CN101663041A - 用于呼吸病症的细菌提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种来自细菌菌株(例如葡萄球菌属、莫拉氏菌属、克雷伯氏菌属、链球菌属和嗜血菌属)的提取物。该提取物可用于适应症(例如呼吸病症)的治疗、包含该提取物的组合物和从不引起朊病毒病的风险的培养基制造该提取物的方法。
Description
发明说明书
本申请要求提交于2007年3月5日的美国临时专利申请第60/904,789号的优先权。
发明领域
本发明涉及可用作适应症(例如呼吸病症)的治疗的得自细菌菌株的提取物、包含该提取物的组合物、和使用不引起朊病毒病(priondisease)的风险的培养基制造该提取物的方法。
发明背景和概述
本发明涉及可用于治疗医学病状(例如呼吸病症)的包含细菌提取物的组合物。该提取物可包含得自选自下列物种的培养物的细菌裂解产物:粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌属)(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)、粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)(Moraxella(Moraxella)catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushemolyticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、咽峡炎链球菌(Streptococcusanginosus)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(又称绿色链球菌(Streptococcusviridans))、干燥奈瑟氏球菌(Neisseria sicca)、副流感嗜血菌(Hemophilus parainfluenzae)、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)(Actinobacillus(Hemophilus)actinomycetemcomitans)、和啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)。
在一些实施方案中,该提取物包含至少一种得自各上述细菌物种的菌株,而在其他实施方案中,一种或更多种得自上述清单的特定菌株可被除去或用一种或更多种不同菌株取代。一些本发明的实施方案包含得自下列细菌菌株的每一种的提取物:粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌属)3622、粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌属)3625、粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌属)I-045、流感嗜血菌8467、肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella pneumoniae ssp.ozaenae)5050、肺炎克雷伯氏菌204、肺炎克雷伯氏菌5056、金黄色葡萄球菌I-049、金黄色葡萄球菌I-050、金黄色葡萄球菌I-051、金黄色葡萄球菌I-052、金黄色葡萄球菌I-053、金黄色葡萄球菌I-054、肺炎链球菌(双球菌属)(Streptococcus(Diplococcus)pneumoniae)7465、肺炎链球菌(双球菌属)7466、肺炎链球菌(双球菌属)7978、肺炎链球菌(双球菌属)10319、酿脓链球菌8191、血链球菌I-046、血链球菌I-047、血链球菌I-048、溶血葡萄球菌11042、粪肠球菌103015、变异链球菌10449、咽峡炎链球菌10713、缓症链球菌12261、唾液链球菌102503、干燥奈瑟氏球菌103345、副流感嗜血菌7857、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)52.105、和啮蚀艾肯氏菌10596。这些菌株根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏。名单中所指示的具有I-号码的菌株由法国巴斯德研究所国立微生物保藏中心(Collection Nationale deCulture des Microorganismes at the Institut Pasteur,25 rue duDr.Roux,75724巴黎,法国)编入索引。所有其他菌株由伦敦国立典型培养物保藏中心(National Collection of Type Cultures inLondon)编入索引。
在一些实施方案中,一种或更多种上述特定菌株可被省略、或用来自相同物种或来自不同的细菌物种的不同菌株取代。例如,在一些实施方案中,菌株溶血葡萄球菌11042、粪肠球菌103015、变异链球菌10449、咽峡炎链球菌10713、缓症链球菌12261、唾液链球菌102503、干燥奈瑟氏球菌103345、副流感嗜血菌7857、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)52.105、和啮蚀艾肯氏菌10596中的一种或更多种或甚至全部可被省略。在其他实施方案中,莫拉氏菌属(Moraxella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、或血链球菌菌株的一种或更多种可被省略。进一步地,为了帮助消化,还可使用乳杆菌属(Lactobacillus)菌株或细菌的另一菌株。
提取物可在细胞于培养基中生长至适当光学密度之后通过碱裂解(alkaline lysis)的方法获得。在一些实施方案中,细菌各自在不引起朊病毒相关疾病的风险或其他可通过摄取得自基于动物的培养基的产物传染的疾病的风险的培养基中生长。例如,在一些实施方案中使用基于植物的培养基(例如基于大豆的培养基)来生长细胞。在其他实施方案中,合成培养基用于细胞生长。在其他实施方案中,培养基可包括生物提取物(例如酵母提取物和马血清),其也不引起此类疾病的风险。
也可过滤裂解产物以除去核酸和较大细胞碎片。由于过滤,在一些实施方案中,存在于提取物中的核酸的量小于100微克/毫升。在一些实施方案中,也通过过滤除去不溶性化合物,例如细胞壁碎片和降解不足的脂多糖(LPS)。因此,在一些实施方案中,所产生的提取物包含可溶性分子成分且不包含显著量的不溶或颗粒物质。
糖成分可保留在提取物中,包括脂多糖(LPS)成分。在裂解方法期间,糖可变成被化学修饰的,例如裂解成较小结构或用其他官能团取代。
在裂解方法期间氨基酸的外消旋作用也从天然蛋白质中所发现的天然存在的L-氨基酸产生D-氨基酸。D-氨基酸在增加提取物的生物利用率上是有益的,因为主要地或部份地由D-氨基酸构成的蛋白质在哺乳动物的肠中不被有效地消化。因此,在裂解期间被化学修饰而包含D-氨基酸的提取物中的抗原性分子留在患者的身体中较长时间,潜在地允许较强免疫刺激作用。
虽然在现有技术中已使用细菌提取物来刺激免疫系统抵抗呼吸疾病,但对更好标准化和控制这些提取物仍存在需要以便使其更安全、更有效、和较持久。例如,为了安全理由原先认为应从细菌提取物除去糖成分,包括潜在有毒的脂多糖(LPS)成分。(参见例如,美国专利第5,424,287号)。然而,本发明提供一种产生充分化学修饰的LPS成分且安全地保留糖的方法。保留这些成分可改良功效和提供给该提取物额外抗原。
例如,发明人已发现调节裂解作用的pH和时间可允许潜在地变应性或有毒的细胞壁成分的充分降解。较低pH或较短时间的先前裂解条件,相比之下,产生其中细胞壁成分和糖化学修饰不足的提取物。(参见例如,GB 2021415A)。所产生的提取物对欲安全施用的患者而言变应原性过强。总的来说,发明人已发现在太低pH和/或在太短时间裂解的产物具有较高毒性、较低蛋白质提取、和较低过滤性。
过滤方法也可影响所产生的提取物的性质,如过滤器的孔径,和在一些情形中,过滤器表面的化学性质,可改变被除去和保留的物质的类型。例如,一些本发明的实施方案使用一种设计用于保留糖但除去其他分子成分(例如核酸)的过滤方法。
因此,本发明提供标准化细菌提取物以帮助维持一致的安全性和功效的参数。
附图简述
图1:细菌裂解之后用于制备细菌提取物的切向流过滤(TFF)系统的示意图。该示意图显示过滤器的二种不同配置:其中所有过滤器同时工作的平行模式和其中过滤器以连续模式配置的蛇形模式。
图2:用来自实施例2.2、3.6、3.7、3.8、3.9和3.10的提取物的纯化混合物的连续稀释物温育的人PBMC的IL-6和TNF-α产生。
图3:用病毒H1N1攻击的小鼠在感染之后3周期间的存活。McNemar:对于10毫克治疗组对对照组,检验*p=0.023。
图4:鼠巨噬细胞中的一氧化氮生物测定中NaOH浓度、生物质的量(以克干重每毫升表示),和裂解持续时间(小时)对纯化的HAIN8467提取物(实施例2.1、2.5、2.8)的生物活性的影响。
图5:肺炎双球菌(Diplococcus pneumonia)提取物(实施例3.6)的纯化混合物的鼠巨噬细胞中的一氧化氮生物测定。
图6:在鼠巨噬细胞中的一氧化氮生物测定中,实施例3.1和实施例3.3的提取物的生物活性(分别地标记为3a和3c)。
图7:在鼠巨噬细胞中的一氧化氮生物测定中,来自实施例2.2、3.6、3.7、3.8、3.9、和3.10的提取物的纯化混合物的生物活性。
图8:根据本发明的提取物对从化合物48/80-刺激的大鼠肥大细胞分泌组织胺的影响。
图9:不同实验组的(a)膀胱和(b)肾组织中的平均总菌落形成单位(CFU)值。
图10:在小鼠的LPS-不敏感株系的大肠杆菌感染模型中本发明的实施方案的效果。该图显示具有(a)标记CD14对FoxP3,和(b)TCR对FoxP3的流式细胞式(flux cytometry)数据。左边显示未处理的组织而右边显示经处理的组织。
发明详述
定义
提取物:提取物,如在本文中定义的,表示一种或更多种细菌菌株的裂解作用之后所获得的物质。在一些情形中,该提取物仅得自一种菌株而在其他情形中提取物得自数种不同菌株的混合物。
碱裂解:其为在碱性条件下裂解细菌细胞的方法。
裂解产物:如在本文中使用的,该术语表示得自细胞裂解步骤的细菌的提取物。
过滤:一种过滤方法,如在本文中描述的,表示提取物或提取物的混合物通过一种或更多种过滤器例如微过滤器(即微过滤)或超滤器(即超滤)。该过滤可不需要除去100%的计划除去的成分。在一些情形中,在数个通路或循环中重复过滤。
初始pH:该术语表示于步骤(例如细菌裂解作用或过滤)的开始时测量的pH。
糖:糖,如在本文中定义的,包括单糖、二糖、以及较大的糖例如直链和支链多糖。糖也包括经取代或化学修饰的糖,例如脂多糖(LPS)和它们的化学修饰变体。
D-氨基酸:该术语是指以右旋异构形式存在的氨基酸,而不是以左旋异构形式存在的生物合成所产生的L-氨基酸。
外消旋作用:该术语指L-氨基酸至少部份化学修饰成D-氨基酸。
避免基于朊病毒(prion)的疾病的风险的培养基表示用于制备该提取物的任何阶段且不包含取自动物(例如牛或羊)、或取自任何可传染基于朊病毒的疾病的其他动物的物质例如血清或肉提取物的培养基。该培养基的例子包括基于植物的或合成培养基以及使用马血清的培养基或包含取自不传染朊病毒病的动物物种的物质的培养基。基于朊病毒的疾病的例子包括(例如)疯牛病、羊瘙痒症、和克雅病(Creutzfeld-Jacob disease)。
非动物培养基为一种不包括得自动物的成分的培养基。例子包括基于植物的(即植物性)培养基,例如大豆培养基、和合成培养基。
治疗如在本文中使用的表示现有感染的治疗(例如)以及预防或防止新感染的发展(例如)二者。
受试者,如在本文中使用的,表示任何动物受试者,包括哺乳动物受试者,例如人和驯养的哺乳动物。
应理解本文所定义和本发明所使用的特定细菌菌株可包括得自本文所列举的原始保藏或其基因克隆的菌株,包括在较迟时间再保藏的具有不同保藏码名字但遗传上被认为是与原保藏版本相同的菌株的菌株。
本文中所使用的数字是大约的,考虑在其测量中的固有误差、舍入、和有效数字。
提取物的制备
本发明的细菌提取物可通过发酵接着热灭活和碱裂解及过滤而制备。对于各菌株,为了获得足够量的物质,发酵培养物可从工作种子批次开始接着接种于较大发酵容器中。
各物种所使用的培养基可以相同。然而,可引入补充生长因子以提高一些物种的生长。在一些实施方案中,避免基于朊病毒的疾病的风险的培养基可用于生长至少一些,或全部,菌株。例子包括非动物培养基例如基于植物的培养基和合成培养基。其他例子包括包含马血清或另一动物提取物的培养基,所述提取物取自不引起朊病毒病的威胁的动物物种,与在可引起该风险的牛血清或肉提取物的存在下生长的菌株不同。在一些实施方案中,Ala-Gln二肽可加至培养基。本发明人观察到Ala-Gln二肽,在一些实施方案中,用作细菌培养物的生长刺激剂。
发酵之后,从各菌株或从一组菌株所产生的生物质可通过热处理灭活、并浓缩、和冷冻。细胞物质可用氢氧根离子(例如来自NaOH)裂解。在一些实施方案中,2至130克/升的细菌干重的生物质浓度可被裂解,例如20至120克/升,或5至90克/升,或10至50克/升,或40至90克/升。(生物质浓度在本文中以每升裂解作用的细菌干重提供。生物质浓度通过在小瓷皿中于105℃干燥5毫升的物质直到其达到恒定质量及然后以克每升记录该质量而测量)。例如,嗜血菌属(Haemophilus)菌株可以以15-90克/升的生物质浓度进行裂解,例如40至90克/升,例如40、50、60、70、80、或90克/升或由这些浓度限制的较小范围(即40-50、70-90、等等)。链球菌属(Streptococcus)菌株(例如)可以以10至90克/升进行裂解,例如10、20、30、40、50、60、70、80、或90克/升或由这些浓度限制的较小范围。莫拉氏菌属菌株可以以(例如)5至60克/升、或10-60克/升,或15-40克/升进行裂解,例如5、10、20、30、40、50、或60克/升或由这些浓度限制的较小范围;克雷伯氏菌属菌株可以以(例如)10至50克/升进行裂解,例如25-50克/升,或10、20、30、40、或50克/升或由这些浓度限制的较小范围。葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株可以以(例如)30至90克/升进行裂解,例如30、40、50、60、70、80、或90克/升或由这些浓度限制的较小范围。奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌株可以以(例如)5至60克/升进行裂解,例如5、10、20、30、40、50、或60克/升或由这些浓度限制的较小范围。
在一些实施方案中,0.01N至1.2N的氢氧化物浓度可用于裂解作用,例如0.1至1N、或0.05N至0.4N,例如0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、或0.4N、或由这些浓度限制的较小范围、或0.5N至1.0N,例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0N、或由这些浓度限制的较小范围。可使用碱浓度以达到12或更高的初始pH,大于12的pH,大于12.5的pH、或pH例如从pH12.0至pH 13.4的pH或12.6至13.4的pH。例如,对于链球菌属菌株,氢氧化物浓度可为0.1-0.7N、或0.2-0.5N,例如0.2、0.3、0.4、或0.5N或由这些浓度限制的较小范围。对于莫拉氏菌属或嗜血菌属菌株,其可为0.05-0.7N、或0.15-0.5N,例如0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、或0.5N或由这些浓度限制的较小范围。对于克雷伯氏菌属或葡萄球菌属菌株,其可为0.1-0.7N、或0.15-0.4N例如0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、或0.4N或由这些浓度限制的较小范围。
