调节剂组合物可明显减少皮损的复发天数,并可显著升高血浆IFN-γ水平,其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表9)。
实施例12:免疫调节剂组合物对肺癌小鼠NK细胞活性的影响
1、动物模型建立:将荷Lewis肺癌瘤株小鼠(CS7BL/6J)处死后,酒精浸泡消毒,无菌操作剥离瘤体,瘤体组织用玻璃注射器针芯研磨过200目不锈钢网筛,收集入玻璃培养皿内,并用Hank′s液冲洗、离心、吹打、稀释为1107个/ml的单细胞悬液,同时,用0.2%胎盼蓝染色镜下观察,保证95%活细胞率,再将制备的单细胞悬液接种至昆明种小鼠右腋皮下,0.2ml/只,约7~10天出瘤,14天左右瘤体直径生长至1.5~2.0cm为造模成功。
2、动物分组及用药:将造模成功的昆明小鼠,随机分为6组,模型对照组和A、B、C、D、E免疫调节剂组合物模型试验组以及正常对照组。正常对照组和模型对照组隔天注射一次生理盐水(剂量为0.1ml/10克体重),模型试验组隔天注射一次免疫调节剂组合物,连续21天。
NK细胞功能测定采用乳酸脱氢酶释放法:在酶标仪570nm处测OD值。依据公式:[NK细胞活性指数(%)=(效靶反应释放孔-自然释放孔/最大释放孔-自然释放孔)*100%],计算NK细胞活性并进行统计学处理分析。
抑瘤效应测定:将全部造模小鼠于第21天摘眼球放血后断颈处死,无菌剥离瘤组织,取出瘤体,电子天平称取瘤体重量,按下公式计算抑瘤率:
抑瘤率=(荷瘤模型组平均瘤重~荷瘤各用药组平均瘤重)/荷瘤模型组平均瘤重100%。
3、结果:同模型对照组相比,5种免疫调节剂组合物均可提高NK细胞杀伤YAC-1细胞活性指数,增加对荷瘤小鼠癌组织抑瘤效应,其中C、D免疫调节剂组合物同A、E组相比具有显著差异(P<0.05,表10-11)。
表10免疫调节剂组合物对肺癌小鼠NK细胞的影响
(x±s n=10)
*同模型对照组P<0.05;
#同免疫调节剂组合物A和E组
表11免疫调节剂组合物对荷瘤小鼠癌组织抑瘤效应(x±s n=10)
*同模型对照组P<0.05,#同免疫调节剂组合物A和E组
自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞,分布于外周各淋巴器官及血液循环系统,无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应,并可分泌多种细胞因子及趋化因子。干扰素及巨噬细胞来源的细胞因子均是NK细胞极强的活化因子,NK细胞活化过程迅速,在趋化介质的作用下离开血液循环系统进入到外周组织部位,在病毒感染后2~3天NK细胞即可聚集于感染灶,杀伤被感染细胞;同时通过其分泌的可溶性因子如IFN、TNF、IL-23,GM-CSF、M-CSF等招募活化中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及触发获得性免疫应答。另外,活化的NK细胞能够表达多种共刺激分子如CD80、CD86、CD70、OX40L、2B4等,直接与T细胞相互作用而促进获得性免疫应答;活化的NK细胞亦可能具有APC样表型,直接行驶抗原提呈功能从而促进T细胞免疫应答。
在肿瘤的发生发展过程中,NK细胞既可以通过“内识别”方式直接识别恶性转化的癌细胞并被活化,也可以在辅助细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)的作用下被活化。它在外周血中含量较少,但它不需活化即可杀伤某些肿瘤细胞,且不受MHC限制。然后未活化的NK细胞杀瘤谱非常窄,仅对少数血液来源的肿瘤有效。而当NK被IL-2、IFNγ等细胞因子活化后,其杀瘤谱和杀伤效率大幅度提高。NK细胞主要通过释放杀伤介质,如穿孔素、NK细胞毒因子、TNF等破坏肿瘤细胞或诱导其凋亡,同时,NK也能通过ADCC作用杀伤肿瘤。
实施例13:免疫调节剂组合物对小鼠抗体产生的影响
1、动物分组及免疫:选取体重14~16g健康清洁级NIH品系雌性小鼠210只,随机分为7组,分别是五组免疫调节剂组合物组,正常对照组和阴性对照组,每组各30只。免疫调节剂组合物组分别用A、B、C、D、E组合物滴鼻免疫小鼠,剂量为5μg/10g(0.1ml/10g),阴性对照组0.1ml/10g生理盐水。免疫分别在第1、14、28天滴鼻免疫,并在每次免疫一周后每组各取10只小鼠经眼眶后静脉采血并用生理盐水冲洗呼吸道,分别收集血清和冲洗液,以ELISA法测定血清中抗体浓度,通过免疫琼扩试验测定IgA含量。
2、结果表明:经三次免疫后,阴性对照组小鼠血清和呼吸道冲洗液中抗体的浓度(OD值)与阴性对照组无显著差异(P>0.05);免疫调节剂组合物组小鼠三次血清和呼吸道冲洗液中抗体浓度均显著高于阴性对照组(P<0.05),且第2次和第3次免疫的抗体浓度(OD值)比第一次抗体浓度显著提高(P<0.05)。IgA阳性沉淀反应表明了IgA增加,鉴于IgA分泌量低以及分泌时间晚,而在应用免疫调节剂组合物后呼吸道冲洗液免疫球蛋白大量增加,有理由相信总Ig的增加几乎完全归因于IgA的增加。说明免疫调节剂组合物可以刺激机体产生整体和局部粘膜免疫反应,并具备免疫记忆及加强免疫应答效应。
IgA是粘膜表面重要的抗病毒和抗毒素免疫因素,是机体抗感染的一道重要屏障,能抑制细胞生长、凝聚抗原、中和毒素、中和病毒,对保护呼吸道粘膜,防止病菌和其他抗原物质侵入起重要作用。
实施例14:免疫调节剂组合物对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫佐剂的作用
