TWI434693B

TWI434693B - 用於呼吸失調症的細菌萃取物及其製備方法

Info

Publication number: TWI434693B
Application number: TW097133419A
Authority: TW
Inventors: Jacques Alain Bauer; Marco Salvagni; Jean-Pierre Leon Vigroux; Laetitia Chalvet; Carlo Chiavaroli
Original assignee: Om Pharma
Priority date: 2007-03-05
Filing date: 2008-09-01
Publication date: 2014-04-21
Also published as: TW200938212A; MX2009009452A; EP3332791A1; CN101663041A; CA2679843C; KR101527483B1; US9463209B2; SI2114421T1; KR20090122940A; JP2010520302A; EP2114421A2; AR111836A2; US20140205693A1; BRPI0808333B1; JP5693010B2; AU2008222865A1; ES2665002T3; IL200666A0; US20100227013A1; US8697154B2

Description

用於呼吸失調症的細菌萃取物及其製備方法

本申請案主張申請於2007年3月5日之美國臨時專利申請案第60/904,789號之優先權。

本發明係有關可用作適應症(例如呼吸失調症)的治療之得自細菌菌株的萃取物、包含該萃取物之組成物、和使用不引起朊蛋白病(prion disease)的風險之培養基製造該萃取物的方法。

【先前技術和發明內容】

本發明係有關可用於治療醫學症狀(例如呼吸失調症)的包含細菌萃取物之組成物。該萃取物可包含得自選自下列物種之培養物的細菌溶解產物：卡他莫拉菌(布蘭漢氏球菌屬)(Moraxella(Branhamella)catarrhalis )、卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)(Moraxella(Moraxella)catarrhalis )、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )、克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis )、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus )、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )、變異鏈球菌(Streptococcus mutans )、咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus )、緩鏈球菌(Streptococcus mitis )、唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius )(又稱草綠色鏈球菌(Streptococcus viridans ))、乾燥奈瑟菌(Neisseria sicca )、副流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae )、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)(Actinobacillus(Hemophilus)actinomycetemcomitans )、和侵蝕艾肯菌(Eikenella corrodens )。

在一些具體實例中，該萃取物包含至少一種得自各上述細菌物種之菌株，而在其他具體實例中，一種或更多種得自上列之特定菌株可被除去或用一種或更多種不同菌株取代。一些本發明之具體實例包含得自下列細菌菌株每一者之萃取物：卡他莫拉菌(布蘭漢氏球菌屬)3622、卡他莫拉菌(布蘭漢氏菌屬)3625、卡他莫拉菌(布蘭漢氏球菌屬)I-045、流感嗜血桿菌8467、肺炎克雷白菌臭鼻亞種(Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae )5050、克雷白氏肺炎菌204、克雷白氏肺炎菌5056、金黃色葡萄球菌I-049、金黃色葡萄球菌I-050、金黃色葡萄球菌I-051、金黃色葡萄球菌I-052、金黃色葡萄球菌I-053、金黃色葡萄球菌I-054、肺炎鏈球菌(雙球菌屬)(Streptococcus(Diplococcus)pneumoniae )7465、肺炎鏈球菌(雙球菌屬)7466、肺炎鏈球菌(雙球菌屬)7978、肺炎鏈球菌(雙球菌屬)10319、化膿鏈球菌8191、血鏈球菌I-046、血鏈球菌I-047、血鏈球菌I-048、溶血葡萄球菌11042、糞腸球菌103015、變異鏈球菌10449、咽峽炎鏈球菌10713、緩鏈球菌12261、唾液鏈球菌102503、乾燥奈瑟菌103345、副流感嗜血桿菌7857、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)52.105、和侵蝕艾肯菌10596。該等菌株係根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)寄存。名單中所指示之具有I-號碼的菌株由法國巴斯德研究所國家微生物菌種寄存所(Collection Nationale de Cultures des Microorganismes at the Institut Pasteur，25 rue du Dr. Roux，75724巴黎，法國)編入索引。所有其他菌株由倫敦國立標準菌種寄存所(National Collection of Type Cultures in London)編入索引。

在一些具體實例中，一種或更多種上列之特定菌株可被省略、或用來自相同物種或來自不同物種的細菌物種之不同菌株取代。例如，在一些具體實例中，一種或更多種或甚至全部的菌株溶血葡萄球菌11042、糞腸球菌103015、變異鏈球菌10449、咽峽炎鏈球菌10713、緩鏈球菌12261、唾液鏈球菌102503、乾燥奈瑟菌103345、副流感嗜血桿菌7857、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)52.105、和侵蝕艾肯菌10596可被省略。在其他具體實例中，莫拉菌屬(Moraxella )、克雷白氏菌屬(Klebsiella )、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、或血鏈球菌菌株之一或更多者可被省略。進一步地，為了幫助消化，亦可使用乳桿菌屬(Lactobacillus )菌株或細菌之另一菌株。

萃取物可在細胞於培養基中生長至適當光學密度之後藉由鹼溶解(alkaline lysis)之方法獲得。在一些具體實例中，細菌各自在不引起朊蛋白病相關疾病的風險或其他可透過攝取得自基於動物的培養基的產物傳染之疾病的風險之培養基生長。例如，在一些具體實例中使用基於植物的培養基(例如基於大豆的培養基)來生長細胞。在其他具體實例中，合成培養基係使用於細胞生長。在其他具體實例中，培養基可包括生物萃取物(例如酵母萃取物和馬血清)，其也不引起該疾病的風險。

也可過濾溶解產物以除去核酸和較大細胞碎片。由於過濾，在一些具體實例中，存在於萃取物中之核酸的量小於100微克/毫升。在一些具體實例中，也藉由過濾除去不溶性化合物，例如細胞壁碎片和降解不足之脂多醣(LPS)。因此，在一些具體實例中，所產生之萃取物包含可溶性分子成分且不包含顯著量之不溶或顆粒物質。

醣成分可保存在萃取物中，包括脂多醣(LPS)成分。在溶解方法期間，醣類可變成被化學修飾的，例如裂解成較小結構或用其他官能基取代。

在溶解方法期間胺基酸之外消旋作用也從天然蛋白質中所發現之自然存在的L-胺基酸產生D-胺基酸。D-胺基酸在增加萃取物的生物利用率上會是有益的，因為由D-胺基酸主要地或部份地構成之蛋白質在哺乳動物的腸中不被有效率地消化。因此，在溶解期間被化學修飾而包含D-胺基酸之萃取物中的抗原性分子留在病人的身體中較長時間，可能地允許較強免疫刺激作用。

雖然在先前技藝中已使用細菌萃取物來刺激免疫系統扺抗呼吸疾病，仍有對較佳標準化和控制該等萃取物的需要以便使其更安全、更有效、和較持久。例如，為了安全理由原先認為應從細菌萃取物除去醣類成分，包括可能有毒的脂多醣(LPS)成分。(參見例如，美國專利第5,424,287號)。然而，本發明提供一種產生充份化學修飾的LPS成分且安全地保留醣類之方法。保留該等成分可改良效能和提供該萃取物額外抗原。

例如，發明人已發現調節溶解作用之pH和時間可允許可能地過敏或有毒的細胞壁成分之充分降解。於較低pH或較短時間之先前溶解條件，對照之下，產生其中細胞壁成分和醣類化學修飾不足之萃取物。(參見例如，GB 2 021 415 A)。所產生之萃取物對欲安全投予之病患而言過敏原性過強。一般，發明人已發現在太低pH及/或在太短時間溶解之產物具有較高毒性、較低蛋白質萃取、和較低過濾性。

過濾方法也可影響所產生之萃取物的性質，如過濾器之孔徑，和在一些情形中，過濾器表面之化學性質，可改變被除去和保留的物質之類型。例如，一些本發明之具體實例使用一種設計用於保留醣類但除去其他分子成分(例如核酸)之過濾方法。

因此，本發明提供標準化細菌萃取物以幫助維持一致的安全和效能之參數。

發明之詳細說明定義

萃取物：萃取物，如定義在本文中，表示一種或更多種細菌菌株的溶解作用之後所獲得之物質。在一些情形中，該萃取物係僅得自一種菌株而在其他情形中萃取物係得自數種不同菌株之混合物。