裂解温度可为30至60℃,例如30-40℃、或35-40℃,例如37℃。裂解作用的时间可从20小时或从40小时至数天,例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10、或甚至15天。例如,对于嗜血菌属、链球菌属、莫拉氏菌属、和葡萄球菌属菌株,可采用5-9天的时间,和对于克雷伯氏菌属和奈瑟氏球菌属菌株可采用7-10天的时间。在一些实施方案中,各菌株可采用30-40℃、或35-40℃的裂解温度,例如37℃,和裂解作用可经历72至210小时(3-9天),例如3天、4、5、6、7、8、及9天或由这些时间限制的小时或天的范围(例如,3-4天、8-9天、等等)。应理解这些时间的范围包括其中任何分数的天、小时、或分钟。
在一些实施方案中,当使用一种以上相同菌属的菌株时,这些菌株可一起或分开地裂解。这些菌株可在裂解作用之前或之后混合。
提取物可通过离心和/或过滤纯化。例如,裂解产物可于9000x重力离心,接着在0.2微米过滤器上过滤一次或更多次。在一些情形中,可使用连续几次在较大孔过滤器上的过滤接着在0.2微米过滤器上过滤。也可采用超滤方法以便帮助从该提取物中提取可溶性物质,例如,循环超滤渗透物(permeate)以进一步微过滤。
在一些实施方案中,切向流过滤(tangential flow filtration,TFF)方法可用于过滤提取物和用于从较大细胞碎片提取可溶性分子。(参见图1)。(参见例如,Separations Technology,Pharmaceuticaland Biotechnology Applications,Wayne P.Olson,Editor,Interpharm Press,Inc.,Buffalo Grove,IL,美国,第126至135页-ISBN:0-935184-72-4)。在该方法的开始时,稀释的细菌裂解产物可储存在第一个槽中。开始微过滤(MF)回路(loop),和泵抽产物。循环所产生的MF滞留物(retentate),而MF渗透物被转移到第二个槽。
到达适当程度的浓度之后,可开始超滤(UF)回路。为了从裂解产物连续提取可溶性化合物,UF渗透物可再循环回到第一个槽而UF滞留物储存在第二个槽中。在连续提取期间,在槽1和2中的体积可通过调节微过滤和超滤渗透物的速率调整。
用TFF或另一过滤方法可进行数个该提取循环。在使用TFF的实施方案中,在最后一个循环结束时,可关闭超滤回路且可单独运行微过滤回路和将MF渗透物转移到槽2。
微过滤回路可装设1.2微米至0.1微米的过滤器,例如0.65至0.2微米、或0.45微米的过滤器。交叉流可在1000升/小时米2(LHM)和3000LHM之间,例如在1500和2500LHM之间、或2000LHM且具有0.6至2巴(例如在0.8和1.5巴之间、或1.0巴)的透膜压力(TMP)。超滤回路可装设10KDa至1000KDa(例如10KDa至100KDa、或10KDa至30KDa、或30KDa至100KDa)的过滤器。交叉流可在30LHM和1000LHM之间,例如在20和500LHM之间且具有0.2至1.5巴(例如在0.4和1.2巴之间、或0.5巴)的TMP。
在5和20之间的渗滤体积可用于从细菌细胞壁提取可溶性化合物。在一些实施方案中,使用在8和15之间的体积。因此(例如)在一些实施方案中,可使用在5和15个循环之间的过滤,在一些情形中在8和15个循环之间,例如8、9、10、11、12、13、14、或15个循环。
过滤之后,可进一步稀释、浓缩或离心提取物(如果需要)。也可包括纯化步骤以从该提取物中除去颗粒物质。例如,可进行另一使用较小孔过滤器(例如0.2微米过滤器)的微过滤。过滤之后,通过Lowry测量的可溶性蛋白质的产率可大于50%、或可大于60%、或可为50至90%、或可为60-90%,例如。过滤之后,提取物可在使用配制之前冷冻干燥。
在一些本发明的实施方案中,可选择一组裂解条件用于一种或更多种细菌菌株。40至90克/升,或40、50、60、70、80、或90克/升的流感嗜血菌NCTC 8467可被裂解72-200小时,例如72、96、120、150、或200小时。10至95克/升的一种或更多种链球菌属菌株(例如10、20、40、60、80、90、或95克/升)可被裂解72-210小时,例如72、96、120、150、或200小时。15至80克/升的一种或更多种双球菌属(Diplococcus)菌株(例如15、20、30、40、50、60、70、或80克/升)可被裂解72-210小时,例如72、96、120、150、或200小时。10至50克/升的一种或更多种克雷伯氏菌属菌株(例如10、15、20、25、30、35、40、45、或50克/升)可被裂解72-210小时,例如72、96、120、150、或200小时。5至60克/升的一种或更多种奈瑟氏球菌属菌株(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、或60克/升)可被裂解72-210小时、例如72、96、120、150、或200小时。30至90克/升的一种或更多种葡萄球菌属菌株(例如30、40、50、60、70、80、或90克/升)可被裂解72-210小时,例如72、96、120、150、200小时。在这些实施方案中,裂解作用可于35-40℃(例如于37℃)下进行。进一步地,“温和”或“强”裂解条件可用于形成该提取物的各菌株或一组相似的菌株。如在本文中使用的,“温和”裂解条件是指0.05至0.4N的氢氧根离子浓度,例如0.1、0.2、0.3、或0.4N与上文提供的用于各类型的菌株的时间、温度、和生物质参数一起(例如用于流感嗜血菌NCTC 8467的35-40℃,40-90克/升的生物质和72-200小时)。如在本文中使用的,“强”裂解条件是指0.5至1N的氢氧根离子浓度,例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1N,与上文提供的用于各菌株的时间、温度、和生物质参数一起。在一些实施方案中,可进行强及温和二种裂解,且将所产生的产物混合在一起。
在一些本发明的实施方案中,该提取物可得自一种以上的细菌菌株,例如得自至少一种革兰氏阴性和至少一种革兰氏阳性菌株。在裂解作用之前或之后可混合来自相同或不同物种的细菌菌株。在一些实施方案中,可混合菌株(例如)以获得各自在混合物中1-40%的体积或15-30体积%的各属的细菌。在一些实施方案中,该提取物可包含得自(例如)2、3、4、5或10个不同属的细菌的裂解产物。例如5个属的混合物可包含嗜血菌属、莫拉氏菌属、克雷伯氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属菌株(包括血链球菌、酿脓链球菌、和肺炎链球菌)。一些肺炎链球菌菌株已知为(例如)双球菌属菌株。在一些该5个属的实施方案中,混合物可包含5至15体积%的嗜血菌属,例如7-10%、或7、8、或9%;5至15体积%的双球菌属,例如7-10%或7、8、或9%;5-20体积%的链球菌属,例如7-15%、或8、9、10、11、或12%;10至30体积%的克雷伯氏菌属,例如15-25%、或16、17、18、19、20、21、22、23、或24%;10至30体积%的葡萄球菌属,例如15-25%、或16、17、18、19、20、21、22、23、或24%;和20至40体积%的奈瑟氏球菌属,例如25-35%、或26、27、28、29、30、31、32、33、或34%。
细菌提取物的化学性质
一些根据本发明的实施方案可包含(例如)5-75毫克/毫升的蛋白质、或10-65毫克/毫升,或20-45毫克/毫升,或5-40毫克/毫升,或5-20毫克/毫升,或5-10毫克/毫升,或6-8毫克/毫升的蛋白质或从5、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75毫克/毫升开始或结束的范围;1.5至2.5毫克/毫升的游离氨基酸(A.A.),或1.5至2毫克/毫升,或2至2.5毫克/毫升的游离A.A.,或从1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、或2.5毫克/毫升开始或结束的范围的游离A.A.,从谷氨酸(147.1克/摩尔)计算;及0.3至4.5毫克/毫升的多糖和单糖、或0.3至4毫克/毫升,或0.4至4毫克/毫升,或0.5至3.5毫克/毫升,或0.6至3毫克/毫升或0.3至1毫克/毫升或从0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、或4.5毫克/毫升开始或结束的范围的多糖和单糖,例如0.4至0.5毫克/毫升。例如,一些实施方案包含约6至8毫克/毫升的蛋白质,1.5至2.5毫克/毫升的游离氨基酸(A.A.),从谷氨酸(147.1克/摩尔)计算和/或约0.4至0.5毫克/毫升的多糖和单糖。蛋白质浓度根据欧洲药典2.5.33的方法2通过Lowry测定测量。糖浓度根据D.Herbert等人,Meth.Microbiol.5B:266及以下(1971)在酸水解和衍生化之后测定。谷氨酸盐(谷氨酸)浓度根据Roth M.,Fluorescence reaction for aminoacids,Anal.Chem.,43,880-882,(1971)通过将氨基酸转化为异吲哚衍生物和于340nm处测量吸光度而测量。
在一些实施方案中,根据鲎变形细胞裂解物(limulus amoebocytelysate,LAL)产色试验,LPS当量的浓度小于1000纳克/毫升,小于500纳克/毫升,小于200纳克/毫升,或小于100纳克/毫升。
根据本发明的细菌的裂解作用可导致蛋白质的部份水解以及脱氨基作用、脱酰胺基作用、和氨基酸从L至D的部分外消旋化。在根据本发明的提取物的分析研究中,各观察到代表D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-丝氨酸、D-甲硫氨酸、D-组氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、和D-赖氨酸的峰。在该研究中这些种类的D-氨基酸的百分比范围从3%至40%。因此,一些本发明的实施方案允许丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和赖氨酸的一种或更多种的外消旋化作用,例如所有的上述氨基酸、或任何一种以上但小于全部的上述氨基酸的选择,例如,丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。在一些实施方案中,上述氨基酸的一种或更多种的至少10%可从D外消旋化变成L。在其他实施方案中,上述氨基酸的一种或更多种的至少40%可被外消旋。
根据本发明的细菌的裂解作用由于水解作用可导致成分分子的分子量从0至300kDa减少到0至100kDa、或0至60kDa。
细菌提取物的生物活性
根据本发明的提取物可有效治疗罹患或处于发展医学病状(例如呼吸病症和变应性反应或病状)的风险的患者。根据本发明的提取物可有效治疗(例如)上和下呼吸道感染、特应性皮炎、鼻咽炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎、咽喉炎、流行性感冒、肺炎、支气管肺炎、支气管炎、下呼吸道感染、变应性鼻炎、变应性哮喘、鼻炎、鼻咽炎、咽炎、鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、喉气管炎、支气管炎、伴有急性下呼吸道感染的阻塞性肺部疾病、及伴有急性恶化的阻塞性肺部疾病。
提取物的生物活性可通过数种测定测量。例如,外周血单核细胞(PBMC)测定检测从PBMC产生的细胞因子IL-6且可筛选提取物刺激免疫系统的能力。例如,在一些实施方案中,用本发明提取物刺激的PBMC的上清液中测量的体外IL-6浓度范围在2000皮克/毫升至70,000皮克/毫升,2000皮克/毫升至50,000皮克/毫升,2000皮克/毫升至30,000皮克/毫升,2000皮克/毫升至20,000皮克/毫升,2000皮克/毫升至10,000皮克/毫升,或5000皮克/毫升至70,000皮克/毫升,5000皮克/毫升至50,000皮克/毫升,5000皮克/毫升至30,000皮克/毫升,5000皮克/毫升至25,000皮克/毫升,或5000皮克/毫升至10,000皮克/毫升,或15,000皮克/毫升至25,000皮克/毫升。当LPS用作激动剂对照(于0.01微克/毫升)时,所得值视供体而定,范围在5,000皮克/毫升至70,000皮克/毫升。
鼠一氧化氮(NO)试验测量鼠巨噬细胞所产生的NO,其也指示免疫刺激。例如,巨噬细胞产生NO以便杀死侵入的细菌。在一些实施方案中,本发明实施方案的一氧化氮(NO)体外活性在0.001毫克/毫升至10毫克/毫升的可溶性干重的浓度下进行检测,提供范围在3μM至100μM一氧化氮、或3μM至90μM、3μM至80μM、3μM至70μM、3μM至60μM、3μM至50μM、3μM至40μM、3μM至30μM、3μM至20μM、3μM至10μM、或5μM至80μM、5μM至60μM、5μM至40μM、5μM至20μM、或10μM至80μM、10μM至70μM、10μM至50μM、10至30μM、或10μM至15μM、或从3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100μM开始或结束的范围的最大应答。
在体外人外周血单核细胞和鼠巨噬细胞中所观察到的活性可取决于变量例如待裂解的细菌干重生物质的量,即用于裂解的“起始材料”的量、碱裂解的持续时间、和NaOH的初始百分比或裂解作用中所使用的初始pH。
体外活性试验例如PBMC和NO与LPS浓度的测定(例如通过LAL)的组合也可提供关于给定的细菌提取物的活性对毒性风险的平衡的信息。
本发明的提取物也可具有抵抗飞沫微粒(aerosol)流感病毒感染,例如抵抗A/PR/8/34(H1N1)感染的活性。在一研究中(例如)根据本发明的提取物在10毫克/小鼠的剂量下在小鼠中能够赋予完全的免疫保护,如根据死亡率、肺病毒滴定、临床症状、和抗体滴度判断的。相比之下,只有70%的对照动物在感染之后存活。
作为另一例子,当这些小鼠首先用有效量的本发明的一些实施方案处理10天时,至少8只具有野生型LPS敏感性的小鼠用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)攻击13天之后的存活率为至少60%。可选择用于攻击的鼠伤寒沙门氏菌的剂量以使未处理的小鼠或用水或包含赋形剂但没有提取物的空白制剂对照处理的小鼠具有60%或更少的存活率,例如50%或更少。在一些情形中,提取物处理的小鼠的存活率为至少70%,至少80%,至少80%,至少90%、或至少95%。
此外,本发明的实施方案也可抑制化合物48/80-刺激的肥大细胞分泌组织胺,以统计上显著的程度,如下所进一步详细地显示的。例如,在化合物48/80-刺激的肥大细胞测定中本发明的实施方案可显示(例如)在0.0005和0.01毫克/毫升之间,例如在0.0005和0.005毫克/毫升之间、或在0.001和0.01毫克/毫升之间、或在0.002和0.008毫克/毫升之间、或在0.004和0.006毫克/毫升之间的IC-50值,例如。
包含细菌提取物的组合物
