KR101527483B1 - 호흡기 질환 치료용 박테리아 추출물 및 그 제조방법 - Google Patents

호흡기 질환 치료용 박테리아 추출물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도상구균(Staphylococcus), 모라셀라(Moraxella), 크렙시엘라( Klebsiella), 연쇄상구균(Streptococcus), 및 헤모필루스(Haemophilus) 등의 박테리아 균주(bacterial strains) 유래 추출물에 관한 것이다. 상기 추출물은 호흡기 질환과 같은 증상의 치료제로서 유용하다. 본 발명은 또한 이러한 추출물을 포함하는 조성물 및 프리온 질병(prion disease)의 위험을 내포하지않은 배지(media)로부터 상기 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
호흡기질환, 추출물, 박테리아, 용해, 모라셀라, 포도상구균, 균주, 핵산

Description

호흡기 질환 치료용 박테리아 추출물 및 그 제조방법{BACTERIAL EXTRACT FOR RESPITORY DISORDERS AND PROCESS FOR ITS PREPARATION}
본 발명은 호흡기 질환과 같은 증상의 치료제로서 유용한 박테리아 종 유래 추출물, 이러한 추출물을 포함하는 조성물 및 프리온 질병(prion disease)의 발병 위험을 내포하지 않는 배지(media)로부터 상기 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 호흡기 질환과 같은 증상(medical conditions)를 치료하는데 유용한 박테리아 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 추출물은 다음 종에서 선택되는 배양액(cultures) 유래 박테리아 용해물(bacterial lysates)을 포함할 수 있다:
모라셀라카타랄리스( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis, Moraxella(Moraxella)catarrhalis), 헤모필루스인플루엔자( Haemophilus influenzae), 크렙시엘라뉴모니아 ( Klebsiella pneumoniae , 폐렴 막대균 ), 스타필로코커스아우레우스( Staphylococcus aureus , 포도상구균), 스트렙토코커스뉴모니 아( Streptococcus pneumoniae , 폐구균 ), 스트렙토코커스피로젠( Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스생귀니스 ( Streptococcus sanguinis , 연쇄상구균), 스타필로코커스헤몰리티쿠스( Staphylococcus Hemolyticus , 용혈성 포도상구균), 엔테로 코커스 패칼리스 ( Enterococcusfae faecalis ), 스트렙토코커스뮤탄스( Streptococcus mutans), 스트렙토코커스생기노서스 ( Streptococcu sanginosus ), 스트렙토코커스미티스( Streptococcus mitis ), 스트렙토코커스살리바리우스( Streptococcus salivarius(일명, Streptococcusviridans )), 네이서리아시카 ( Neisseria sicca ), 헤모필루스파라인플루엔자( Hemophilus parainfluenzae ), 액티노바실러 스(Actinobacillus( Hemophilus )), 액티노미세템코미탄 ( actinomycetemcomitans ), 및 아이케넬라코로덴 ( Eikenellacorrodens ).
일 실시형태에 따르면, 상기 추출물들은 상기 박테리아 종의 적어도 하나의 균주를 포함하며, 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 리스트에 제시된 하나 또는 그 이상의 특정 균주가 제외되거나 하나 또는 그 이상의 다른 균주으로 대체된다. 본 발명의 실시형태에 따르면, 다음 각각의 박테리아 균주에서 각각 얻어지는 추출물을 포함한다: 모라셀라카타랄리스 3622( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis 3622), 모라셀라카타랄리스 3625( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis 3625), 모라셀라카타랄 리스 I-045( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis I-045), 헤모필루스인플 루엔자 8467(Haemophilusinfluenzae 8467), 크렙시엘라뉴모니아 오자에나에 5050(Klebsiella pneumoniae ssp . ozaenae 5050), 크렙시엘라뉴모니아 204(Klebsiella pneumoniae 204), 크렙시엘라뉴모니아 5056( Klebsiella pneumoniae5056), 스타필로코커스아우레우스 I-049( Staphylococcus aureusI -049), 스타필로코커스아우레우스 I-050( Staphylococcus aureus I-050), 스타필로코커스아 우레우스 I-051( Staphylococcus aureus I-051), 스타필로코커스아우레우스 I-052(Staphylococcus aureus I-052), 스타필로코커스아우레우스 I-053(Staphylococcus aureusI -053), 스타필로코커스아우레우스 I-054(Staphylococcus aureusI -054), 스트렙토코커스(디플로코커스)뉴모니아 7465(Streptococcus(Diplococcus)pneumoniae7465), 스트렙토코커스(디플로코커스)뉴모니아 7466( Streptococcus ( Diplococcus )pneumoniae7466), 스트렙토코커스( 디플로코커스 ) 뉴모니아 7978( Streptococcus ( Diplococcus ) pneumoniae 7978), 스트렙토코커스 ( 디플로코커스 ) 뉴모니아 10319(Streptococcus(Diplococcus)pneumoniae 10319), 스트렙토코커스피로젠 8191(Streptococcus pyogenes 8191), 스트렙토코커 스생귀니스 I-046( Streptococcus sanguinis I-046), 스트렙토코커스생귀니스 I-047(Streptococcussanguinis I-047), 스트렙토코커스생귀니스 I-048(Streptococcussanguinis I-048), 스타필로코커스헤몰리티쿠스 11042(StaphylococcusHemolyticus 11042), 엔테로코커스패칼리스 103015( Enterococcus faecalis 103015), 스트렙토코커스뮤탄스 10449( Streptococcusmutans 10449), 스트렙토코커스생기노서스 10713( Streptococcusanginosus 10713), 스트렙 토코커스미티스 12261( Streptococcus mitis 12261), 스트렙토코커스살리바리우스 102503(Streptococcus salivarius 102503), 네이서리아시카 103345( Neisseria sicca 103345), 헤모필루스파라인플루엔자 7857( Hemophilus parainfluenzae 7857), 액티노바실러스( 헤모필루스 ) 액티노미세템코미탄 52.105(Actinobacillus(Hemophilus)actinomycetemcomitans52.105) 및 아이케넬라코 로덴 10596( Eikenellacorrodens10596 ). 이들 균주들을 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 의거하여 기탁하였다. 상기 리스트에서 I-번호로써 넘버링된 균주들은 Collection Nationale de Culture des Microorganismes(Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris France)에 의하여 인덱싱되었다. 그 밖의 모든 균주들은 런던의 National Collection of Type Cultures에 의하여 인덱싱된 것들이다.
일 실시형태에 따르면, 상기 리스트에 제시된 특정 균주들 중 하나 또는 그 이상이 생략되거나 동일 종 또는 다른 종에 속한 균주의 박테리아로 대체될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에 따르면, 스타필로코커스헤몰리티쿠스 11042(Staphylococcus Hemolyticus 11042), 엔테로코커스패칼리스 103015( Enterococcus faecalis 103015), 스트렙토코커스뮤탄스 10449( Streptococcusmutans 10449), 스트렙토코커스생기노서스 10713( Streptococcusanginosus 10713), 스트렙토코커스미티스 12261( Streptococcus mitis 12261), 스트렙토코커스살리바리우스 102503(Streptococcus salivarius 102503), 네이서리아시카 103345( Neisseria sicca 103345), 헤모필루스파라인플루엔자 7857( Hemophilus parainfluenzae 7857), 액티노바실러스( 헤모필루스 ) 액티노미세템코미탄 52.105(Actinobacillus(Hemophilus)actinomycetemcomitans52.105) 및 아이케넬라코 로덴 10596( Eikenellacorrodens10596 ) 중 어느 하나 또는 그 이상 심지어는 이 모든 균주들이 생략될 수 있다. 다른 실시형태에 따르면, 모라셀라 ( Moraxella ), 크렙 시엘라( Klebsiella ), 스타필로코커스아우레우스 ( Staphylococcus aureus ), 스트렙토코커스뉴모니아( Streptococcus pneumoniae ), 스트렙토코커스피로젠( Streptococcus pyogenes ), 스트렙토코커스생귀니스 ( Streptococcus sanguinis ) 중 어느 하나 또는 그 이상이 생략될 수 있다. 나아가, 소화를 돕기 위하여, 락토 바실러스 균주( Lactobacillus strain ) 또는 다른 균주의 박테리아 역시 사용될 수 있다.
이러한 추출물은 세포를 알맞은 광학밀도(optical density)로 배지(culture medium)에서 성장시킨 후 알칼라인 라이시스(alkaline lysis) 방법에 의하여 얻을 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 각각의 박테리아를 프리온 관련 질병(prion-related disease) 또는 동물기반의 배지(animal-based media)로부터 얻어지는 생성물의 섭취과정(ingesting)에서 전염될 소지가 있는 기타 질병의 위험에 노출되지 않은 배지에서 성장시킨다. 예를 들어 일 실시형태에 따르면, 세포 배양에 있어서 콩-기반(soya-based) 배지와 같은 식물기반의 배지(vegetable-based medium)를 사용한다.
다른 실시형태에 따르면, 합성 배지(synthetic medium)를 세포 배양에 사용한다. 또 다른 실시형태에 따르면, 배지는 역시 그러한 질병의 위험을 내포하지 않는 효모 추출물(yeast extracts) 및 말 혈청(horse serum)과 같은 생물학적 추출물을 포함할 수 있다.
상기 용해물(lysates)은 또한 핵산과 더 큰 세포 잔해를 제거하기 위하여 여과될 수 있다. 일 실시형태에 의하면, 이러한 여과로 인해 추출물 내에 잔존하는 핵산의 양을 100㎍/mL로 만들 수 있다. 일 실시형태에 의하면, 세포벽 잔해와 같이 용해되지 않은 화합물 및 충분히 분해되지 않은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 역시 이러한 여과로 인해 제거된다. 따라서, 일 실시형태에 따르면, 결과물로서의 추출물은 가용성 분자화합물을 포함하며, 현저한 양의 비가용성 물질 또는 미립자형(particulate) 물질을 함유하지 않는다.
지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 포함하는 당류 성분(Saccharide components)은 추출물 내에 잔존할 수 있다. 용해(lysis) 과정에서, 당류는 예를 들어, 더 작은 구조로 쪼개어지거나(cleaved), 다른 작용기로 치환되는 등, 화학적으로 변형될 수 있다.
또한, 용해 과정을 수행하는 동안 아미노산의 라세미화(Racemization)에 의하여 자연계의 단백질에서 발견되는 D-아미노산의 자연적 발생으로 인한 D-아미노산이 생성된다. D-아미노산은 상기 추출물의 생물학적 이용가능성(bioavailability)을 향상시킴에 있어 유리하게 작용할 수 있다. 이는 대부분 또는 일부분이 D-아미노산으로 구성되는 단백질들이 포유류의 소화기관 내에서 효율적으로 소화되지 않기 때문이다. 따라서, 용해 과정에서 화학적으로 변형되어 D-아미노산을 함유하게 된 추출물 내의 항원 분자(antigenic molecules)가 환자의 몸 안에 장기간 잔존하여, 잠재적으로 보다 강한 면역자극 활성(immunostimulating action)을 갖게 되는 것이다.
상술한 종래기술에서 박테리아 추출물이 호흡기 질병에 저항하는 면역계를 활성화하기 위하여 사용되어 왔으나, 이들을 보다 안전하고, 보다 효과적이며, 보 다 내구성을 갖도록 하기 위해서는 이들 추출물을 보다 나은 방법으로 규격화하고 제어할 필요성이 있다. 예를 들어, 종래에는 잠재적으로 독성을 갖는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 성분을 포함하는 당류 성분들이 안전상의 이유로 제거되어야 한다고 여겨졌다.(예를 들어, 미국특허 5,424,287 참조) 그러나, 본 발명은 결과적으로 LPS 성분의 충분한 화학적 변형을 초래하여 당류 성분이 안전하게 유지되는 제조방법을 제시한다. 이들 성분을 유지함으로써 효능을 향상시킬 수 있고 추출물에 추가적인 항원을 제공할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 발명자들은 pH 및 용해 공정의 시간을 조절함으로써 잠재적으로 알레르기를 유발하거나 독성을 갖는 세포벽 성분의 충분한 분해가 가능하다는 것을 발견하였다. 반면에 종래의 더 낮은 pH 또는 더 짧은 시간의 용해 조건하에서는 세포벽 성분들 및 당류가 화학적으로 불충분하게 변형된 상태로 추출물이 생성되었다.(예를 들어, GB 2 021 415 A 참조) 생성된 추출물은 환자들에게 투여하기에는 지나치게 알레르기 유발성이 강하였다. 본 발명자들은 지나치게 낮은 pH 및/또는 짧은 시간의 조건하에서 용해 방법을 실시하여 생성된 생성물은 일반적으로 보다 강한 독성과 낮은 추출효율, 및 낮은 여과능력을 갖는 것을 발견하였다.
또한 여과 과정은 필터의 공극(pore) 사이즈, 몇몇 사안에서는 필터 표면의 화학적 특성 등이 제거되거나 잔존하는 물질들의 형태를 변경시킬 수 있기에, 생성된 추출물의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시형태에서는 당류를 유지하고 핵산과 같은 다른 분자 성분들은 제거하도록 설계된 여과방법을 사용한다.
따라서, 본 발명은 박테리아 추출물을 규격화하여 안전성과 효능을 유지하는데 도움을 줄 수 있는 파라메터를 제공한다.
정의( Definition )
추출물(Extract): 여기서 정의되는 추출물은 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주들(bacterial strains)에 대한 용해(lysis)를 통하여 얻어지는 물질을 의미한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 추출물은 오직 하나의 균주으로부터 얻어지는 반면, 다른 경우들에서는 추출물이 몇 가지 다른 균주의 혼합물로부터 얻어진다.
알칼라인 용해(alkaline lysis): 이것은 박테리아 세포들을 기초적인 조건하에서 용해(lysing)하는 방법을 말한다.
용해물(Lysates): 본 발명에서 상기 용어는 세포 용해 방법을 통해 얻어진 박테리아의 추출물을 의미한다.
여과(Filtration): 본 발명에서의 여과 공정은, 하나의 추출물 또는 추출물들의 혼합물이 마이크로필터(즉, 마이크로여과(microfiltration)) 또는 한외여과필터(ultrafilter) (즉, 한외여과(ultrafiltration))를 통과하는 공정을 의미한다. 이러한 여과는 제거하고자 하는 성분을 100% 제거하여야 할 필요는 없다. 몇몇 경우에 있어서, 여과는 수차례 경로 또는 순환과정을 통해 반복된다.
초기 pH: 이 용어는 박테리아 용해 또는 여과 등의 공정의 시작시에 측정한 pH를 의미한다.
당류(Saccharides): 당(Saccharide)은 선형(linear) 및 가지형(branched) 다당류 등의 상대적으로 큰 당류뿐 아니라, 단당류(monosaccharides) 및 이당류(disaccharides)도 포함한다. 또한, 당류는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 및 이들이 화학적으로 변형된 변형물질과 같이, 치환되거나 화학적으로 변형된 당류도 포함한다.
D-아미노산: 이 용어는 시계방향 이성질체 형태(dextra-rotatory isomeric form)로 존재하는 아미노산을 일컫는 것으로서, 반시계방향 이성질체 형태(levo-rotatory isomeric form)로 존재하는 생물합성적으로(biosynthetically)으로 생성된 L-아미노산과 반대되는 것이다.
라세미화(Racemization): 이 용어는 L-아미노산이 적어도 부분적인 화학적 변형에 의해 D-아미노산으로 변형되는 것을 의미한다.
프리온 기반의(prion-based) 질병의 위험을 내포하지 않는 배지(medium)는 소 또는 양 또는 프리온 기반의 질병을 전염시킬 수 있는 다른 동물로부터 얻어진 혈청 또는 고기 추출물 등의 물질을 포함하지 않는 추출물 제조의 임의의 단계에서 사용되는 배지(culture medium)를 의미한다. 이러한 배지의 예로서는, 식물기반의 배지(vegetable-based medium), 합성 배지(synthetic medium), 및 말 혈청(horse serum)을 사용한 배지 또는 프리온 질병을 전염시키지 않는 동물 종들로부터 얻어진 물질을 포함하는 배지 등을 들 수 있다. 프리온 기반의 질병의 예로서는 광우병, 스크래피(scrapie) 및 크로이츠펠트-야콥병을 들 수 있다.
비동물성 배지는 동물로부터 유도된 성분을 포함하지 않는 배지이다. 그 예로서, 콩 배지(soya medium)와 같은 식물기반의 배지(vegetable-based medium, vegetal medium) 및 합성 배지(synthetic medium)를 들 수 있다.
여기서 사용되는 치료는 예를 들어 새로운 감염으로 발전하는 것으로부터 보호하거나 이를 예방하는 것뿐만 아니라, 예를 들어 현재의 감염에 대한 치료 역시 아우르는 의미이다.
여기서 대상(subject)은 사람 및 가축 포유동물과 같은 포유류 대상을 포함하는 여하한 동물 대상을 의미한다.
여기에 명시되고 본 발명에서 사용되는 특정 박테리아 균주들은, 본 발명에서 열거된 상기 원본 기탁물(original deposit)로부터 얻어지는 균주, 또는 추후에 다른 기탁 코드명으로 재기탁된(re-deposited) 균주를 포함하는 그들의 유전적 클론(genetic clone)을 포함할 수 있다.
여기에서 사용되는 모든 수치들은 그들의 측정, 어림(rounding) 및 유효 숫자(significant figures)에서의 고유 오차를 고려한 근사치이다.
추출물의 제조
본 발명의 박테리아 추출물들은 발효과정(fermentation)을 거친 후, 열처리 비활성화(heat inactivation)와 알칼라인 용해 및 여과과정을 거쳐 제조될 수 있다. 각각의 균주가 충분한 양의 물질로서 얻어지려면, 상기 발효 배양(fermentation cultures)은 워킹 씨드 로트(working seed lot)로부터 시작하여 보다 큰 배양 컨테이너로 이식배양(innoculation)하는 방법을 사용할 수 있다.
상기 사용된 배지는 각 종들에 대하여 동일한 것을 사용할 수 있다. 그러나, 보조 성장인자 (supplementary growth factor)가 몇몇 종의 성장을 촉진하기 위하여 도입될 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 프리온 기반 질병의 위험을 회피할 수 있는 배지가 균주의 적어도 일부 또는 전부의 성장을 위하여 사용될 수 있다. 예로서, 식물기반의 배지 및 합성배지와 같은 비동물성 배지를 들 수 있다. 다른 예는 그러한 위험에 노출될 수 있는 소 혈청 또는 고기 추출물의 존재 하에 성장된 균주들과 반대로, 말 혈청이나 프리온 질병의 위험에 노출되지 아니하는 기타 동물 종으로부터 유래된 추출물을 포함하는 배지를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, Ala-Gin 디펩타이드(dipeptide)를 상기 배지에 첨가할 수 있다. 본 발명자들은 몇몇 실시형태에서 Ala-Gin 디펩타이드가 박테리아 배양에 대한 성장 촉진제(growth stimulator)로서 작용할 수 있음을 발견하였다.