鹼溶解：此為一種在鹼性條件下溶解細菌細胞之方法。

溶解產物：如使用在本文中，此術語表示一種得自細胞溶解步驟之細菌的萃取物。

過濾：一種過濾方法，如描述於本文中，表示萃取物或萃取物之混合物通過一種或更多種過濾器例如微過濾器(也就是微過濾)或超過濾器(也就是超過濾)。該過濾可不需要除去100%的被計劃除去之成分。在一些情形中，以數個通路或循環中重複過濾。

初pH：該術語表示於步驟(例如細菌溶解作用或過濾)之開始測量之pH。

醣類：醣，如定義在文中，包括單醣類、二醣類、以及較大醣類例如直鏈和支鏈多醣類。醣類也包括經取代或化學修飾之醣類，例如脂多醣類(LPS)和它們的化學修飾變體。

D-胺基酸：此術語係指以右旋異構形式存在之胺基酸，而不是以左旋異構形式存在的生物合成所產生之L-胺基酸。

外消旋作用：此術語指示L-胺基酸至少部份化學修飾成D-胺基酸。

避免基於朊蛋白(prion)的疾病之風險的培養基表示一種使用於製備該萃取物之任何階段而不包含取自動物(例如牛或羊)、或取自任何可傳染基於朊蛋白的疾病之其他動物的物質例如血清或肉萃取物之培養基。該培養基之例子包括基於植物的或合成培養基以及使用馬血清之培養基或包含取自不傳染朊蛋白病之動物物種的物質之培養基。基於朊蛋白的疾病之例子包括(例如)狂牛症、綿羊癢病、和庫賈氏症(Creutzfeld-Jacob disease)。

非動物培養基為一種不包括得自動物之成分的培養基。例子包括基於植物的(也就是植物性)培養基，例如大豆培養基、和合成培養基。

治療如使用在本文中表示現有感染之治療(例如)以及，預防或防止新感染之發展(例如)二者。

個體，如使用在本文中，表示任何動物個體，包括哺乳動物個體，例如人和馴養的哺乳動物。

應了解本文所定義和本發所使用之特定細菌菌株可包括得自本文所列舉的原寄存或其基因克隆之菌株，包括在較後時間再寄存之具有不同寄存碼名字但遺傳基因上被認為是與原寄存版本相同的菌株之菌株。

本文中所使用之數目是大約的，考慮在其測量中的固有誤差、捨入、和有效數字。

萃取物之製備

本發明之細菌萃取物可藉由發酵接著熱去活作用和鹼溶解及過濾而製備。對於各菌株，為了獲得足夠量之物質，發酵培養物可從工作種子批開始接著接種於較大發酵容器中。

各物種所使用之培養基可相同。然而，可引進補充生長因素以提高一些物種的生長。在一些具體實例中，避免基於朊蛋白的疾病之風險的培養基可使用於生長至少一些，或全部，菌株。例子包括非動物培養基例如基於植物的培養基和合成培養基。其他例子包括包括馬血清或另一動物萃取物之培養基，取自不引起朊蛋白病的威脅之動物物種，對照在可引起該風險之牛血清或肉存在下生長之菌株。在一些具體實例中，Ala-Gln二肽可加至培養基。本發明家觀察到Ala-Gln二肽，在一些具體實例中，用作細菌培養物之生長模擬器(simulator)。

發酵之後，從各菌株或從一系列菌株所產生之生質可藉由熱處理、濃縮、和冷凍去活化。細胞物質可用氫氧離子(例如來自NaOH)溶解。在一些具體實例中，2至130克/公升之細菌乾重的生質濃度可被溶解，例如從20至120克/公升，或從5至90克/公升，或從10至50克/公升，或從40至90克/公升。(生質濃度在本文中以每公升溶解作用之細菌乾重提供。生質濃度係藉由在小瓷皿中於105℃乾燥5毫升的物質直到其達到固定質量及然後以每公升克記錄該質量而測量)。例如，嗜血桿菌屬(Haemophilus )菌株可被溶解於15-90克/公升的生質濃度，例如從40至90克/公升，例如40、50、60、70、80、或90克/公升或被該等濃度限制之較小範圍(也就是40-50、70-90、等等)。鏈球菌屬(Streptococcus )菌株(例如)可被溶解於10至90克/公升，例如於10、20、30、40、50、60、70、80、或90克/公升或被該等濃度限制之較小範圍。莫拉菌屬菌株可被溶解於(例如)5至60克/公升、或於10-60克/公升，或於15-40克/公升，例如於5、10、20、30、40、50、或60克/公升或被該等濃度限制之較小範圍；克雷白氏菌屬菌株可被溶解於(例如)10至50克/公升，例如25-50克/公升，或10、20、30、40、或50克/公升或被該等濃度限制之較小範圍。葡萄球菌屬(Staphylococcus )菌株可被溶解於(例如)30至90克/公升，例如30、40、50、60、70、80、或90克/公升或被該等濃度限制之較小範圍。奈瑟氏球菌屬(Neisseria)菌株可被溶解於(例如)5至60克/公升，例如5、10、20、30、40、50、或60克/公升或被該等濃度限制之較小範圍。

在一些具體實例中，0.01N至1.2N的氫氧化物濃度可用於溶解作用(例如)從0.1至1N、或從0.05N至0.4N，例如0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、或0.4N、或被該等濃度限制之較小範圍、或從0.5N至1.0N，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0N、或被該等濃度限制之較小範圍。可使用鹼濃度以達成12或更高之初pH，大於12之pH，大於12.5之pH、或pH例如從pH12.0至pH 13.4之pH或12.6至13.4。例如，對於鏈球菌菌株，氫氧化物濃度可為0.1-0.7N、或0.2-0.5N，例如0.2、0.3、0.4、或0.5N或被該等濃度限制之較小範圍。對於莫拉菌屬或嗜血桿菌屬菌株，其可為0.05-0.7N、或0.15-0.5N，例如0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、或0.5N或被該等濃度限制之較小範圍。對於克雷白氏菌屬或葡萄球菌屬菌株，其可為0.1-0.7N、或0.15-0.4N例如0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、或0.4N或被該等濃度限制之較小範圍。

溶解溫度可為從30至60℃，例如從30-40℃、或從35-40℃，例如37℃。溶解作用之時間可從20小時或從40小時改變至數天，例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10、或甚至15天。例如，對於嗜血桿菌屬、鏈球菌屬、莫拉菌屬、和葡萄球菌屬菌株，可採用5-9天之時間，和對於克雷白氏菌屬和奈瑟氏球菌屬菌株可採用7-10天之時間。在一些具體實例中，各菌株可採用30-40℃、或35-40℃之溶解溫度，例如37℃，和溶解作用可發生經過72至210小時(3-9天)之時段，例如3天、4、5、6、7、8、及9天或被該等時間限制之小時或天之範圍(例如，3-4天、8-9天、等等)。應了解這些時間之範圍其中包括任何數目的天、小時、或分鐘。

在一些具體實例中，當使用一個以上相同菌屬之菌株時，該等菌株可一起或分開地溶解。該等菌株可在溶解作用之前或之後混合。

萃取物可藉由離心及/或過濾純化。例如，溶解產物可為於9000x重力離心，接著在0.2微米過濾器上過濾一次或更多回合。在一些情形中，可使用在較大孔過濾器上的過濾接著在0.2微米過濾器上過濾之連續回合。也可採用超過濾方法以便幫助從該萃取物萃取可溶性物質，例如，循環超過濾通過物以進一步微過濾。

在一些具體實例中，一種切向流過濾(tangential flow filtration，TFF)方法可用以過濾萃取物和用以從較大細胞碎片萃取可溶性分子。(參見圖1)。(參見例如，分離技術、醫藥和生物技術應用(Separations Technology,Pharmaceutical and Biotechnology Applications)，Wayne P. Olson，編者，Interpharm出版社，Buffalo Grove，IL，美國，第126至135頁-ISBN：0-935184-72-4)。在該類方法的開始，一種稀釋細菌溶解產物可儲存在第一個槽中。開始微過濾(MF)迴路，和泵抽產物。回收所產生之MF滯留物，而MF通過物被轉移到第二個槽。

到達適當程度的濃度之後，可開始超過濾(UF)迴路。為了從溶解產物連續萃取可溶性化合物，UF通過物可再循環回到第一槽而UF滯留物儲存在第二個槽中。在連續萃取期間，在槽1和2中之體積可藉由調節微過濾和超過濾通過物之速率調整。