可以许多不同的方式配制冷冻干燥提取物混合物用于最后施用。例如,可制备口服片剂、胶囊、丸剂,以及液体制剂或气雾剂。也可制备输注或注射用制剂。本发明的实施方案可被配制(例如)成固体剂型或液体剂型。示例性固体剂型可包括(例如)包含提取物和任选的一种或更多种营养和/或膳食补充物的片剂,例如包衣片、咀嚼片、泡腾片、舌下片、粒剂、粉剂、或胶囊。固体剂型也可包含稀释剂、填充剂、和/或其他赋形剂。可加入其他赋形剂成分例如防腐剂、着色剂、调味剂、和甜味剂。也可能制备粉末或颗粒制剂。液体剂型如溶液、糖浆、悬浮液、或滴剂也可用于口服途径。
实施例
实施例1:细菌培养物
实施例1.1:流感嗜血菌NCTC 8467的培养
初始培养条件
培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠:3克/升;磷酸氢二钠:2克/升;乙酸钠:0.5克/升;大豆蛋白胨40克/升;葡萄糖:6克/升;肌苷:0.1克/升;氯化钙:0.02克/升;氯化钾:0.1克/升;碳酸氢钠:0.6克/升;丙酮酸钠:0.06克/升;金属溶液(硫酸铜:3毫克/升;氯化铁:830毫克/升;硫酸锌:860毫克/升;硫酸:1.1毫克/升):0.5毫升/升;氯化血红素:25毫克/升;NADH(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐还原型三水合物)25毫克/升。溶解之后,将pH调整至7.2。将培养基灭菌之后,小锥形瓶单独地用冷冻瓶的内含物(包含1.5毫升的冷冻细菌)接种且在37℃下培养8小时。然后将此培养物的等分试样转移到包含150毫升培养基的较大锥形烧瓶中,且在相同条件中再培养。具有1000毫升培养基的另一发酵步骤以相同条件(但在接种之前加入50毫克/升的氯化血红素和50毫克/升的NADH)进行(10小时之后10毫升培养物1在700nm处的OD:3.7,11小时之后1000毫升培养物在700nm处的OD:13.5)。然后,将整个1000毫升培养内含物转移到前发酵槽。
在前发酵槽中的培养条件
培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠:3克/升;磷酸氢二钠2克/升;乙酸钠:0.5克/升;大豆蛋白胨40克/升;葡萄糖6克/升;肌苷0.1克/升;氯化钙0.02克/升;氯化钾0.1克/升;碳酸氢钠0.6克/升;丙酮酸钠0.06克/升;金属溶液:0.5毫升/升;氯化血红素:1毫克/升;NADH:10毫克/升,聚丙二醇:0.06-0.10毫升/升。培养温度调整为30℃,并搅拌及曝气。在培养期间不调整pH。13小时之后,将2个前发酵槽转移到发酵槽(在700nm处的OD,6小时之后培养物1:1.53;8.5小时之后培养物2:1.90)。在无菌条件下将前发酵槽的培养物转移到发酵槽。
在发酵槽中的培养条件
培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠:3克/升,磷酸氢二钠:2克/升;乙酸钠0.5克/升,大豆蛋白胨40克/升;肌苷0.1克/升;氯化钙0.02克/升;氯化钾0.1克/升,碳酸氢钠0.6克/升;丙酮酸钠:0.06克/升;金属溶液:0.5毫升/升;氯化血红素1.5毫克/升;NADH:15毫克/升;聚丙二醇:0.02-0.04毫升/升。
灭菌之后,将15克/升葡萄糖加至该培养物。培养温度调整为35℃,并搅拌及曝气。在培养期间pH调整为6.8。8小时之后,通过在90至100℃下的热处理将培养物(在700nm处的OD,7.25小时之后培养物1:3.69;8.75小时之后培养物2:3.55)灭活并将其转移到收获槽。一旦灭活,将培养物转移到离心机以便从培养基分离生物质和浓缩。将收获的生物质储存在连接至离心机的槽中。将离心机的滞留物(1000升/小时)再循环至储存槽而排出渗透物。浓缩该生物质且然后收获于无菌槽中。3.25小时之后,收获31,768克的生物质。浓缩的生物质的OD于700nm处为237.4。将生物质分成一系列的包含425克干重生物质的等分试样。然后将这些等分试样冷冻于-15℃。
实施例1.2:葡萄球菌培养物
在锥形瓶中的培养条件
用于金黄色葡萄球菌049(StAu 049)、金黄色葡萄球菌I-050(StAu 050)、金黄色葡萄球菌I-051(StAu 051)、金黄色葡萄球菌I-052(StAu 052)、金黄色葡萄球菌I-053(StAu 053)和金黄色葡萄球菌(I-054(StAu 054)的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠2克/升;磷酸氢二钠2克/升;乙酸钠0.5克/升;大豆蛋白胨40克/升;葡萄糖6克/升。然后用1.5毫升的冷冻细菌接种0.012升的培养基。该培养物在180rpm搅拌和pH 6.9下于37℃下培养7小时。进行从12至1000毫升的连续培养步骤。
在前发酵槽中的培养条件
制备与前述步骤相同的培养基用于前发酵槽,但加入聚丙二醇0.06-0.10毫升/升。将培养基于123℃就地灭菌30分钟。将1000毫升的得自前述步骤的培养物转移到前发酵槽并搅拌及曝气。培养温度调整为37±2℃。在培养期间不调整pH。6小时之后,将2个前发酵槽转移到发酵槽。
在发酵槽中的培养
用于StAu 049的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠2克/升;磷酸氢二钠2克/升;乙酸钠0.5克/升;大豆蛋白胨40克/升;聚丙二醇0.04毫升/升。将培养基就地灭菌。将葡萄糖(14克/升)加至该培养物。培养温度调整为37℃并搅拌及曝气。pH调整为6.4±0.5。7小时之后,通过在90至100℃下的热处理将培养物灭活并将其转移到收获槽。然后通过离心从培养基分离生物质。将该生物质分成一系列包含一定量的干重生物质的等分试样。
在各等分试样中生物质干重为:StAu 049:327克,StAu 050:297克,StAu 051:375克,StAu 052:363克,StAu 053:446克和StAu 054:365克。
实施例1.3:克雷伯氏菌培养物
初始培养条件
用于肺炎克雷伯氏菌NCTC 5050(Klba 5050)、肺炎克雷伯氏菌NCTC 5056(Klba 5056)和肺炎克雷伯氏菌NCTC 204(Klba 204)的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠2克/升;磷酸氢二钠2克/升;乙酸钠0.5克/升;大豆蛋白胨40克/升;葡萄糖6克/升。然后用1.5毫升的冷冻细菌接种0.012升的培养基。该培养物在37℃下培养10小时并搅拌且初始pH设定为6.9。进行从0.012至1.0升的连续培养步骤。
Klba 5050在前发酵槽中的培养条件
制备与前述步骤相同的培养基用于前发酵槽,但加入聚丙二醇0.06毫升/升。将一升的得自前述步骤的培养物转移到前发酵槽。培养温度调整为37℃并搅拌及曝气。在培养期间不调整pH。6小时之后,将二个前发酵槽转移到发酵槽。
在发酵槽中的培养条件
用于Klba 5050的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠2克/升;磷酸氢二钠2克/升;乙酸钠0.5克/升;大豆蛋白胨40克/升和聚丙二醇0.02毫升/升。将培养基就地灭菌并加入21克/升葡萄糖。培养温度调整为37℃并搅拌及曝气。在培养期间pH调整为6.6。8小时之后,通过在90至100℃下的热处理将培养物灭活并将其转移到收获槽。然后通过离心从培养基分离生物质。在各等分试样中生物质干重为:Klba 5050:393克,Klba 5056:455克和Klba204:440克。
实施例1.4:粘膜炎莫拉氏菌培养物
初始培养条件
用于粘膜炎莫拉氏菌NCTC 3622(NeCa 3622);粘膜炎莫拉氏菌NCTC 3625(NeCa 3625)和粘膜炎莫拉氏菌I-045(NeCa 045)的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠:3克/升;磷酸氢二钠:2克/升;乙酸钠:0.5克/升;大豆蛋白胨:40克/升;淀粉:0.1克/升;肌苷:0.1克/升;氯化钙:0.02克/升;氯化钾:0.1克/升;碳酸氢钠:0.6克/升;丙酮酸钠:0.06克/升;金属溶液:0.5毫升/升(金属溶液的组成:硫酸铜3毫克/升;氯化铁:830毫克/升;硫酸锌:860毫克/升;硫酸:1.1毫克/升);二肽ALA-GLN(200毫克/毫升在0.9%NaCl溶液中):10毫克/升(用于第一培养步骤50毫克/升;用于1升培养步骤10毫克/升)。然后用1.5毫升的冷冻细菌接种0.012升的培养基。该培养物在37℃下培养10小时并搅拌。初始pH设定为7.2。在相同条件中进行从0.012至1.0升的连续培养步骤。
在前发酵槽中的培养
制备与前述步骤相同的培养基用于前发酵槽,但加入聚丙二醇0.06-0.10毫升/升且将ALA-GLN的浓度调整至4毫克/升。将培养基就地灭菌。将一升的得自前述步骤的培养物转移到前发酵槽。培养温度调整为33℃并搅拌及曝气。在培养期间不调整pH。10小时之后,将2个前发酵槽转移到发酵槽。
在发酵槽中的培养条件
制备与锥形瓶步骤相同的培养基用于前发酵槽,但加入聚丙二醇0.06毫升/升且没有ALA-GLN或葡萄糖。培养温度调整为33℃并搅拌及曝气。在培养期间不调整pH。10.5小时之后,通过在90至100℃下的热处理将培养物灭活且将其转移到收获槽。然后通过离心从培养基分离生物质。在各等分试样中生物质干重为:NeCa 3622:361克,NeCa 3625:351克和NeCa 045:223克。
实施例1.5:链球菌属培养物
初始培养条件
用于肺炎链球菌NCTC 7465(StPn 7465)、肺炎链球菌NCTC 7466(StPn 7466)、肺炎链球菌NCTC 7978(StPn 7978)、肺炎链球菌NCTC 10319(StPn 710319)、血链球菌I-046(StSa 046)、血链球菌I-047(StSa 047)、血链球菌I-048(StSa 048)和酿脓链球菌NCTC 8191(StPy 8191)的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得:氯化钠:2克/升;磷酸氢二钠:2克/升;乙酸钠:0.5克/升;大豆蛋白胨:40克/升;葡萄糖:6克/升;马血清:50毫升/升。灭菌之后,用1.5毫升的冷冻细菌接种0.012升的培养基。该培养物在37℃下培养14小时并搅拌。然后,将10毫升的此培养物转移到包含150毫升培养基的瓶且再次在相同条件中培养10小时。在加至前发酵槽之前,在包含1000毫升的具有20毫升/升马血清的培养基的较大的瓶中在相同条件下进行最后步骤。
在前发酵槽中的培养
制备与前述步骤相同的培养基用于前发酵槽,且加入聚丙二醇0.06毫升/升且具有8毫升/升的马血清浓度。将一升的前述培养物转移到二个前发酵槽。培养温度调整为30℃并搅拌。在培养期间不调整pH。14小时之后,将2个前发酵槽转移到发酵槽。
在发酵槽中的培养
制备与锥形瓶步骤相同的培养基用于前发酵槽,但加入聚丙二醇0.06毫升/升且具有1.2毫升/升的马血清浓度。在培养期间加入15.75千克的葡萄糖。培养温度调整为37℃并搅拌。用浓KOH将pH调整为6.4。9.25小时之后,通过在90至100℃下的热处理将培养物灭活且将其转移到收获槽。然后通过离心从培养基分离生物质。StSa 046、StSa 047、StSa 048和StPy 8191用无菌空气曝气且培养不需要加入马血清。在各等分试样中生物质干重为StPn 7465:134克,StPn 7466:142克,StPn 7978:134克,StPn 10319:153克,StSa 046:246克,StSa 047:232克,StSa 048:353克和StPy 8191:269克。
实施例2:细菌裂解
HAIN 8467实施例2.1
得自发酵实施例1.1的细菌生物质的HaIn 8467的等分试样在室温下解冻且用生理食盐水(8克/升NaCl)稀释至达到79克/升干重,以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育120小时。在裂解期间,监测pH以使减少不超过0.5pH单位。结果。82.2毫克/毫升的可溶性干重(SDW)和32.4毫克/毫升的蛋白质(Prot)和6.2毫克/毫升的以谷氨酸(147.1克/摩尔)计算的总氨基酸(A.A),通过OPA测量,通过OPA测量的2.40毫克/毫升的还原糖(碳水化合物)。
蛋白质浓度(Prot)通过Lowry测定测量(参见欧洲药典2.5.33,“总蛋白质-方法2”)。总游离氨基酸浓度(A.A)通过将氨基酸转化成异吲哚衍生物和于340nm处测量吸光度测量,根据Roth M.,Fluorescence reaction for amino acids,Anal.Chem.,43,880-882,(1971)。结果以谷氨酸的当量表示。根据D.Herbert等人,Meth.Microbiol.5B:266及以下(1971)在酸水解和衍生化之后分析糖(碳水化合物)浓度。
HAIN 8467实施例2.2
将根据实施例1.1的生物质稀释至58.2克/升。以O.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育5天。(可溶性干重(SDW):70.0毫克/毫升;Lowry蛋白质(Prot):30.0毫克/毫升;氨基酸(A.A):6.0毫克/毫升;糖:2.60毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:18.7μM,C2:20.8μM,C3:12.1μM。
HAIN 8467实施例2.3
将根据实施例1.1的生物质稀释至20克/升。以0.045M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育5天。(SDW:29.99毫克/毫升。Prot:4.8毫克/毫升;糖:0.2毫克/毫升)。
HAIN 8467实施例2.4(OP0662L)
将根据实施例1.1的生物质稀释至12.5克/升。以0.05M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:11.2毫克/毫升;Prot:<0.2毫克/毫升;A.A:2.0毫克/毫升;糖:0.4毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:15%D-Ala,9%D-Leu,45%D-Ser,21%D-Asx,15%D-Met,11%D-Phe,9%D-Glx。
HAIN 8467实施例2.5
将根据实施例1.1的生物质稀释至127克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:157.2毫克/毫升;Prot:86毫克/毫升;A.A:20.0毫克/毫升;糖:4.0毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:22%D-Ala,11%D-Leu,54%D-Ser,41%D-Asx,35%D-Met,32%D-Phe,29%D-Glx,6%D-Tyr。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:9.1μM,C2:-18.5μM,C3:3.1μM。
HAIN 8467实施例2.6
将根据实施例1.1的生物质稀释至12.5克/升。以0.05M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育3天。(SDW:10.8毫克/毫升;Prot:小于0.5毫克/毫升;A.A:2.0毫克/毫升;糖:0.4毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:10%D-Ala,9%D-Leu,56%D-Ser,22%D-Asx,16%D-Met,13%D-Phe,11%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:20.2μM,C2:26.7μM,C3:4.3μM。