1、动物分组和免疫:8~10周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为六组,每组12只。其中免疫调节剂组合物组为A、B、C、D、E组,对照组为1组。A群脑膜炎球菌多糖疫苗与免疫调节剂组合物混合,总体积200μl,其中含有150μg免疫调节剂组合物和2.5μg多糖疫苗,对照组为未添加佐剂的单纯疫苗组,多糖疫苗注射量为2.5μg。头背部皮下免疫BALB/c小鼠,隔1周免疫,共免疫3次。
2、方法:末次免疫后7d,摘眼球取小鼠血液,离心1500×g,15min分离血清,ELISA法检测多糖特异性IgG抗体。
3、结果:同对照组相比,5种免疫调节剂组合物均可提高免疫小鼠抗A群脑膜炎球菌特异性抗体的产生水平(P<0.05),其中D免疫调节剂组合物组的抗原特异性的IgG水平分别是未添加佐剂组的2.16倍。同A和E免疫调节剂组合物组相比,D免疫调节剂组合物组诱导免疫小鼠产生抗A群脑膜炎球菌特异性抗体的水平具有显著差异(P<0.05)。
实施例15:免疫调节剂组合物对H5N1流感全病毒灭活疫苗的免疫增强作用
1、动物分组和免疫:8~10周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为七组,每组12只。其中免疫调节剂组合物组为A、B、C、D、E组,同时设立无添加对照组和PBS免疫组。流感病毒A/Vietnam/1194/2004(H5N1)全病毒灭活疫苗与免疫调节剂组合物混合,总体积200μl,其中含有150μg免疫调节剂组合物和0.015μg全病毒灭活疫苗,对照组为未添加佐剂的单纯疫苗组和PBS组,疫苗注射量为0.015μg,PBS的注射剂量为200μl。头背部皮下免疫BALB/c小鼠,隔1周免疫,共免疫3次。
2、方法:末次免疫后7d,摘眼球取小鼠血液,离心1500×g,15min分离血清,ELISA法检测特异性IgG抗体和抗体亚型。
3、结果:同对照组相比,5种免疫调节剂组合物组均可提高免疫小鼠抗流感病毒A特异性抗体的产生水平(P<0.05),其中,同A和E免疫调节剂组合物组相比,D免疫调节剂组合物组诱导免疫小鼠产生抗流感病毒A特异性抗体的水平具有显著差异(P<0.05)。
同时,同未添加佐剂组相比,5种免疫调节剂组合物组诱导的抗原特异性的IgG1抗体水平与无统计学意义(P>0.05),但诱导的IgG2a的水平明显高于未添加佐剂组(P<0.05)。
从实施例14~15可以推断出如下判断:本发明提供的免疫调节剂组合物不仅能提高细菌疫苗(如A群脑膜炎球菌多糖疫苗)特异性IgG水平,而且也可提高病毒疫苗(如流感疫苗)特异性IgG水平,是一种作用肯定、具有通用性的疫苗佐剂。同时,该免疫调节剂组合物对抗原特异性IgG1抗体无较大的影响,但对多糖特异性IgG2a抗体有较明显的影响,IgG2a的类别转换是由IFN-γ来实现的,IgG2a是Th1类免疫反应代表的抗体分子,IgG2a与巨噬细胞表面高亲和力的FcγRI受体结合,参与巨噬细胞介导的宿主防御反应,巨噬细胞可以直接消除各种异物,杀伤细胞内的病原体。而IgG1抗体主要介导吞噬细胞(如肥大细胞和噬酸性粒细胞)的防御作用。这说明本发明提供的免疫调节剂组合物作为佐剂具有诱导抗原疫苗导向Th1类免疫反应的趋势,这在控制感染方面有重要的意义。
通过实施例4~12显示,本发明所提供的免疫调节剂组合物具有良好的免疫调节作用,除可以提高正常机体的免疫功能,尚可以促进免疫低下机体免疫功能的恢复和抑制免疫亢进机体过强的免疫应答。调节Th1/Th2平衡,促进机体产生NO,对细菌和病毒性感染性疾病和Th2应答异常增高的过敏性疾病具有预防和治疗效果,同时可活化NK等免疫活性细胞,增强机体抗肿瘤的活性。例如通过本发明所制备的免疫调节剂组合物均可增强免疫功能低下模型小鼠的总T细胞、Th细胞、Ts细胞数和血浆IFN-γ水平;恢复环磷酰胺所致白细胞减少症小鼠的白细胞、中性粒细胞和血小板的数目,提高机体在免疫功能抑制或受损情况下(如使用免疫抑制剂、肿瘤的放化疗等)免疫功能的恢复能力。同时,通过本发明所制备的免疫调节剂组合物可调节机体的Th1/Th2平衡,可显著抑制二甲苯所致迟发性变态反应以及大鼠同种被动皮肤过敏反应,降低小鼠哮喘模型小鼠的气道高反应性和气道炎症,增强机体抗过敏能力。可增强机体NO的产生能力,可明显减少豚鼠生殖器疱疹皮损的复发天数,升高血浆IFN-γ水平,增强机体抗病毒的能力。
通过实施例13~15结果提示:通过本发明所制备的免疫调节剂组合物可诱导机体产生非特异性和特异性抗体的产生,增强机体对感染的控制能力;同时,通过本发明所制备的免疫调节剂组合物是一种良好的疫苗佐剂,不仅能提高细菌疫苗(如A群脑膜炎球菌多糖疫苗)特异性IgG水平,而且也可提高病毒疫苗(如流感疫苗)特异性IgG。
综上所述:本发明提供了一种免疫调节剂组合物或药物组合物,其包含多种细菌多糖,这些细菌多糖可被表达于人或动物免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和DC细胞上的模式识别受体(PRR)特异性识别,启动宿主的非特异免疫和炎症反应,继而引发宿主的特异性免疫反应。由于非特异性免疫反应系统被激活,一方面启动中性粒细胞、巨噬细胞、DC等免疫活性细胞内的信号激活通路,刺激免疫活性细胞增殖、分化并分泌TNF-α、IL-12等细胞因子。IL-12等细胞因子促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌,产生Th1占优势的免疫反应,调节Th1/Th2平衡,从而增强机体抗感染、过敏能力;同时部分多糖抗原在非特异性免疫反应的基础上,激活特异性免疫反应,产生特异性抗体从而杀灭入侵的微生物,消除感染;另一方面参与非特异性和特异性免疫的NK细胞、效应T细胞等免疫细胞被活化,增强了机体免疫系统抗肿瘤的活性,从而在整体上增强人或动物抗感染、抗过敏、抗肿瘤的能力。其中由多种细菌多糖制备的免疫调节剂组合物的作用要优于单独或两种细菌多糖制备的免疫调节剂组合物。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解:在不脱离本发明原理和技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (16)