用TFF或另一過濾方法可進行數個該萃取循環。在使用TFF之具體實例中，在終循環結束時，可關閉超過濾迴路和可單獨進行微過濾迴路和將MF通過物轉移到槽2。

微過濾迴路可裝設1.2微米至0.1微米之過濾器，例如0.65至0.2微米、或0.45微米之過濾器。交叉流可介於1000公升/小時米² (LHM)和3000LHM之間，例如介於1500和2500LHM之間、或2000LHM且具有0.6至2巴(例如介於0.8和1.5巴之間、或1.0巴)之透膜壓力(TMP)。超過濾迴路可裝設從10KDa至1000Kda(例如從10KDa至100KDa、或從10KDa至30KDa、或從30KDa至100Kda)之過濾器。交叉流可為介於30LHM和1000LHM之間，例如介於20和500LHM之間且具有0.2至1.5巴(例如介於0.4和1.2巴之間、或0.5巴)之TMP。

介於5和20滲濾體積之間可用以從細菌細胞壁萃取可溶性化合物。在一些具體實例中，使用介於8和15體積之間。因此(例如)在一些具體實例中，可使用介於5和15次循環之間的過濾，在一些情形中介於8和15次循環之間，例如8、9、10、11、12、13、14、或15次循環。

過濾之後，可進一步稀釋、濃縮或離心萃取物，如果需要。也可包括純化步驟以從該萃取物除去顆粒物質。例如，可進行另一使用較小孔過濾器(例如0.2微米過濾器)之微過濾。過濾之後，藉由Lowry測量之可溶性蛋白質的產率可大於50%、或可大於60%、或可為50至90%、或可為60-90%，例如。過濾之後，萃取物可在使用調配之前冷凍乾燥。

在一些本發明之具體實例中，可選擇一組溶解條件應用於一種或更多種細菌菌株。從40至90克/公升，或40、50、60、70、80、或90克/公升之流感嗜血桿菌NCTC 8467可被可被溶解72-200小時，例如72、96、120、150、或200小時。從10至95克/公升之一種或更多種鏈球菌菌株(例如10、20、40、60、80、90、或95克/公升)可被溶解72-210小時，例如72、96、120、150、或200小時。從15至80克/公升之一種或更多種雙球菌(Diplococcus )菌株(例如15、20、30、40、50、60、70、或80克/公升)可被溶解72-210小時，例如72、96、120、150、或200小時。從10至50克/公升之一種或更多種克雷白氏菌屬菌株(例如10、15、20、25、30、35、40、45、或50克/公升)可被溶解72-210小時，例如72、96、120、150、或200小時。從5至60克/公升之一種或更多種奈瑟氏球菌屬菌株(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、或60克/公升)可被溶解72-210小時、例如72、96、120、150、或200小時。從30至90克/公升之一種或更多種葡萄球菌屬菌株(例如30、40、50、60、70、80、或90克/公升)可被溶解72-210小時，例如72、96、120、150、200小時。在該等具體實例中，溶解作用可於35-40℃(例如於37℃)下進行。進一步地，“溫和”或“強”溶解條件可用於形成該萃取物或一組相似的菌株之各菌株。如使用在本文中，“溫和”溶解條件係指0.05至0.4N的氫氧離子濃度，例如0.1、0.2、0.3、或0.4N與剛給予於上之各菌株的時間、溫度、和生質參數一起。(例如流感嗜血桿菌NCTC 8467之35-40℃，40-90克/公升之生質和72-200小時)。如使用在本文中，“強”溶解條件係指0.5至1N的氫氧離子濃度，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1N，與剛給予於上之各菌株的時間、溫度、和生質參數一起。在一些具體實例中，可進行強及溫和二種溶解，且所產生之產物混合在一起。

在一些本發明之具體實例中，該萃取物可得自一種以上之細菌菌株，例如從至少一種革蘭氏陰性和至少一種革蘭氏陽性菌株。在溶解作用之前或之後可混合來自相同或不同物種之細菌菌株。在一些具體實例中，可混合菌株(例如)以獲得在混合物中各1-40%之體積或15-30體積%之各屬的細菌。在一些具體實例中，該萃取物可包含得自(例如)2、3、4、5或10個不同屬的細菌之溶解產物。例如5個屬之混合物可包含嗜血桿菌屬、莫拉菌屬、克雷白氏菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌菌株，包含血鏈球菌、化膿鏈球菌、和肺炎鏈球菌。一些肺炎鏈球菌菌株已知為(例如)雙球菌菌株。在一些該5個屬具體實例中，混合物可包含從5至15體積%之嗜血桿菌屬，例如7-10%、或7、8、或9%；從5至15體積%之雙球菌，例如7-10%或7、8、或9%；從5-20體積%之鏈球菌屬，例如7-15%、或8、9、10、11、或12%；從10至30體積%之克雷白氏菌屬，例如15-25%、或16、17、18、19、20、21、22、23、或24%；從10至30%體積之葡萄球菌屬，例如15-25%、或16、17、18、19、20、21、22、23、或24%；和從20至40體積%之奈瑟氏球菌屬，例如25-35%、或26、27、28、29、30、31、32、33、或34%。

細菌萃取物之化學性質

一些根據本發明之具體實例可包含(例如)5-75毫克/毫升的蛋白質、或10-65毫克/毫升，或20-45毫克/毫升，或5-40毫克/毫升，或5-20毫克/毫升，或5-10毫克/毫升，或6-8毫克/毫升的蛋白質或從5、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75毫克/毫升開始或結束之範圍；1.5至2.5毫克/毫升的游離胺基酸(A.A.)，或1.5至2毫克/毫升，或2至2.5毫克/毫升的游離A.A.，或從1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、或2.5毫克/毫升開始或結束之範圍的游離A.A.，從麩胺酸(147.1克/莫耳)計算；及0.3至4.5毫克/毫升的多醣類和單醣類、或0.3至4毫克/毫升，或0.4至4毫克/毫升，或0.5至3.5毫克/毫升，或0.6至3毫克/毫升或0.3至1毫克/毫升或從0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、或4.5毫克/毫升開始或結束之範圍的多醣類和單醣類(例如)例如0.4至0.5毫克/毫升。例如，一些具體實例包含約6至8毫克/毫升的蛋白質，1.5至2.5毫克/毫升的游離胺基酸(A.A.)，從麩胺酸(147.1克/莫耳)計算及/或約0.4至0.5毫克/毫升的多醣類和單醣類。蛋白質濃度係根據歐洲藥典2.5.33之方法2藉由Lowry分析測量。糖濃度係根據D. Herbert等人，Meth. Microbiol. 5B：266以下(1971)在酸水解和衍生化之後分析。麩胺酸鹽(麩胺酸)濃度係根據Roth M.，胺基酸之螢光反應(Anal.Chem.，43，880-882，(1971))藉由將胺基酸轉化至異吲哚衍生物和於340nm測量吸光度而測量。

在一些具體實例中，根據鱟變形細胞溶解物(limulus amoebocyte lysate，LAL)產色試驗LPS當量之濃度小於1000奈克/毫升，小於500奈克/毫升，小於200奈克/毫升，小於100奈克/毫升。

根據本發明之細菌的溶解作用可導致蛋白質之部份水解作用以及脫胺基作用、脫醯胺基作用、和胺基酸從L至D之部分外消旋化。在根據本發明萃取物之分析研究中，各觀察到代表D-天門冬胺酸、D-麩胺酸、D-絲胺酸、D-甲硫胺酸、D-組胺酸、D-丙胺酸、D-精胺酸、D-苯丙胺酸、D-酪胺酸、D-白胺酸、和D-離胺酸之峰。在該研究中該等物種之D-胺基酸的百分比範圍從3%至40%。因此，一些本發明之具體實例允許之絲胺酸、蘇胺酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、和離胺酸之一或更多者之外消旋化作用，例如所有的上述胺基酸、或任何一種上以但小於全部之上述胺基酸的選擇，(例如)例如，丙胺酸、苯丙胺酸和離胺酸。在一些具體實例中，至少10%的上述胺基酸之一或更多者可從D外消旋化變成L。在其他具體實例中，至少40%的上述胺基酸之一或更多者可變成外消旋。