HAIN 8467实施例2.7
将根据实施例1.1的生物质稀释至127克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育3天。(SDW:168.8毫克/毫升;Prot:90毫克/毫升;A.A:22毫克/毫升;糖:4.2毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:36%D-Ala,8%D-Leu,9%D-Ser,44%D-Asx,42%D-Met,37%D-Phe,37%D-Glx,37%D-Tyr。
HAIN 8467实施例2.8
将根据实施例1.1的生物质稀释至12.5克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:47.2毫克/毫升;Prot:小于0.2毫克/毫升;A.A:4.0毫克/毫升;糖:0.2毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:3%D-Ala,13%D-Leu,54%D-Ser,45%D-Asx,43%D-Met,42%D-Phe,41%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:7.5μM,C2:16.0μM,C3:8.6μM。
HAIN 8467实施例2.9
将根据实施例1.1的生物质稀释至127克/升。以0.05M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育196小时。D-氨基酸百分比:14%D-Ala,5%D-Asx,11%D-Met,5%D-Glx。
STPY 8191实施例2.10
得自实施例1.5的StPy 8191的一个等分试样(包含269克的细菌物质)在室温下解冻且用生理食盐水(8克/升NaCl)稀释至达59.8克/升干重。以0.2M NaOH进行碱化作用。然后,该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育192小时。在裂解期间,监测pH以使减少不超过0.5pH单位。(SDW:61.92毫克/毫升;Prot:31.68毫克/毫升;A.A.:7.2毫克/毫升;糖:7.2毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:22%D-Ala,11%D-Leu,54%D-Ser,41%D-Asx,35%D-Met,32%D-Phe,29%D-Glx,6%D-Tyr。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:4.9μM,C2:11.8μM,C3:6.7μM。
STSA 046实施例2.11
将根据实施例1.5的生物质稀释至30克/升。以0.022N NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。
STPY 8191实施例2.12
将根据实施例1.5的生物质稀释至100克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:120.2毫克/毫升;Prot:45.6毫克/毫升;A.A:15.2毫克/毫升;糖:2.8毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:35%D-Ala,13%D-Leu,57%D-Ser,44%D-Asx,40%D-Met,39%D-Phe,43%D-Glx。
STPY8191实施例2.13
将根据实施例1.5的生物质稀释至12.7克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:12.5毫克/毫升;Prot:<0.2毫克/毫升;A.A:0.8毫克/毫升;糖:0.1毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:24%D-Ala,13%D-Leu,52%D-Ser,28%D-Asx,8%D-Met,8%D-Phe,23%D-Glx,6%D-Tyr。
STPY 8191实施例2.14
将根据实施例1.5的生物质稀释至100克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:41.4毫克/毫升;Prot:3.2毫克/毫升;A.A:4毫克/毫升;糖:1.5毫克/毫升)。
STPY 8191实施例2.15
将根据实施例1.5的生物质稀释至12.7克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:52.5毫克/毫升;Prot:0.8毫克/毫升;A.A:3.2毫克/毫升;糖:0.6毫克/毫升)。
STPY 8191实施例2.16
将根据实施例1.5的生物质稀释至100克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:147.2毫克/毫升;Prot:53.6毫克/毫升;A.A:24.8毫克/毫升;糖:5.4毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:44%D-Ala,26%D-Leu,11%D-Ser,45%D-Asx,43%D-Met,42%D-Phe,46%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量:0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:9.7μM,C2:17.4μM,C3:2.5μM。
STPY 8191实施例2.17
将根据实施例1.5的生物质稀释至12.7克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:14.7毫克/毫升;Prot:0毫克/毫升;A.A:0.8毫克/毫升;糖:0.2毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:28%D-Ala,9%D-Ser,36%D-Asx,33%D-Met,32%D-Phe,31%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:5.8μM,C2:12.1μM,C3:6.8μM。
STSA 046实施例2.18
将根据实施例1的生物质稀释至68克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:90.72毫克/毫升;Prot:47.68毫克/毫升;A.A:9.36毫克/毫升;糖:2.48毫克/毫升)。
STSA 047实施例2.19
将根据实施例1的生物质稀释至68克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。
STSA 047实施例2.20
将根据实施例1的生物质稀释至60克/升。以0.33M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。
STSA 048实施例2.21
将根据实施例1的生物质稀释至62克/升。以0.33M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。
STPY 8191实施例2.22
将根据实施例1.5的生物质稀释至55克/升。以0.33M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育4天。
STPN 7978实施例2.23
将根据实施例1.5的生物质稀释至38.7克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:66.4毫克/毫升;Prot:25.4毫克/毫升;A.A:6.0毫克/毫升;糖:2.5毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:10.2μM,C2:20.7μM,C3:20.8μM。
STPN 7978实施例2.24
将根据实施例1.5的生物质稀释至30克/升。以0.022M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:30.4毫克/毫升;Prot:2.20毫克/毫升;糖:0.40毫克/毫升)。
STPN 7978实施例2.25
将根据实施例1.5的生物质稀释至60克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:59毫克/毫升;Prot:17毫克/毫升;A.A:7.0毫克/毫升;糖1.8毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:9.1μM,C2:13.4μM,C3:1.4μM。
STPN 7978实施例2.26
将根据实施例1.5的生物质稀释至12.5克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:17.8毫克/毫升;Prot:<0.2毫克/毫升;A.A:2.0毫克/毫升;糖:0.7毫克/毫升)。
STPN 7978实施例2.27
将根据实施例1.5的生物质稀释至60克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:43.6毫克/毫升;Prot:6毫克/毫升;A.A:10毫克/毫升;糖:1.5毫克/毫升)。
STPN 7978实施例2.28
将根据实施例1.5的生物质稀释至12.5克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:55.4毫克/毫升;Prot:2毫克/毫升;A.A:4毫克/毫升;糖0.7毫克/毫升)。
STPN 7978实施例2.29
将根据实施例1.5的生物质稀释至60克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:118.4毫克/毫升;Prot:31毫克/毫升;A.A:19毫克/毫升;糖:4.1毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:5.8μM,C2:12.1μM,C3:2.8μM。
STPN 7978实施例2.30
将根据实施例1.5的生物质稀释至12.5克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:18.4毫克/毫升;Prot:<0.2毫克/毫升;A.A:2毫克/毫升;糖:0.5毫克/毫升)。
STPN 7465实施例2.31
将根据实施例1.5的生物质稀释至52.5克/升。0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:69.4毫克/毫升;Prot:32.3毫克/毫升;A.A:6.0毫克/毫升;糖:1.7毫克/毫升)。
STPN 7466实施例2.32
将根据实施例1.5的生物质稀释40.0克/升。0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:60.6毫克/毫升;Prot:29.0毫克/毫升;A.A:6.0毫克/毫升;糖:1.50毫克/毫升)。
STPN 10319实施例2.33
将根据实施例1.5的生物质稀释至41.2克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:60.4毫克/毫升;Prot:28.4毫克/毫升;A.A:6.0毫克/毫升;糖1.1毫克/毫升)。
STSA 046实施例2.34
将根据实施例1.5的生物质稀释至58.9克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:83.2毫克/毫升;Prot:7.2毫克/毫升;A.A:8.39毫克/毫升;糖:2.16毫克/毫升)。
STSA 047实施例2.35
将根据实施例1.5的生物质稀释至50.4克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:60.64毫克/毫升;Prot:27.92毫克/毫升;A.A:7.2毫克/毫升;糖:3.52毫克/毫升)。
STSA 048实施例2.36
将根据实施例1.5的生物质稀释至66.2克/升。以0.25M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:72.96毫克/毫升;Prot:36.16毫克/毫升;A.A:7.2毫克/毫升;糖:3.28毫克/毫升)。
NECA I045实施例2.37
得自实施例1.4的NeCa I045的一个等分试样(包含223克的细菌物质)在室温下解冻且用生理食盐水(8克/升NaCl)稀释至达22.8克/升。0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育192小时。在裂解期间,监测pH以使减少不超过0.5pH单位。(SDW:41.29毫克/毫升;Prot:17.45毫克/毫升;A.A.:3.41毫克/毫升;糖:3.4毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:4.2μM,C2:14.8μM,C3:13.4μM。
NECA I045实施例2.38
将根据实施例1.4的生物质稀释至20.5克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育3天。(SDW:36.6毫克/毫升;Prot:16.4毫克/毫升;A.A:3.63毫克/毫升;糖:0.77毫克/毫升)。
NECA I045实施例2.39
将根据实施例1.4的生物质稀释至51.0克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:75.69毫克/毫升;Prot:30.8毫克/毫升;A.A:10.8毫克/毫升;糖:1.14毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:40%D-Ala,45%D-Asx,42%D-Met,40%D-Phe,46%D-Glx,48%D-Lys。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:4.9μM,C2:14.3μM,C3:3.6μM。
NECA I045实施例2.40
将根据实施例1.4的生物质稀释至13克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:15.08毫克/毫升;Prot:7.7毫克/毫升;A.A:1.5毫克/毫升;糖:0.28毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:21%D-Ala,67%D-Ser,31%D-Asx,25%D-Met,12%D-Lys。
NECA I045实施例2.41
将根据实施例1.4的生物质稀释至51.0克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:41.23毫克/毫升;Prot:26.2毫克/毫升;A.A:4.6毫克/毫升:糖:0.98毫克/毫升)。
NECA I045实施例2.42