1.一种免疫调节剂组合物,其特征在于,至少包含分支杆菌属细菌多糖提取物和肺炎球菌多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比不低于20%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比不低于10%。
3.根据权利要求1或2所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,所述分支杆菌属细菌多糖提取物为卡介菌多糖提取物、草分枝杆菌多糖提取物或耻垢分枝杆菌多糖提取物。
4.根据权利要求3所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,还包含葡萄球菌属、链球菌属、埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、克雷伯菌属的多糖提取物。
5.根据权利要求4所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,包含金黄色葡萄球菌多糖提取物、卡他布兰汉氏菌多糖提取物、肺炎克雷伯杆菌多糖提取物、流感嗜血杆菌多糖提取物、草绿色链球菌多糖提取物、化脓性链球菌多糖提取物。
6.根据权利要求5所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为20~80%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10~70%,金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为0~20%。
7.根据权利要求6所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为50%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比为35%,金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为15%。
8.根据权利要求6所述的免疫调节剂组合物,其特征在于,所述免疫调节剂组合物中分支杆菌属细菌多糖提取物所占重量比为70%,肺炎球菌多糖提取物所占重量比为10%,金黄色葡萄球菌多糖提取物所占质量比为20%。
9.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1所述的免疫调节剂组合物及药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求1所述的免疫调节剂组合物或权利要求9所述的药物组合物,其特征在于,还包含抗原或抗原决定簇。
11.根据权利要求10所述的免疫调节剂组合物或药物组合物,其特征在于,所述抗原或抗原决定簇选自以下一种或多种疫苗的抗原或抗原决定簇:细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、肿瘤疫苗。
12.根据权利要求11所述的免疫调节剂组合物或药物组合物,其特征在于,所述药物组合物和/或免疫调节剂组合物与抗原或抗原决定簇联合给药。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于,所述抗原或抗原决定簇为卡介苗疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、SARS疫苗、疟原虫抗原、流感病毒A全病毒灭活疫苗或A群脑膜炎球菌多糖疫苗。
14.权利要求1所述的免疫调节剂组合物或权利要求9所述的药物组合物在制备预防或治疗感染、过敏、肿瘤、免疫系统失衡、肺部相关慢性疾病的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用,其特征在于,所述感染为单纯疱疹病毒感染,所述过敏为被动皮肤过敏和哮喘,所述肿瘤为肺癌,所述免疫系统失衡为环磷酰胺所致白细胞减少症,所述肺部相关慢性疾病为慢性阻塞性肺病。
16.根据权利要求15所述的应用,其特征在于,所述药物为疫苗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110416789.5A CN103157108B (zh) | 2011-12-13 | 2011-12-13 | 免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110416789.5A CN103157108B (zh) | 2011-12-13 | 2011-12-13 | 免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103157108A true CN103157108A (zh) | 2013-06-19 |