根據本發明之細菌的溶解作用由於水解作用可導致成分分子之分子量從0至300kDa減少到0至100kDa、或0至60kDa。

細菌萃取物之生物活性

根據本發明之萃取物可有效治療罹患或於發展醫學症狀(例如呼吸失調症和過敏性反應或症狀)之風險的病患。根據本發明之萃取物可有效治療(例如)上和下呼吸道感染、異位性皮膚炎、鼻咽炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃腺炎、喉炎、氣管炎、咽喉炎、流行性感冒、肺炎、支氣管肺炎、支氣管炎、下呼吸道感染、過敏性鼻炎、過敏性氣喘、鼻炎、鼻咽炎、咽炎、鼻竇炎、扁桃腺炎、喉炎、喉氣管炎、支氣管炎、伴有急性下呼吸道感染之阻塞性肺部疾病、及伴有急性惡化之阻塞性肺部疾病。

萃取物之生物活性可藉由數種分析測量。例如，週邊血液單核細胞(PBMC)分析試驗從PBMC產生之細胞激素IL-6且可篩選萃取物刺激免疫系統的能力。例如，在一些具體實例中，用根據本發明萃取物刺激之PBMC的上澄液中測量之體外IL-6濃度範圍從2000皮克/毫升至70,000皮克/毫升，2000皮克/毫升至50,000皮克/毫升，2000皮克/毫升至30,000皮克/毫升，2000皮克/毫升至20,000皮克/毫升，2000皮克/毫升至10,000皮克/毫升，或5000皮克/毫升至70,000皮克/毫升，5000皮克/毫升至50,000皮克/毫升，5000皮克/毫升至30,000皮克/毫升，5000皮克/毫升至25,000皮克/毫升，或5000皮克/毫升至10,000皮克/毫升，或15,000皮克/毫升至25,000皮克/毫升。當LPS用作促動劑控制組(於0.01微克/毫升)，所得值視捐贈者而定，範圍從5,000皮克/毫升至70,000皮克/毫升。

小鼠一氧化氮(NO)試驗測量小鼠巨噬細胞所產生之NO，其也指示免疫刺激。例如，巨噬細胞產生NO以便殺死侵入細菌。在一些具體實例中，本發明具體實例之一氧化氮(NO)體外活性試驗於從0.001毫克/毫升至10毫克/毫升的可溶性乾重之濃度提供範圍從3μM至100μM一氧化氮、或3μM至90μM、3μM至80μM、3μM至70μM、3μM至60μM、3μM至50μM、3μM至40μM、3μM至30μM、3μM至20μM、3μM至10μM、或5μM至80μM、5μM至60μM、5μM至40μM、5μM至20μM、或10μM至80μM、10μM至70μM、10μM至50μM、10至30μM、或10μM至15μM之最大反應、或從3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100μM開始或結束之範圍。

在體外人類週邊血液單核細胞和小鼠巨噬細胞所觀察到之活性可視變數例如欲溶解的細菌乾重生質之量，也就是用於溶解之“起始原料”、鹼溶解之期間、和NaOH之初百分比或溶解作用中所使用之初pH而定。

體外活性試驗的組合例如用LPS濃度之測定的PBMC和NO例如藉由LAL也可提供關於給定的細菌萃取物之活性平衡對毒性風險的資訊。

本發明之萃取物也可具有扺抗飛沫微粒(aerosol)流行性感冒病毒感染，例如扺抗A/PR/8/34(H1N1)感染之活性。在一研究中(例如)根據本發明之萃取物於10毫克/鼠之劑量在小鼠中能夠賦予完全的免疫保護，如以死亡率、肺病毒滴定、臨床癥狀、和抗體力價判斷。對照之下，只有70%的對照組動物感染之後存活。

作為另一例子，當該等小鼠先用有效量的本發明之一些具體實例治療10天時，至少8隻具有野生型LPS敏感性之小鼠用鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium )攻毒13天之後的存活率為至少60%。可選擇用於攻毒之鼠傷寒沙氏桿菌的劑量以使未治療之小鼠或用水或包含賦形劑但沒有萃取物之空白調配物對照組治療之小鼠具有60%更少的存活率，例如50%更少。在一些情形中，萃取物治療之小鼠的存活率為至少70%，至少80%，至少80%，至少90%、或至少95%。

此外，本發明之具體實例也可抑制化合物48/80-刺激之肥胖細胞分泌組織胺至統計上顯著的程度，如下所進一步詳細地顯示。例如，在化合物48/80-刺激之肥胖細胞分析中本發明之具體實例可顯示(例如)介於0.0005和0.01毫克/毫升之間，例如介於0.0005和0.005毫克/毫升之間、或介於0.001和0.01毫克/毫升之間、或介於0.002和0.008毫克/毫升之間、或介於0.004和0.006毫克/毫升之間的IC-50值，例如。

包含細菌萃取物之組成物

可以許多不同之方式調配冷凍乾燥萃取物混合物用於最後投予。例如，可製備口服錠劑、膠囊、丸劑，以及液體調配物或氣霧劑。也可製備灌注或注射用調配物。本發明之具體實例可被調配(例如)成固體劑型或液體劑型'典型固體劑型可包括(例如)包含萃取物和視需要選擇之一種或更多種營養及/或膳食補充品之錠劑，例如膜衣錠、咀嚼錠、泡沸騰錠、舌下錠、粒劑、粉劑、或膠囊。固體劑型也可包含稀釋劑、填充劑、及/或其他賦形劑。可加入其他賦形劑成分例如防腐劑、著色劑、調味劑、和甜味劑。也可能製備粉末或顆粒調配物。液體劑型如溶液、糖漿、懸浮液、或滴劑也可利用於口服路徑。

實施例實施例1：細菌培養物實施例1.1：流感嗜血桿菌NCTC 8467的培養初始培養條件

培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉：3克/公升；磷酸氫二鈉：2克/公升；乙酸鈉：0.5克/公升；大豆蛋白40克/公升；葡萄糖：6克/公升；肌苷：0.1克/公升；氯化鈣：0.02克/公升；氯化鉀：0.1克/公升；碳酸氫鈉：0.6克/公升；丙酮酸鈉：0.06克/公升；金屬溶液(硫酸銅：3毫克/公升；氯化鐵：830毫克/公升；硫酸鋅：860毫克/公升；硫酸：1.1毫克/公升)：0.5毫升/公升；氯化血紅素：25毫克/公升；NADH(β-菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽還原之三水合物)25毫克/公升。溶解之後，將pH調整至7.2。將培養基滅菌之後，錐形瓶個別地用冷凍瓶之內含物(包含1.5毫升的冷凍細菌)接種且在37℃下培養8小時。然後將此培養物之十個等分試樣轉移到包含50毫升培養基之較大錐形燒瓶中，且在相同條件中再培養。具有1000毫升培養基之另一發酵步驟係以相同條件但用50毫克/公升之氯化血紅素和在接種之前加入50毫克/公升之NADH進行(10小時之後10毫升培養物1於700nm之OD：3.7，11小時之後1000毫升培養物於700nm之OD：13.5)。然後，將整個1000毫升培養內含物轉移到前發酵槽。

在前發酵槽中之培養條件

培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉：3克/公升；磷酸氫二鈉2克/公升；乙酸鈉：0.5克/公升；大豆蛋白腖40克/公升；葡萄糖6克/公升；肌苷0.1克/公升；氯化鈣0.02克/公升；氯化鉀0.1克/公升；碳酸氫鈉0.6克/公升；丙酮酸鈉0.06克/公升；金屬溶液：0.5毫升/公升；氯化血紅素：1毫克/公升；NADH：10毫克/公升，聚丙二醇：0.06-0.10毫升/公升。培養溫度調整於30℃，並攪拌及曝氣。在培養期間不調整pH。13小時之後，將2個前發酵槽轉移到發酵槽(於700nm的OD，16小時之後培養物1：1.53；8.5小時之後培養物2：1.90)。在滅菌條件下將前發酵槽之培養物轉移到發酵槽。

在發酵槽中的培養條件

培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉：3克/公升，磷酸氫二鈉：2克/公升；乙酸鈉0.5克/公升，大豆蛋白40克/公升；肌苷0.1克/公升；氯化鈣0.02克/公升；氯化鉀0.1克/公升，碳酸氫鈉0.6克/公升；丙酮酸鈉：0.06克/公升；金屬溶液：0.5毫升/公升；氯化血紅素1.5毫克/公升；NADH：15毫克/公升；聚丙二醇：0.02-0.04毫升/公升。