将根据实施例1.4的生物质稀释至13克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:48.43毫克/毫升;Prot:7.7毫克/毫升;A.A:4.3毫克/毫升;糖:0.22毫克/毫升)。
NECA I045实施例2.43
将根据实施例1.4的生物质稀释至51.0克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:83.02毫克/毫升;Prot:28.9毫克/毫升;A.A:15毫克/毫升;糖:1.11毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:44%D-Ala,48%D-Ser,47%D-Asx,45%D-Met,43%D-Phe,50%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:5.1μM,C2:12.0μM,C3:7.5μM。
NECA I045实施例2.44
将根据实施例1.4的生物质稀释至13克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:15.26毫克/毫升;Prot:8.6毫克/毫升;A.A:1.8毫克/毫升;糖0.22毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:31%D-Ala,42%D-Ser,38%D-Asx,36%D-Met,35%D-Phe,37%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:4.1μM,C2:13.9μM,C3:6.0μM。
NECA I045实施例2.45
将根据实施例1.4的生物质稀释至9克/升。以0.066M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:20.62毫克/毫升;Prot:5.57毫克/毫升;糖:0.06毫克/毫升)。
NECA NCTC3622实施例2.46
将根据实施例1.4的生物质稀释至20.1克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:35.69毫克/毫升;Prot:14.25毫克/毫升;A.A:3.4毫克/毫升;糖:0.71毫克/毫升)。
NECA NCTC3625实施例2.47
将根据实施例1.4的生物质稀释至9.7克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:38.83毫克/毫升;Prot:15.54毫克/毫升;A.A:3.4毫克/毫升;糖:0.95毫克/毫升)。
KLPN 204实施例2.48
KlPn 204实施例1.3的一个等分试样(包含440克的细菌物质)在室温下解冻且用生理食盐水(8克/升NaCl)稀释至达37.7克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育192小时。在裂解期间,监测pH以使减少不超过0.5pH单位。(SDW:51.77毫克/毫升;Prot:27.66毫克/毫升;A.A.:4.2毫克/毫升;糖:1.03毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.6μM,C2:2.8μM,C3:1.8μM。
KLPN 204实施例2.49
将根据实施例1.3的生物质稀释至9克/升。以0.013N NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:25.71毫克/毫升;Prot:4.91毫克/毫升;糖0.51毫克/毫升)。
KLPN 204实施例2.50
将根据实施例1.3的生物质稀释至99克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:50.63毫克/毫升;Prot:15.4毫克/毫升;A.A:2.9毫克/毫升;糖:2.1毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:5%D-Ala,6%D-Asx。
KLPN 204实施例2.51
将根据实施例1.3的生物质稀释至13克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:52.69毫克/毫升;Prot:5.7毫克/毫升;A.A:2.3毫克/毫升;糖:0.3毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:36%D-Ala,8%D-Ser,45%D-Asx,7%D-Met,27%D-Phe,40%D-Glx,29%D-Lys。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.5μM,C2:0.8μM,C3:6.0μM。
KLPN 204实施例2.52
将根据实施例1.3的生物质稀释至99克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:136.34毫克/毫升;Prot:58.9毫克/毫升;A.A:20.6毫克/毫升;糖:3.4毫克/毫升)。
KLPN 204实施例2.53
将根据实施例1.3的生物质稀释至13克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:18.06毫克/毫升;Prot:6.3毫克/毫升;A.A:1.1毫克/毫升;糖:0.3毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.5μM,C2:1.6μM,C3:1.9μM。
KLPN 204实施例2.54
将根据实施例1.3的生物质稀释至99克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:58.06毫克/毫升;Prot:20毫克/毫升;A.A:4.6毫克/毫升;糖2.7毫克/毫升)。
KLPN 204实施例2.55
将根据实施例1.3的生物质稀释至13克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:52.57毫克/毫升;Prot:5.7毫克/毫升;A.A:4.0毫克/毫升;糖:0.3毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:43%D-Ala,25%Val,5%D-Ser,46%D-Asx,46%D-Met,45%D-Phe,44%D-Glx,38%D-Lys。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.5μM,C2:0.6μM,C3:2.6μM。
KLPN 5056实施例2.56
将根据实施例1.3的生物质稀释至39.4克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:52.69毫克/毫升;Prot:27.83毫克/毫升;A.A:4.0毫克/毫升;糖:1.09毫克/毫升)。
KLPN 5050实施例2.57
将根据实施例1.3的生物质稀释至34.2克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:48.23毫克/毫升;Prot:26.57毫克/毫升;A.A:4.0毫克/毫升;糖:1.03毫克/毫升)。
STAU I051实施例2.58
得自实施例1.2的StAu I051的一个等分试样(包含375克的细菌物质)在室温下解冻且用生理食盐水(8克/升NaCl)稀释至达55.2克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育192小时。在裂解期间,应监测pH 以使减少不超过0.5pH单位。(SDW:66.4毫克/毫升;Prot:34.08毫克/毫升;A.A.:6.4毫克/毫升;糖:0.64毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.6μM,C2:0.8μM,C3:1.4μM。
STAU I051实施例2.59
将根据实施例1.2的生物质稀释至51克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育9天。(SDW:65.31毫克/毫升;Prot:25.56毫克/毫升;A.A:6.57毫克/毫升;糖:0.98毫克/毫升)。
STAU I051实施例2.60
将根据实施例1.2的生物质稀释至81克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。(SDW:137.2毫克/毫升;Prot:51.2毫克/毫升;A.A:20.8毫克/毫升;糖:1.6毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:51%D-Ala,11%D-Ser,43%D-Asx,37%D-Met,35%D-Phe,43%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.6μM,C2:0.8μM,C3:1.3μM。
STAU I051实施例2.61
将根据实施例1.2的生物质稀释至13克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:55.7毫克/毫升;Prot:4.8毫克/毫升;A.A:4.8毫克/毫升;糖:0.2毫克/毫升)。
STAU I051实施例2.62
将根据实施例1.2的生物质稀释至81克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:130.1毫克/毫升;Prot:47.2毫克/毫升;A.A:24.8毫克/毫升;糖:1.4毫克/毫升)。
STAU I051实施例2.63
将根据实施例1.2的生物质稀释至13克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:18.4毫克/毫升;Prot:4.8毫克/毫升;A.A:2.4毫克/毫升;糖:0.2毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.5μM,C2:0.6μM,C3:1.3μM。
STAU I051实施例2.64
将根据实施例1.2的生物质稀释至81克/升。以0.7M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:134.6毫克/毫升;Prot:48毫克/毫升;A.A:25.6毫克/毫升;糖:1.5毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:56%D-Ala,10%D-Ser,45%D-Asx,42%D-Met,39%D-Phe,73%D-Tyr,49%D-Glx。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.6μM,C2:0.7μM,C3:1.1μM。
STAU I051实施例2.65
将根据实施例1.2的生物质稀释至13克/升。以0.1M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育10天。(SDW:17.9毫克/毫升;Prot:5.6毫克/毫升;A.A:2.4毫克/毫升;糖:0.2毫克/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.02毫克/毫升(C1),0.2毫克/毫升(C2),和2.0毫克/毫升(C3):C1:0.5μM,C2:0.6μM,C3:3.7μM。
STAU I049实施例2.66
将根据实施例1.2的生物质稀释至52.8克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:70.08毫克/毫升;Prot:34.4毫克/毫升;A.A:6.4毫克/毫升;糖:0.64毫克/毫升)。
STAU I050实施例2.67
将根据实施例1.2的生物质稀释至47.5克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:64.32毫克/毫升;Prot:32.24毫克/毫升;A.A:6.4毫克/毫升;糖:0.64毫克/毫升)。
STAU I050实施例2.68
将根据实施例1.2的生物质稀释至48.5克/升。以0.033M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。STAU I052实施例2.69
将根据实施例1.2的生物质稀释至56.9克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:62.72毫克/毫升;Prot:30.8毫克/毫升;A.A:6.4毫克/毫升;糖:0.72毫克/毫升)。
STAU I053实施例2.70
将根据实施例1.2的生物质稀释至67.3克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:68.8毫克/毫升;Prot:32.24毫克/毫升;A.A:6.4毫克/毫升;糖:1.2毫克/毫升)。
STAU I050实施例2.71
将根据实施例1.2的生物质稀释至63.6克/升。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育8天。(SDW:68.96毫克/毫升;Prot:24.56毫克/毫升;A.A:6.4毫克/毫升;糖:2.56毫克/毫升)。
实施例3:裂解产物的纯化
实施例3.1:革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株的澄清提取物
混合2升的实施例2.57和2升的实施例2.66,加入浓HCl将pH调整至12.0,且用2升的8克/升NaCl溶液稀释混合物。将稀释的混合物转移到微过滤(MF)槽。微过滤单元使用蛇形模式的0.45微米切向流过滤过滤器(PALL Procette PES 0.45微米)(参见图1)。交叉流调整为2000升/小时米2(LHM)和透膜压力(TMP)调整为1.3巴。将微过滤渗透物转移到超滤(UF)槽。
一旦混合物在微过滤槽的体积达到初始体积的一半,启动UF单元。超滤单元使用30kDa切向流过滤过滤器(PALL Centrasette PES30kD)。交叉流调整为1000LHM和TMP调整为0.5巴。
将MF和UF槽中的体积维持于相同水平。在各渗滤体积下,蛋白质浓度通过Bradford方法测量。[在本领域中Bradford方法为标准方法。不需要引用参考,除非进行该方法的不同方式产生显著不同的结果]。在UF槽中该Bradford蛋白质含量在1渗滤体积(DFV)之后为26.8毫克/毫升,4DFV之后为34.8毫克/毫升,和9DFV之后为37.2毫克/毫升。在渗滤期间微过滤的渗透通量(permeate flux)为15LHM。14渗滤体积之后,停止UF,且在MF槽中浓缩产物。产物包含15.9毫克/毫升蛋白质。然后将产物稀释至7.4毫克/毫升且通过0.2微米无菌过滤器过滤。(可溶性干残余物(SDR):21.0毫克/毫升,Prot:7.4毫克/毫升,A.A.:1.2毫克/毫升,糖(碳水化合物):0.3毫克/毫升,氯化物:4.6毫克/毫升)。以毫克Lowry蛋白质/毫升表示的NOx产量,0.03毫克/毫升(C1),0.3毫克/毫升(C2),和3.0毫克/毫升(C3):C1:5.8μM,C2:11.4μM,C3:1.2μM。
实施例3.2:Klba单菌株
将4千克的实施例2.57调整至pH 12.0且用4升的8克/升NaCl溶液稀释。将稀释的裂解产物转移到微过滤槽。