발효 이후에, 각 균주 또는 균주들의 집합물로부터 생성된 바이오매스(biomass, 생물량)는 열처리, 농축(concentrated) 및 동결(frozen)에 의하여 비활성화될 수 있다. 상기 세포 물질은 NaOH 등으로부터 유래된 수산화이온(hydroxide ions)에 의하여 용해될 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 박테리아 건조중량 기준으로 농도 20 내지 120g/L 또는 5 내지 90g/L, 10 내지 50g/L 또는 40 내지 90g/L로서, 전체적으로 2 내지 130g/L 농도 범위의 바이오매스가 용해될 수 있다. (여기서 제시되는 상기 바이오매스 농도는 용해 리터 당 박테리아 건조중량으로 표현된다. 바이오매스 농도는 작은 자기 접시(porcelain dish) 내의 5mL의 물질을 105℃ 온도에서 일정한 질량에 도달할 때까지 건조하고, 상기 질량을 g/L 단위로 기록하며 측정하였다) 예를 들어, 헤모필루스 균주는 15 내지 90g/L, 예를 들어 40 내지 90g/L, 40, 50, 60, 70,80 또는 90 또는 상기 범위 내에 속하는 더 좁은 범위(즉, 40-50, 70-90 등)로 한정되는 바이오매스 농도에서 용해될 수 있다. 스트렙토코커스 균주는 예를 들어 10 내지 90g/L, 즉 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90g/L 또는 이들 범위 내로 한정되는 더 좁은 범위의 바이오매스 농도에서 용해될 수 있다. 모라셀라 균주는 예를 들어 5 내지 60g/L 또는 10 내지 60g/L, 또는 15 내지 40g/L, 즉 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60g/L 또는 이들 범위 내로 한정되는 더 좁은 범위의 바이오매스 농도에서 용해될 수 있다. 클렙시엘라 균주는 예를 들어 10 내지 50g/L, 예를 들어 25 내지 50g/L 또는 10, 20, 30, 40 또는 50g/L 또는 이들 범위 내로 한정되는 더 좁은 범위의 바이오매스 농도에서 용해될 수 있다. 스타필로코커스 균주는 예를 들어 30 내지 90g/L, 예를 들어 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90g/L 또는 이들 범위 내로 한정되는 더 좁은 범위의 바이오매스 농도에서 용해될 수 있다. 네이서리아 균주는 예를 들어 5 내지 60g/L, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60g/L 또는 이들 범위 내로 한정되는 더 좁은 범위의 바이오매스 농도에서 용해될 수 있다.
일 실시형태에 의하면, 농도가 0.01N 내지 1.2N인 수산화물(hydroxide)이 용해 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어 상기 농도는 0.1 내지 1N 또는 0.05N 내지 0.4N, 또는 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35 또는 0.4N, 또는 이들 범위 내로 한정되는 더 좁은 범위의 농도, 예를 들어 0.5 내지 1.0N, 또는 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0N 또는 상기 농도에 의하여 한정되는 더 좁은 범위이다. 염기 농도(base concentration)는 초기 pH 12 또는 이보다 더 높은 pH, 즉 12 보다 더 큰 pH로서, 12.5 또는 pH 12.0 내지 13.4 또는 pH 12.6 내지 13.4를 달성하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 균주에 대하여, 수산화물 농도는 0.1 내지 0.7N 또는 0.2 내지 0.5N, 예를 들어 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5N 또는 이들 농도에 의하여 한정되는 더 좁은 범위의 농도일 수 있다. 모라셀라 또는 헤모필루스 균주에 대해서는, 수산화물 농도는 0.05 내지 0.7N 또는 0.15 내지 0.5N, 예를 들어 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45 또는 0.5N 또는 이들 농도에 의하여 한정되는 더 좁은 범위의 농도일 수 있다. 클렙시엘라 또는 스타필로코커스 균주에 대해서는, 수산화물 농도는 0.1 내지 0.7N 또는 0.15 내지 0.4N, 예를 들어 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35 또는 0.4N 또는 이들 농도에 의하여 한정되는 더 좁은 범위의 농도일 수 있다.
상기 용해 온도는 30 내지 60℃ 범위일 수 있으며, 예를 들어 30 내지 40℃, 또는 35 내지 40℃ 예를 들어 37℃일 수 있다. 용해 수행시간은 20시간 또는 40시간에서부터 수일 동안, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 심지어 15일 동안 수행할 수 있다. 예를 들어, 헤모필루스, 스트렙토코커스, 모라셀라, 및 스타필로코커스 균주는 용해 수행시간으로서 5 내지 9일이 소요되며, 클렙시엘라 및 네이서리아 균주는 7 내지 10일이 소요된다. 일 실시형태에 따르면, 각각의 균주에 대하여 용해 온도로서 30 내지 40℃, 또는 35 내지 40℃ 예를 들어 37℃를 채용하면, 용해는 72 내지 210시간(3 내지 9일), 예를 들어 3일, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9일 또는 이들 수행시간에 의하여 한정되는 범위의 시간(3 내지 4일, 8 내지 9일 등)에 걸쳐 수행될 수 있다. 이들 시간범위에는 여하한 일수(days), 시간 또는 분(minutes) 또는 그 안에 포함되는 분수 또는 소수(fractional number)도 포함된다는 것이 이해될 것이다.
일 실시형태에 의하면, 동일한 박테리아 속(genus) 중에서 하나 이상의 균주를 사용할 때, 상기 균주들은 함께 또는 분리되어 용해될 수 있다. 상기 균주들은 용해 전 또는 후에 혼합될 수 있다.
상기 추출물은 원심분리 및/또는 여과에 의하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 용해물(lysate)은 9000배 중력에 의하여 원심분리된 후, 0.2마이크론 필터로 일회 또는 그 이상 순환하여 여과할 수 있다. 어떠한 경우에는, 보다 큰 기공의 필터상에서, 연속적인 순환 여과를 수행한 후, 0.2마이크론 필터상에서 여과를 수행할 수도 있다. 한외여과 방법(ultrafiltration methods)은 상기 추출물에서 가용성 물질을 추출하는 것을 돕기 위하여 수행되며, 예를 들어, 미세여과를 추가적으로 수행하기 위하여 상기 한외여과 투과물(permeates)을 재순환시킨다.
일 실시형태에 따르면, 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)방법이 추출물들을 보다 큰 여과하는데 사용되며, 더 큰 세포 잔해로부터 가용화된 분자(solubilized molecules)들을 추출하기 위해 사용된다. 이는 도 1에 나타내었다 (Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson, Editor, lnterpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., p.126 to 135 - ISBN:0-935184-72-4). 이런 과정의 초기에, 희석화된 박테리아 용해물은 제1 탱크에 저장된다. 미세여과(MF) 루프(loop)가 시작되면, 생성물이 생성되어 나오고 미세여과의 결과인 투석유물(retentate)은 순환되어 재사용되며, 한편 미세여과의 투과물은 제2탱크로 이송된다.
적절한 농도에 도달한 후에, 한외여과(UF)루프가 시작된다. 한외여과의 투과물은 용해물(lysate)로부터 가용화된 화합물을 지속적으로 추출하기 위해 제1탱크로 돌아가 재순환되는 반면, 한외여과 투석유물은 제2탱크에 저장된다. 지속적인 추출과정 동안 제1탱크와 제2탱크의 부피는 미세여과 및 한외여과 투과물의 유속을 조정함으로써 조절된다.
몇몇 추출 사이클은 접선유동여과(TFF) 또는 기타 여과방법과 아울러 수행된다. TFF를 사용하는 실시형태에 따르면, 마지막 사이클의 끝에서, 한외여과 루프가 마무리되고, 미세여과루프(MF)는 홀로 계속되며, MF 투과물은 제2탱크로 전달된다.
상기 미세여과루프는 0.1 내지 1.2마이크론의 필터, 예를 들어 0.2 내지 0.65마이크론, 또는 0.45 마이크론의 필터를 사용한다. 대향류(cross-flow)의 유량은 1000 Liters/hours·m2(LHM) 내지 3000 LHM, 예를 들어 1500 내지 2500 LHM 또는 2000 LHM이고, 막전위 압력(trans-membrane pressure,TMP)은 0.6 내지 2bar, 예를 들어 0.8 내지 1.5bar 또는 1.0bar이다. 상기 한외여과루프는 10KDa 내지 1000KDa, 예를 들어 10 내지 100KDa, 또는 10 내지 30KDa 또는 30 내지 100KDa의 필터를 설치하는 것이 바람직하다. 대향류는 30 내지 1000 LHM, 예를 들어 20 내지 500 LHM인 것이 효과적이다. 여기서, 막전위 압력(trans-membrane pressure,TMP)은 0.2 내지 1.5bar, 예를 들어 0.4 내지 1.2bar 또는 0.5bar인 것이 바람직하다.
5 내지 20 사이의 투석 여과 부피(diafiltration volume)가 박테리아 세포벽으로부터 가용화된 화합물을 추출하기 위하여 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 8 내지 15의 부피가 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 일 실시형태에 따라 5 내지 15 사이클의 여과가 실시될 수 있고, 어떤 경우에는 8 내지 15회의 사이클, 즉 8,9,10,11,12,13,14 또는 15사이클이 실시된다.
여과에 이어, 원한다면 상기 추출물은 더욱 희석되거나, 농축되거나 원심분리될 수 있다. 정제단계는 추출물로부터 미립자 물질을 제거하기 위해서 역시 포함될 수 있다. 예를 들어, 0.2마이크론 필터와 같이 더욱 작은 공극 필터를 사용한 보다 정밀한 여과가 추가적으로 수행될 수 있다. 여과 이후에, Lowry에 의하여 측정된 가용화된 단백질의 수율은 예를 들어 50% 이상 또는 60% 이상 또는 60 내지 90%이었다. 여과 이후에, 상기 추출물은 사용을 위한 제형(fomulating) 이전에 감압동결건조(lyophilized)된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 용해 조건의 그룹은 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주에 따라 선택되고 적용될 수 있다. 40 내지 90g/L, 예를 들어 40, 50, 60, 70,80, 또는 90g/L의 헤모필루스 인플루엔자 NCTC 8467는 72 내지 200시간, 예를 들어 72,96, 120, 150 또는 200시간 동안 용해 수행할 수 있다. 10 내지 95g/L, 예를 들어 10, 20, 40, 60, 80, 90, 95g/L의 하나 또는 그 이상의 스트렙토코커스 균주는 72 내지 210시간, 예를 들어 72,96, 120, 150, 200시간 동안 용해될 수 있다. 15 내지 80g/L, 예를 들어 15,20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80g/L의 하나 또는 그 이상의 디플로코커스 균주는 72 내지 210시간, 예를 들어 72,96, 120, 150, 200시간 동안 용해될 수 있다. 10 내지 50g/L, 예를 들어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50g/L의 하나 또는 그 이상의 클렙시엘라 균주는 72 내지 210시간, 예를 들어 72,96, 120, 150, 200시간 동안 용해될 수 있다. 5 내지 60g/L, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60g/L의 하나 또는 그 이상의 네이서리아 균주는 72 내지 210시간, 예를 들어 72,96, 120, 150, 200시간 동안 용해될 수 있다. 30 내지 90g/L, 예를 들어 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90g/L의 하나 또는 그 이상의 스타필로코커스 균주는 72 내지 210시간, 예를 들어 72,96, 120, 150, 200시간 동안 용해될 수 있다. 이들 각각의 실시형태에 있어서, 용해은 35 내지 40℃, 예를 들어 37℃에서 수행될 수 있다.
나아가, "보통의(moderate)" 또는 "강한(strong)" 용해 조건은 각 균주가 추출물을 형성하거나 유사한 균주 간의 그룹을 형성할 때 사용될 수 있다. 여기에 사용되는 "보통의(moderate)" 용해 조건은 수산화이온 농도 0.05 내지 0.4N, 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4N과, 상기와 같이 각각의 균주 타입에 따라 주어진 바이오매스, 시간 및 온도 파라메터(예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자 NCTC 8467의 경우, 35 내지 40℃, 40 내지 90g/L의 바이오매스 및 72 내지 200시간)의 조합을 의미한다. 여기에 사용되는 "강한(strong)" 용해 조건은 수산화이온 농도 0.5 내지 1N, , 예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 및 1.0N과, 상기와 같이 각각의 균주 타입에 따라 주어진 바이오매스, 시간 및 온도 파라메터의 조합을 의미한다. 일 실시형태에 따르면, 생성물들이 서로 혼합되어, 강하고 적절한 조건을 모두 갖춘 용해를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 추출물은 적어도 1그램의 네거티브 및 적어도 1그램의 포지티브 균주와 같이 하나 이상의 박테리아 균주으로부터 얻어질 수 있다. 동일 또는 다른 종 유래의 박테리아 균주는 용해 전후에 혼합될 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 예를 들어, 균주들이 혼합되어, 혼합물 내에서 각각 1 내지 40% 부피를 차지하거나, 각 박테리아 속(genus)에 대한 부피비로 15 내지 30%을 차지한다. 일 실시형태에 따르면, 상기 추출물은 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 10개의 서로 다른 박테리아 속 유래의 용해 생성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 박테리아의 5개 속(genera)의 혼합물은 헤모필루스(Haemophilus), 모라셀라(Moraxella), 크렙시엘라( Klebsiella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 균주를 포함한다. 이 중 스트렙토코커스는 스트렙토코커스 생귀니스( Streptococcus sanguinis), 피로젠(pyrogenes) 및 뉴모니아(pneumoniae)를 포함한다. 어떠한 스트렙토코커스뉴모니아 균주들은 또한 디플로코커스(Diplococcus) 균주으로도 알려져 있다. 이러한 5개 속의 일 실시형태로서의 혼합물은 부피비 5 내지 15%, 예를 들어 7 내지 10% 또는 7,8 또는 9%의 해모필루스; 부피비 5 내지 15%, 예를 들어 7 내지 10% 또는 7, 8 또는 9%의 디플로코커스; 부피비 5 내지 20%, 예를 들어 7 내지 15% 또는 8,9,10,11 또는 12%의 스트렙토코커스; 부피비 10 내지 30%, 예를 들어 15 내지 25% 또는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24%의 클렙시엘라; 부피비 10 내지 30%, 예를 들어 15 내지 25% 또는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24%의 스타필로코커스; 및 부피비 20 내지 40%, 예를 들어 25 내지 35% 또는 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34%의 네이서리아를 포함하여 이루어진다.
박테리아 추출물의 화학적 특성
본 발명의 일 실시형태는 예를 들어, 5 내지 75mg/mL 또는 10 내지 65mg/mL, 20 내지 45mg/mL, 5 내지 40mg/mL 또는 5 내지 20mg/mL, 5 내지 10mg/mL 또는 6 내지 8mg/mL의 단백질을 포함한다. 즉, 5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70 또는 75mg/mL의 수치로부터 단백질 함량 범위의 시작 또는 끝이 정해진다. 1.5 내지 2.5mg/mL 또는 1.5 내지 2mg/mL 또는 2 내지 2.5mg/mL의 자유아미노산(free amino acids, A.A.)을 포함한다. 즉, 1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4 또는 2.5mg/mL의 수치로부터 자유아미노산 함량 범위의 시작 또는 끝이 정해진다. 이는 글루탐산(147.1g/mol)으로부터 계산된다. 또한, 0.3 내지 4.5mg/mL 또는 0.3 내지 4mg/mL, 0.4 내지 4mg/mL, 0.5 내지 3.5mg/mL, 0.6 내지 3mg/mL 또는 0.3 내지 1mg/mL의 다당류 및 단당류를 포함한다. 즉, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0, 3.5, 4.0 또는 4.5mg/mL의 수치로부터 다당류 및 단당류의 함량 범위의 시작 또는 끝이 정해진다. 예를 들면, 0.4 내지 0.5와 같다.
예를 들어, 일 실시형태에 의하면 약 6 내지 8mg/mL의 단백질, 글루탐산(147.1g/mol)으로부터 계산된 1.5 내지 2.5mg/mL의 자유아미노산 및/또는 약 0.4 내지 0.5mg/mL의 다당류 및 단당류를 포함하여 이루어진다. 단백질 농도는 European Pharmacopoeia 2.5.33에 근거한 Lowry assay 방식으로 측정된다. 당(sugar) 농도는 가수분해(acid hydrolysis) 및 데리베티제이션(derivatization) 이후에 D. Herbert el al. Meth. Microbiol. 5B: 266 et seq.(1971)에 근거하여 측정하였다. 글루타메이트(glutamate, 글루탐산) 농도는 아미노산을 이소인돌 유도체(isoindole derivatives)로 전환하여 측정하였으며, Roth M., Fluorescencce reaction for amino acids, Anal. Chem. 43, 880-882에 근거하여, 340nm에서의 흡광도를 측정하였다.
일 실시형태에 따르면, 리물루스 변형세포 용해물(Limulus amoebocyte lysate,LAL) 크로모제닉(chromogenic) 테스트에 근거한 지질다당류(LPS) 당량(equivalents)은 1000ng/ml 이하, 또는 500ng/ml 이하, 200ng/ml 이하, 또는 100ng/ml 이하로 나타났다.
본 발명에 의한 박테리아의 용해는 탈아미노(deamination),탈아미드(deamidation) 및 L형에서 D형으로의 부분적인 라세미화 뿐만 아니라, 단백질의 부분적인 가수분해를 초래할 수 있다. 본 발명에 따른 추출물의 분석연구에서, D-아스파트산(aspartic acid), D-글루탐산, D-세린, D-메티오닌, D-히스티딘, D-알라닌, D-아르기닌, D-페닐알라닌, D-타이로신, D-류신, 및 D-리신을 나타내는 피크가 각각 관찰된다. 상기 연구에서, 이들 종 중의 D-아미노산 비율은 30 내지 80%의 범위이다. 그러므로, 발명의 일 실시형태에 따르면, 세린, 트레오닌(threonine), 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 타이로신, 페닐알라닌, 류신 및 류신 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상 또는 예를 들어 상술한 아미노산 전부, 또는 전부보다는 적은 하나 이상의 선택된 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 페닐알라닌, 및 리신에 대한 라세미화가 가능하다. 일 실시형태에 의하면, 상기 언급된 아미노산 중 하나 또는 그 이상의 적어도 10%가 L로부터 D로 라세미화될 수 있다. 또 다른 실시형태에 의하면, 상기 언급된 아미노산 중 하나 또는 그 이상의 적어도 40%가 라세미화되었다.
본 발명에 의한 박테리아의 용해에 따르면, 가수분해에 의하여 구성 분자들의 분자량이 0 내지 300kDa 또는 0 내지 100kDa, 또는 0 내지 60kDa로 감소하는 결과가 도출된다.
박테리아 추출물의 생물학적 활성( biological activities )
본 발명에 의한 추출물은 호흡기 질환 및 알레르기 반응 또는 증상의 악화에 의하여 고통을 받는 환자를 치료하는데 효과적이다. 본 발명에 따른 추출물은 예를 들어 상부 및 하부 호흡기 감염, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 비인두염(감기, Nasopharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 목 통증(pharyngitis), 편도염 (tonsillitis), 후두염(laryngitis), 기관염(tracheitis), 인후염(laryngopharyngitis), 인플루엔자(influenza), 폐렴(pneumonia) 기관지 폐렴 (bronchopneumonia), 기관지염(bronchitis), lower respiratory infections(하부 호흡기 감염, 폐렴), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 천식(allergic asthma), rhinitis(비염), 급성비인두염(nasopharyngitis), 인두통(pharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 편도염(tonsillitis), 후두염(laryngitis), 인후염(laryngotracheitis), 기관지염(bronchitis), 급성 하부 호흡기 감염을 동반한 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute lower respiratory infection), 급성 악화 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute exacerbation) 치료에 효과적이다.