滅菌之後，將15克/公升葡萄糖加至該培養物。培養溫度調整於35℃，並攪拌及曝氣。在培養期間pH調整於6.8。8小時之後，藉由在90至100℃下熱處理將培養物(於700nm之OD，7.25小時之後培養物1：3.69；8.75小時之後培養物2：3.55)去活化和轉移到收穫槽。一旦去活化，將培養物轉移到離心機以便從培養基分離生質和濃縮。將收穫之生質儲存在連接至離心機之槽中。將離心機之滯留物(1000公升/小時)再循環至儲存槽而排出通過物。濃縮該生質且然後收穫於滅菌槽中。3.25小時之後，收穫31,768克之生質。濃縮之生質的OD於700nm為237.4。將生質分成一系列之包含425克乾重生質的等分試樣。然後將該等等分試樣冷凍於-15℃。

實施例1.2：葡萄球菌培養物在錐形瓶之培養條件

用於金黃色葡萄球菌049(StAu 049)、金黃色葡萄球菌I-050(StAu 050)、金黃色葡萄球菌I-051(StAu 051)、金黃色葡萄球菌I-052(StAu 052)、金黃色葡萄球菌I-053(StAu 053)和金黃色葡萄球菌(I-054(StAu 054)之培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉2克/公升；磷酸氫二鈉2克/公升；乙酸鈉0.5克/公升；大豆蛋白腖40克/公升；葡萄糖6克/公升。然後用1.5毫升的冷凍細菌接種0.012公升的培養基。該培養物在180rpm攪拌和pH 6.9下於37℃下培養7小時。進行從12至1000毫升的連續培養步驟。

在前發酵槽中之培養條件

製備與前述步驟相同的培養基用於前發酵槽，但加入聚丙二醇0.06-0.10毫升/公升將培養基於123℃就地滅菌30分鐘。將1000毫升的得自前述步驟之培養物轉移到前發酵槽並攪拌及曝氣。培養溫度調整於37±2℃。在培養期間不調整pH。6小時之後，將2個前發酵槽轉移到發酵槽。

在發酵槽中之培養

用於StAu 049之培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉2克/公升；磷酸氫二鈉2克/公升；乙酸鈉0.5克/公升；大豆蛋白40克/公升；聚丙二醇0.04毫升/公升。將培養基就地滅菌。將葡萄糖(14克/公升)加至該培養物。培養溫度調整於37℃並攪拌及曝氣。pH調整於6.4±0.5。7小時之後，藉由在90至100℃下熱處理將培養物去活化和轉移到收獲槽。然後藉由離心從培養基分離生質。將該生質分成一系列包含某量之乾重生質的等分試樣。

在各等分試樣中生質乾重為：StAu 049：327克，StAu 050：297克，StAu 051：375克，StAu 052：363克，StAu 053：446克和StAu 054：365克。

實施例1.3：克雷白氏菌培養物初始培養條件

用於克雷白氏肺炎菌NCTC 5050(Kiba 5050)、克雷白氏肺炎菌NCTC 5056(Kiba 5056)和克雷白氏肺炎菌NCTC 204(Kiba 204)之培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉2克/公升；磷酸氫二鈉2克/公升；乙酸鈉0.5克/公升；大豆蛋白40克/公升；葡萄糖6克/公升。然後用1.5毫升的冷凍細菌接種0.012公升的培養基。該培養物在37℃下培養10小時並攪拌及初pH設定於6.9。進行從0.012至1.0公升的連續培養步驟。

Kiba 5050在前發酵槽中之培養條件

製備與前述步驟相同的培養基用於前發酵槽，但加入聚丙二醇0.06毫升/公升。將一公升的得自前述步驟之培養物轉移到前發酵槽。培養溫度調整於37℃並攪拌及曝氣。在培養期間不調整pH。6小時之後，將二個前發酵槽轉移到發酵槽。

在發酵槽中的培養條件

用於Kiba 5050之培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉2克/公升；磷酸氫二鈉2克/公升；乙酸鈉0.5克/公升；大豆蛋白40克/公升和聚丙二醇0.02毫升/公升。將培養基就地滅菌和加入21克/公升葡萄糖。培養溫度調整於37℃並攪拌及曝氣。在培養期間pH調整於6.6。8小時之後，藉由在90至100℃下熱處理將培養物去活化和轉移到收獲槽。然後藉由離心從培養基分離生質。在各等分試樣中生質乾重為：Kiba 5050：393克，Kiba 5056：455克和Kiba 204：440克。

實施例1.4：卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis )培養物初始培養條件

用於卡他莫拉菌NCTC 3622(NeCa 3622)；卡他莫拉菌NCTC 3625(NeCa 3625)和卡他莫拉菌I-045(NeCa 045)之培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉：3克/公升；磷酸氫二鈉：2克/公升；乙酸鈉：0.5克/公升；大豆蛋白腖：40克/公升；澱粉：0.1克/公升；肌苷：0.1克/公升；氯化鈣：0.02克/公升；氯化鉀：0.1克/公升；碳酸氫鈉：0.6克/公升；丙酮酸鈉：0.06克/公升；金屬溶液：0.5毫升/公升(金屬溶液組成物：硫酸銅3毫克/公升；氯化鐵：830毫克/公升；硫酸鋅：860毫克/公升；硫酸：1.1毫克/公升)；二肽ALA-GLN(200毫克/毫升在0.9%NaCl溶液中)：10毫克/公升(用於第一培養步驟50毫克/公升；用於1公升培養步驟10毫克/公升)。然後用1.5毫升的冷凍細菌接種0.012公升的培養基。該培養物在37℃下培養10小時並攪拌。初pH設定於7.2。在相同條件中進行從0.012至1.0公升之連續培養步驟。

在前發酵槽中之培養

製備與前述步驟相同的培養基用於前發酵槽，但加入聚丙二醇0.06-0.10毫升/公升和ALA-GLN的濃度調整至4毫克/公升。將培養基就地滅菌。將一公升的得自前述步驟之培養物轉移到前發酵槽。培養溫度調整於33℃並攪拌及曝氣。在培養期間不調整pH。10小時之後，將2前發酵槽轉移到發酵槽。

在發酵槽中的培養條件

製備與錐形瓶步驟相同之培養基用於前發酵槽，但加入聚丙二醇0.06毫升/公升且沒有ALA-GLN或葡萄糖。培養溫度調整於33℃並攪拌及曝氣。在培養期間不調整pH。10.5小時之後，藉由在90至100℃下熱處理將培養物去活化和轉移到收獲槽。然後藉由離心從培養基分離生質。在各等分試樣中生質乾重為：NeCa 3622：361克，NeCa 3625：351克和NeCa 045：223克。

實施例1.5：鏈球菌培養物初始培養條件

用於肺炎鏈球菌NCTC 7465(StPn 7465)、肺炎鏈球菌NCTC 7466(StPn 7466)、肺炎鏈球菌NCTC 7978(StPn 7978)、肺炎鏈球菌NCTC 10319(StPn 710319)、血鏈球菌I-046(StSa 046)、血鏈球菌I-047(StSa 047)、血鏈球菌I-048(StSa 048)和化膿鏈球菌NCTC 8191(StPy 8191)之培養基係藉由將下列成分溶解在純化水中而製得：氯化鈉：2克/公升；磷酸氫二鈉：2克/公升；乙酸鈉：0.5克/公升；大豆蛋白：40克/公升；葡萄糖：6克/公升；馬血清：50毫升/公升。滅菌之後，用1.5毫升的冷凍細菌接種0.012公升的培養基。該培養物在37℃下培養14小時並攪拌。然後，將10毫升的此培養物轉移到包含150毫升培養基之燒瓶和再次在相同條件中培養10小時。在加至前發酵槽之前，在包含1000毫升之具有20毫升/公升馬血清的培養基的較大燒瓶中在相同條件下進行最後步驟。

在前發酵槽中之培養

製備與前述步驟相同的培養基用於前發酵槽，且加入聚丙二醇0.06毫升/公升和8毫升/公升的馬血清濃度。將一公升的前述培養物轉移到二個前發酵槽。培養溫度調整於30℃並攪拌。在培養期間不調整pH。14小時之後，將2前發酵槽轉移到發酵槽。