微过滤参数为:交叉流2000LHM,TMP 1.3巴,截断值(cut off):0.45微米。超滤参数为:交叉流1000LHM,TMP 0.5巴,截断值:30kDa,渗滤体积的数目:8。
将产物稀释至7.0毫克/毫升且通过0.2微米无菌过滤器过滤。(SDR:18.0毫克/毫升,Prot:7.0毫克/毫升,A.A.:0.8毫克/毫升,糖:0.3毫克/毫升)。以毫克Lowry蛋白质/毫升表示的NOx产量,0.03毫克/毫升(C1),0.3毫克/毫升(C2),和3.0毫克/毫升(C3):C1:5.2μM,C2:9.8μM,C3:1.1μM。
实施例3.3:莫拉氏菌属单菌株
将2千克的实施例2.37调整至pH 10.7且用3升的8克/升NaCl溶液稀释。将稀释的裂解产物转移到微过滤槽。
微过滤参数为:交叉流2000LHM,TMP 1.3巴,截断值:0.45微米。超滤参数为:交叉流1000LHM,TMP 0.5巴,截断值:30kDa,渗滤体积的数目:8。
将产物稀释至7.0毫克/毫升且通过0.2微米无菌过滤器过滤。(SDR:19.4毫克/毫升,Prot:6.8毫克/毫升)。
实施例3.4:肺炎(Pneumoniae)单菌株
将5.0千克的实施例2.32调整至pH 12.27且用5.0升的8克/升NaCl溶液稀释。将稀释的裂解产物转移到微过滤槽。
微过滤参数为:交叉流2000LHM,TMP 1.3巴,截断值:0.45微米。超滤参数为:交叉流1000LHM,TMP 0.5巴,截断值:30kDa,渗滤体积的数目:8。
将产物稀释至7.0毫克/毫升且通过0.2微米无菌过滤器过滤。(SDR:23.3毫克/毫升,Prot:4.3毫克/毫升)。
实施例3.5
混合500毫升的实施例2.45、500毫升的实施例2.47、和500毫升的实施例2.37且于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至10.5。
实施例3.6
混合300毫升的实施例2.23的裂解产物、300毫升的实施例2.31、300毫升的实施例2.32、和300毫升的实施例2.33且于9000xg离心30分钟。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至10.5。分析结果:(SDR:63.60毫克/毫升,Prot:23.00毫克/毫升,A.A.:6.00毫克/毫升,糖:1.60毫克/毫升)。
实施例3.7
混合300毫升的实施例2.48、300毫升的实施例2.56、和300毫升的实施例2.57且于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至10.5。(SDR:50.40毫克/毫升,Prot:22.30毫克/毫升,A.A.:4.0毫克/毫升,糖:0.97毫克/毫升)。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:1.06μM,C2:3.19μM,C3:7.62μM。
实施例3.8:
混合200毫升的实施例2.58、200毫升的实施例2.66、200毫升的实施例2.67、200毫升的实施例2.69、200毫升的实施例2.70和200毫升的实施例2.71且于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至10.5。(SDR:65.12毫克/毫升,Prot:24.80毫克/毫升,A.A.:7.2毫克/毫升,糖:1.12毫克/毫升)。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:0.76μM,C2:1.16μM,C3:3.79μM。
实施例3.9:
混合500毫升的实施例2.46、500毫升的实施例2.47和500毫升的实施例2.37且于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至10.5。(SDR:38.15毫克/毫升,Prot:13.5毫克/毫升,A.A.:3.4毫克/毫升,糖:0.80毫克/毫升)。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:2.25μM,C2:5.25μM,C3:14.21μM。
实施例3.10
混合500毫升的实施例2.34、500毫升的实施例2.35、500毫升的实施例2.36、和500毫升的实施例2.10且于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至10.5。(SDR:69.6毫克/毫升,Prot:28.00毫克/毫升。A.A.:7.2毫克/毫升,糖:2.48毫克/毫升)。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:0.95μM,C2:1.21μM,C3:4.44μM。
实施例3.11
10毫升的实施例2.61的裂解产物和10毫升的实施例2.27分开地于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。混合3毫升的各上清液。用HCl将pH调整至7.2。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:0.34μM,C2:0.66μM,C3:1.33μM。
实施例3.12
10毫升的实施例2.58和10毫升的实施例2.61分开地于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。混合3毫升的各上清液。用HCl将pH调整至7.6。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:0.40μM,C2:0.44μM,C3:0.71μM。
实施例3.13
10毫升的实施例2.9和10毫升的实施例2.8分开地于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。1.5毫升的第一裂解产物(实施例2.9)与4.5毫升的第二裂解产物(实施例2.8)混合。用HCl将pH调整至7.2。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:8.7μM,C2:16.90μM,C3:21.1μM。
实施例3.14
10毫升的实施例2.2和10毫升的实施例2.8分开地于9000xg离心。上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米的孔隙度的连续过滤器过滤。混合3毫升的各上清液。用HCl将pH调整至7.5。以毫克可溶性干重/毫升表示的NOx产量,0.01毫克/毫升(C1),0.1毫克/毫升(C2),和1.0毫克/毫升(C3):C1:9.2μM,C2:11.3μM,C3:17.2μM。
实施例3.15
将13.2升的得自实施例2.2的裂解物(lysis)、48.6升的得自实施例3.9的混合裂解物、36.6升的得自实施例3.7的混合裂解物、36升的得自实施例3.8的混合裂解物、14.4升的实施例3.6、和18.4升的实施例3.10混合在一起且用8克/升NaCl溶液稀释至334.4升。在双微过滤和超滤回路系统中通过切向流过滤纯化溶液,如实施例3.1中所述。(SDW:21.0毫克/毫升;Prot:6.4毫克/毫升;A.A:1.9毫克/毫升;糖0.45毫克/毫升)。D-氨基酸百分比:42%D-Ala,12%Leu,53%D-Ser,37%D-Asx,35%D-Met,32%D-Phe,28%D-Glx,8%D-Tyr,16%Lys。以毫克Lowry蛋白质/毫升表示的NOx产量,0.03毫克/毫升(C1),0.3毫克/毫升(C2),和3.0毫克/毫升(C3):C1:9.3μM,C2:14.3μM,C3:11.5μM。
实施例4:在较低pH条件下的细菌裂解作用的比较实施例
实施例4代表在本发明范围外的在碱性条件下进行的方法。用于进行细菌的裂解作用的NaOH浓度低于0.1%,导致较低的pH值。
混合下列裂解产物:1.18千克的实施例2.24、3.0千克的实施例2.49、2.95千克的实施例2.69、1.08千克的实施例2.4、1.51千克的实施例2.11、和3.98千克的实施例2.45。用NaCl溶液8克/升将六千克混合物稀释至12千克且将pH调整至pH 12.0。微过滤参数为:交叉流2000LHM,TMP 1.3巴,截断值:0.45微米。超滤参数为:交叉流1000LHM,TMP 0.5巴,截断值:30kDa,渗滤体积的数目:12。(SDR:19.4毫克/毫升,Prot:3.1毫克/毫升,A.A.:2.0毫克/毫升,糖:0.1毫克/毫升,LAL:20140EU/毫升)。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量,0.03毫克/毫升(C1),0.3毫克/毫升(C2),和3.0毫克/毫升(C3):C1:9.3μM,C2:14.3μM,C3:11.5μM。
实施例5:瑞士乳杆菌(Lactobaccilus helveticus)的裂解
通过在植物性培养基上发酵获得的瑞士乳杆菌的细菌生物质的等分试样在室温下解冻且用纯化的水稀释至达80克/升的干重浓度。以0.2M NaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40℃温育2天。在裂解期间,监测pH以使减少不超过0.5pH单位。
实施例6:在小鼠中抗飞沫微粒流感病毒感染的免疫保护
此实验旨在通过评估其抗病毒(即H1N1)的功效研究某些本发明实施方案的非特异性免疫活性。六周大的雌性BALB/c小鼠购自Bundesinstitut für Risikobewertung,柏林,且用于所有的实验。将这些动物维持在于22℃的周围温度和60±5%的相对湿度的正常条件下。光方案设定为12:12小时的光暗循环。用标准膳食粒(Altromin1314,Altromin,Lage,德国)喂食动物且随意提供自来水。
预处理
将总计60只小鼠分成各20只小鼠的三组,其中2个处理组和1个对照组。每天用每只小鼠1毫克或10毫克预处理一次动物(2组)连续10天、或用PBS对照处理(1组)。预处理结束时,给予所有的小鼠一种小鼠适应株A/PR/8/34(H1N1)流感病毒的飞沫微粒。使用此菌株的对于小鼠的LD50通常为通过鼻内途径10-4.5和通过飞沫微粒途径10-1.7。在这些实验中选择用于攻击感染的剂量以提供能够引起明确症状的流感病毒感染但不是100%致死的稀释。
每天观察10只小鼠的组的死亡率,持续10天。示于图3中的结果显示在此实验的剂量条件下10毫克/小鼠剂量的该提取物可以给予完全的抗再感染的保护。相比之下,仅70%的对照小鼠在流感病毒感染之后存活。在接受1毫克/小鼠的药物的组中存活为70%。
流感病毒感染之后在经处理的小鼠中观察到的临床症状。
每天观察10只小鼠的各组的流感病毒感染的临床症状。临床症状评分显示于下表中。施用10毫克剂量的该提取物的动物在2天后显示轻临床症状且显然地比对照组小鼠更早健康,表明较高剂量的有利效果。在临床评分中1毫克剂量-处理组和对照组之间没有显著不同。
组 流感病毒感染之后的天数1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 |
PBS 0 0 + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++/ ++/ ++ ++ +++++ +++TTT 0 0 + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++/ ++ ++ +1毫克 +++TTT 0 0 0 0 + +/ ++ +++ +++ ++/ ++/ +++ ++/ +/ ++ ++010毫克 ++ +++ +++ +++ |
TTT=用实施例16裂解产物处理只有存活动物的临床症状评分纳入考虑。代号:0:没有毛皮竖起、显示健康,和+至+++:毛皮竖起逐渐增加;运动和一般活动逐渐减少。 |
经处理的小鼠的流行性感冒血凝抑制抗体滴度
每组3只小鼠,在第一次和第二次感染之后,在流感病毒攻击之后第10天收集血清。将得自免疫的动物的血清储存于-20℃下。用受体破坏酶(receptor-destroying enzyme)预处理所有的血清以除去非特异性抑制剂。流行性感冒血凝抑制(HI)试验使用由世界卫生组织(WHO,2002)推荐的标准步骤,在微量滴定板中使用0.5%鸡红细胞和4个血凝单位进行。显示抗流行性感冒A/PR/8/34(H1N1)病毒的几何平均H I抗体滴度的结果示于下表中。第一次注射之后处理组和对照组之间没有显著不同。
因此,第一次(初次)感染之后21天用A/PR/8/34流感病毒给予小鼠第二次(增强)攻击感染。如上所示用A/PR/8/34(H1N1)病毒攻击之后,抗体滴度的大小增加。用10毫克/小鼠剂量的OM-85BV观察到较高水平的HI抗体滴度。相比之下,1毫克/小鼠剂量具有低于10毫克/小鼠剂量的药物的抗体滴度。
在所检测的肺病毒中处理组和对照组之间没有显著不同。然而,在施用10毫克剂量的根据本发明提取物的动物中,用小鼠-病原性流行性感冒A/PR/8/34病毒飞沫微粒感染之后的临床症状比对照组至少晚一整天发生,且实验组也显然地比对照小鼠更早恢复。然而,1毫克剂量处理组和对照组之间没有显著不同,暗示该提取物的效果为剂量依赖性的。第一次感染之后三天,在流行性感冒血凝抑制抗体水平上处理组和对照组之间没有显著不同。然而,当第一次感染三周之后用A/PR/8/34流感病毒二次感染时,在10毫克/小鼠剂量组观察到较高和显著大小的抗体诱导。
如通过多个参数所测定的,此实施例显示根据本发明的提取物在每只小鼠10毫克的剂量下能够赋予抗小鼠-病原性飞沫微粒流行性感冒A/PR/8/34(H1N1)病毒感染的保护。本发明的实施方案因此可在体内活化抗病毒的免疫反应。在一些实施方案中,因为该提取物可完全从病原细菌制造,如在此实施例中所试验的提取物,这表明本发明的实施方案可活化先天性免疫系统。
实施例7:本发明实施方案在鼠一氧化氮试验中的活性
通过CO2吸入杀死六周大雄性C57/BL6小鼠(六周大雄性,SPF品质,Charles Rivier,FR)。从后附肢移出髋骨、大腿骨、和胫骨。在切割两端部分之后通过将达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′smodified Eagle medium)(DH)注射通过骨从内腔提取骨髓。洗涤之后,将干细胞再悬浮(40,000细胞/毫升)于用20%马血清和30%L929细胞上清液补充的DH培养基。细胞悬浮液在培养箱中于37℃在8%CO2及饱和湿气氛围下培养8天。然后用冰冷PBS分离巨噬细胞,洗涤和再悬浮于用5%胎牛血清(FCS)、氨基酸和抗生素补充的DH培养基(DHE培养基)中。将细胞密度调整至700,000细胞/毫升。产物的水溶液直接在微量滴定板中连续地稀释于DHE培养基中。以一式三份测试产物且每个微量滴定板包含由培养基组成的阴性对照。在各孔中最终体积为100微升。将100微升的细胞悬浮液加至该稀释的产物且细胞在培养箱中于37℃在8%CO2及饱和湿气氛围下培养22小时。在培养期结束时,将100微升的上清液转移到另一微量滴定板且通过进行革利士(Griess)反应测定在各上清液中所产生的亚硝酸盐浓度。将在2.5%磷酸水溶液中的100微升的革利士试剂(5毫克/毫升的磺胺+0.5毫克/毫升的N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐)加至各孔。用分光光度计(SpectraMax Plus,Molecular Devices),于562nm处(对照690nm处的参照)读取微量滴定板。亚硝酸盐浓度与所形成的一氧化氮含量成比例。亚硝酸盐含量根据标准曲线测定。结果以μM一氧化氮(NO)表达为平均值±标准偏差且绘制为剂量应答曲线(参见图4-7)。