추출물의 생물학적 활성은 몇 가지 효력검증(assays)에 의하여 평가된다. 예를 들어 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 검사는 PBMC로부터 사이토카인 IL-6의 생산을 검증하며, 면역계를 자극하는 추출물의 효능을 스크린할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에 의하면, PBMC의 상청액(supernatant)에서 측정된 in vitro IL-6 농도가 2000pg/ml 내지 70000pg/ml, 2000pg/ml 내지 50000pg/ml, 2000pg/ml 내지 30000pg/ml, 2000pg/ml 내지 20000pg/ml, 2000pg/ml 내지 10000pg/ml, 또는 5000pg/ml 내지 70000pg/ml, 5000pg/ml 내지 50000pg/ml, 5000pg/ml 내지 30000pg/ml, 5000pg/ml 내지 25000pg/ml, 5000pg/ml 내지 10000pg/ml, 또는 15000pg/ml 내지 25000pg/ml의 범위에서 본 발명의 추출물을 활성화하였다. LPS가 효능제 대조군(agonist control, 0.01 ㎍/ml 단위로)으로 사용될 경우, 그 값은 공여체(donor)에 의존하여 5000pg/ml 내지 70000pg/ml의 범위로 얻을 수 있었다.
생쥐 산화 질소(murine nitric oxide(NO)) 테스트는 역시 면역자극성을 나타내는 생쥐대식세포(murine macrophages)에 의한 산화질소(NO)의 생산을 측정한다. 예를 들어, 대식세포는 침입하는 박테리아를 제거하기 위해 산화질소를 생산한다. 일 실시형태에 따르면, 가용성 건조 중량으로 0.001mg/ml 내지 10mg/ml 농도 범위에서 평가된 본 발명의 실시형태에 의한 in vitro NO의 활성은 3μM 내지 100μM, 3μM 내지 90μM, 3μM 내지 80μM, 3μM 내지 70μM, 3μM 내지 60μM, 3μM 내지 50μM, 3μM 내지 40μM, 3μM 내지 30μM, 3μM 내지 20μM, 3μM 내지 10μM, 5μM 내지 80μM, 5μM 내지 60μM, 5μM 내지 40μM, 5μM 내지 20μM, 10μM 내지 80μM, 10μM 내지 70μM, 10μM 내지 50μM, 10μM 내지 30μM 또는 10μM 내지 15μM, 예를 들어, 시작 또는 끝의 수치가 3,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95 또는 100μM에서 선택되는 범위에 최대한의 반응(maximal response)을 나타내었다.
in vitro에서 생쥐 대식세포 및 인간 말초혈액(peripheral blood)단핵세포에서 관찰된 활성은 용해되는 박테리아 건조 중량 바이오매스의 양(amount)과 같은 변수에 의존한다. 예를 들어, 용해의 "시작물질", 알칼라인 용해의 지속시간 및 용해에 사용된 초기 pH 또는 수산화나트륨의 초기 비율 등이 그러한 변수이다.
PBMC 및 NO 테스트와 같은 in vitro 활성검증방법과 LAL 등에 의한 LPS 농도 결정(평가)의 조합은 주어진 박테리아 추출물에 대한 활성과 독성 리스크의 밸런스에 관련된 정보를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 추출물은 A/PR/8/34(H1N1) 감염 등 공기전파형 인플루엔자(aerosol influenza)바이러스 감염에 대한 활성을 가진다. 연구에 의하면, 예를 들어, 본 발명에 의한 추출물을 쥐에게 10mg/mouse의 투여량으로 투여한 후, 사망률(mortality), 폐 바이러스 적정(lung virus titration), 임상학적 징후(clinical symtoms), 및 항체 적정농도(antibody titers)에 의하여 판단한 결과, 쥐의 체내에서 완전한 면역보호(immunoprotection) 부여할 수 있음을 확인하였다. 반면에, 대조군(control) 동물의 70%만이 감염을 극복하였다.
다른 예로서, 야생형(wild-type) LPS 민감성을 갖는 적어도 8마리의 쥐에게 Salmonella thyphimurium을 주입한 13일 이후 생존률을 검토한 결과, 최초에 10일 동안 본 발명의 실시형태를 유효량 치료받은 생쥐들의 생존률은 최소 60%였다. 공격감염을 위한 살모넬라 티피무리움(Salmonella thyphimurium)의 투여량은, 처치되지 않은 쥐들 또는 물이나 추출물 없이 첨가제를 함유한 블랭크 제형 대조군(blank formulation control)으로 처리된 쥐들이 60% 이하, 예를 들어 50% 이하의 생존율을 나타내도록 선택되어도 좋다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 추출물로 처리된 쥐들의 생존율은 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다.
나아가, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 실시형태들은 화합물 48/80로 인해활성화된(이하, "화합물 48/80-활성화"로 약칭함) 비만세포에 의한 히스타민 분비를 통계적으로 현저한 수준으로 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태들은 화합물 48/80-활성화 비만세포 연구에서, IC-수치가, 예를 들어, 0.0005 내지 0.01mg/mL, 예를 들어 0.0005 내지 0.005mg/mL, 또는 0.001 내지 0.01mg/mL 또는 0.002 내지 0.0081mg/mL 또는 0.004 내지 0.006mg/mL로 나타났다.
박테리아 추출물을 포함하는 조성물
감압동결된 추출물(lyophilized extract)의 혼합물은 최종적인 투여를 위한 다수의 서로 다른 방법으로 조제(formulate)될 수 있다. 예를 들어, 액상 포뮬레이션 이나 에어로졸뿐 아니라, 구강 정제(oral tablet), 캡슐, 알약(pills) 형태로도 제조될 수 있다. 주입(infusion) 또는 주사(injection)을 위한 포뮬레이션으로도 제조될 수 있다. 본 발명의 실시형태들은, 예를 들어 고상의 알약(solid dosage) 형태 또는 액상의 알약 형태로 조제될 수 있다. 대표적인 액상 알약 형태는 예를 들어, 정제(tablet)-즉 코팅된 정제, 씹을 수 있는 정제, 발포정(Effervescent tablets), 설하(舌下)정(sublingual tablet), 과립형(granulates), 분말(powder) 또는 추출물을 함유하며 선택적으로 하나 또는 그 이상의 영양 성분 및/또는 소화를 위한 첨가제를 함유하는 캡슐형을 포함할 수 있다. 고상 알약 형태들은 또한 희석제, 필터, 및/또는 기타 첨가제를 함유할 수 있다. 기타 첨가제 성분들이 방부제(preservative), 착색제, 착향제(flavouring) 및 감미제(sweeteners)로서 첨가될 수 있다. 또한 이를 분말이나 과립형(granulates) 포뮬레이션으로 조제할 수도 있다. 액상 알약 형태들은 구강 투여를 위한 용액형, 시럽형, 서스펜션, 또는 액적(drop)형으로 조제될 수 있다.
도 1: 박테리아 용해 방식을 추종하여 수행되는 박테리아 추출물의 제조를 위한 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF) 시스템의 다이어그램. 본 다이어그램은 필터들에 대한 두 가지의 서로 다른 형태(configuration)를 보인다: 모든 필터들이 동시에 작동하는 병렬모드(parallel mode) 및 필터들이 연속모드(serial mode)로 구성되어 있는 사행(蛇行)모드(serpentine mode)가 그것이다.
도 2a 및 도 2b: 실험예 2.2, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 및 3.10 유래 추출물의 정제된 혼합물의 연속희석(serial dilution)으로 배양된 인간PBMC에 의한 IL-6 및 TNF-α 생성량.
도 3: H1N1 바이러스로 감염된 생쥐의 상기 감염 후 3주 동안의 생존율. Mc Nemar: 10mg 처방 치료를 한 시험군(test*p)=0.023 vs 대조군(control)
도 4: 생쥐 대식세포(murine macrophages) 내의 산화질소 생물정량법(nitric oxide bioassay)에서의 정제된 HAIN 8467 추출물(실험예 2.1, 2.5, 2.8)의 생물학적 활성에 대한 NaOH 농도, 바이오매스의 양(amount of biomass)(건조중량/밀리리터로 표현됨) 및 용해(lysis)의 지속시간(시간)의 영향.
도 5: 디플로코커스뉴모니아 ( Diplococcus pneumonia ) 추출물의 정제된 혼합물의 생쥐 대식세포(murine macrophages) 내의 산화질소 생물정량법(nitric oxide bioassay)(실험예 3.6)
도 6: 생쥐 대식세포(murine macrophages) 내의 산화질소 생물정량법에서의 실험예 3.1 및 실험예 3.3(각각 3a 및 3c)에 의한 추출물의 생물학적 활성.
도 7: 생쥐 대식세포(murine macrophages) 내의 산화질소 생물정량법에서의 실험예 2.2, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 및 3.10에 의한 추출물의 정제된 혼합물의 생물학적 활성
도 8: 화합물 48/80로 인해 활성화된 생쥐 비만 세포(rat mast cell)의 히스타민의 분비에 대한 본 발명에 의한 추출물의 효과
도 9a 및 도 9b: 서로 다른 실험군에 대한 (a) 방광(bladder) 및 (b) 신장(kidney) 조직 내에서의 총평균 균총형성단위(mean total colony forming unit(CFU)).
도 10a 및 도 10b: 쥐의 LPS-둔감성(LPS-insensitive)을 갖는 균주에서의 대장균(Escherichia coli) 감염 모델 내에서의 본 발명의 일 실시형태의 효과. 상기 도면은 (a) markers CD14 vs FoxP3 및 (b)TCR vs Fox를 이용한 세포계수 (cytometry) 데이터를 나타낸다. 좌측의 프레임에는 미치료된 조직을, 우측 프레임에는 치료된 조직을 보여준다.
실시예 1: 박테리아 배양
실시예 1.1: 헤모필루스 인플루엔자 NCTC 8467의 배양
초기 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 3g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone)40g/L; 글루코오스 :6g/L; 이노신(Inosine):0.1g/L; 염화칼슘:0.02g/L; 염화칼륨:0.1g/L; 탄산수소나트륨:0.6g/L;
피루브산나트륨(Sodium pyruvate): 0.06g/L; 금속용액(황산구리:3mg/l; 염화철:830
mg/l;황산아연: 860mg/l; 황산:1.1mg/L):0.5mL/L; 헤민(Hemin):25mg/l; NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 디소듐 염 축소 트리하이드레이트) 25mg/l.
용해(dissolution) 이후에, pH는 7.2로 조정되었다. 배지를 살균한 후, 얼렌마이어 플라스크들(Erlenmeyer flasks)에 동결된 바이얼(frozen vials)의 내용물(1.5mL의 동결 박테리아)을 접종하고, 37℃에서 8시간 동안 배양하였다. 이후, 이 배양액의 분취액(aliquot)을 150mL의 배지를 함유하는 더 큰 얼렌마이어 플라스크들로 이전한 후, 동일한 조건에서 다시 배양하였다. 접종 전에 헤민 50mg/L와 NADH 50mg/L을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 조건에서 1000mL의 배지로써 다른 발효과정을 수행하였다. (10시간 후 10ml 배양액 1에 대한 700nm에서의 OD: 3.7, 11시간 후 1000ml 배양액 2에 대한 OD: 13.5) 그리고, 전체적인 1000ml 배양액 내용물을 선발효배지(Prefermenters)로 이전하였다.
선발효배지에서의 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 3g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone)40g/L; 글루코오스 :6g/L; 이노신(Inosine):0.1g/L; 염화칼슘:0.02g/L; 염화칼륨:0.1g/L; 탄산수소나트륨:0.6g/L;
피루브산나트륨(Sodium pyruvate): 0.06g/L; 금속용액:0.5mL/L; 헤민(Hemin):1mg/l; NADH 10mg/l; 폴리프로필렌글리콜: 0.06 내지 0.10g/L. 배양온도는 교반 및 에어레이션(aeration, 공기주입)을 이용하여 30℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 조절하지 아니하였다.
13시간 후, 2개의 선발효배지들을 발효배지(fermenter)로 이전하였다(6시간 후 배양액 1에 대한 700nm에서의 OD: 1.53, 8.5시간 후 배양액 2에 대한 OD: 1.90). 선발효배지의 배양액을 살균 조건(sterile conditions)하에서 발효배지로 이전하였다.
발효배지에서의 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 3g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone)40g/L; 이노신(Inosine):0.1g/L; 염화칼슘:0.02g/L; 염화칼륨:0.1g/L; 탄산수소나트륨:0.6g/L; 피루브산나트륨(Sodium pyruvate): 0.06g/L; 금속용액:0.5mL/L; 헤민(Hemin):1.5mg/l; NADH 15mg/l; 폴리프로필렌글리콜: 0.02 내지 0.04mL/L.
살균 후, 15g/L 글루코오스를 배양액에 첨가하였다. 배양온도는 교반 및 에어레이션(aeration, 공기주입)을 이용하여 35℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 6.8로 조절하였다. 8시간 후, 배양액(7.25시간 후 배양액 1에 대한 700nm에서의 OD: 3.69, 8.75시간 후 배양액 2에 대한 OD: 3.55)을 90 내지 100℃ 온도로 열처리하여 비활성화시키고 이를 하베스트 탱크(Harvest Tank)로 이전하였다. 일단 비활성화된 후, 배양액을 배지 유래의 바이오매스와 농축액을 분리하기 위하여 원심분리기로 이전하였다. 얻어진 바이오매스를 원심분리기와 연결되어 있는 탱크에 저장하였다. 원심분리(1000l/h)의 잔류물(retentate)을 투과물(혹은 분리된 물질, permeate)이 수거된 저장탱크로 순환시켰다. 바이오매스는 농축되어 살균 탱크로 수거되었다. 3.25시간 후, 31,769g의 바이오매스가 수거되었다. 바이오매스의 700nm에서의 OD는 237.4였다. 상기 바이오매스는 425g 건조 중량의 바이오매스를 함유하는 일련의 분취액(aliquot)으로 분리되었다. 이후, 상기 분취액을 -15℃에서 동결하였다.
실시예 1.2: 스타필로코커스 의 배양
얼렌마이어 플라스크 내의 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 스타필로코커스아우레우스 049(Staphylococcus aureus 049, StAu 049), 스타필로코커스아우레우스 I-050(StAu 050), 스타필로코커스아우레우스 I-051(StAu 051), 스타필로코커스아우레우스 I-052(StAu 052), 스타필로코커스아우레 우스 I-053(StAu 053) 및 스타필로코커스아우 레우스 I- 054(StAu 054)배양을 위한 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 2g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone): 40g/L; 글루코오스:6g/L.
이후, 0.012L의 배지를 1.5mL의 동결 바이러스로 접종하였다. 상기 배양액을 180rpm 및 pH 6.9 조건하에서 교반하며 37℃에서 7시간 동안 배양하였다. 12에서 1000mL까지의 일련의 배양단계를 수행하였다.
선발효배지에서의 배양조건
선발효배지을 위해서는 폴리프로필렌글리콜: 0.06 내지 0.10mL/L을 더 첨가한 것을 제외하고는 선행 단계에서와 동일한 배지를 준비하였다. 배지를 in situ 123℃에서 30분 동안 살균하였다. 선행단계에서 1000ml의 배양액을 교반 및 에어레이션 작업을 수행하면서 선발효배지로 이전하였다. 배양 온도는 37±2℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 조절하지 아니하였다. 6시간 후, 2개의 선발효배지들을 발효배지(fermenter)로 이전하였다.
발효배지에서의 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 StAu 049에 대한 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 2g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone) 40g/L; 폴리프로필렌글리콜: 0.04mL/L. 상기 배지를 in situ에서 살균하였다. 살균 후, 14g/L 글루코오스를 배양액에 첨가하였다. 배양온도는 교반 및 에어레이션(aeration, 공기주입)을 이용하여 37℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 6.4±0.5로 조절하였다. 7시간 후, 배양액을 90 내지 100℃ 온도로 열처리하여 비활성화시키고 이를 하베스트 탱크(Harvest Tank)로 이전하였다. 바이오매스는 이후 원심분리에 의하여 상기 배지로부터 분리되었다. 상기 바이오매스는 소정량의 건조중량 바이오매스를 함유하는 일련의 분취액(aliquot)으로 분리되었다.
각각의 분취액에서의 바이오매스 건조중량은: StAu 049: 327g, StAu 050: 297g, StAu 051: 375g, StAu 052: 363g, StAu 053: 446g 및 StAu 054: 365g이었다.
실시예 1.3: 크렙시엘라 의 배양
초기 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 크렙시엘라뉴모니아 NCTC 5050(Klebsiella pneumoniae NCTC 5050, Klba 5050), 크렙시엘라뉴모니아 NCTC 5056(Klebsiella pneumoniae NCTC 5056, Klba 5056), 및 크렙시엘라뉴모니아 NCTC 204(Klebsiella pneumoniae NCTC 204, Klba 204)의 배양을 위한 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 2g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone): 40g/L; 글루코오스:6g/L.
이후, 0.012L의 배지를 1.5mL의 동결 바이러스로 접종하였다. 상기 배양액을 초기설정 pH 6.9 조건하에서 교반하며 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 0.012에서 1.0L까지의 일련의 배양단계를 수행하였다.
선발효배지에서의 배양조건
폴리프로필렌글리콜: 0.06mL/L을 더 첨가한 것을 제외하고는 선행 단계에서와 동일한 배지를 준비하였다. 선행단계에서의 1리터의 배양액을 교반 및 에어레이션 작업을 수행하면서 선발효배지로 이전하였다. 배양 온도는 37℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 조절하지 아니하였다. 6시간 후, 2개의 선발효배지들을 발효배지(fermenter)로 이전하였다.
발효배지에서의 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 Klba 5050에 대한 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 2g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone) 40g/L; 폴리프로필렌글리콜: 0.04g/L. 상기 배지를 in situ에서 살균하였다. 살균 후, 21g/L 글 루코오스를 배양액에 첨가하였다. 배양온도는 교반 및 에어레이션(aeration, 공기주입)을 이용하여 37℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 6.6으로 조절하였다. 8시간 후, 배양액을 90 내지 100℃ 온도로 열처리하여 비활성화시키고 이를 하베스트 탱크(Harvest Tank)로 이전하였다. 바이오매스는 이후 원심분리에 의하여 상기 배지로부터 분리되었다. 각각의 분취액에서의 바이오매스 건조중량은: Klba 5050: 393g, Klba 5056:455g 및 Klba 204: 440g이었다.
실시예 1.4: 몰라셀라 의 배양
초기 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 모라셀라카타랄리스 NCTC 3622(Moraxella(Branhamella)catarrhalis NCTC 3622, NeCa 3622), 모라셀라카타랄 리스 NCTC 3625( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis NCTC 3625, NeCa 3625), 모라 셀라카타랄리스 I-045( Moraxella catarrhalis I-045, NeCa I045)의 배양을 위한 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 3g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone): 40g/L; 전분 0.1g/L; 이노신: 0.1g/L; 염화칼슘:0.02g/L; 염화칼륨:0.1g/L; 탄산수소나트륨:0.6g/L; 피루브산나트륨(Sodium pyruvate): 0.06g/L; 금속용액:0.5mL/L ( 금속용액 조성물: 황산구리:3mg/l; 염화철:830mg/l; 황산아연: 860mg/l; 황산:1.1mg/L); 디펩티드 ALA-GLN(0.9% NaCl 용액 내에서 200mg/mL): 10mg/L(최초 배양단계에서 50mg/L; 1L 배양단계에서 10mg/L).
이후, 0.012L의 배지를 1.5mL의 동결 바이러스로 접종하였다. 상기 배양액을 초기설정 pH 7.2 조건하에서 교반하며 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 0.012에서 1.0L까지의 일련의 배양단계를 수행하였다.
선발효배지에서의 배양조건
폴리프로필렌글리콜: 0.06 내지 0.10mL/L을 더 첨가하고, ALA-GLN의 농도를 4mg/L로 한 것을 제외하고는 선행 단계에서와 동일한 배지를 준비하였다. 배지는 in situ에서 살균되었다. 선행단계에서의 1리터의 배양액을 선발효배지로 이전하였다. 배양 온도는 교반 및 에어레이션을 통해 33℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 조절하지 아니하였다. 10시간 후, 2개의 선발효배지들을 발효배지(fermenter)로 이전하였다.