在發酵槽中的培養

製備與錐形瓶步驟相同之培養基用於前發酵槽，但加入聚丙二醇0.06毫升/公升和1.2毫升/公升的馬血清濃度。在培養期間加入15.75公斤的葡萄糖。培養溫度調整於37℃並攪拌。用濃KOH將pH調整於6.4。9.25小時之後，藉由在90至100℃下熱處理將培養物去活化和轉移到收獲槽。然後藉由離心從培養基分離生質。StSa 046、StSa 047、StSa 048和StPy 8191用滅菌空氣曝氣且培養不需要加入馬血清。在各等分試樣中生質乾重為StPn 7465：134克，StPn 7466：142克，StPn 7978：134克，StPn 10319：153克，StSa 046：246克，StSa 047：232克，StSa 048：353克和StPy 8191：269克。

實施例2：細菌溶解作用 HAIN 8467實施例2.1

得自細菌生質的發酵實施例1.1之Haln 8467的等分試樣在室溫下解凍和用生理食鹽水(8克/公升NaCl)稀釋至達到79克/公升乾重，以0.2M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養120小時。在溶解期間，監測pH以使減少不超過0.5pH單位。結果。82.2毫克/毫升的可溶性乾重(SDW)和32.4毫克/毫升的蛋白質(Prot)和6.2毫克/毫升的以麩胺酸(147.1克/莫耳)計算之總胺基酸(A.A)，以OPA測量，以OPA測量之2.40毫克/毫升的還原糖(醣)。

蛋白質濃度(Prot)係藉由Lowry分析測定(參見歐洲藥典2.5.33，屬於“總蛋白質-方法2”)。總游離胺基酸濃度(A.A)係藉由將胺基酸轉化成異吲哚衍生物和於340nm測量吸光度測量，根據Roth M.，胺基酸之螢光反應，Anal.Chem.，43，880-882，(1971)。結果以麩胺酸之當量表示。根據D.Herbert等人，Meth. Micmbiol. 5B：266以下(1971)酸水解和衍生化之後分析糖(醣)濃度。

HAIN 8467實施例2.2

將根據實施例1.1之生質稀釋至58.2克/公升。以0.2M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養5天。(可溶性乾重(SDW)：70.0毫克/毫升；Lowry蛋白質(Prot)：30.0毫克/毫升；胺基酸(A.A)：6.0毫克/毫升；醣：2.60毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：18.7μM，C2：20.8μM，C3：12.1μM。

HAIN 8467實施例2.3

將根據實施例1.1之生質稀釋至20克/公升。以0.045M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養5天。(SDW：29.99毫克/毫升。Prot：4.8毫克/毫升；醣：0.2毫克/毫升)。

HAIN 8467實施例2.4(OP0662L)

將根據實施例1.1之生質稀釋至12.5克/公升。以0.05M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：11.2毫克/毫升；Prot：<0.2毫克/毫升；A.A：2.0毫克/毫升；醣：0.4毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：15%D-Ala，9%D-Leu，45%D-Ser，21%D-Asx，15%D-Met，11%D-Phe，9%D-Glx。

HAIN 8467實施例2.5

將根據實施例1.1之生質稀釋至127克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：157.2毫克/毫升；Prot：86毫克/毫升；A.A：20.0毫克/毫升；醣：4.0毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：22%D-Ala，11%D-Leu，54%D-Ser，41%D-Asx，35%D-Met，32%D-Phe，29%D-GlX，6%D-Tyr。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：9.1μM，C2：-I0.5μM，C3：3.1μM。

HAIN 8467實施例2.6

將根據實施例1.1之生質稀釋至12.5克/公升。以0.05M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養3天。(SDW：10.8毫克/毫升；Prot：小於0.5毫克/毫升；A.A：2.0毫克/毫升；醣：0.4毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：10%D-Ala，9%D-Leu，56%D-Ser，22%D-Asx，16%D-Met，13%D-Phe，11%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：20.2μM，C2：26.7μM，C3：4.3μM。

HAIN 8467實施例2.7

將根據實施例1.1之生質稀釋至127克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養3天。(SDW：168.8毫克/毫升；Prot：90毫克/毫升；A.A：22毫克/毫升；醣：4.2毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：36%D-Ala，8%D-Leu，9%D-Ser，44%D-Asx，42%D-Met，37%D-Phe，37%D-Glx，37%D-Tyr。

HAIN 8467實施例2.8

將根據實施例1.1之生質稀釋至12.5克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：47.2毫克/毫升；Prot：小於0.2毫克/毫升；A.A：4.0毫克/毫升；醣：0.2毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：3%D-Ala，13%D-Leu，54%D-Ser，45%D-Asx，43%D-Met，42%D-Phe，41%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：7.5μM，C2：16.0μM，C3：8.6μM。

HAIN 8467實施例2.9

將根據實施例1.1之生質稀釋至127克/公升。以0.05MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養196小時。D-胺基酸百分比：14%D-Ala，5%D-Asx，11%D-Met，5%D-Glx。

STPY 8191實施例2.10

一得自實施例1.5之StPy 8191的等分試樣(包含269克之細菌物質)在室溫下解凍和用生理食鹽水(8克/公升NaCl)稀釋至達59.8克/公升乾重。以0.2M NaOH進行鹼化作用。然後，該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養192小時。在溶解期間，監測pH以使減少不超過0.5pH單位。(SDW：61.92毫克/毫升；Prot：31.68毫克/毫升；A.A.：7.2毫克/毫升；醣：7.2毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：22%D-Ala，11%D-Leu，54%D-Ser，41%D-Asx，35%D-Met，32%D-Phe，29%D-Glx，6%D-Tyr。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：4.9μM，C2：11.8μM，C3：6.7μM。

STSA 046實施例2.11

將根據實施例1.5之生質稀釋至30克/公升。以0.22M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。

STPY8191實施例2.12

將根據實施例1.5之生質稀釋至100克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：120.2毫克/毫升；Prot：45.6毫克/毫升；A.A：15.2毫克/毫升；醣：2.8毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：35%D-Ala，13%D-Leu，57%D-Ser，44%D-Asx，40%D-Met，39%D-Phe，43%D-Glx。

STPY8191實施例2.13

將根據實施例1.5之生質稀釋至12.7克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：12.5毫克/毫升；Prot：<0.2毫克/毫升；A.A：0.8毫克/毫升；醣：0.1毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：24%D-Ala，13%D-Leu，52%D-Ser，28%D-Asx，8%D-Met，8%D-Phe，23%D-Glx，6%D-Tyr。

STPY 8191實施例2.14

將根據實施例1.5之生質稀釋至100克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：41.4毫克/毫升；Prot：3.2毫克/毫升；A.A：4毫克/毫升；醣：1.5毫克/毫升)。

STPY 8191實施例2.15

將根據實施例1.5之生質稀釋至12.7克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：52.5毫克/毫升；Prot：0.8毫克/毫升；A.A：3.2毫克/毫升；醣：0.6毫克/毫升)。

STPY 8191實施例2.16

將根據實施例1.5之生質稀釋至100克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：147.2毫克/毫升；Prot：53.6毫克/毫升；A.A：24.8毫克/毫升；醣：5.4毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：44%D-Ala，26%D-Leu，11%D-Ser，45%D-Asx，43%D-Met，42%D-Phe，46%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量：0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：9.7μM，C2：17.4μM，C3：2.5μM。

STPY 8191實施例2.17

將根據實施例1.5之生質稀釋至12.7克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：14.7毫克/毫升；Prot：0毫克/毫升；A.A：0.8毫克/毫升；醣：0.2毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：28%D-Ala，9%D-Ser，36%D-Asx，33%D-Met，32%D-Phe，31%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：5.8μM，C2：12.1μM，C3：6.8μM。

STSA 046 實施例2.18

將根據實施例1(參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之生質稀釋至68克/公升。以0.25M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：90.72毫克/毫升；Prot：47.68毫克/毫升；A.A：9.36毫克/毫升；醣：2.48毫克/毫升)。

STSA 047 實施例2.19

將根據實施例1(參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之生質稀釋至68克/公升。以0.25M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。

STSA 047 實施例2.20

將根據實施例1(參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之生質稀釋至60克/公升。以0.33M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。

STSA 048 實施例2.21

將根據實施例1(參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之生質稀釋至62克/公升。以0.33M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。

STPY 8191 實施例2.22

將根據實施例1.5之生質稀釋至55克/公升。以0.33M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養4天。