CN103157108B CN103157108B (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=48580972
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110416789.5A Active CN103157108B (zh) | 2011-12-13 | 2011-12-13 | 免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103157108B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105747232A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-07-13 | 无限极(中国)有限公司 | 一种多糖组合物及其应用 |
CN106606775A (zh) * | 2015-10-27 | 2017-05-03 | 格里菲斯大学 | 脂质体a群链球菌疫苗 |
CN107921106A (zh) * | 2015-05-20 | 2018-04-17 | 大日本住友制药株式会社 | Wt1抗原肽和免疫调节剂的组合 |
CN110804643A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-02-18 | 同济大学 | 一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法 |
US11759509B2 (en) | 2013-03-29 | 2023-09-19 | Sumitomo Pharma Co., Ltd. | WT1 antigen peptide conjugate vaccine |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1582956A (zh) * | 2003-08-21 | 2005-02-23 | 北京首医科技有限公司 | 一种分枝杆菌多糖复合物及其制备方法 |
CN101663041A (zh) * | 2007-03-05 | 2010-03-03 | Om药物公司 | 用于呼吸病症的细菌提取物及其制备方法 |
CN102186500A (zh) * | 2008-10-20 | 2011-09-14 | 苏黎世大学 | 结核分枝杆菌疫苗 |
-
2011
- 2011-12-13 CN CN201110416789.5A patent/CN103157108B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1582956A (zh) * | 2003-08-21 | 2005-02-23 | 北京首医科技有限公司 | 一种分枝杆菌多糖复合物及其制备方法 |
CN101663041A (zh) * | 2007-03-05 | 2010-03-03 | Om药物公司 | 用于呼吸病症的细菌提取物及其制备方法 |
CN102186500A (zh) * | 2008-10-20 | 2011-09-14 | 苏黎世大学 | 结核分枝杆菌疫苗 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
MING WEN FAN ETAL: "Regulation of BCG-Polysaccharide Nucleic Acid and Dexamethasone on Th1/Th2 Cytokines from Peripheral Blood Mononuclear Cells in Oral Lichen Planus", 《THE CHINESE JOURNAL OF DENTAL RESEARCH》 * |
周太光等: "卡介菌多糖核酸佐治儿童哮喘的临床观察", 《儿科药学杂志》 * |
周莉婷等: "分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展", 《药物生物技术》 * |
王茂慈等: "23价肺炎球菌多糖疫苗和流行性感冒病毒裂解疫苗联合接种对老年人呼吸系统防治效果观察与效益分析", 《中国疫苗和免疫》 * |
陈乐创: "肺炎球菌疫苗新进展", 《当代医学》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11759509B2 (en) | 2013-03-29 | 2023-09-19 | Sumitomo Pharma Co., Ltd. | WT1 antigen peptide conjugate vaccine |
CN107921106A (zh) * | 2015-05-20 | 2018-04-17 | 大日本住友制药株式会社 | Wt1抗原肽和免疫调节剂的组合 |
CN107921106B (zh) * | 2015-05-20 | 2023-09-08 | 住友制药株式会社 | Wt1抗原肽和免疫调节剂的组合用途 |
CN106606775A (zh) * | 2015-10-27 | 2017-05-03 | 格里菲斯大学 | 脂质体a群链球菌疫苗 |
CN105747232A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-07-13 | 无限极(中国)有限公司 | 一种多糖组合物及其应用 |