발효배지에서의 배양조건
프로필렌글리콜 0.06mL/L을 첨가하고 ALA-GLN 또는 글루코오스를 배제한 것을 제외하고는 선발효배지 제조를 위한 얼런마이어 단계와 동일한 배지를 사용하였다. 배양온도는 교반 및 에어레이션(aeration, 공기주입)을 이용하여 33℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 조절하지 아니하였다. 10.5시간 후, 배양액을 90 내지 100℃ 온도로 열처리하여 비활성화시키고 이를 하베스트 탱크(Harvest Tank)로 이전하였다. 바이오매스는 이후 원심분리에 의하여 상기 배지로부터 분리되었다. 각각의 분취액에서의 바이오매스 건조중량은: NeCa 3622: 361g; NeCa 3625: 351g; NeCa 045: 223g이었다.
실시예 1.5: 스트렙토코코스 의 배양
초기 배양조건
정화된 물에 다음 성분들을 용해하여 스트렙토코커스뉴모니아 NTCT 7465(Streptococcus pneumoniae NTCT 7465, StPn 7465), 스트렙토코커스뉴모니아 NTCT 7466( Streptococcus pneumoniae NTCT 7466, StPn 7466), 스트렙토코커스뉴모 니아 7978( Streptococcus pneumoniae NTCT 7978, StPn 7978), 스트렙토코커스뉴모 니아 NTCT 10319( Streptococcus pneumoniae NTCT 10319, StPn 10319), 스트렙토코 커스생귀니스 I-046( Streptococcus sanguinis I-046, StSa 046), 스트렙토코커스생 귀니스 I-047( Streptococcussanguinis I-047, StSa 047), 스트렙토코커스생귀니스 I-043(Streptococcussanguinis I-048, StSa 048), 스트렙토코커스피로젠 NTCT 8191(Streptococcus pyogenes NTCT 8191, StPy 8191)의 배양을 위한 배지를 준비하였다: 염화나트륨(Sodium Chloride): 2g/L; 인산 일수소 나트륨(sodium monohydrogen phosphate): 2g/L; 소듐아세테이트: 0.5g/L; 콩 펩톤(Soya peptone): 40g/L; 글루코오스: 6g/L; 말 혈청: 50mL/L.
이후, 0.012L의 배지를 1.5mL의 동결 바이러스로 접종하였다. 상기 배양액을 교반하며 37℃에서 14시간 동안 배양하였다. 그리고, 10mL의 상기 배양액을 150mL의 배지를 함유하는 플라스크에 이전하고 동일한 조건하에서 10시간 동안 재배양하였다. 마지막 단계는 선배양배지로 옮겨지기 전에 20mL/L 말 혈청(Horse Serum)과 1000mL의 배지를 함유하는 더 큰 플라스크 내에서 동일한 조건하에 수행하였다.
선발효배지에서의 배양조건
폴리프로필렌글리콜: 0.06mL/L를 더 첨가하고, 말 혈청의 농도를 8mL/L로 한 것을 제외하고는 선행 단계에서와 동일한 배지를 준비하였다. 선행단계에서의 1리터의 배양액을 2개의 선발효배지로 이전하였다. 배양 온도는 교반을 통해 30℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 조절하지 아니하였다. 14시간 후, 2개의 선발효배지들을 발효배지(fermenter)로 이전하였다.
발효배지에서의 배양조건
프로필렌글리콜 0.06mL/L을 첨가하고 말 혈청의 농도를 1.2mL/L로 한 것을 제외하고는 선발효배지 제조를 위한 얼런마이어 단계와 동일한 배지를 사용하였다. 글루코오스 15.75kg이 배양과정에서 첨가되었다. 배양온도는 교반을 이용하여 37℃로 조절하였다. pH는 배양이 진행되는 동안 농축 KOH를 이용하여 6.4로 조절하였다. 9.25시간 후, 배양액을 90 내지 100℃ 온도로 열처리하여 비활성화시키고 이를 하베스트 탱크(Harvest Tank)로 이전하였다. 바이오매스는 이후 원심분리에 의하여 상기 배지로부터 분리되었다. StSa 046, StSa 047, StSa 048 및 StPy 8191에는 무균 공기(sterile air)가 주입되었고(aerated), 배양액에는 추가적인 말 혈청을 필요로 하지 않았다. 각각의 분취액에서의 바이오매스 건조중량은: StPn 7465: 134g; StPn 7466: 142g; StPn 7978: 134g; StPn 10319: 153g; StSa 046: 246g; StSa 047: 232g; StSa 048: 353g; 및 StPy 8191: 269g 이었다.
실시예 2: 박테리아 용해( Bacterial Lysis )
HAIN 8467 실시예 2.1
실시예 1.1에 의한 발효로부터 얻어진 박테리아 바이오매스 HaIn 8467의 분취액(Aliquots)을 실온에서 해동시키고 염류 용액(saline solution)으로 희석한 결과(8g/L NaCl), 79g/L 건조중량이 되었다. 0.2M NaOH에서의 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 120시간 동안 수행되었다. 용해가 진행되는 동안, pH가 0.5 pH 유닛 이상 감소되지 않도록 모니터하였다.
결과. 가용화된 건조중량(solubilized dry weight, SDW) 82.2mg/mL및 단백질(Prot) 32.4mg/mL, 글루탐산(147.1g/mol)에 의한 계산에 의거하여 전체 아미노산(A.A) 6.2mg/mL, OPA에 의하여 측정함, OPA에 의해 측정된 감소하는 당(reducing sugars)(탄수화물) 2.40mg/mL.
단백질 농도(Prot)를 Lowry assay(European Pharmacopoeia 2.5.33, under "total protein-method 2" 참조)에 의하여 측정하였다. 총 자유 아미노산 농도(total free amino acid concentration)는 Roth M.Fluorescence reaction for amino acids, Anal.Chem., 43, 880-882,(1971)에 의거하여 아미노산을 이소인돌 유도체로 전환시키고, 340nm에서의 흡수광 측정을 통해 측정하였다. 결과는 글루탐산의 당량으로 표현된다. 당(탄수화물) 농도는 D. Herbert el al. Meth. Microbiol. 5B: 266 et seq.(1971)에 의거하여, 가수분해 및 데리베티제이션(derivatization) 이후에 평가하였다.
HAIN 8467 실시예 2.2
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 58.2g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 5일 동안 수행되었다. 용해가 진행되는 동안, pH가 0.5 pH 유닛 이상 감소되지 않도록 모니터하였다. (가용화된 건조중량(solubilized dry weight, SDW): 70.0mg/mL; Lowry Protein(Prot): 30.0mg/mL; 아미노산(A.A) 6.0mg/mL; 탄수화물: 2.60mg/mL) 활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 18.7μM, C2: 20.8μM, C3: 12.1μM.
HAIN 8467 실시예 2.3
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 20g/L로 희석하였다. 0.045M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 5일 동안 수행되었다(SDW: 29.99mg/mL; Prot: 4.8mg/mL; 탄수화물: 0.2mg/mL).
HAIN 8467 실시예 2.4
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 12.5g/L로 희석하였다. 0.05M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다(SDW: 11.2mg/mL; Prot<0.2mg/mL; A.A: 2.0mg/mL; 탄수화물: 0.4mg/mL). D-아미노산 비율: 15% D-Ala, 9% D-Leu, 45% D-Ser, 21% D-Asx, 15% D-Met, 11% D-Phe, 9% D-Glx.
HAIN 8467 실시예 2.5
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 127g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다(SDW: 157.2mg/mL; Prot: 86mg/mL; A.A: 20.0mg/mL; 탄수화물: 4.0mg/mL). D-아미노산 비율: 22% D-Ala, 11% D-Leu, 54% D-Ser, 41% D-Asx, 35% D-Met, 32% D-Phe, 29% D-Glx, 6% D-Tyr.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 9.1μM, C2: 18.5μM, C3: 3.1μM.
HAIN 8467 실시예 2.6
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 12.5g/L로 희석하였다. 0.05M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 3일 동안 수행되었다.(SDW: 10.8mg/mL; Prot: 0.5mg/mL 미만; A.A: 2.0mg/mL; 탄수화물: 0.4mg/mL). D-아미노산 비율: 10% D-Ala, 9% D-Leu, 56% D-Ser, 22% D-Asx, 16% D-Met, 13% D-Phe, 11% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 20.1μM, C2: 26.7μM, C3: 4.3μM.
HAIN 8467 실시예 2.7
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 127g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 3일 동안 수행되었다(SDW: 168.8mg/mL; Prot: 90mg/mL; A.A: 22mg/mL; 탄수화물: 4.2mg/mL). D-아미노산 비율: 36% D-Ala, 8% D-Leu, 9% D-Ser, 44% D-Asx, 42% D-Met, 37% D-Phe, 37% D-Glx, 37% D-Tyr.
HAIN 8467 실시예 2.8
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 12.5g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 47.2mg/mL; Prot: 0.2mg/mL 미만; A.A: 4.0mg/mL; 탄수화물: 0.2mg/mL). D-아미노산 비율: 3% D-Ala, 13% D-Leu, 54% D-Ser, 45% D-Asx, 43% D-Met, 42% D-Phe, 41% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 7.5μM, C2: 16.0μM, C3: 8.6μM.
HAIN 8467 실시예 2.9
실시예 1.1에 의한 바이오매스를 127g/L로 희석하였다. 0.05M NaOH에서 알칼 리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 196시간 동안 수행되었다. D-아미노산 비율: 14% D-Ala, 5% D-Asx, 11% D-Met, 5% D-Glx.
STPY 8191 실시예 2.10
실시예 1.5에 의한 269g의 박테리아 물질을 함유하는 StPy의 분취액(Aliquots)을 실온에서 해동시키고 염류 용액(saline solution)으로 희석한 결과(8g/L NaCl), 59.8g/L 건조중량이 되었다. 0.2M NaOH에서의 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 192시간 동안 수행되었다. 용해가 진행되는 동안, pH가 0.5 pH 유닛 이상 감소되지 않도록 모니터하였다(SDW: 61.92mg/mL; Prot: 31.68mg/mL; A.A: 7.2mg/mL; 탄수화물: 7.2mg/mL). D-아미노산 비율: 22% D-Ala, 11% D-Leu, 54% D-Ser, 41% D-Asx, 35% D-Met, 32% D-Phe, 29% D-Glx, 6% D-Tyr.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 4.9μM, C2: 11.8μM, C3: 6.7μM.
STSA 046 실시예 2.11
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 30g/L로 희석하였다. 0.022M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.
STPY 8191 실시예 2.12
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 100g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다(SDW: 120.2mg/mL; Prot: 45.6mg/mL; A.A: 15.2mg/mL; 탄수화물: 2.8mg/mL). D-아미노산 비율: 35% D-Ala, 13% D-Leu, 57% D-Ser, 44% D-Asx, 40% D-Met, 39% D-Phe, 43% D-Glx.
STPY 8191 실시예 2.13
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 12.7g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다(SDW: 12.5mg/mL; Prot<0.2mg/mL; A.A: 0.8mg/mL; 탄수화물: 0.1mg/mL). D-아미노산 비율: 24% D-Ala, 13% D-Leu, 52% D-Ser, 28% D-Asx, 8% D-Met, 8% D-Phe, 23% D-Glx, 6% D-Tyr.
STPY 8191 실시예 2.14
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 100g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다(SDW: 41.4mg/mL; Prot: 3.2mg/mL; A.A: 4mg/mL; 탄수화물: 1.5mg/mL)
STPY 8191 실시예 2.15
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 12.7g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다(SDW: 52.5mg/mL; Prot: 0.8mg/mL; A.A: 3.2mg/mL; 탄수화물: 0.6mg/mL)
STPY 8191 실시예 2.16
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 100g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 147.2mg/mL; Prot: 53.6mg/mL; A.A: 24.8mg/mL; 탄수화물: 5.4mg/mL). D-아미노산 비율: 44% D-Ala, 26% D-Leu, 11% D-Ser, 45% D-Asx, 43% D-Met, 42% D-Phe, 46% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 9.7μM, C2: 17.4μM, C3: 2.5μM.
STPY 8191 실시예 2.17
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 12.7g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 14.7mg/mL; Prot: 0mg/mL; A.A: 0.8mg/mL; 탄수화물: 0.2mg/mL). D-아미노산 비율: 28% D-Ala, 9% D-Ser, 36% D-Asx, 33% D-Met, 32% D-Phe, 31% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 5.8μM, C2: 12.1μM, C3: 6.8μM.
STSA 046 실시예 2.18
실시예 1에 의한 바이오매스를 68g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 90.72mg/mL; Prot: 47.68mg/mL; A.A: 9.36mg/mL; 탄수화물: 2.48mg/mL).
STSA 047 실시예 2.19
실시예 1에 의한 바이오매스를 68g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.
STSA 047 실시예 2.20
실시예 1에 의한 바이오매스를 60g/L로 희석하였다. 0.33M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.
STSA 048 실시예 2.21
실시예 1에 의한 바이오매스를 62g/L로 희석하였다. 0.33M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.
STPY 8191 실시예 2.22
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 55g/L로 희석하였다. 0.33M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 4일 동안 수행되었다.
STPN 7978 실시예 2.23
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 38.7g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 66.4mg/mL; Prot: 25.4mg/mL; A.A: 6.0mg/mL; 탄수화물: 2.5mg/mL). D-아미노산 비율: 28% D-Ala, 9% D-Ser, 36% D-Asx, 33% D-Met, 32% D-Phe, 31% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 10.2μM, C2: 20.7μM, C3: 20.8μM.
STPN 7978 실시예 2.24
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 30g/L로 희석하였다. 0.022M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 30.4mg/mL; Prot: 2.20mg/mL; 탄수화물: 0.40mg/mL).
STPN 7978 실시예 2.25
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 60g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 59mg/mL; Prot: 17mg/mL; A.A: 7.0mg/mL; 탄수화물: 1.8mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 9.1μM, C2: 13.4μM, C3: 1.4μM.
STPN 7978 실시예 2.26
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 12.5g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 17.8mg/mL; Prot<0.2mg/mL; A.A: 2.0mg/mL; 탄수화물: 0.7mg/mL).
STPN 7978 실시예 2.27
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 60g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 43.6mg/mL; Prot: 6mg/mL; A.A: 10mg/mL; 탄수화물: 1.5mg/mL).
STPN 7978 실시예 2.28
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 12.5g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 55.4mg/mL; Prot: 2mg/mL; A.A: 4mg/mL; 탄수화물: 0.7mg/mL).
STPN 7978 실시예 2.29
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 60g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 118.4mg/mL; Prot: 31mg/mL; A.A: 19mg/mL; 탄수화물:4.1mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 5.8μM, C2: 12.1μM, C3: 2.8μM.
STPN 7978 실시예 2.30
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 12.5g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 18.4mg/mL; Prot<0.2mg/mL; A.A: 2.0mg/mL; 탄수화물: 0.5mg/mL).
STPN 7465 실시예 2.31
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 52.5g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 69.4mg/mL; Prot: 32.3mg/mL; A.A: 6.0mg/mL; 탄수화물:1.7mg/mL).
STPN 7466 실시예 2.32
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 40.0g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 60.6mg/mL; Prot: 29.0mg/mL; A.A: 6.0mg/mL; 탄수화물:1.50mg/mL).
STPN 10319 실시예 2.33
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 41.2g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알 칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 60.4mg/mL; Prot: 28.4mg/mL; A.A: 6.0mg/mL; 탄수화물:1.1mg/mL).
STSA 046 실시예 2.34
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 58.9g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 83.2mg/mL; Prot: 7.2mg/mL; A.A: 8.39mg/mL; 탄수화물:2.16mg/mL).
STSA 047 실시예 2.35
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 50.4g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 60.64mg/mL; Prot: 27.92mg/mL; A.A: 7.2mg/mL; 탄수화물:3.52mg/mL).
STSA 048 실시예 2.36
실시예 1.5에 의한 바이오매스를 66.2g/L로 희석하였다. 0.25M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 72.96mg/mL; Prot: 36.162mg/mL; A.A: 7.2mg/mL; 탄수화물:3.28mg/mL).
NECA I045 실시예 2.37
실시예 1.4에 의한 223g의 박테리아 물질을 함유하는 NECA I045의 분취액(Aliquots)을 실온에서 해동시키고 염류 용액(saline solution)으로 희석한 결과(8g/L NaCl), 22.8g/L 건조중량이 되었다. 0.2M NaOH에서의 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 192시간 동안 수행되었다. 용해가 진행되는 동안, pH가 0.5 pH 유닛 이상 감소되지 않도록 모니터하였다(SDW: 41.29mg/mL; Prot: 17.45mg/mL; A.A: 3.41mg/mL; 탄수화물: 3.4mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 4.2μM, C2: 14.8μM, C3: 13.4μM.
NECA I045 실시예 2.38
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 20.5g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 3일 동안 수행되었다.(SDW: 36.6mg/mL; Prot: 16.4mg/mL; A.A: 3.63mg/mL; 탄수화물:0.77mg/mL).
NECA I045 실시예 2.39
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 51.0g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 75.69mg/mL; Prot: 30.8mg/mL; A.A: 10.8mg/mL; 탄수화물:1.14mg/mL). D-아미노산 비율: 40% D-Ala, 40% D-Asx, 42% D-Met, 40% D-Phe, 46% D-Glx. 48% D-Lys.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 4.9μM, C2: 14.3μM, C3: 3.6μM.
NECA I045 실시예 2.40
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 15.08mg/mL; Prot: 7.7mg/mL; A.A: 1.5mg/mL; 탄수화물:0.28mg/mL). D-아미노산 비율: 21% D-Ala, 67% D-Ser, 31% D-Asx, 25% D-Met, 12% D-Lys.
NECA I045 실시예 2.41
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 51.0g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 41.23mg/mL; Prot: 26.2mg/mL; A.A: 4.6mg/mL; 탄수화물:0.98mg/mL).
NECA I045 실시예 2.42
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 48.43mg/mL; Prot: 7.7mg/mL; A.A: 4.3mg/mL; 탄수화물:0.22mg/mL).
NECA I045 실시예 2.43
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 51.0g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 83.02mg/mL; Prot: 28.9mg/mL; A.A: 15mg/mL; 탄수화물:1.11mg/mL). D-아미노산 비율: 44% D-Ala, 48% D-Ser, 47% D-Asx, 45% D-Met, 43% D-Phe, 50% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 5.1μM, C2: 12.0μM, C3: 7.5μM.
NECA I045 실시예 2.44
실시예 1.4에 의한 바이오매스를13g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 15.26mg/mL; Prot: 8.6mg/mL; A.A: 1.8mg/mL; 탄수화물:0.22mg/mL). D-아미노산 비율: 31% D-Ala, 42% D-Ser, 38% D-Asx, 36% D-Met, 35% D-Phe, 37% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 4.1μM, C2: 13.9μM, C3: 6.0μM.
NECA I045 실시예 2.45
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 9g/L로 희석하였다. 0.066M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 20.62mg/mL; Prot: 5.57mg/mL; 탄수화물:0.06mg/mL).
NECA NCTC 3622 실시예 2.46
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 20.1g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 35.69mg/mL; Prot: 14.25mg/mL; A.A: 3.4mg/mL; 탄수화물:0.71mg/mL).