STPN 7978實施例2.23

將根據實施例1.5之生質稀釋至38.7克/公升。以0.25M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：66.4毫克/毫升；Prot：25.4毫克/毫升；A.A：6.0毫克/毫升；醣：2.5毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(Cl)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：Cl：10.2μM，C2：20.7μM，C3：20.8μM。

STPN 7978實施例2.24

將根據實施例1.5之生質稀釋至30克/公升。以0.022M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：30.4毫克/毫升；Prot：2.20毫克/毫升；醣：0.40毫克/毫升)。

STPN 7978實施例2.25

將根據實施例1.5之生質稀釋至60克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：59毫克/毫升；Prot：17毫克/毫升；A.A：7.0毫克/毫升；醣1.8毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(Cl)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：9.1μM，C2：13.4μ M，C3：1.4μ M。

STPN 7978實施例2.26

將根據實施例1.5之生質稀釋至12.5克/公升。以0.1MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：17.8毫克/毫升；Prot：<0.2毫克/毫升；A.A：2.0毫克/毫升；醣：0.7毫克/毫升)。

STPN 7978實施例2.27

將根據實施例1.5之生質稀釋至60克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：43.6毫克/毫升；Prot：6毫克/毫升；A.A：10毫克/毫升；醣：1.5毫克/毫升)。

STPN 7978實施例2.28

將根據實施例1.5之生質稀釋至12.5克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：55.4毫克/毫升；Prot：2毫克/毫升；A.A：4毫克/毫升；醣0.7毫克/毫升)。

STPN 7978實施例2.29

將根據實施例1.5之生質稀釋至60克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：118.4毫克/毫升；Prot：31毫克/毫升；A.A：19毫克/毫升；醣：4.1毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：5.8μM，C2：12.1μM，C3：2.8μM。

STPN 7978實施例2.30

將根據實施例1.5之生質稀釋至12.5克/公升。以0.1MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：18.4毫克/毫升；Prot：<0.2毫克/毫升；A.A：2毫克/毫升；醣：0.5毫克/毫升)。

STPN 7465實施例2.31

將根據實施例1.5之生質稀釋至52.5克/公升。以0.25MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：69.4毫克/毫升；Prot：32.3毫克/毫升；A.A：6.0毫克/毫升；醣：1.7毫克/毫升)。

STPN 7466實施例2.32

將根據實施例1.5之生質稀釋至40.0克/公升。以0.25MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：60.6毫克/毫升；Prot：29.0毫克/毫升；A.A：6.0毫克/毫升；醣：1.50毫克/毫升)。

STPN 10319實施例2.33

將根據實施例1.5之生質稀釋至41.2克/公升。以0.25MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：60.4毫克/毫升；Prot：28.4毫克/毫升；A.A：6.0毫克/毫升；醣1.1毫克/毫升)。

STSA 046實施例2.34

將根據實施例1.5之生質稀釋至58.9克/公升。以0.25MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：83.2毫克/毫升；Prot：7.2毫克/毫升；A.A：8.39毫克/毫升；醣：2.16毫克/毫升)。

STSA 047 實施例2.35

將根據實施例1.5之生質稀釋至50.4克/公升。以0.25MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：60.64毫克/毫升；Prot：27.92毫克/毫升；A.A：7.2毫克/毫升；醣；3.52毫克/毫升)。

STSA 048 實施例2.36

將根據實施例1.5之生質稀釋至66.2克/公升。以0.25MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：72.96毫克/毫升；Prot：36.16毫克/毫升；A.A：7.2毫克/毫升；醣：3.28毫克/毫升)。

NECAI 045 實施例2.37

一得自實施例1.4之NeCa I045的等分試樣(包含223克的細菌物質)在室溫下解凍和用生理食鹽水(8克/公升NaCl)稀釋至達22.8克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養192小時。在溶解期間，監測pH以使減少不超過0.5pH單位。(SDW：41.29毫克/毫升；Prot：17.45毫克/毫升；A.A.：3.41毫克/毫升；醣：3.4毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOX產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：4.2μ M，C2：14.8μ M，C3：13.4μ M。

NECA I045實施例2.38

將根據實施例1.4之生質稀釋至20.5克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養3天。(SDW：36.6毫克/毫升；Prot：16.4毫克/毫升；A.A：3.63毫克/毫升；醣：0.77毫克/毫升)。

NECA I045實施例2.39

將根據實施例1.4之生質稀釋至51.0克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：75.69毫克/毫升；Prot：30.8毫克/毫升；A.A：10.8毫克/毫升；醣：1.14毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：40%D-Ala，45%D-Asx，42%D-Met，40%D-Phe，46%D-Glx，48%D-Lys。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(Cl)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：Cl：4.9μM，C2：14.3μM，C3：3.6μM。

NECA I045實施例2.40

將根據實施例1.4之生質稀釋至13克/公升。以0.1MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：15.08毫克/毫升；Prot：7.7毫克/毫升；A.A：1.5毫克/毫升；醣：0.28毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：21%D-Ala，67%D-Ser，31%D-Asx，25%D-Met，12%D-Lys。

NECA I045實施例2.41

將根據實施例1.4之生質稀釋至51.0克/公升。以0.1MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：41.23毫克/毫升；Prot：26.2毫克/毫升；A.A：4.6毫克/毫升：醣：0.98毫克/毫升)。

NECA I045實施例2.42

將根據實施例1.4之生質稀釋至13克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：48.43毫克/毫升；Prot：7.7毫克/毫升；A.A：4.3毫克/毫升；醣：0.22毫克/毫升)。

NECA I045實施例2.43

將根據實施例1.4之生質稀釋至51.0克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：83.02毫克/毫升；Prot：28.9毫克/毫升；A.A：15毫克/毫升；醣：1.11毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：44%D-Ala，48%D-Ser，47%D-Asx，45%D-Met，43%D-Phe，50%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：5.1μM，C2：12.0μM，C3：7.5μM。

NECA I045實施例2.44

將根據實施例1.4之生質稀釋至13克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：15.26毫克/毫升；Prot：8.6毫克/毫升；A.A：1.8毫克/毫升；醣0.22毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：31%D-Ala，42%D-Ser，38%D-Asx，36%D-Met，35%D-Phe，37%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：4.1μM，C2：13.9μM，C3：6.0μM。

NECA I045實施例2.45

將根據實施例1.4之生質稀釋至9克/公升。以0.66M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：20.62毫克/毫升；Prot：5.57毫克/毫升；醣：0.06毫克/毫升)。

NECA NCTC 3622實施例2.46

將根據實施例1.4之生質稀釋至20.1克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：35.69毫克/毫升；Prot：14.25毫克/毫升；A.A：3.4毫克/毫升；醣：0.71毫克/毫升)。

NECA NCTC3625實施例2.47

將根據實施例1.4之生質稀釋至9.7克/公升。以0.2M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：38.83毫克/毫升；Prot：15.54毫克/毫升；A.A：3.4毫克/毫升；醣：0.95毫克/毫升)。

KLPN 204實施例2.48

一得自KlPn 204實施例1.3的等分試樣(包含440克的細菌物質)在室溫下解凍和用生理食鹽水(8克/公升NaCl)稀釋至達37.7克/公升。以0.2M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養192小時。在溶解期間，監測pH以使減少不超過0.5pH單位。(SDW：51.77毫克/毫升；Prot：27.66毫克/毫升；A.A.：4.2毫克/毫升；醣：1.03毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.6μM，C2：2.8μM，C3：1.8μM。

KLPN 204實施例2.49

將根據實施例1.3之生質稀釋至9克/公升。以0.013N NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：25.71毫克/毫升；Prot：4.91毫克/毫升；醣0.51毫克/毫升)。

KLPN 204實施例2.50

將根據實施例1.3之生質稀釋至99克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：50.63毫克/毫升；Prot：15.4毫克/毫升；A.A：2.9毫克/毫升；醣：2.1毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：5%D-Ala，6%D-Asx。

KLPN 204實施例2.51

將根據實施例1.3之生質稀釋至13克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：52.69毫克/毫升；Prot：5.7毫克/毫升；A.A：2.3毫克/毫升；醣：0.3毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：36%D-Ala，8%D-Ser，45%D-Asx，7%D-Met，27%D-Phe，40%D-Glx，29%D-Lys。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.5μM，C2：0.8μM，C3：6.0μM。