实施例8:鲎变形细胞裂解物(LAL)产色试验
为了测定内毒素样分子的存在,用Bio-Whittaker的Chromogenic-LAL Kit进行LAL试验。
此试验基于通过存在于LAL中的酶促级联利用脂多糖(LPS)或可比较结构的产物的活化作用。此酶促活化作用通过用蛋白酶切开连接到肽的色素原来证明。酶促反应于37℃进行和色素原随时间的形成在405nm处进行测量。记录达到0.2单位D.O.所需的时间和相对于LPS标准(标准曲线)计算的内毒素活性。
根据本发明的提取物的该类示例性实验的结果以相对于标准化大肠杆菌LPS制剂的EU(内毒素单位)表示于下表中(1EU对应于0.09纳克当量LPS)。
裂解条件(裂解时间、起始材料量、NaOH的初始百分比) | EU/毫升 | 纳克当量LPS/毫升 |
Hemo NaOH 1%100克/升/T 22小时 | 169900±600 | 15291 |
Hemo NaOH 1%125克/升/T 211小时 | 2811000±82644 | 252990 |
Hemo NaOH 1%50克/升/T 211小时 | 33950±224 | 3055 |
Hemo NaOH 1%50克/升/T 22小时 | >5000000 | 450000 |
Hemo NaOH 1%50克/升/T 92小时 | >500000 | 45000 |
Hemo NaOH 2%25克/升/T 92小时 | 65430±565 | 5888 |
Hemo NaOH 2%50克/升/T 211小时 | 23560±142 | 2120 |
Hemo NaOH 2%50克/升/T 22小时 | 579200±1062 | 52128 |
Hemo NaOH 2%50克/升/T 92小时 | 7927±320 | 713 |
Hemo NaOH 3%125克/升/T 211小时 | 30000±113 | 2700 |
Hemo NaOH 3%25克/升/T 22小时 | 6883±34 | 619 |
Hemo NaOH 3%50克/升/T 22小时 | 10690±41 | 962 |
Hemo NaOH 4%100克/升/T 92小时 | 11380±36 | 1024 |
Hemo NaOH 4%12.5克/升/T 22小时 | 3415±40 | 307 |
Hemo NaOH 4%12.5克/升/T 92小时 | 10500±37 | 945 |
Hemo NaOH 10%100克/升/T 92小时 | 1229±38 | 110 |
Hemo NaOH 10%12.5克/升/T 211小时 | 224±17 | 20 |
Hemo NaOH 10%125克/升/T 211小时 | 602±6 | 54 |
实施例4 | 20140 | 1812 |
实施例3.15 | 108±0.5 | 10 |
H2O | <0.005 | 15291 |
实施例9:组织胺分泌的抑制
采用肥大细胞的去颗粒体外大鼠模型(由CRO CEREP提出,目录号2006:771-c,refR,AL,K.AnalBiochem,1972 Jun 47(2):356-70)来研究本发明的实施方案(包含21种细菌菌株)抑制由化合物48/80-刺激的肥大细胞分泌组织胺的方式。方案和实验条件简略地概述在下表中:
实验方案
实验条件
结果的分析和表示
这些结果表示为对照比活性的百分比:(测得的比活性/对照比活性)x100,在试验化合物的存在下获得。IC50值(产生对照比活性的一半最大抑制的浓度)通过用平均平行测定值产生的抑制曲线的非线性回归分析测定,使用希尔(Hill)方程式曲线拟合(Y=D+[(A-D)/(1+(C/C50)nH)],其中Y=比活性,D=最小比活性,A=最大比活性,C=化合物浓度,C50=IC50,和nH=斜率因子)。此分析使用Cerep(希尔软件)开发的软件进行且通过与由的商业软件4.0(年,SPSS公司)所产生的数据比较来确认。
在各实验中,同时检测参照物与试验提取物以便评估测定的适合性。检测数个浓度(用于IC50值测定),且数据与在Cerep测定的历史值比较。根据对应标准操作步骤,如果符合适合性标准,则该测定被认为是有效的。试验提取物和参照物(测量两次)的测得的IC50值示于下表中。参照物的IC50值在历史平均值±0.5对数单位的可接受极限内。
用试验提取物获得的对应抑制曲线显示于图8中。
测试的化合物 IC50
试验提取物 0.0049毫克/毫升
SCG(参照物1) 4.7E-06M
SCG(参照物2) 1.1E-06M
这些结果表明试验提取物为由化合物48/80-刺激的肥大细胞所诱导的组织胺分泌的潜在抑制剂。
实施例10:本发明的实施方案在大肠杆菌感染模型(在小鼠的LPS-不敏感株系中)中的效果
本发明的实施方案在公认的大肠杆菌细菌感染的体内模型中进行测试(参见Hopkins等人,Inheritance of susceptibility toinduced Escherichia coli bladder and kidney infections infemale C3H/HeJ mice,J Infect Dis.2003 Feb 1;187(3):418-23)。C3H/HeJ小鼠的To11样受体基因(TLR4)被突变,且对TLR4激动剂例如LPS不敏感。因此此模型适合于检测经由其他途径而非TLR4起作用的药效。
一组10-12周大雌性C3H/HeJ小鼠(8只小鼠)在大肠杆菌感染之前用类似于实施例3.15的提取物口服处理10天。
动物维持在于18-26℃的周围温度和30至70%的相对湿度的正常条件下。光方案设定为12:12小时的光暗循环。
动物喂食由Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN)实验室提供的标准膳食。随意提供自来水,除非另有指示。
处理的动物口服接受143毫克的冷冻干燥产物(即25毫克(17.5%)的细菌提取物和118毫克(82.5%)的赋形剂)/只动物/次提取物施用。接种
根据极大地减少肾的反流相关接种的可能性且在所有接种的动物中诱发感染的最小接种方案,用PBS或用尿道致病性大肠杆菌膀胱内(intravesically)接种小鼠。在这些实验中使用大肠杆菌菌株1677,其分离自具有发热性UTI的妇女的尿液。为了制备接种物,在胰蛋白胨肉汤(Difco实验室)中通过2个通路从冷冻原液生长细菌,用PBS洗涤,且再悬浮到2×1010细菌/毫升的浓度。剥夺小鼠的水1小时且紧在接种之前从他们的膀胱取出尿。在异氟醚麻醉下通过导尿术将十微升的细菌接种物滴入膀胱内,产生每只小鼠2×108大肠杆菌的剂量。使这些动物从麻醉恢复和1小时后恢复水。
接种10天之后杀死小鼠以评估膀胱和肾感染的强度。取出各动物的膀胱和两个肾,称重,且在无菌PBS中均质化,其后将均质物连续地涂布在列文氏(Levine′s)伊红-亚甲蓝琼脂(Difco实验室)上。在37℃下培养过夜之后计数在各平板上的大肠杆菌菌落的数目且用于计算在各膀胱或每对肾中的细菌的总数。
使用费雪保护最小显著差数法(Fisher′s protected leastsignificant difference test)测定不同组小鼠的平均总菌落形成单位(CFU)值之间的统计上显著的差异(PBS、未处理的感染组、和处理且感染的组)。膀胱和肾感染数据使用总CFU=log10[(CFU+100)/毫克组织]转换,其中CFU为每个组织样品所计算的菌落形成单位总数。
膀胱和肾的所得结果分别地显示于图9a和9b中。接种10天之后处死小鼠以评估膀胱和肾感染的强度。取出各动物的膀胱和两个肾,称重,且在无菌PBS中均质化,其后将均质物连续地涂布在列文氏(Levine′s)伊红-亚甲蓝琼脂(Difco实验室)上。在37℃下培养过夜之后计数在各平板上的大肠杆菌菌落的数目,且在将100CFU加至所得结果之后,将在各情况中获得的总数除以组织的毫克(即总CFU=log10[(CFU+100)/毫克组织]以便计算膀胱或肾的细菌的平均总数+/-SEM。细菌提取物将所获得的对数值减少因子>3(膀胱)和>2(肾),暗示从膀胱和肾培养的菌落的数目分别地减少至少1000和100的因子。这些结果证明本发明实施方案的免疫活性。
实施例11:本发明的实施方案在腹膜内鼠伤寒沙门氏菌感染的鼠模型中(在C57/bl小鼠中)的效果
本发明的实施方案也在腹膜内鼠伤寒沙门氏菌感染的鼠模型中测试。C57BL/6小鼠在口服处理之前保持7天。处理的动物每次施用每只动物接受85毫克的冷冻干燥产物(即15毫克(17.5%)的细菌提取物和70毫克(82.5%)的赋形剂)。实验由20只用类似于实施例3.15的提取物处理的小鼠的实验组,和20只用水对照处理的小鼠的对照组所组成。对于处理,每天将提取物溶解在蒸馏水中以便在0.5毫升的最终体积中具有单一剂量。用鼠伤寒沙门氏菌菌株415腹膜内攻击所有小鼠之前,将此0.5毫升体积一天一次口服给予于各小鼠连续10天(I.Mechnokov Institute for Vaccines and Sera,Russian Academyof Medical Sciences)。
提取物以85毫克每只小鼠的单一剂量(即15毫克的活性成分与82.5%的赋形剂)引入。对照组中的小鼠接受10天的使用每天口服施用0.5毫升水的假处理。达到攻击的初步剂量的范围在每只小鼠102至105CFU的沙门氏菌(Salmonellae)。主要的实验选择104CFU的剂量,因为在未处理的动物中此剂量提供大约50%的存活者。
攻击之后,将小鼠保持在实验用动物的标准条件下。在感染后的21天期间每天观察和纪录死亡。化合物的抗感染功效(参见下表)根据对每个实验组计算的感染后存活率(SR)、感染后平均寿命(ADL)、防御因子(DF)、和制剂功效指数(EI)评估。SR为在感染后第21天实验组中的活动物的百分比。
ADL、DF和EI使用下列公式计算:
ADL=(X1+X2+...+Xn):N,
其中ADL为平均寿命、X1至Xn为实验小鼠#1至#n的感染后寿命,和N-为实验组中动物的总数。
DF=CD∶ED,
其中DF为防御因子,CD为对照组中的死亡百分比,和ED为实验组的死亡百分比。
EI=[(DF-1)∶DF]x100%,
其中EI为制剂功效指数和DF为防御因子。
在用104CFU的鼠伤寒沙门氏菌感染后21天期间纪录对照和实验组中的死亡。
实施例3.15在鼠伤寒沙门氏菌致死感染模型中(在C57BL/6小鼠中)的防御功效。
用物质预处理 | 死亡率(%) | 存活率(%) | ADL(天) | DF | EI(%) |
H2O | 42 | 58 | 15.3 | 1 | 0 |
实施例3.15 | 0 | 100 | 21 | 最大防御 | 100 |
在实验期间显然的是,该提取物表现出良好的耐受性。在用水预处理的小鼠的对照组中,在观察期间(21d)存活率为58%,和ADL为15.3天。相比之下,所有接受根据本发明提取物的小鼠在攻击之后存活。这些结果暗示本发明的实施方案对于抗人类中的某些细菌感染是有利的。
实施例12:本发明的实施方案在变应原攻击期间对黏膜气管中调节T细胞的产生的影响。
在急性变应性炎症的模型中测试本发明实施方案的免疫调节潜能。进行实验以测定,在PVG大鼠中施用根据本发明的提取物是否增加可利用的黏膜归巢调节性T(mucosal-homing Tregulatory,Treg)细胞的库大小(pool size),导致在间断性炎症期间Treg在气道黏膜组织中的数目的增加。
饲养近亲繁殖的PVG大鼠且维持无常见大鼠病原体。自始至终利用随机选择的8-13周大的2种性别的动物。
用400微克的所提供的冷冻干燥产物/克的体重(或400毫克/千克/天)进行每天的连续喂食(胃管灌食法)。在研究组中表型地鉴定在PVG大鼠的气道组织中的Treg群体。大鼠气管组织的表型表征需要综合5至10只动物的组大小以产生足够的用于分析的细胞。在胶原酶/DNA酶中消化气管组织以产生单细胞悬浮液接着进行CD4、CD25、Foxp 3和TCRαβ的表面表达的流术细胞术分析。首先,动物在第零天(d0)用OVA敏化且从d10至d17用类似于实施例3.15的提取物或安慰剂喂食;在d18用气雾化的OVA攻击动物且24小时后测量所产生的Th细胞/Treg(FoxP3)应答。对于Fox p3的细胞内染色,如制造商所述使用得自eBioscience(圣地亚哥,加州)的抗-小鼠/大鼠FoxP3-FLR染色试剂盒。在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上获取数据且使用Flowjo软件(4.6.1版,Tree Star公司)分析。OVA得自Sigma Chemicals Co.(圣路易斯,密苏里)。
图10a和10b显示原始流式细胞术数据(在图10a中标记为CD14对FoxP3,和在图10b中标记为TCR对FoxP3)。细胞得自OVA敏化的大鼠(i.p.在第0天)中的和飞沫微粒OVA攻击(第18天)24小时之后的气道黏膜。图10a和10b中的右边显示当动物从第10天至第18天口服施用提取物时,FoxP3阳性CD4细胞(及TCR分别地)的百分比增加,当与显示于左边的对照(用OVA敏化的未处理动物和OVA攻击的动物)比较时。
此实施例显示在炎症变应性危险期的情形中本发明的实施方案可具有治疗价值。
额外的实施例包括:
来自一种或更多种细菌物种的提取物,所述细菌物种选自:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、变异链球菌、咽峡炎链球菌、缓症链球菌、唾液链球菌、干燥奈瑟氏球菌、副流感嗜血菌、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)、和啮蚀艾肯氏菌,其中,在该提取物的制备期间,该一种或更多种细菌菌株裂解于大于12的pH下,和该提取物经处理以除去核酸;及其中该提取物在施用给患者后不引起朊病毒病的风险。
前述段落的提取物,其得自各下列细菌物种的至少一种菌株:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、变异链球菌、咽峡炎链球菌、缓症链球菌、唾液链球菌、干燥奈瑟氏球菌、副流感嗜血菌、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)、和啮蚀艾肯氏菌。
前述段落的提取物,其得自各下列细菌菌株:粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)3622、粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)3625、粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)I-045、流感嗜血菌8467、肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种5050、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae ssp.pneumoniae)204、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种5056、金黄色葡萄球菌I-049、金黄色葡萄球菌I-050、金黄色葡萄球菌I-051、金黄色葡萄球菌I-052、金黄色葡萄球菌I-053、金黄色葡萄球菌I-054、肺炎链球菌7465、肺炎链球菌7466、肺炎链球菌7978、肺炎链球菌10319、酿脓链球菌8191、血链球菌I-046、血链球菌I-047、血链球菌I-048、溶血葡萄球菌11042、粪肠球菌103015、变异链球菌10449、咽峡炎链球菌10713、缓症链球菌12261、唾液链球菌102503、干燥奈瑟氏球菌103345、副流感嗜血菌7857、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)52.105、和啮蚀艾肯氏菌10596。