NECA NCTC 3625 실시예 2.47
실시예 1.4에 의한 바이오매스를 9.7g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내 지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 38.83mg/mL; Prot: 15.54mg/mL; A.A: 3.4mg/mL; 탄수화물:0.95mg/mL).
KLPN 204 실시예 2.48
실시예 1.3에 의한 440g의 박테리아 물질을 함유하는 KlPn 204의 분취액(Aliquots)을 실온에서 해동시키고 염류 용액(saline solution)으로 희석한 결과(8g/L NaCl), 37.7g/L 건조중량이 되었다. 0.2M NaOH에서의 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 192시간 동안 수행되었다. 용해가 진행되는 동안, pH가 0.5 pH 유닛 이상 감소되지 않도록 모니터하였다(SDW: 51.77mg/mL; Prot: 27.66mg/mL; A.A: 4.2mg/mL; 탄수화물: 1.03mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.6μM, C2: 2.8μM, C3: 1.8μM.
KLPN 204 실시예 2.49
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 9g/L로 희석하였다. 0.013M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 25.71mg/mL; Prot: 4.91mg/mL; 탄수화물:0.51mg/mL).
KLPN 204 실시예 2.50
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 99g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 50.63mg/mL; Prot: 15.4mg/mL; A.A: 2.9mg/mL; 탄수화물:2.1mg/mL). D-아미노산 비율: 5% D-Ala, 6% D-Asx.
KLPN 204 실시예 2.51
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 52.69mg/mL; Prot: 5.7g/mL; A.A: 2.3mg/mL; 탄수화물:0.3mg/mL). D-아미노산 비율: 36% D-Ala, 8% D-Ser, 45% D-Asx, 7% D-Met, 27% D-Phe, 40% D-Glx, 29% D-Lys.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.5μM, C2: 0.8μM, C3: 6.0μM.
KLPN 204 실시예 2.52
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 99g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 136.34mg/mL; Prot: 58.9g/mL; A.A: 20.6mg/mL; 탄수화물: 3.4mg/mL).
KLPN 204 실시예 2.53
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 18.06mg/mL; Prot: 6.3g/mL; A.A: 1.1mg/mL; 탄수화물:0.3mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.5μM, C2: 1.6μM, C3: 1.9μM.
KLPN 204 실시예 2.54
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 99g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 58.06mg/mL; Prot: 20g/mL; A.A: 4.6mg/mL; 탄수화물:2.7mg/mL).
KLPN 204 실시예 2.55
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 52.57mg/mL; Prot: 5.7g/mL; A.A: 4.0mg/mL; 탄수화물:0.3mg/mL). D-아미노산 비율: 43% D-Ala, 25% Val, 5% D-Ser, 46% D-Asx, 46% D-Met, 45% D-Phe, 44% D-Glx, 38% D-Lys.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.5μM, C2: 0.6μM, C3: 2.6μM.
KLPN 5056 실시예 2.56
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 39.4g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 52.69mg/mL; Prot: 27.83g/mL; A.A: 4.0mg/mL; 탄수화물:1.09mg/mL).
KLPN 5050 실시예 2.57
실시예 1.3에 의한 바이오매스를 34.2g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 48.23mg/mL; Prot: 26.57g/mL; A.A: 4.0mg/mL; 탄수화물: 1.03mg/mL).
STAU I051 실시예 2.58
실시예 1.2에 의한 375g의 박테리아 물질을 함유하는 StAu I051의 분취액(Aliquots)을 실온에서 해동시키고 염류 용액(saline solution)으로 희석한 결과(8g/L NaCl), 55.2g/L 건조중량이 되었다. 0.2M NaOH에서의 알칼리 화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 192시간 동안 수행되었다. 용해가 진행되는 동안, pH가 0.5 pH 유닛 이상 감소되지 않도록 모니터하였다(SDW: 66.4mg/mL; Prot: 34.08mg/mL; A.A: 6.4mg/mL; 탄수화물: 0.64mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.6μM, C2: 0.8μM, C3: 1.4μM.
STAU I051 실시예 2.59
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 51g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 9일 동안 수행되었다.(SDW: 65.31mg/mL; Prot: 25.56g/mL; A.A: 6.57mg/mL; 탄수화물: 0.98mg/mL).
STAU I051 실시예 2.60
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 81g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 2일 동안 수행되었다.(SDW: 137.2mg/mL; Prot: 51.2g/mL; A.A: 20.8mg/mL; 탄수화물: 1.6mg/mL). D-아미노산 비율: 51% D-Ala, 11% D-Ser, 43% D-Asx, 37% D-Met, 35% D-Phe, 43% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.6μM, C2: 0.8μM, C3: 1.3μM.
STAU I051 실시예 2.61
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 55.7mg/mL; Prot: 4.8g/mL; A.A: 4.8mg/mL; 탄수화물: 0.2mg/mL).
STAU I051 실시예 2.62
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 81g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 130.1mg/mL; Prot: 47.2g/mL; A.A: 24.8mg/mL; 탄수화물: 1.4mg/mL).
STAU I051 실시예 2.63
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 18.4mg/mL; Prot: 4.8g/mL; A.A: 2.4mg/mL; 탄수화물: 0.2mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.5μM, C2: 0.6μM, C3: 1.3μM.
STAU I051 실시예 2.64
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 81g/L로 희석하였다. 0.7M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 134.6mg/mL; Prot: 48g/mL; A.A: 25.6mg/mL; 탄수화물: 1.5mg/mL). D-아미노산 비율: 56% D-Ala, 10% D-Ser, 45% D-Asx, 42% D-Met, 39% D-Phe, 73% D-Tyr, 49% D-Glx.
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.6μM, C2: 0.7μM, C3: 1.1μM.
STAU I051 실시예 2.65
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 13g/L로 희석하였다. 0.1M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 10일 동안 수행되었다.(SDW: 17.9mg/mL; Prot: 5.6g/mL; A.A: 2.4mg/mL; 탄수화물: 0.2mg/mL).
활성 건조중량/mL 중의 NOx 생성물(mg), 0.02mg/mL(C1), 0.2mg/mL(C2), 2.0mg/mL(C3): C1: 0.5μM, C2: 0.6μM, C3: 3.7μM.
STAU I049 실시예 2.66
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 52.8g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 70.08mg/mL; Prot: 34.4g/mL; A.A: 6.4mg/mL; 탄수화물: 0.64mg/mL).
STAU I050 실시예 2.67
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 47.5g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 64.32mg/mL; Prot: 32.24g/mL; A.A: 6.4mg/mL; 탄수화물: 0.64mg/mL).
STAU I050 실시예 2.68
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 48.5g/L로 희석하였다. 0.033M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.
STAU I052 실시예 2.69
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 56.9g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 62.72mg/mL; Prot: 30.8g/mL; A.A: 6.4mg/mL; 탄수화물: 0.72mg/mL).
STAU I053 실시예 2.70
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 67.3g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 68.8mg/mL; Prot: 32.24g/mL; A.A: 6.4mg/mL; 탄수화물: 1.2mg/mL).
STAU I050 실시예 2.71
실시예 1.2에 의한 바이오매스를 63.6g/L로 희석하였다. 0.2M NaOH에서 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해(lysis)는 연속적인 교반하에 35 내지 40℃에서 8일 동안 수행되었다.(SDW: 68.96mg/mL; Prot: 24.56g/mL; A.A: 6.4mg/mL; 탄수화물: 2.56mg/mL).
실시예 3: 용해물의 정제
실시예 3.1: 그램 네거티브 및 그램 포지티브 균주의 정화된 추출물
실시예 2.57 2L와 실시예 2.66 2L를 서로 혼합한다. pH는 농축된 HCl을 첨가하여 12.0으로 조정하였으며, 상기 혼합물을 8g/L의 NaCl 용액 2L로 희석하였다. 상기 희석화된 혼합물을 미세여과(microfiltration, MF) 탱크로 이전하였다. 상기 미세여과 장치는 사행모드(serpentine mode)에서 0.45마이크론 접선 유동 여과필 터(PALL Procette PES 0.45micron)를 사용한다(도 1). 대향류(cross flow)는 2000L/h m2(LHM)으로, 막전위 압력(trans-membrane pressure,TMP)을 1.3bar로 조절하였다. 상기 정밀투과에 의한 투과물(permeate)은 한외여과(ultrafiltration, UF) 탱크로 이송되었다.
일단 미세여과탱크 내의 상기 혼합물의 부피가 초기 부피의 절반에 이를 경우, 상기 UF장치가 작동된다. 상기 한외여과장치로는 30kDa 접선 유동 여과필터(PALL Centrasette PES 30kDa)를 사용하였다. 상기 대향류는 1000LHM으로, TMP는 0.5bar로 조절하였다.
상기 MF 및 UF 탱크의 내부 부피는 동일 수준으로 유지하였다. 각각의 투석 여과 부피(diafiltration volume)에서, 상기 단백질 농도를 Bradford method에 의해 측정하였다. [Bradford method는 해당 기술분야에 있어서 표준으로 사용되는 것이다. 상기 방법을 다른 방식으로 사용하는 것이 현저하게 다른 결과를 도출하지 않는다면, 참고문헌을 인용할 필요가 없을 것이다] UF 탱크에서 1 투석 여과 부피(diafiltration volume, DFV) 이후에 상기 Bradford 단백질 내용물은 26.8mg/mL였고, 4DFV 이후에는 34.8mg/mL, 9DFV 이후에는 37.2mg/mL였다. 투석여과가 진행되는 동안의 미세여과의 투과물 플럭스는 15LHM이었다. 14투석 여과 부피(DFV) 이후에, 상기 UF는 작동을 멈추었으며, 생성물은 MF 탱크 내부에 집중되었다. 상기 생성물은 15.0mg/mL 단백질을 함유하였다. 이후 상기 생성물을 0.2마이크론 살균 필터를 통과하여 7.4mg/mL로 희석되었다. (가용화된 건조 잔류물(solubilized dry residue, SDR)): 21.0mg/mL, Prot: 7.4mg/mL, A.A: 1.2mg/mL, 당질(glucides)(탄수화물): 0.3mg/mL, 염소: 4.6mg/mL.) Lowry 단백질 중의 mg NOx 생성물(mg/mL), 0.03mg/mL(C1), 0.3mg/mL(C2), 및 3.0mg/mL(C3): C1: 5.8μM, C2: 11.4μM, C3: 1.2μM
실시예 3.2: Klba 단일 균주( mono strain )
4kg의 실시예 2.57을 pH 12.0으로 조정하고, 8g/L의 NaCl 용액 4L를 이용하여 희석하였다. 희석된 용해물은 미세여과 탱크로 이송되었다.
미세여과(microfiltration)에 관련된 파라메터는, 대향류 2000LHM, TMP 1.3bar, 컷오프: 0.45㎛였다. 한외여과에 관련된 파라메터는, 대향류 1000LHM, TMP 0.5bar, 컷오프: 30kDa, 투석 여과 부피(diafiltration volume)의 수: 8이었다.
상기 생성물을 7.0mg/mL까지 희석하고, 0.2마이크론 살균 필터를 통과시켜 여과하였다. (SDR: 18.0mg/mL, Prot: 7.0mg/mL, A.A: 0.8mg/mL, 탄수화물: 0.3mg/mL) Lowry 단백질의 (mg)/mL 내의 NOx 생성물 중량, 0.03mg/mL(C1), 0.3mg/mL(C2), 및 3.0mg/mL(C3): C1: 5.2μM, C2: 9.8μM, C3: 1.1μM.
실시예 3.3: 모라셀라 단일균주(( mono strain )
2kg의 실시예 2.37의 pH를 10.7로 조정하고, 8g/L의 NaCl 용액 3L를 이용하여 희석하였다. 희석된 용해물은 미세여과 탱크로 이송되었다.
미세여과(microfiltration)에 관련된 파라메터는, 대향류 2000LHM, TMP 1.3bar, 컷오프: 0.45㎛였다. 한외여과에 관련된 파라메터는, 대향류 1000LHM, TMP 0.5bar, 컷오프: 30kDa, 투석 여과 부피(diafiltration volume)의 수: 8이었다.
상기 생성물을 7.0mg/mL까지 희석하고, 0.2마이크론 살균 필터를 통과시켜 여과하였다. (SDR: 19.4mg/mL, Prot: 6.8mg/mL)
실시예 3.4: 뉴모니아 단일균주( pneumoniae Mono Strain )
5.0kg의 실시예 2.32의 pH를 12.27로 조정하고, 8g/L의 NaCl 용액 5.0L를 이용하여 희석하였다. 희석된 용해물은 미세여과 탱크로 이송되었다.
미세여과(microfiltration)에 관련된 파라메터는, 대향류 2000LHM, TMP 1.3bar, 컷오프: 0.45㎛였다. 한외여과에 관련된 파라메터는, 대향류 1000LHM, TMP 0.5bar, 컷오프: 30kDa, 투석 여과 부피(diafiltration volume)의 수: 8이었다.
상기 생성물을 7.0mg/mL까지 희석하고, 0.2마이크론 살균 필터를 통과시켜 여과하였다. (SDR: 23.3mg/mL, Prot: 4.3mg/mL)
실시예 3.5
500ml의 실시예 2.45, 500ml의 실시예 2.47, 및 500ml의 실시예 2.37을 혼합하고 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. pH는 HCl을 이용하여 10.5로 조정하였다.
실시예 3.6
300ml의 실시예 2.23, 300ml의 실시예 2.31, 300ml의 실시예 2.32 및 300ml 의 실시예 2.33을 혼합하고 9000 x g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. pH는 HCl을 이용하여 10.5로 조정하였다.
분석 결과: (SDR: 63.60mg/mL, Prot: 22.00mg/mL, A.A: 6.00mg/mL, 탄수화물: 1.60mg/mL)
실시예 3.7
300ml의 실시예 2.48, 300ml의 실시예 2.56, 및 300ml의 실시예 2.57을 혼합하고 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. pH는 HCl을 이용하여 10.5로 조정하였다.
(SDR: 50.40mg/mL, Prot: 22.30mg/mL, A.A: 4.0mg/mL, 탄수화물: 0.97mg/mL)
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 1.06μM, C2: 3.19μM, C3: 7.62μM.
실시예 3.8
200ml의 실시예 2.58, 200ml의 실시예 2.66, 200ml의 실시예 2.67, 200ml의 실시예 2.69, 200ml의 실시예 2.70, 및 200ml의 실시예 2.71을 혼합하고 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. pH는 HCl을 이용하여 10.5로 조정하였다.
(SDR: 65.12mg/mL, Prot: 24.80mg/mL, A.A: 7.2mg/mL, 탄수화물: 1.12mg/mL)
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 0.76μM, C2: 1.16μM, C3: 3.79μM.
실시예 3.9
500ml의 실시예 2.46, 500ml의 실시예 2.47, 및 500ml의 실시예 2.37을 혼합하고 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. pH는 HCl을 이용하여 10.5로 조정하였다.
(SDR:38.15mg/mL, Prot: 13.5mg/mL, A.A: 3.4mg/mL, 탄수화물: 0.80mg/mL)
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 2.25μM, C2: 5.25μM, C3: 14.21μM.
실시예 3.10
500ml의 실시예 2.34, 500ml의 실시예 2.35, 500ml의 실시예 2.36, 및 500ml의 실시예 2.10을 혼합하고 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. pH는 HCl을 이용하여 10.5로 조정하였다.
(SDR:69.6mg/mL, Prot: 28.005mg/mL, A.A: 7.2mg/mL, 탄수화물: 2.48mg/mL)
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 0.95μM, C2: 1.21μM, C3: 4.44μM.
실시예 3.11
10ml의 실시예 2.61, 및 10ml의 실시예 2.27을 각각 별도로 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. 각각의 상청액 3mL를 혼합하였다. pH는 HCl을 이용하여 7.2로 조정하였다.
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 0.34μM, C2: 0.66μM, C3: 1.33μM.
실시예 3.12
10ml의 실시예 2.58, 및 10ml의 실시예 2.61을 각각 별도로 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. 각각의 상청액 3mL를 혼합하였다. pH는 HCl을 이용하여 7.2로 조정하였다.
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 1.40μM, C2: 0.44μM, C3: 0.71μM.
실시예 3.13
10ml의 실시예 2.9, 및 10ml의 실시예 2.8을 각각 별도로 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. 제1용해물(실시예 2.9) 중 1.5mL와 제2용해물(실시예 2.8)을 혼합하였다.
pH는 HCl을 이용하여 7.2로 조정하였다.
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 8.7μM, C2: 16.90μM, C3: 21.1μM.
실시예 3.14
10ml의 실시예 2.2, 및 10ml의 실시예 2.8을 각각 별도로 9000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 0.8㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 공극을 갖는 연속 필터를 통과시켜 여과하였다. 각각의 상청액 3mL를 혼합하였다.
pH는 HCl을 이용하여 7.5로 조정하였다.
가용화된 건조중량의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.01mg/mL(C1), 0.1mg/mL(C2), 및 1.0mg/mL(C3): C1: 9.2μM, C2: 11.3μM, C3: 17.2μM.
실시예 3.15
실시예 2.2로부터의 용해 13.2L, 실시예 3.9로부터의 혼합물 용해 48.6L, 실시예 3.7로부터의 혼합물 용해 36.6L, 실시예 3.8로부터의 혼합물 용해 36L, 실시예 3.6 14.4L, 및 실시예 10 18.4L를 혼합하고 NaCl 용액 8g/L를 이용하여 334.4L로 희석하였다. 상기 용액을 실시예 3.1에 기재된 미세여과-한외여과 더블 루프 시스템(double microfiltration and ultrafiltration loops system) 내에서 접선 유동 여과법에 의하여 정제하였다.
(SDW: 21.0mg/mL, Prot: 6.4mg/mL, A.A: 1.9mg/mL, 탄수화물: 0.45mg/mL) D-아미노산 비율: 42% D-Ala, 12% D-Leu, 53% D-Ser, 37% D-Asx, 35% D-Met, 32% D-Phe, 28% D-Glx, 8% D-Tyr, 16% D-Lys.
Lowry 단백질의 mg/mL 내에서의 NOx 생성물, 0.03mg/mL(C1), 0.3mg/mL(C2), 및 3.0mg/mL(C3): C1: 9.3μM, C2: 14.3μM, C3: 11.5μM.
실시예 4: 낮은 pH 조건에서의 박테리아 용해 의 비교예
도 4는 본 발명의 범위에서 벗어나는 알칼리화 조건으로 수행되는 과정을 나타낸 도면이다. 박테리아 용해를 수행하기 위하여 사용되는 NaOH 농도는 0.1%를 사용하여, 더 낮은 pH 값을 유도하였다.
다음 용해물(lysates)들이 혼합되었다.: 실시예 2.24 1.18kg, 실시예 2.49 3.0kg, 실시예 2.69 2.95kg, 실시예 2.4 1.08kg, 실시예 2.11 1.51kg, 실시예 2.45 3.98kg. 상기 혼합물 6kg을 8g/L NaCl 용액을 이용하여 12kg으로 희석하였으며, pH는 12.0으로 조정하였다.
미세여과 파라메터는: 대향류 2000LHM, TMP 1.3bar, 컷오프: 0.45㎛였다.
한외여과 파라메터는: 대향류 1000LHM, TMP 0.5bar, 컷오프: 30kDa, 투석 여과 부피(diafiltration volume)의 수: 12이었다.
(SDR: 19.4mg/mL, Prot: 3.1mg/mL, A.A: 2.0mg/mL, 탄수화물: 0.1mg/mL, LAL: 20140E/ml) 가용화된 건조중량의 (mg)/mL 내의 NOx 생성물, 0.03mg/mL(C1), 0.3mg/mL(C2), 및 3.0mg/mL(C3): C1: 9.3μM, C2: 14.3μM, C3: 11.5μM.