CN110804643A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-02-18 | 同济大学 | 一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103157108B (zh) | 2016-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102802665B (zh) | 流感疫苗、组合物及使用方法 | |
Preston et al. | Inhibition of allergic airways disease by immunomodulatory therapy with whole killed Streptococcus pneumoniae | |
CN103157108B (zh) | 免疫调节剂组合物及其药物组合物和应用 | |
JP2010502766A (ja) | アジュバントとしてのキチン微粒子 | |
CN104302314A (zh) | 减毒博代氏杆菌菌株对抗变应性疾病的效果 | |
US20180161414A1 (en) | Vaccine comprising lactobacillus strains for treating prostate inflammation and benign prostate hyperplasias | |
CN102238959B (zh) | 包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物及其在制备药剂中的应用 | |
CN101690813A (zh) | 一种鸡新城疫浓缩冻干卵黄抗体复合制剂及其制备工艺 | |
Ghaemi et al. | Echinacea purpurea polysaccharide reduces the latency rate in herpes simplex virus type-1 infections | |
JP6019492B2 (ja) | 乳酸菌および抗原物質を含み、口腔内に投与されることを特徴とする抗アレルギー剤 | |
WO2008014570A2 (en) | Treatment and prevention of allergic airways diseases | |
CN101686992B (zh) | 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗变态反应性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 | |
CN100571774C (zh) | 伤寒、副伤寒外膜蛋白疫苗 | |
CN114377127A (zh) | 一种三联卵黄抗体制剂及其制备方法和应用 | |
Oremeyi et al. | Cellular and mucosal immune responses in the respiratory tract of Nigerian goats following intranasal administration of inactivated Recombinant Mannheimia hemolytica bacterine | |
KR20020021375A (ko) | 미코박테리움 바카이를 활용하여 면역적으로 매개된질병을 치료하는 방법 및 조성물 | |
CN101686993A (zh) | 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 | |
CN104248758A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
CN107661489A (zh) | 疫苗用中药免疫增强剂及其制备方法与应用 | |
CN114805554B (zh) | 抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备方法 | |
WO2024040979A1 (zh) | 一种人参酸性多糖疫苗佐剂、疫苗组合物及其应用 | |
CN103638520B (zh) | 柴胡皂苷a和柴胡皂苷d疫苗免疫佐剂用途 | |
JP5995329B2 (ja) | インフルエンザワクチン、組成物、および使用方法 | |
CN105412919A (zh) | 流感疫苗、组合物及使用方法 | |
CN102988988B (zh) | 一种治疗肺曲霉病的药物组合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230913 Address after: Room 109, No. 2 Shatai North Road, Baiyun District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510080 Patentee after: Yunfan Medical Technology (Guangzhou) Co.,Ltd. Address before: A3, Building 93, No. 1023 Shatai South Road, Guangzhou City, Guangdong Province, 510515 Patentee before: Ning Yunshan |