三个前述段落的任何提取物,其中该提取物包含小于100微克/毫升的核酸。
三个前述段落的任何提取物,其中该提取物包含至少0.3毫克/毫升的糖。
三个前述段落的任何提取物,其中该提取物包含在0.3和4.5毫克/毫升之间的糖。
任何前述段落的提取物,其中至少一种糖选自单糖、二糖和多糖。
前述段落的提取物,其中至少一种多糖为支链多糖。
任何前述段落的提取物,其中至少一种糖被化学修饰。
任何前述段落的提取物,其中该提取物包含在1.5至2.5毫克/毫升之间的游离氨基酸。
任何上述段落的提取物,其中裂解在12.6至13.4的pH下进行。
任何前述段落的提取物,其中该提取物经处理以除去颗粒和/或不溶性成分。
任何前述段落的提取物,其中各细菌菌株培养于不引起朊病毒病的风险的培养基中。
任何前述段落的提取物,其中至少一种选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、和赖氨酸的氨基酸被外消旋至少10%。
任何前述段落的提取物,其中该提取物的游离氨基酸包含在1和80%之间的D-氨基酸。
任何前述段落的提取物,其中该提取物的游离氨基酸包含在10和45%之间的D-氨基酸。
前述段落的提取物,其中该提取物的游离氨基酸包含在25和35%之间的D-氨基酸。
任何前述段落的提取物,其中该提取物包含至少一种选自D-天冬氨酸和D-天冬酰胺、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺、D-丝氨酸、D-甲硫氨酸、D-组氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-缬氨酸、和D-苏氨酸的D-氨基酸。
前述段落的提取物,其中任何一种D-氨基酸的浓度包含在1和50%之间的游离氨基酸浓度。
前述段落的提取物,其中任何一种D-氨基酸的浓度包含在10和40%之间的游离氨基酸浓度。
前述段落的提取物,其中任何一种D-氨基酸的浓度包含在15和35%之间的游离氨基酸浓度。
任何前述段落的提取物,其中该提取物包含在6和75毫克/毫升之间的一种或更多种蛋白质。
前述段落的提取物,其中该提取物包含在6和8毫克/毫升之间的一种或更多种蛋白质。
任何前述段落的提取物,其中该一种或更多种蛋白质具有小于30kDa的分子量。
任何前述段落的提取物,其中该一种或更多种蛋白质具有小于10kDa的分子量。
任何前述段落的提取物,其中至少8只具有野生型LPS敏感性的小鼠用鼠伤寒沙门氏菌攻击之后13天的存活率为至少70%,其中选择该鼠伤寒沙门氏菌的剂量以使至少8只对照小鼠的存活率为60%或更低。
前述段落的提取物,其中该存活率为至少80%。
前述段落的提取物,其中该存活率为至少90%。
任何前述段落的提取物,其中该提取物包含小于5000纳克的根据鲎变形细胞裂解物(LAL)产色试验的LPS当量。
一种药物组合物,其包含任何上述段落的提取物。
用于治疗罹患呼吸病症或处于发展呼吸病症的风险的受试者的方法,其包括将有效量的任何上述段落的提取物施用给该受试者。
前述段落的方法,其中该受试者为人或驯养的哺乳动物。
二个前述段落的任一个的方法,其中该呼吸病症或变应性病状为上和下呼吸道感染、特应性皮炎、鼻咽炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎、咽喉炎、流行性感冒、肺炎、支气管肺炎、支气管炎、下呼吸道感染、变应性鼻炎、变应性哮喘、鼻炎、鼻咽炎、咽炎、鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、喉气管炎、支气管炎、具有急性下呼吸道感染的阻塞性肺部疾病、或具有急性恶化的阻塞性肺部疾病。
一种制备提取物的方法,该提取物得自一种或更多种选自下列的细菌物种:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、变异链球菌、咽峡炎链球菌、缓症链球菌、唾液链球菌、干燥奈瑟氏球菌、副流感嗜血菌、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)、和啮蚀艾肯氏菌,其包括:
(a)在不引起朊病毒病的风险的培养基中培养各细菌菌株;
(b)在大于12的初始pH下裂解各菌株;及
(c)将(b)的产物通过微过滤器至少一次和通过超滤器至少一次。
前述段落的方法,其中该提取物得自各下列细菌物种的至少一种菌株:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、变异链球菌、咽峡炎链球菌、缓症链球菌、唾液链球菌、干燥奈瑟氏球菌、副流感嗜血菌、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)、和啮蚀艾肯氏菌。
前述段落的方法,其中该提取物得自各下列细菌菌株:粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)3622、粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)3625、粘膜炎莫拉氏菌(莫拉氏菌属)I-045、流感嗜血菌8467、肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种5050、肺炎克雷伯氏菌204、肺炎克雷伯氏菌5056、金黄色葡萄球菌I-049、金黄色葡萄球菌I-050、金黄色葡萄球菌I-051、金黄色葡萄球菌I-052、金黄色葡萄球菌I-053、金黄色葡萄球菌I-054、肺炎链球菌7465、肺炎链球菌7466、肺炎链球菌7978、肺炎链球菌10319、酿脓链球菌8191、血链球菌I-046、血链球菌I-047、血链球菌I-048、溶血葡萄球菌11042、粪肠球菌103015、变异链球菌10449、咽峡炎链球菌10713、缓症链球菌12261、唾液链球菌102503、干燥奈瑟氏球菌103345、副流感嗜血菌7857、伴放线放线杆菌(嗜血菌属)52.105、和啮蚀艾肯氏菌10596。任何前述段落的方法,其中该裂解在大于12.5的初始pH下进行。
任何前述段落的方法,其中该裂解在12.6至13.4的初始pH下进行。
任何前述段落的方法,其中该裂解在30-60℃的温度下进行40小时至10天。
任何前述段落的方法,其中该微过滤器为0.45微米且超滤器为30KDa。
任何前述段落的方法,其中(c)部分包含切向流过滤。
前述段落的方法,其中该切向流过滤进行5至15个循环。
任何前述段落的方法,其进一步包括将(c)的产物通过0.2微米的第二个微过滤器。
任何前述段落的方法,其中(b)部分用10-120克/升细菌干重的物质进行。
任何前述段落的方法,其中该切向流过滤如图1中所示进行。
任何前述段落的方法,其中该切向流过滤如图1中所示,以蛇形模式进行。
通过任何前述段落的方法获得的产物。
用于治疗罹患呼吸病症或处于发展呼吸病症的风险的受试者的方法,其包括将有效量的通过任何前述段落的方法获得的任何产物施用给该受试者。
前述段落的方法,其中该受试者为人或驯养的哺乳动物。
Claims (48)
1.来自一种或更多种细菌物种的提取物,所述细菌物种选自:粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和血链球菌(Streptococcus sanguinis),其中,在所述提取物的制备期间,所述一种或更多种细菌菌株在大于12的pH下裂解,且所述提取物经处理以除去核酸;且其中所述提取物在施用给患者后不引起朊病毒病的风险。
2.权利要求1的提取物,其得自各下列细菌物种的至少一种菌株:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和血链球菌。
3.权利要求2的提取物,其得自下列细菌菌株的每一种:粘膜炎莫拉氏菌3622、粘膜炎莫拉氏菌3625、粘膜炎莫拉氏菌I-045、流感嗜血菌8467、肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella pneumoniae ssp.ozaenae)5050、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae ssp.pneumoniae)204、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种5056、金黄色葡萄球菌I-049、金黄色葡萄球菌I-050、金黄色葡萄球菌I-051、金黄色葡萄球菌I-052、金黄色葡萄球菌I-053、金黄色葡萄球菌I-054、肺炎链球菌7465、肺炎链球菌7466、肺炎链球菌7978、肺炎链球菌10319、酿脓链球菌8191、血链球菌I-046、血链球菌I-047和血链球菌I-048。
4.权利要求1、2或3的提取物,其中所述提取物包含小于100微克/毫升的核酸。
5.权利要求1、2、3或4的提取物,其中所述提取物包含至少0.3毫克/毫升的糖。
6.权利要求5的提取物,其中所述提取物包含在0.3和4.5毫克/毫升之间的糖。
7.权利要求5的提取物,其中至少一种糖选自单糖、二糖和多糖。
8.权利要求7的提取物,其中至少一种多糖为支链多糖。
9.权利要求5的提取物,其中至少一种糖被化学修饰。
10.权利要求1-9中任一项的提取物,其中裂解在12.6至13.4的pH下进行。
11.权利要求1-10中任一项的提取物,其中所述提取物经处理以除去颗粒和/或不溶性成分。
12.权利要求1-11中任一项的提取物,其中各细菌菌株在不引起朊病毒病的风险的培养基中培养。
13.权利要求1-12中任一项的提取物,其中所述提取物包含在1.5至2.5毫克/毫升之间的游离氨基酸。
14.权利要求1-13中任一项的提取物,其中至少一种选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的氨基酸被外消旋至少10%。
15.权利要求13-14中任一项的提取物,其中在所述提取物中游离氨基酸包含在1和80%之间的D-氨基酸。
16.权利要求17的提取物,其中在所述提取物中游离氨基酸包含在10和45%之间的D-氨基酸。
17.权利要求16的提取物,其中在所述提取物中游离氨基酸包含在25和35%之间的D-氨基酸。
18.权利要求1-17中任一项的提取物,其中所述提取物包含在6和8毫克/毫升之间的一种或更多种蛋白质。
19.权利要求18的提取物,其中所述一种或更多种蛋白质具有小于30kDa的分子量。
20.权利要求18的提取物,其中所述一种或更多种蛋白质具有小于10kDa的分子量。
21.权利要求1-20中任一项的提取物,其中所述提取物包含小于5000纳克的根据鲎变形细胞裂解物(LAL)产色试验的LPS当量。
22.权利要求1-21中任一项的提取物,其中至少8只具有野生型LPS敏感性的小鼠用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)攻击之后13天的存活率为至少70%,其中选择所述鼠伤寒沙门氏菌的剂量以使至少8只用水处理的对照小鼠的存活率为60%或更低,且其中在攻击之前实验和对照小鼠用所述提取物或用水处理10天。
23.前述段落的提取物,其中所述存活率为至少80%。
24.前述段落的提取物,其中所述存活率为至少90%。
25.一种药物组合物,其包含权利要求1-24中任一项的提取物。
26.用于治疗罹患呼吸病症或变应性病状或处于发展呼吸病症或变应性病状的风险的受试者的方法,其包括给所述受试者施用有效量的权利要求1-24中任一项的提取物或权利要求25的药物组合物。
27.权利要求26的方法,其中所述受试者为人或驯养的哺乳动物。
28.权利要求26或27的方法,其中所述呼吸病症或变应性病状为上和下呼吸道感染、特应性皮炎、鼻咽炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎、咽喉炎、流行性感冒、肺炎、支气管肺炎、支气管炎、下呼吸道感染、变应性鼻炎、变应性哮喘、鼻炎、鼻咽炎、咽炎、鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、喉气管炎、支气管炎、具有急性下呼吸道感染的阻塞性肺部疾病或具有急性恶化的阻塞性肺部疾病。
29.一种制备提取物的方法,所述提取物得自一种或更多种选自下列的细菌物种:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和血链球菌,其包括:
(b)在不引起朊病毒病的风险的培养基中培养各细菌菌株;
(c)在大于12的初始pH下裂解各菌株;和
(d)将(b)的产物通过微过滤器至少一次和通过超滤器至少一次。
30.权利要求29的方法,其中所述提取物得自各下列细菌物种的至少一种菌株:粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和血链球菌。
31.权利要求30的方法,其中所述提取物得自下列细菌菌株的每一种:粘膜炎莫拉氏菌3622、粘膜炎莫拉氏菌3625、粘膜炎莫拉氏菌I-045、流感嗜血菌8467、肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种5050、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种204、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种5056、金黄色葡萄球菌I-049、金黄色葡萄球菌I-050、金黄色葡萄球菌I-051、金黄色葡萄球菌I-052、金黄色葡萄球菌I-053、金黄色葡萄球菌I-054、肺炎链球菌7465、肺炎链球菌7466、肺炎链球菌7978、肺炎链球菌10319、酿脓链球菌8191、血链球菌I-046、血链球菌I-047和血链球菌I-048。
32.权利要求29、30或31的方法,其中所述裂解在大于12.5的初始pH下进行。
33.权利要求32的方法,其中所述裂解在12.6至13.4的初始pH下进行。
34.权利要求29、30或31的方法,其中至少一部分的所述裂解在0.05至0.4N的初始氢氧根离子浓度下进行。
35.权利要求29、30或31的方法,其中至少一部分的所述裂解在0.5至1N的初始氢氧根离子浓度下进行。
36.权利要求29-35中任一项的方法,其中所述裂解在30-60℃的温度下进行40小时至10天。
37.权利要求36的方法,其中所述裂解在30至40℃下进行20至240小时。
38.权利要求29-37中任一项的方法,其中所述微过滤器为0.45微米且所述超滤器为30KDa。
39.权利要求29-38中任一项的方法,其中(c)部分包含切向流过滤。
40.权利要求39的方法,其中所述切向流过滤进行5至15个循环。
41.权利要求29-40中任一项的方法,其进一步包括将(c)的产物通过0.2微米的第二个微过滤器。
42.权利要求29-41中任一项的方法,其中(b)部分用5-120克/升细菌干重的物质进行。
43.权利要求42的方法,其中(b)部分用5-90克/升细菌干重的物质进行。
44.权利要求29-43中任一项的方法,其中至少一部分的所述菌株在温和裂解条件下裂解。
45.权利要求29-44中任一项的方法,其中至少一部分的所述菌株在强裂解条件下裂解。
46.通过权利要求29-45中任一项的方法获得的产物。
47.用于治疗罹患呼吸病症或变应性病状或处于发展呼吸病症或变应性病状的风险的受试者的方法,其包括给所述受试者施用有效量的任何权利要求46的产物。
48.权利要求47的方法,其中所述受试者为人或驯养的哺乳动物。
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