실시예 5: 락토바실러스헬베티쿠스( Lactobaccilus helveticus ) 의 용해
식물성 배지(vegetal media)상에서의 발효로 얻어진 락토바실러스헬베티쿠스( Lactobaccilus helveticus)의 바이오매스의 분취액(aliquots)을 실온에서 해동시키고, 순수(purified water)를 이용하여 건조중량 농도가 80g/L로 될 때까지 희석하였다. 0.2M의 NaOH를 이용하여 알칼리화(Alkalinization)를 수행하였다. 상기 용해를 연속교반 하에, 35 내지 40℃에서 2일 동안 배양하였다. 용해를 진행하는 동안, pH가 0.5pH 단위만큼 감소하지 않도록 모니터하였다.
실시예 6: 쥐( mice )에 대한 공기전파형 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면 역저항
본 실험은 본 발명의 임의의 실시형태의 특정 바이러스, 즉 H1N1에 대한 효능 평가를 통해, 그들의 비특이적 면역저항 활성(immunoprotection activity)을 검증하는 것을 목적으로 한다.
6주령의 BALB/c 암컷 쥐들을 Bundesinstitute fur Risikobewertung, Berlind으로부터 구입하여 모든 실험에 사용하였다. 상기 동물들을 주위온도 22℃ 및 상대습도 60±5%의 정상조건하에서 양육하였다. 조명프로그램(light programs)은 12:12시간씩 명-암 사이클을 설정하였다. 동물들을 펠렛형 규정식(Altromin 1314, Altromin, Lage, Germany)을 공급하고, 수돗물(tap water)는 임의로 공급하여 양육하였다.
선치료( Pre - treatment )
총 60마리의 쥐들을 20마리씩 3그룹으로 나누고, 이를 다시 2개의 치료군과 1개의 대조군으로 나누었다. 동물들(2개 군)에게 10일 동안 연속적으로 한 마리당 1회에 1mg 또는 10mg을 주입하여 선치료를 수행하거나, PBS 제어(PBS control, 1개 군)를 수행하였다. 상기 선치료선치료막에, 모든 쥐들에게 쥐에 적용되는 A/PR/8/34(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 에어로졸을 주입하였다. 이 균주를 사용하는 쥐에 대한 LD50는 통상적으로 비강 내(intranasal) 투여로는 10-4.5이며, 에어로졸 루트로는 10-1.7이다. 이들 실험에서의 공격감염(challenge infection)을 위하여 사용되는 투여량은 100% 치사율을 보이지는 않지만, 명백한 인플루엔자 감염 증상을 일으킬 수 있는 희석액(dilution)을 제공하기 위하여 선택될 수 있다.
10일 동안 10마리 쥐 그룹들의 치사율을 매일 관찰하였다. 도 3에 나타낸 결과에 따르면, 본 실험의 투여환경하에서 추출물을 10mg/mouse로 투여한 경우에 재감염으로부터 완벽하게 보호할 수 있음을 보여준다. 반면, 대조군 쥐들 중 70%만이 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 생존하였다. 상기 약을 1mg/mouse 투여받은 그룹의 생존율은 70%였다.
인플루엔자 바이러스 감염 후 치료된 쥐들에게서 발견되는 임상학적 징후
10마리씩으로 이루어진 그룹들에 대한 인플루엔자 바이러스 감염의 임상학적 징후(clinical symtom)를 매일 관찰하였다. 상기 임상학적 징후들에 대한 점수를 아래 표에 나타내었다. 10mg의 추출물이 투여된 쥐들의 경우, 2일 후에 가벼운 임상학적 징후를 보였으며, 대조군의 쥐들보다 현저하게 일찍 회복되었다. 이로써, 많은 투여량의 효과를 알 수 있다. 1mg 투여-치료군과 대조군 사이에는 눈에 띄는 차이가 없었다.
그룹
 바이러스 감염 후 경과일
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
PBS
 0
 0
 +
 +
 ++
 +++
 +++
 +++
 +++
 +++
 +++
 ++/
+++		 ++/
+++		 ++
 ++
 ++
TTT
1mg		 0 0 + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++/
+++		 ++ ++ +
TTT
10mg		 0
 0
 0 0
 +
 +/
++		 ++
 +++
 +++
 ++/
+++		 ++/
+++		 ++/
+++		 +/
+++		 ++
 ++
 0
TTT=본 발명의 추출물 용해물에 의한 치료
생존한 동물에 대해서만 상기 임상학적 징후 점수를 고려하였다.
코드 0: fur의 세포운동(ruffling)이 없는 것, 건강한 것으로 나타난 것.
+ 에서 +++: fur의 세포운동의 점진적인 증가를 나타냄; 움직임과 일반 활성 의 점진적인 감소를 나타냄.
치료받은 쥐들의 인플루엔자 적혈구 응집( hemagglutination ) 억제 항체의 적정( titers )
인플루엔자 제1 및 제2감염 이후에, 바이러스 공격 이후 10일째에 그룹당 3마리의 혈청들을 수집하였다. 면역성을 갖게 된 쥐들로부터 얻은 혈정을 -20℃에서 저장하였다. 모든 혈정들은 비특이적 억제자(nonspecific inhibitors)를 제거하기 위하여 수용체-파괴 효소(receptor-destroying enzyme)로 선처리(pretreat)하였다. 인플루엔자 적혈구 응집-억제(HI) 테스트를 미세적정 플레이트(microtiter plates) 내에서 국제보건기구(WHO, 2002)에서 권고하는 표준절차에 따라 0.5% 닭 적혈구 세포와 4개의 적혈구응집유닛을 이용하여 수행하였다. 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1)에 대한 기하평균(geometric mean) HI 항체 적정을 보여주는 결과는 아래 표에 제시되었다.
그룹 Titer D13 *GMT Titer D34 *GMT
PBS

 320 403 640 640
320 640
640 640
TTT
1mg
 320 403 320 320
320 320
640 320
TTT
10mg
 320 320 640 1612
320 2560
320 2560
TTT=본 발명의 추출물에 의한 치료
혈청들은 인플루엔자 바이러스 공격 감염 이후 10일 후에 얻었다.
*기하평균 적정(Geometric Mean Titre)
쥐들은 제1(초기)감염 이후, A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스 제2(증 폭(booster)) 공격 감염(challenge infection)을 받게 된다. 위에 나타낸 바와 같이 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스에 의한 공격을 받은 이후에 항체 적정(antibody titers)의 양은 증가한다. OM-85 BV를 10mg/mouse 투여한 경우, 높은 수준의 HI 항체적정이 관찰되었다. 반면, 1mg/mouse 투여의 경우에는 동일 약물의 10mg/mouse 투여의 경우보다 낮은 항체 적정을 나타내었다.
폐암 검출에 관해서는 치료군과 대조군 사이에 눈에 띄는 차이가 없었다. 그럼에도, 본 발명에 의한 일 추출물을 10mg 투여받은 쥐의 경우, 쥐 병원성 인플루엔자(mouse-pathogenic influenza) A/PR/8/34 바이러스의 에어로졸 감염 이후의 임상학적 징후가 대조군의 경우보다 적어도 하루 늦게 발생하였으며, 회복속도 또한 대조군의 쥐들보다 현저히 빨랐다. 그러나, 1mg 투여된 치료군의 경우에는 대조군과 임상학적 점수에 있어 큰 차이가 없었다. 이는, 상기 추출물의 효과가 투여량 의존적(dose-dependant)이라는 것을 보여준다. 제1감염 3일 후에는, 인플루엔자 적혈구 응집 억제 항체 수준에 있어서, 치료군과 대조군 사이에 큰 차이가 없었다. 그러나, 제1감염 3주일 후에 A/PR/8/34 바이러스의 2차 감염이 있자, 10mg/mouse 투여 그룹에서 더 많고 현저한 양의 항체 유도가 관찰되었다.
본 실시예에서는 본 발명에 의한 10mg/mouse 투여량으로 투여된 추출물이 수많은 파라메터에 의하여 결정되는 쥐 병원성 인플루엔자(mouse-pathogenic influenza) A/PR/8/34 바이러스 감염에 대항하는 보호능을 부여할 수 있음을 보여준다. 따라서 본 발명의 실시형태들은 in vivo 조건에서 바이러스에 대항하는 면역 반응을 활성화할 수 있다. 몇몇 실시형태에서의 상기 추출물은 병원성 박테리아로 부터 배타적으로 제조되며, 본 실시예에서도 상기 추출물이 이러한 조건에서 테스트되었기 때문에, 이로부터 본 발명의 실시형태들에 따르면 선천적 면역시스템을 활성화할 수 있다.
실시예 7: 생쥐 산화질소( murine nitric oxide ) 테스트에서의 본 발명의 실시형태의 활성
6주령 C57/BL6 수컷 쥐(six weeks old male, SPF quality, Charles RIver, FR)을 CO2 흡입으로 죽였다. 둔부 부속지(付屬肢)(posterior appendage)로부터 엉덩이(hip), 대퇴골(femur), 및 경골(tibia)을 제거하였다. 뼈의 양단부를 절단한 후, 뼈 속으로 DH(Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 주사하여 그 내강(lumen)으로부터 골수를 추출하였다. 세척 후에, 줄기세포들을 20% 말 혈청 및 30% L929 세포 상청액을 보충한 DH 배지 내에 재현탁(resuspend)시켰다. 상기 세포 서스펜션(현탁액)을 8% CO2, 37℃ 및 습기포화 환경의 인큐베이터에서 배양하였다. 이후, 5% 소태아 혈청 (fetal calf serum, FCS), 아미노산 및 항생제(DHE 배지)로 보충된 DH 배지 내에서 재현탁되고 세척된 얼음처럼 차가운(ice-cold) PBS를 이용하여 대식세포들(macrophages)을 분리하였다. 세포밀도를 700,000cell/mL로 조절하였다. 상기 생성물의 수용액을 미세적정 플레이트에서 DHE 배지로 직접 순차적으로 희석하였다. 상기 생성물들을 3회 테스트하였으며, 각각의 미세적정 플레이트는 배지로 이루어진 음성 대조군을 포함하였다
각 웰(well)의 최종부피는 100㎕였다. 상기 세포 서스펜션을 상기 희석된 생성물에 첨가하고, 상기 세포들을 8% CO2, 37℃ 및 습기포화 환경의 인큐베이터에서 배양하였다. 배양기간 마지막에, 100㎕의 상청액을 다른 미세적정 플레이트에 옮기고, Griess 반응을 수행하여 각 상청액 내에 생성된 아질산염(nitrite)의 농도를 결정하였다. 2.5% 인산수용액 내의 100㎕의 Griess 시약(5mg/mL의 술파닐아미드 + 0.5mg/mL의 N-(1-나프틸)에틸렌-디아민 히드록클로라이드)을 각 웰(well)에 첨가하였다. 미세적정 플레이트에 대하여, 분광측정기(spectrophotometer)(SpectraMax Plus, Molecular Devices)를 이용하여 레퍼런스에 제시된 690nm와 달리 562nm 파장으로 조사하였다.
아질산염 농도는 형성되는 산화질소 함량에 비례하였다. 상기 아질산염 함량은 표준 곡선에 기초하여 결정하였다. 그 결과는 평균치±표준편자로서의 μM 산화질소(NO)로 표현되며, 투여량 감응곡선으로서 그래프화하였다(도 4-7 참조)
실시예 8: 리물루스 변형세포 용해물 크로모닉( Limulus amoebocyte lysate chromogenic) 테스트
유사엔도톡신 분자(endotoxin-like molecules)의 존재 여부를 결정하기 위하여, Chromogenic -LAL Kit of Bio-Whittaker를 이용한 LAL 테스트를 수행하였다.
본 시험은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 또는 LAL 내에 존재하는 계단식 효소촉매과정 (enzymatic cascade)에 의한 비교가능한 구조의 생성물에 의한 활성화를 기초로 한다. 이러한 효소의 활성화는 프로테아제(protease)에 의하여 펩타이드에 연결된 색소원 (chromogen)이 분리됨으로써 입증된다. 상기 효소 반응은 37℃에서 수행되며, 시간경과에 따른 색소원의 형성은 405nm에서 측정되었다. 0.2유닛의 D.O.에 도달하기 위한 시간을 기록하고 내독소(endotoxic) 활성을 LPS 표준(표준 곡선)에 의거하여 산출하였다.
이러한 본 발명에 의한 추출물에 대한 실시예 실험 결과는 E.coli LPS의 표준화된 제조방법에 관련된 EU(엔도톡신 단위)를 사용하여 아래 표에 정리하였다(1EU는 0.09ng 당량 LPS에 상응한다).
용해의 조건(수행시간, 초기물질의 양, NaOH의 초기 비율) EU/ml ng 당량 LPS/ml
Hemo NaOH 1% 100g/l/ T 22h 169900±600 15291
Hemo NaOH 1% 125g/l/ T 21h 2811000±82644 252990
Hemo NaOH 1% 50g/l/ T 21h 33950±224 3055
Hemo NaOH 1% 50g/l/ T 22h >5000000 450000
Hemo NaOH 1% 50g/l/ T 92h >5000000 450000
Hemo NaOH 2% 25g/l/ T 92h 65430±565 5888
Hemo NaOH 2% 50g/l/ T 211h 23560±142 2120
Hemo NaOH 2% 50g/l/ T 22h 579200±1062 52128
Hemo NaOH 2% 50g/l/ T 92h 7927±320 713
Hemo NaOH 3% 125g/l/ T 21h 30000±113 2700
Hemo NaOH 3% 25g/l/ T 22h 6883±34 619
Hemo NaOH 3% 50g/l/ T 22h 10690±41 962
Hemo NaOH 4% 100g/l/ T 92h 11380±36 1024
Hemo NaOH 4% 12.5g/l/ T 22h 3415±40 307
Hemo NaOH 4% 12.5g/l/ T 92h 10500±37 945
Hemo NaOH 10% 100g/l/ T 92h 1229±38 110
Hemo NaOH 10% 12.5g/l/ T 211h 224±17 20
Hemo NaOH 10% 125g/l/ T 211h 602±6 54
실시예 4 20140 1812
실시예 3.15 108±0.5 10
H2O <0.005 15291
실시예 9: 히스타민 분비 억제
비만세포 탈과립(degranulation)의 in vitro 쥐 모델(CRO CEREP, catalog number 2006:771-c, ref Hakanson R, Ronnberg AL, Sjolund K. Anal Biochem, 1972 Jun 47(2):356-70에 의하여 제안됨)을 채용하여 본 발명의 실시형태(21개의 박테리아 균주를 포함함)가 48/80 화합물-활성화된 비만세포에 의한 히스타민 분비를 억제하는 기작에 대한 조사를 하였다. 실험조건 및 규칙을 아래 표에 간략하게 정리하였다.
규칙( Protocol )
연구대상 유래(Origin) 레퍼런스 화합물 참고문헌
히스타민 분비
(화합물 48/80-활성화에 의한 것)		 쥐 비만세포
(rat mast cell) 		SCG Hakanson et al.(1972)
실험조건
연구대상 자극제 배양
(incubation)		 반응생성물 검출방법
히스타민 분비
(화합물 48/80-활성화에 의한 것)		 화합물 48/80 2분/37℃ 히스타민 형광스펙트럼 측정(Fluorimetry)
분석 및 결과도출
결과는 테스트 화합물의 존재하에 도출된 제어특이적 활성(control specific activity)의 비율로 표현된다:(특이적 활성/제어특이적 활성으로 측정됨)×100. IC50 수치(제어특이적 활성의 억제의 중간 극대치(half-maximal)를 야기하는 농도)는 Hill 방정식 곡선 보정(Hill equation curve fitting)(Y=D+[(A-D)/(1+(C/C50)nH), 여기서 Y=특이적 활성, D=최소 특이적활성, A=최대 특이적 활 성, C=화합물 농도, C50=IC50, 그리고 nH=기울기 요소이다.]을 이용한 평균 반복값(mean replicate values)로 얻어지는 억제 곡선의 비선형 회귀분석을 통하여 결정하였다. 이러한 분석은 Cerep(Hill software)에서 개발한 소프트웨어를 이용하여 수행하였으며, 상업용 소프트웨어인 SigmaPlot®4.0 for Windows®(copyright 1997 by SPSS Inc.)에 의하여 생성된 데이터와의 비교를 통하여 검정하였다.
각 실험에서, 상기 레퍼런스는, 연구의 적절성을 평가하기 위하여 시험 추출물과 함께 테스트하였다. 몇 가지 농도를 검정하고(IC50 수치 결정을 위한 테스트), 그 데이터를 Cerep에서 결정한 히스토리 수치와 비교하였다. 만약 적절성 기준이 상응하는 표준 수행절차와 일치한다면, 본 연구는 유효한 것으로 인정받을 것이다. 상기 시험 추출물 및 레퍼런스(2회 측정됨)에 대하여 결정된 IC50 값들은 아래 표에 제시되었다. 상기 레퍼런스에 대한 IC50 값들은 히스토리상의 평균±0.5 로그단위의 수용 한계 내에 있었다.
시험 추출물에 대한 상기 상응하는 억제곡선은 도 8에 나타내었다.
테스트 대상 화합물 IC50
시험 추출물 0.0049 mg/ml
SCG(레퍼런스 1) 4.7E-06M
SCG(레퍼런스 2) 1.1E-06M
상기 결과는 시험 추출물이 화합물 48/80-활성화 비만세포에 의하여 유도되는 히스타민 분비의 잠재적인 억제자임을 보여준다.
실시예10 : 쥐의 LPS - 둔감성 계열 내에서의 대장균( Escherichia coli ) 감염모 델에 대한 본 발명의 일 실시형태의 효과
본 발명의 일 실시형태를, 공지의 E. coli 박테리아 감염에 대한 in vivo 모델에 따라 테스트하였다(Hopkins et aI., Inheritance of susceptibility to induced Escherichia coli bladder and kidney infections infemale C3H/HeJ mice., J Infect Dis. 2003 Feb 1;187(3): 418-23 참조). C3H/HeJ 쥐들의 toll-like 수용체 유전자(TLR4)에 대하여 돌연변이를 유도하였으며, 이들은 LPS와 같은 TLR4 작용약에 둔감한 것이다. 따라서 이 모델은 TLR4와는 다른 루트를 경우하여 활성을 갖는 약물의 효능을 검출하는데에 적절하다.
10-12주령의 암컷 C3H/HeJ 쥐들(8마리)의 그룹을 실시예 3.15의 추출물과 유사한 추출물을 E.coli 감염 전 10일 동안 구강 투여하여 치료하였다.
상기 동물들을 주위 온도 18 내지 26℃ 및 상대습도 30 내지 70%의 정상 환경하에서 양육하였다. 조명 프로그램은 명-암 사이클을 12:12시간으로 설정하였다.
동물들을 Harlan Sprague Dawley(Indianapolis, IN) 실험실에서 제공하는 표준 급식으로써 양육하였다. 수돗물은 특별한 지침이 없는 한 자유롭게 공급하였다.
치료된 동물들 한 마리당 추출물 투여량에 대하여 143mg의 리오필리제이트(lyophilizate)(즉, 25mg(17.5%)의 박테리아 추출물 및 118mg(82.5%)의 첨가제) 을 경구투여하였다.
접종
쥐들에게 PBS 또는 uropathogenic E. coli를 방광의 역류와 연계되는(refulx-associated) 접종의 가능성을 크게 감소시키고, 접종된 모든 동물들의 감염을 유도하는 최소 접종원 규칙(minimal inoculum protocol)에 의거하여 방광 내(intravesically) 접종하였다. 여성의 소변에서 추출된 E. coli 균주 1677과 발열 UTI(febrile UTI)을 이들 실험에 사용하였다. 접종원을 제조하기 위하여, 박테리아를 PBS로 세척하고, 2×1010 bacteria/mL 농도로 재현탁하여, 동결 스탁(frozen stock)으로부터 트립토스 배양액(tryptose broth, Difco Laboratories) 내에서, 2개 경로에 의하여 성장시켰다. 쥐들에게 1시간 동안 물을 주지 않았으며, 접종 전에는 그들의 방광에 소변이 남지 않도록 하였다. 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia) 하에 10마이크로리터의 박테리아 접종원을 요도관(urethral catheterize)을 이용하여 방광에 주입하여, 2×108 E. coli/mouse을 투여하였다. 쥐들을 마취에서 회복되도록 한 뒤, 1시간 후 물을 다시 공급하였다.
접종일 10일 후에 방광(bladder) 및 신장(kidney) 감염의 강도를 검정하기 위하여 쥐들을 죽였다. 각 동물의 방광 및 양쪽 신장을 제거하고, 측량한 뒤, 살균 PBS에서 균질화(homogenize)하였다. 그 전에, 상기 균질 현탁액(homogenate)들을 Levine's 에오신-메틸렌 블루 아가(Levine's eosin-methylene blue ager, Difco Laboratories) 위에서 연속적으로 평판 배양되었다.
이들을 37℃의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양시킨 후, 각 플레이트 상의 E.coli 군체(colonies)의 수를 세고, 이를 이용하여 각 방광 및 한 쌍의 신장 내의 박테리아의 총 수를 계산하였다.
Fisher의 최소 유의차 테스트법(Least Significant Difference test)을 활용 하여, 서로 다른 쥐 그룹(PBS, 미치료된 감염그룹 및 치료된 감염그룹)들에 대한 평균 총 컬러니 형성 단위(mean total colony-forming unit(CFU))의 수치들 간의 통계학적으로 유의차(Significant Difference)를 결정하였다. 방광과 신장 감염 데이터는 총 CFU=log10[(CFU+100)/mg tissue, 여기서, CFU는 산출된 컬러니-형성 단위의 총수/조직 샘플이다]를 이용하여 변형되었다.
얻어진 결과는 방광 및 신장에 대하여 각각 도 9a 및 도 9b에 나타내었다. 접종일 10일 후에 방광(bladder) 및 신장(kidney) 감염의 강도를 검정하기 위하여 쥐들을 희생시켰다. 각 동물의 방광 및 양쪽 신장을 제거하고, 측량한 뒤, 살균 PBS에서 균질화(homogenize)하였다. 그 전에, 상기 균질 현탁액(homogenate)들을 Levine's 에오신-메틸렌 블루 아가(Levine's eosin-methylene blue ager, Difco Laboratories) 위에서 연속적으로 평판 배양되었다. 이들을 37℃의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양시킨 후, 박테리아의 평균 총 수 +/- 방광 또는 신장에 대한 SEM을 산출하기 위하여, 각 플레이트 상의 E.coli 군체(colonies)의 수를 세고, 이들 얻어진 결과물에 100CFU를 첨가한 후, 각각의 케이스에서 얻어진 총합을 조직의 mg으로 나누었다(즉, 총 CFU=log10[(CFU+100)/mg tissue]).
박테리아 추출물은 >3(방광) 및 >2(신장) 대수값(logarithmic values) 팩터(factor) 만큼 감소하였다. 이로써, 방광 및 신장 유래의 배양된 군집(컬러니) 수는 각각 적어도 1000 및 100 팩터만큼 감소하였음을 알 수 있다. 이들 결과는 본 발명의 일 실시형태의 면역활성을 입증한다.
실시예 11: C57 / bl 쥐의 복막 내( intraperitoneal ) Salmonella typhimurium 감염의 생쥐 모델에서의 본 발명의 일 실시형태의 효능
본 발명의 일 실시형태를 복막 내(intraperitoneal) Salmonella typhimurium 감염의 생쥐 모델로 테스트하였다. 구강 투여를 통한 치료 전에 C57BL/쥐들을 7일 동안 방치하였다. 치료받은 동물들은 한 마리당 투여량에 대하여 85mg의 리오필리제이트(Iyophilizate)(즉 15mg(17.5%)의 박테리아 추출물과 70mg(82.5%)의 첨가제)를 투여받았다. 본 실험의 대상은 실시예 3.15와 유사한 추출물로 치료받은 20마리의 쥐들로 이루어진 실험군, 물로 치료받은 쥐들로 이루어진 대조군으로 이루어진다. 치료를 위하여, 상기 추출물을 매일 증류된 물에 용해하여, 최종 부피 0.5ml의 단일 투여량을 갖도록 하였다. 모든 쥐들에게 Salmonella typhimurium strain 415이 공격감염용으로 투여되기 전에 이 0.5ml 부피를 각 쥐들에게 하루에 한번, 10일 연속하여 구강 투여하였다(I. Mechnokov Institute for Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences).
상기 추출물을 한마리당 단일투여량 85mg으로 주입하였다(즉, 15mg의 활성 성분과 82.5%의 첨가제). 대조군에 속한 쥐들은 10일 동안 매일 0.5ml의 물을 구강 투여하여 허위 치료(sham treatmen)를 받았다. 예비 임상실험(dose-finding) 공격(challenge)의 Salmonella의 범위는 한 마리당 102 내지 105CFU였다. 104CFU의 투여량을 주요 실험으로 선택하였는데, 이는 상기 투여량에 의할 때 치료받지 않은 쥐들의 약 50%만이 생존하였기 때문이다.
공격감염 이후, 쥐들은 실험실 동물들에 있어서의 표준 조건 하에 방치되었 다. 감염이후 21일의 기간 동안 매일 관찰 및 사망에 대한 기록을 수행하였다. 상기 추출물의 항-감염적(anti-infective) 효능(아래 표 참조)을 각 실험군에 대해 산출된 감염 후 생존율(SR), 감염 후 평균 수명(Average Duration of Life, ADL), 및 방어인자(defense factor, DF), 및 조제 효율 인덱스(efficacy index, EI)에 의하여 평가하였다. SR은 감염 이후 21일째 날에 실험군에서 살아 있는 동물들의 비율을 취한 것이다.
ADL, DF 및 EI는 다음 공식으로 산출하였다.
ADL=(X1+X2+....+Xn): N
여기서 ADL은 평균수명이며, X1 내지 Xn은 #1 내지 #n 실험용 쥐의 감염 후 생명 지속일(수명)이고, N은 상기 실험군 내의 총 동물 수이다.
DF=CD:ED
여기서, DF는 방어인자, CD는 대조군의 사망률, ED는 실험군의 사망률이다.
EI= EI=[(DF-1):DF]×x100%
여기서, EI는 조제 효율 인덱스이며 DF는 방어인자이다.
104 CFU의 Salmonella typhimurium 감염 이후 21일 간의 대조군 및 실험군 내의 사망 기록
Figure 112009055023491-pct00001
C57BL/6 쥐에 대한 Salmonella typhimurium 치명적 감염 모델실시예 3.15의 방어 효능
선처리에 사용된 성분 사망율(%) 생존율(%) ADL(일수) DF EI(%)
H2O 42 58 15.3 1 0
실시예 3.15 0 100 21 최대 방어 100
실험 과정에서 상기 추출물은 잘 견디는 것으로 보이는 것은 명백하였다. 물로 선치료된 쥐들의 대조군은, 관찰기간(21일) 동안의 생존율이 58%였으며, ADL은 15.3일이었다. 만면, 본 발명에 의한 추출물을 투여받은 모든 쥐들은 상기 공격감염에서 생존하였다. 이들 결과는 본 발명의 실시형태들이 인간의 특정 박테리아 감염에 대하여 효과적으로 작용할 수 있음을 시사한다.
실시예 12: 알레르겐 공격 과정에서의 점막 기관( mucosal trachea ) 내의 조 절 T 세포( Regulatory T cell )의 생산에 대한 본 발명의 효과
급성 알레르기 염증 모델에서의 본 발명의 일 실시형태의 면역조절 능력(immuno-regulatory potential)을 평가하였다. 본 실험은 PVG 쥐에서, 본 발명에 의한 추출물의 투여가 유용한 점막-귀소 T 조절 세포(mucosal-homing T regulatory(Treg) cells)의 풀 사이즈(pool size)를 증가시켜, 결과적으로 일시적 염증(episodic inflammation)의 기간 동안 에어웨이(airway) 점막 조직 내 Treg 수의 증가를 초래하는지 여부를 검증하기 위하여 수행되었다.
근교계(Inbred) PVG 쥐들을 일반적인 쥐들의 병원체가 없는 상태를 유지하며 양육하였다. 성별은 양쪽 모두에 해당하며, 8 내지 13주령의 임의로 선택된 동물들을 실험 기간 내내 활용하였다.
매일 연속적으로 한 마리의 몸무게 g 당 400㎍의 리오필리제이트(또는 400mg/kg/day)를 위관 영양법(gavage)으로 공급하였다. PVG 쥐들의 airway tissue 상 Treg 개체수는 연구 대상 그룹들 내에서 표현형으로(phenotypical) 밝혀졌다. 쥐의 기관 조직의 표현형 특성은 분석을 위한 충분한 세포를 생산하기 위하여 5 내지 10마리의 동물들로 이루어진 그룹이 요구된다. 기관 조직들은 콜라게나아제/DN아제(Collagenase/DNase) 등의 분해효소에 의하여 분해되어, 단일세포 서스펜션을 생성하고, 이어서 CD4, CD25, Foxp3, 및 TCR αβ의 표면 발현(surface expression)의 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 수행하였다. 첫째, 0일 째(d0)에는 동물들이 OVA에 감작되도록(sensitize)하였으며, d10 내지 d17에는 실시예 3.15와 유사한 추출물 또는 플라시보를 주입하여 주었다: d18에 그들에게 에어로젤화된 OVA로 공격하였으며, 생성된 Th 세포/Treg(FoxP3) 반응을 24시간 이후에 측정하였다. Fox p3의 세포 내부의(intracellular) 세포염색(staining)을 위하여, anti-mouse/rat Fox P3-FLR staining kit from eBioscience(San Diego, CA)를 제조자의 설명대로 사용하였다.
데이터는 FACSCaliber 유세포 분석기(flow cytometer,BD Biosciences)에서 얻었고, Flowjo 소프트웨어(version 4.6.1. Tree Star Inc.)를 이용하여 분석하였다. OVA는 Sigma Chemical Co.(St. Louis Missouri)에서 얻었다.
도 10a 및 도 10b는 최초 역류 세포계수(original flux cytometry) 데이터를 나타낸다(도 10a에서, 표지들은 CD14 vs FoxP3이었고, 도 10b에서는 표지들이 TCR vs FoxP3였다). 상기 세포들은, OVA 감작된(sensitized) 쥐들(0일째 복강주사)에게 에어로졸 OVA 투여(18일째)하고 24시간 후에, 상기 쥐들의 기도 점막으로부터 얻었다. 도10a 및 도 10b의 우측 판넬은 추출물이 상기 동물들에게 10 내지 18일 동안 경구투여되었을 경우, 좌측의 판넬에 나타낸 제어군(OVA 민감성 처리를 받고 치료받지 않은 상태에서 OVA 공격을 받은 동물들)과 비교할 때, FoxP3 포지티브 CD4 세포들(및 TCR, 각각)의 비율이 증가하는 것을 보여주고 있다.
본 실시예는 본 발명의 실시형태가 염증 알레르기에 대해서는 치료가능한 가치가 있음을 보여준다.
추가적 실시예들이 포함하는 사항
모라셀라카타랄리스( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis, Moraxella(Moraxella)catarrhalis), 헤모필루스인플루엔자( Haemophilus influenzae), 크렙시엘라뉴모니아 ( Klebsiella pneumoniae , 폐렴 막대균 ), 스타필로코커스아우레우스( Staphylococcus aureus , 포도상구균), 스트렙토코커스뉴모니아( Streptococcus pneumoniae , 폐구균 ), 스트렙토코커스피로젠( Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스생귀니스 ( Streptococcus sanguinis , 연쇄상구균), 스타필로코커스헤몰리티쿠스( Staphylococcus Hemolyticus , 용혈성 포도상구균), 엔테로코커스 패칼리스 ( Enterococcusfae faecalis ), 스트렙토코커스뮤탄스( Streptococcus mutans), 스트렙토코커스앵기노서스 ( Streptococcusanginosus ), 스트렙토코커스미티 스( Streptococcus mitis ), 스트렙토코커스살리바리우스( Streptococcus salivarius) , 네이서리아시카( Neisseria sicca ), 헤모필루스파라인플루엔자( Hemophilus parainfluenzae ), 액티노바실러스(Actinobacillus( Hemophilus )), 액 티노미세템코미탄( actinomycetemcomitans ), 및 아이케넬라코로덴( Eikenellacorrodens ):으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 박테리아 종 유래 추출물에 있어서, 상기 추출물의 제조과정 중에는, 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주들이 pH 12 이상에서 용해되고, 상기 추출물들의 처리를 통해 핵산이 제거된다; 여기서, 상기 추출물은 환자에게 투여될 때까지 프리온 질병의 위험을 내포하지 아니한다.
상술한 추출물은 다음 박테리아 종들 중 적어도 하나의 균주(strain)으로부터 얻어진다: 모라셀라카타랄리스(Moraxella( Branhamella )catarrhalis, Moraxella(Moraxella)catarrhalis), 헤모필루스인플루엔자( Haemophilus influenzae), 크렙시엘라뉴모니아 ( Klebsiella pneumoniae , 폐렴 막대균 ), 스타필로코커스아우레우스( Staphylococcus aureus , 포도상구균), 스트렙토코커스뉴모니 아( Streptococcus pneumoniae , 폐구균 ), 스트렙토코커스피로젠( Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스생귀니스 ( Streptococcus sanguinis , 연쇄상구균), 스타필로코커스헤몰리티쿠스( Staphylococcus Hemolyticus , 용혈성 포도상구균), 엔테로코커스 패칼리스 ( Enterococcusfae faecalis ), 스트렙토코커스뮤탄스( Streptococcus mutans), 스트렙토코커스앵기노서스 ( Streptococcusanginosus ), 스트렙토코커스미티스( Streptococcus mitis ), 스트렙토코커스살리바리우스( Streptococcus salivarius), 네이서리아시카 ( Neisseria sicca ), 헤모필루스파라인플루엔자( Hemophilus parainfluenzae ), 액티노바실러스 ( Actinobacillus ), 액티노미세템코미탄( actinomycetemcomitans ), 및 아이케넬라코로덴 ( Eikenellacorrodens ).
또한, 상술한 추출물은 다음 박테리아 종들 중 적어도 하나의 균주으로부터 얻어진다: 모라셀라카타랄리스 3622( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis 3622), 모라셀라카타랄리스 3625( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis 3625), 모라셀라카타랄리스 I-045( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis I-045), 헤모필루스인플루엔자 8467(Haemophilusinfluenzae 8467), 크렙시엘라뉴모니아 오자에나에 5050(Klebsiella pneumoniae ssp . ozaenae 5050), 크렙시엘라뉴모니아 204(Klebsiella pneumoniae 204), 크렙시엘라뉴모니아 5056( Klebsiella pneumoniae5056), 스타필로코커스아우레우스 I-049( Staphylococcus aureusI -049), 스타필로코커스아우레우스 I-050( Staphylococcus aureus I-050), 스타필로코커스아우레우스 I-051( Staphylococcus aureus I-051), 스타필로코커스아우레우스 I-052(Staphylococcus aureus I-052), 스타필로코커스아우레우스 I-053(Staphylococcus aureusI -053), 스타필로코커스아우레우스 I-054(Staphylococcus aureusI -054), 스트렙토코커스(디플로코커스)뉴모니아 7465(Streptococcus(Diplococcus)pneumoniae7465), 스트렙토코커스(디플로코커스)뉴모니아 7466( Streptococcus ( Diplococcus )pneumoniae7466), 스트렙토코커스( 디플로코커스 ) 뉴모니아 7978( Streptococcus ( Diplococcus ) pneumoniae 7978), 스트렙토코커스 ( 디플로코커스 ) 뉴모니아 10319( Streptococcus ( Diplococcus )pneumoniae 10319), 스트렙토코커스피로젠 8191( Streptococcus pyogenes 8191), 스트렙토코커스생귀니스 I-046( Streptococcus sanguinis I-046), 스트렙토코커스생귀니스 I-047(Streptococcussanguinis I-047), 스트렙토코커스생귀니스 I-048(Streptococcussanguinis I-048), 스타필로코커스헤몰리티쿠스 11042(StaphylococcusHemolyticus 11042), 엔테로코커스패칼리스 103015( Enterococcus faecalis 103015), 스트렙토코커스뮤탄스 10449( Streptococcusmutans 10449), 스트렙토코커스생기노서스 10713( Streptococcusanginosus 10713), 스트렙토코커스미티스 12261( Streptococcus mitis 12261), 스트렙토코커스살리바리우스 102503(Streptococcus salivarius 102503), 네이서리아시카 103345( Neisseria sicca 103345), 헤모필루스파라인플루엔자 7857( Hemophilus parainfluenzae 7857), 액티노바실러스( 헤모필루스 ) 액티노미세템코미탄 52.105(Actinobacillus(Hemophilus)actinomycetemcomitans52.105) 및 아이케넬라코 로덴 10596( Eikenellacorrodens10596 ).
상술한 3단락 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 100㎍/mL 이하의 핵산을 포함한다.
상술한 3단락 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 적어도 0.3mg/mL의 당류(saccharides)를 포함한다.
상술한 3단락 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 0.3 내지 4.5mg/mL의 당류를 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 적어도 하나의 당류 는 단당류, 이당류, 및 다당류로 이루어진 군에서 선택된다.
상술한 단락에 나타낸 추출물에 있어서, 적어도 하나의 다당류는 가지형 다당류(branched polysaccharide)이다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 적어도 하나의 당류는 화학적으로 변형된 것(chemicallymodified)이다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 1.5 내지 2.5mg/mL의 자유 아미노산을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 용해(lysis)는 pH 12.6 내지 13.4에서 수행된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 미립자(particulate) 및/또는 비용해성 성분들을 제거하기 위하여 처리된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 각 박테리아 균주는 프리온 질병(prion diseases)의 위험을 내포하지 않는 배지에서 배양된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 아스파트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 세린(serine), 히스티딘(histidine), 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 리신(lysine)으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산은 적어도 10% 라세미화된 것(racemized)이다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물의 자유 아미노산은 1 내지 80%의 D-아미노산을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물의 자유 아미노산은 10 내지 45%의 D-아미노산을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물의 자유 아미노산은 25 내지 35%의 D-아미노산을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은, D-아스파트산(aspartic acid) 및 D-아스파라긴(asparagine), D-글루타민 및 D-글루탐산, D-세린, D-메티오닌, D-히스티딘, D-알라닌, D-아르기닌, D-페닐알라닌, D-타이로신, D-류신, 및 D-리신, D-발린(valine), 및 D-테로닌(theronine)으로부터 선택되는 적어도 하나의 D-아미노산을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 D-아미노산 중 어느 하나의 농축액(concentration)은 1 내지 50%의 자유 아미노산 농축액을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 D-아미노산 중 어느 하나의 농축액(concentration)은 10 내지 40%의 자유 아미노산 농축액을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 D-아미노산 중 어느 하나의 농축액(concentration)은 15 내지 35%의 자유 아미노산 농축액을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 6 내지 75mg/mL의 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물은 6 내지 8mg/mL의 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 단백질은 30kDa 이하의 분자량을 가진다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 단백질은 10kDa 이하의 분자량을 가진다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 야생형(wild-type) LPS 민감성을 갖는 적어도 8마리의 쥐에 대한 살모넬라티피무리움(Salmonella thyphimurium)을 이용한 공격감염(challenge) 13일 이후 생존율은 적어도 70%이며, 상기 살모넬라티피무리움의 투입량(dose)은 적어도 8마리의 대조군 쥐들의 생존율이 60% 이하로 되도록 투여한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 생존율은 적어도 80%이다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 생존율은 적어도 90%이다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 나타낸 추출물에 있어서, 상기 추출물의 리물루스 변형세포 용해물(Limulus amoebocyte lysate,LAL) 크로모제닉(chromogenic) 테스트에 근거한 당량이, 5000ng 이하의 LPS 당량(equivalents)이다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 추출물을 포함한 의약 조성물.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 추출물의 유효량(effective amount)을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 질환의 악화 위험에 있거나 또는 이로부터 고통받는 대상(subject)의 치료방법.
상술한 단락의 치료방법에 있어서, 상기 대상은 동물 또는 가축 포유류(domestic mammal)이다.
상술한 어느 하나 또는 두 개의 단락에 있어서, 상기 호흡기 질환 또는 알레르기 증상은, 상부 및 하부 호흡기 감염, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 비인두염(감기, Nasopharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 목 통증(pharyngitis), 편도염 (tonsillitis), 후두염(laryngitis), 기관염(tracheitis), 인후염(laryngopharyngitis), 인플루엔자(influenza), 폐렴(pneumonia), 기관지 폐렴 (bronchopneumonia), 기관지염(bronchitis), 하부 호흡기 감염(lower respiratory infections), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 천식(allergic asthma), rhinitis(비염), 급성비인두염(nasopharyngitis), 인두통(pharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 편도염(tonsillitis), 후두염(laryngitis), 인후염(laryngotracheitis), 기관지염(bronchitis), 급성 하부 호흡기 감염을 동반한 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute lower respiratory infection), 급성 악화 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute exacerbation)이다.
모라셀라카타랄리스( Moraxella ( Branhamella )catarrhalis, Moraxella(Moraxella)catarrhalis), 헤모필루스인플루엔자( Haemophilus influenzae), 크렙시엘라뉴모니아 ( Klebsiella pneumoniae , 폐렴 막대균 ), 스타필로 코커스아우레우스( Staphylococcus aureus , 포도상구균), 스트렙토코커스뉴모니아( Streptococcus pneumoniae , 폐구균 ), 스트렙토코커스피로젠( Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스생귀니스 ( Streptococcus sanguinis , 연쇄상구균), 스타필로코커스헤몰리티쿠스( Staphylococcus Hemolyticus , 용혈성 포도상구균), 엔테로 코커스 패칼리스 ( Enterococcusfae faecalis ), 스트렙토코커스뮤탄스( Streptococcus mutans), 스트렙토코커스앵기노서스 ( Streptococcusanginosus ), 스트렙토코커스미티스( Streptococcus mitis ), 스트렙토코커스살리바리우스( Streptococcus salivarius), 네이서리아시카 ( Neisseria sicca ), 헤모필루스파라인플루엔 자( Hemophilus parainfluenzae ), 액티노바실러스 ( Actinobacillus ), 액티노미세템코미탄( actinomycetemcomitans ), 및 아이케넬라코로덴( Eikenellacorrodens )으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 박테리아 종에서 얻어진 추출물의 제조방법에 있어서,
(a) 프리온 질병의 위험을 내포하지 않는 배지 내에 각 박테리아 균주를 배양하는 단계;
(b) 초기 pH를 12 이상으로 하여 용해(lysing)하는 단계;
(c) (b)로부터의 생성물을 적어도 1회의 미세필터(microfilter) 및 적어도 1회의 한외필터(ultrafilter)를 거치게 하는 여과단계를 포함한다.
상술한 단락에 의한 제조방법에 있어서, 상기 추출물은 다음의 박테리아 종 각각의 적어도 하나의 균주(strain)으로부터 얻어진다: 모라셀라카타랄리 스(Moraxella( Branhamella )catarrhalis, Moraxella(Moraxella)catarrhalis), 헤모 필루스인플루엔자( Haemophilus influenzae ), 크렙시엘라뉴모니아( Klebsiella pneumoniae, 폐렴 막대균 ), 스타필로코커스아우레우스 ( Staphylococcus aureus , 포도상구균), 스트렙토코커스뉴모니아( Streptococcus pneumoniae , 폐구균 ), 스트렙토코커스피로젠( Streptococcus pyogenes ), 스트렙토코커스생귀니스( Streptococcus sanguinis, 연쇄상구균), 스타필로코커스헤몰리티쿠스( Staphylococcus Hemolyticus, 용혈성 포도상구균), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcusfae faecalis), 스트렙토코커스뮤탄스 ( Streptococcus mutans ), 스트렙토코커스앵기노서스( Streptococcusanginosus ), 스트렙토코커스미티스 ( Streptococcus mitis ), 스트렙토코커스살리바리우스( Streptococcus salivarius ), 네이서리아시카( Neisseria sicca), 헤모필루스파라인플루엔자 ( Hemophilus parainfluenzae ), 액티노바실러스( Actinobacillus ), 액티노미세템코미탄 ( actinomycetemcomitans ), 및 아이케넬라코로덴( Eikenellacorrodens ).
상술한 단락에 의한 제조방법에 있어서, 상기 추출물은 다음의 박테리아 종 각각의 적어도 하나의 균주(strain)으로부터 얻어진다: 모라셀라카타랄리스 3622(Moraxella(Branhamella)catarrhalis 3622), 모라셀라카타랄리스 3625(Moraxella(Branhamella)catarrhalis 3625), 모라셀라카타랄리스 I-045(Moraxella(Branhamella)catarrhalis I-045), 헤모필루스인플루엔자 8467(Haemophilusinfluenzae 8467), 크렙시엘라뉴모니아 오자에나에 5050(Klebsiella pneumoniae ssp . ozaenae 5050), 크렙시엘라뉴모니아 204(Klebsiella pneumoniae 204), 크렙시엘라뉴모니아 5056( Klebsiella pneumoniae5056), 스타필로코커스아우레우스 I-049( Staphylococcus aureusI -049), 스타필로코커스아우레우스 I-050( Staphylococcus aureus I-050), 스타필로코커스아우레우스 I-051( Staphylococcus aureus I-051), 스타필로코커스아우레우스 I-052(Staphylococcus aureus I-052), 스타필로코커스아우레우스 I-053(Staphylococcus aureusI -053), 스타필로코커스아우레우스 I-054(Staphylococcus aureusI -054), 스트렙토코커스(디플로코커스)뉴모니아 7465(Streptococcus(Diplococcus)pneumoniae7465), 스트렙토코커스(디플로코커스)뉴모니아 7466( Streptococcus ( Diplococcus )pneumoniae7466), 스트렙토코커스( 디플로코커스 ) 뉴모니아 7978( Streptococcus ( Diplococcus ) pneumoniae 7978), 스트렙토코커스 ( 디플로코커스 ) 뉴모니아 10319( Streptococcus ( Diplococcus )pneumoniae 10319), 스트렙토코커스피로젠 8191( Streptococcus pyogenes 8191), 스트렙토코커스생귀니스 I-046( Streptococcus sanguinis I-046), 스트렙토코커스생귀니스 I-047(Streptococcussanguinis I-047), 스트렙토코커스생귀니스 I-048(Streptococcussanguinis I-048), 스타필로코커스헤몰리티쿠스 11042(StaphylococcusHemolyticus 11042), 엔테로코커스패칼리스 103015( Enterococcus faecalis 103015), 스트렙토코커스뮤탄스 10449( Streptococcusmutans 10449), 스트렙토코커스생기노서스 10713( Streptococcusanginosus 10713), 스트렙토코커스미티스 12261( Streptococcus mitis 12261), 스트렙토코커스살리바리우스 102503(Streptococcus salivarius 102503), 네이서리아시카 103345( Neisseria sicca 103345), 헤모필루스파라인플루엔자 7857( Hemophilus parainfluenzae 7857), 액티노바실러스( 헤모필루스 ) 액티노미세템코미탄 52.105(Actinobacillus(Hemophilus)actinomycetemcomitans52.105) 및 아이케넬라코 로덴 10596( Eikenellacorrodens10596 ).
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 용해(lysis)는 초기 pH가 12.5 이상인 조건에서 수행된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 용해(lysis)는 초기 pH가 12.6 내지 13.4인 조건에서 수행된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 용해는 30 내지 60℃에서 40시간 내지 10일의 기간 동안 수행된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 미세필터는 0.45마이크론이며, 한외필터는 30KDa이다.
상술한 단락에 의한 제조방법에 있어서, 상기 (c)단계는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 포함한다.
상술한 단락에 의한 제조방법에 있어서, 상기 접선 유동 여과는 5 내지 15사이클 동안 수행한다.
상술한 단락에 의한 제조방법에 있어서, 상기 (c)단계는 상기 생성물을 0.2마이크론의 제2미세필터에 통과시키는 단계를 더 포함한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 (b)단계는 10 내지 120g/l의 박테리아 건조중량의 물질로 수행한다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 접선 유동 여 과는 도 1에 설명된 바와 같이 수행된다.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 있어서, 상기 접선 유동 여과는 도 1에 설명된 사행 모드(serpentine mode)로 수행된다.
상술한 단락들에 의한 제조방법 중 어느 하나에 의하여 얻어진 생성물.
상술한 단락들 중 어느 하나에 의한 제조방법에 의하여 생성된 어느 하나의 생성물의 유효량(effective amount)을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 질환의 악화 위험에 있거나 또는 이로부터 고통받는 대상(subject)의 치료방법.
상술한 단락에 의한 제조방법에 있어서, 상기 대상은 인간 또는 가축 포유류이다.

Claims (48)

  1. 모라셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피로젠(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 유래된 추출물에 있어서,
    상기 추출물은 0.3 mg/ml 이상의 당류 및 100 ug/ml 이하의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은, 모라셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스피로젠(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종의 균주 유래인 것을 특징으로 하는, 박테리아 종 유래 추출물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 박테리아 종의 균주는 모라셀라카타랄리스 3622(Moraxella catarrhalis 3622), 모라셀라카타랄리스 3625(Moraxella catarrhalis 3625), 모라셀라카타랄리스 I-045(Moraxella catarrhalis I-045), 헤모필루스인플루엔자 8467(Haemophilusinfluenzae 8467), 크렙시엘라뉴모니아 오자에나에 5050(Klebsiella pneumoniae ssp.ozaenae 5050), 크렙시엘라뉴모니아 204(Klebsiella pneumoniae 204), 크렙시엘라뉴모니아 5056(Klebsiella pneumoniae5056), 스타필로코커스아우레우스 I-049(Staphylococcus aureusI-049), 스타필로코커스아우레우스 I-050(Staphylococcus aureus I-050), 스타필로코커스아우레우스 I-051(Staphylococcus aureus I-051), 스타필로코커스아우레우스 I-052(Staphylococcus aureus I-052), 스타필로코커스아우레우스 I-053(Staphylococcus aureusI-053), 스타필로코커스아우레우스 I-054(Staphylococcus aureusI-054), 스트렙토코커스뉴모니아 7465(Streptococcus pneumoniae7465), 스트렙토코커스뉴모니아 7466(Streptococcus pneumoniae7466), 스트렙토코커스 뉴모니아 7978(Streptococcus pneumoniae 7978), 스트렙토코커스뉴모니아 10319(Streptococcus pneumoniae 10319), 스트렙토코커스피로젠 8191(Streptococcus pyogenes 8191), 스트렙토코커스생귀니스 I-046(Streptococcus sanguinis I-046), 스트렙토코커스생귀니스 I-047(Streptococcussanguinis I-047) 및 스트렙토코커스생귀니스 I-048(Streptococcussanguinis I-048)로부터 선택된 1종 이상의 균주인, 박테리아 종 유래 추출물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 0.3 내지 4.5mg/mL의 당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 당류는 단당류, 이당류, 및 다당류로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다당류는 가지형 다당류(branched polysaccharide)인 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 글루탐산(147.1g/mol)으로부터 계산된, 1.5 내지 2.5mg/mL 또는 1.5 내지 2mg/mL 또는 2 내지 2.5mg/mL의 자유 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 자유 아미노산은 아스파트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 세린(serine), 히스티딘(histidine), 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 리신(lysine)으로부터 선택된 하나 이상이며, 10%이상이 라세미화된 것(racemized)인 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 자유 아미노산은 1 내지 80%의 D-아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 자유 아미노산은 10 내지 45%의 D-아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 자유 아미노산은 25 내지 35%의 D-아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은, 6 내지 8mg/mL, 또는 5 내지 75mg/mL, 또는 10 내지 65mg/mL, 또는 20 내지 45mg/mL, 또는 5 내지 40mg/mL 또는 5 내지 20mg/mL, 또는 5 내지 10mg/mL의 하나 이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 하나 이상의 단백질은 30kDa 이하의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 하나 이상의 단백질은 10kDa 이하의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은,
    리물루스 변형세포 용해물(Limulus amoebocyte lysate,LAL) 크로모제닉(chromogenic) 테스트에 근거하여, 5000ng/ml 이하의 당량(equivalents)의 지질다당류 당량(LPS)을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제1항에 의한 추출물을 포함하는, 상부 및 하부 호흡기 감염, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 비인두염(감기, Nasopharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 목 통증(pharyngitis), 편도염 (tonsillitis), 후두염(laryngitis), 기관염(tracheitis), 인후염(laryngopharyngitis), 인플루엔자(influenza), 폐렴(pneumonia), 기관지 폐렴 (bronchopneumonia), 기관지염(bronchitis), 하부 호흡기 감염(lower respiratory infections), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 천식(allergic asthma), 비염(rhinitis), 급성비인두염(nasopharyngitis), 인두통(pharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 편도염(tonsillitis), 후두염(laryngitis), 인후염(laryngotracheitis), 기관지염(bronchitis), 급성 하부 호흡기 감염을 동반한 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute lower respiratory infection), 및 급성 악화 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute exacerbation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환에 대한 의약 조성물(pharmaceutical composition).
  26. 삭제
  27. 제25항에 있어서,
    상기 조성물을 적용하는 대상은 동물 또는 가축 포유류(domestic mammal)인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  28. 삭제
  29. 모라셀라카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크렙시엘라뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스피로젠(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 유래된 제1항의 추출물의 제조방법에 있어서,
    (a) 프리온 질병의 위험을 내포하지 않은 배지 내에 각 박테리아 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 각 균주를 12보다 큰 초기 pH에서 용해(lysis)하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 생성물을 1회 이상 미세필터(microfilter) 및 1회 이상 한외필터(ultrafilter)를 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 추출물은, 모라셀라카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크렙시엘라뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스피로젠(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종의 균주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 박테리아 종의 균주는 모라셀라카타랄리스 3622(Moraxella catarrhalis 3622), 모라셀라카타랄리스 3625(Moraxella catarrhalis 3625), 모라셀라카타랄리스 I-045(Moraxella catarrhalis I-045), 헤모필루스인플루엔자 8467(Haemophilusinfluenzae 8467), 크렙시엘라뉴모니아 오자에나에 5050(Klebsiella pneumoniae ssp.ozaenae 5050), 크렙시엘라뉴모니아 204(Klebsiella pneumoniae 204), 크렙시엘라뉴모니아 5056(Klebsiella pneumoniae5056), 스타필로코커스아우레우스 I-049(Staphylococcus aureusI-049), 스타필로코커스아우레우스 I-050(Staphylococcus aureus I-050), 스타필로코커스아우레우스 I-051(Staphylococcus aureus I-051), 스타필로코커스아우레우스 I-052(Staphylococcus aureus I-052), 스타필로코커스아우레우스 I-053(Staphylococcus aureusI-053), 스타필로코커스아우레우스 I-054(Staphylococcus aureusI-054), 스트렙토코커스뉴모니아 7465(Streptococcus pneumoniae7465), 스트렙토코커스뉴모니아 7466(Streptococcus pneumoniae7466), 스트렙토코커스 뉴모니아 7978(Streptococcus pneumoniae 7978), 스트렙토코커스뉴모니아 10319(Streptococcus pneumoniae 10319), 스트렙토코커스피로젠 8191(Streptococcus pyogenes 8191), 스트렙토코커스생귀니스 I-046(Streptococcus sanguinis I-046), 스트렙토코커스생귀니스 I-047(Streptococcussanguinis I-047), 및 스트렙토코커스생귀니스 I-048(Streptococcussanguinis I-048)로부터 선택된 1종 이상의 균주인, 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  32. 제29항에 있어서,
    상기 용해(lysis)는 초기 pH가 12.5 이상인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 용해(lysis)는 초기 pH가 12.6 내지 13.4인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  34. 제29항에 있어서,
    상기 용해의 일부는 초기 수산화 이온(hydroxide ion) 농도가 0.05 내지 0.4N인 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 용해의 일부는 초기 수산화 이온(hydroxide ion) 농도가 0.5 내지 1N인 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  36. 제29항에 있어서,
    상기 용해는 30 내지 60℃에서 40시간 내지 10일의 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 용해는 30 내지 40℃에서 20시간 내지 240시간의 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  38. 제29항에 있어서,
    상기 미세필터는 0.45마이크론이며, 한외필터는 30KDa인 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  39. 제29항에 있어서,
    상기 (c)단계는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 접선 유동 여과는 5 내지 15사이클 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  41. 제29항에 있어서,
    상기 (c)단계의 상기 생성물을 0.2마이크론의 제2미세필터에 통과시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  42. 제29항에 있어서,
    상기 (b)단계는 5 내지 120g/l의 박테리아 건조중량의 물질을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 (b)단계는 5 내지 90g/l의 박테리아 건조중량의 물질을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  44. 제29항에 있어서,
    상기 균주(strains) 중 일부는 보통의(moderate) 용해 조건 하에서 용해되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  45. 제29항에 있어서,
    상기 균주(strains) 중 일부는 강한(strong) 용해 조건 하에서 용해되는 것을 특징으로 하는 박테리아 종 유래 추출물의 제조방법.
  46. 제29항에 의한 제조방법에 의하여 얻어진 추출물.
  47. 제46항에 의한 추출물의 유효량(effective amount)을 포함하는, 상부 및 하부 호흡기 감염, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 비인두염(감기, Nasopharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 목 통증(pharyngitis), 편도염 (tonsillitis), 후두염(laryngitis), 기관염(tracheitis), 인후염(laryngopharyngitis), 인플루엔자(influenza), 폐렴(pneumonia), 기관지 폐렴 (bronchopneumonia), 기관지염(bronchitis), 하부 호흡기 감염(lower respiratory infections), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 천식(allergic asthma), rhinitis(비염), 급성비인두염(nasopharyngitis), 인두통(pharyngitis), 정맥두염(sinusitis), 편도염(tonsillitis), 후두염(laryngitis), 인후염(laryngotracheitis), 기관지염(bronchitis), 급성 하부 호흡기 감염을 동반한 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute lower respiratory infection), 및 급성 악화 폐쇄성 폐질환(obstructive pulmonary disease with acute exacerbation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환에 대한 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 조성물을 적용하는 대상은 동물 또는 가축 포유류(domestic mammal)인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
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BRPI0808351B1 (pt) Extrato bacteriano para doenças do trato digestivo ou urinário e processo para sua preparação

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