KLPN 204實施例2.52

將根據實施例1.3之生質稀釋至99克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：136.34毫克/毫升；Prot：58.9毫克/毫升；A.A：20.6毫克/毫升；醣：3.4毫克/毫升)。

KLPN 204實施例2.53

將根據實施例1.3之生質稀釋至13克/公升。以0.1NNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：18.06毫克/毫升；Prot：6.3毫克/毫升；A.A：1.1毫克/毫升；醣：0.3毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.5μM，C2：1.6μM，C3：1.9μM。

KLPN 204實施例2.54

將根據實施例1.3之生質稀釋至99克/公升。以0.1M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：58.06毫克/毫升；Prot：20毫克/毫升；A.A：4.6毫克/毫升；醣2.7毫克/毫升)。

KLPN 204實施例2.55

將根據實施例1.3之生質稀釋至13克/公升。以0.7M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：52.57毫克/毫升；Prot：5.7毫克/毫升；A.A：4.0毫克/毫升；醣：0.3毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：43%D-Ala，25%Val，5%D-Ser，46%D-Asx，46%D-Met，45%D-Phe，44%D-GlX，38%D-Lys。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOX產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.5μM，C2：0.6μM，C3：2.6μM。

KLPN 5056實施例2.56

將根據實施例1.3之生質稀釋至39.4克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：52.69毫克/毫升；Prot：27.83毫克/毫升；A.A：4.0毫克/毫升；醣：1.09毫克/毫升)。

KLPN 5050實施例2.57

將根據實施例1.3之生質稀釋至34.2克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：48.23毫克/毫升；Prot：26.57毫克/毫升；A.A：4.0毫克/毫升；醣：1.03毫克/毫升)。

STAU I051實施例2.58

一得自實施例1.2之StAu1051的等分試樣(包含375克的細菌物質)在室溫下解凍和用生理食鹽水(8克/公升NaCl)稀釋至達55.2克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養192小時。在溶解期間，應監測pH以使減少不超過0.5pH單位。(SDW：66.4毫克/毫升；Prot：34.08毫克/毫升；A.A.：6.4毫克/毫升；醣：0.64毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOX產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.6μM，C2：0.8μM，C3：1.4μM。

STAU I051實施例2.59

將根據實施例1.2之生質稀釋至51克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養9天。(SDW：65.31毫克/毫升；Prot：25.56毫克/毫升；A.A：6.57毫克/毫升；醣：0.98毫克/毫升)。

STAU I051實施例2.60

將根據實施例1.2之生質稀釋至81克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。(SDW：137.2毫克/毫升；Prot：51.2毫克/毫升；A.A：20.8毫克/毫升；醣：1.6毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：51%D-Ala，11%D-Ser，43%D-Asx，37%D-Met，35%D-Phe，43%D-Glx。以活性乾重的毫克/毫升表示之Nox產量，0.02毫克/毫升(Cl)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：Cl：0.6μM，C2：0.8μM，C3：1.3μM。

STAU I051實施例2.61

將根據實施例1.2之生質稀釋至13克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：55.7毫克/毫升；Prot：4.8毫克/毫升；A.A：4.8毫克/毫升；醣：0.2毫克/毫升)。

STAU I051實施例2.62

將根據實施例1.2之生質稀釋至81克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：130.1毫克/毫升；Prot：47.2毫克/毫升；A.A：24.8毫克/毫升；醣：1.4毫克/毫升)。

STAU I051實施例2.63

將根據實施例1.2之生質稀釋至13克/公升。以0.1MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：18.4毫克/毫升；Prot：4.8毫克/毫升；A.A：2.4毫克/毫升；醣：0.2毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.5μM，C2：0.6μM，C3：1.3μM。

STAU I051實施例2.64

將根據實施例1.2之生質稀釋至81克/公升。以0.7MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：134.6毫克/毫升；Prot：48毫克/毫升；A.A：25.6毫克/毫升；醣：1.5毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：56%D-Ala，10%D-Ser，45%D-Asx，42%D-Met，39%D-Phe，73%D-Tyr，49%D-GlX。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.6μM，C2：0.7μM，C3：1.1μM。

STAU I051實施例2.65

將根據實施例1.2之生質稀釋至13克/公升。以0.1MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養10天。(SDW：17.9毫克/毫升；Prot：5.6毫克/毫升；A.A：2.4毫克/毫升；醣：0.2毫克/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.02毫克/毫升(C1)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3)：C1：0.5μM，C2：0.6μM，C3：3.7μM。

STAU I049實施例2.66

將根據實施例1.2之生質稀釋至52.8克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：70.08毫克/毫升；Prot：34.4毫克/毫升；A.A：6.4毫克/毫升；醣：0.64毫克/毫升)。

STAU I050實施例2.67

將根據實施例1.2之生質稀釋至47.5克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：64.32毫克/毫升；Prot：32.24毫克/毫升；A.A：6.4毫克/毫升；醣：0.64毫克/毫升)。

STAU I050實施例2.68

將根據實施例1.2之生質稀釋至48.5克/公升。以0.033M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。

STAU I052實施例2.69

將根據實施例1.2之生質稀釋至56.9克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：62.72毫克/毫升；Prot：30.8毫克/毫升；A.A：6.4毫克/毫升；醣：0.72毫克/毫升)。

STAU I053實施例2.70

將根據實施例1.2之生質稀釋至67.3克/公升。以0.2MNaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：68.8毫克/毫升；Prot：32.24毫克/毫升；A.A：6.4毫克/毫升；醣：1.2毫克/毫升)。

STAU I050實施例2.71

將根據實施例1.2之生質稀釋至63.6克/公升。以0.2M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養8天。(SDW：68.96毫克/毫升；Prot：24.56毫克/毫升；A.A：6.4毫克/毫升；醣：2.56毫克/毫升)。

實施例3：溶解產物之純化實施例3.1：革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌株之澄清萃取物

混合2公升的實施例2.57和2公升的實施例2.66，以加入濃HCl將pH調整至12.0，和用2公升的8克/公升NaCl溶液稀釋混合物。將稀釋之混合物轉移到微過濾(MF)槽。微過濾單元使用於蛇形模式之0.45微米切向流過濾過濾器(PALL Procette PES 0.45微米)(參見圖1)。交叉流調整於2000公升/小時米² (LHM)和透膜壓力(TMP)於1.3巴。將微過濾通過物轉移到超過濾(UF)槽。

一旦混合物在微過濾槽之體積達到初體積之一半，啟動UF單元。超過濾單元使用30kDa切向流過濾過濾器(PALL Centrasette PES 30kD)。交叉流流調整於1000LHM和TMP於0.5巴。

在MF和UF槽中之體積維持於相同液位。在各滲濾體積，蛋白質濃度係藉由Bradford方法測量。[在該技藝中Bradford方法為標準。不需要引用參考，除非劑量之不同方式，該方法產生顯著不同的結果]。在UF槽中該Bradford蛋白質含量在1滲濾體積(DFV)之後為26.8毫克/毫升，4 DFV之後為34.8毫克/毫升，和9 DFV之後為37.2毫克/毫升。在滲濾期間微過濾之滲透通量為15LHM。14滲濾體積之後，停止UF，和在MF槽中濃縮產物。產物包含15.9毫克/毫升蛋白質。然後將產物稀釋至7.4毫克/毫升和通過0.2微米滅菌過濾器過濾。(可溶性乾殘餘物(SDR)：21.0毫克/毫升，Prot：7.4毫克/毫升，A.A.：1.2毫克/毫升，醣類(醣)：0.3毫克/毫升，氯化物：4.6毫克/毫升)。以Lowry蛋白質的毫克/毫升表示之NOx產量，0.03毫克/毫升(C1)，0.3毫克/毫升(C2)，和3.0毫克/毫升(C3)：C1：5.8μM，C2：11.4μM，C3：1.2μM。

實施例3.2：Kiba單菌株

將4公斤的實施例2.57調整至pH 12.0和用4公升的8克/公升NaCl溶液稀釋。將稀釋之溶解產物轉移到微過濾槽。

微過濾參數為：交叉流2000 LHM，TMP 1.3巴，截切：0.45微米。超過濾參數為：交叉流1000 LHM，TMP 0.5巴，截切(cut off)：30kDa，滲濾體積之數目：8。

將產物稀釋至7.0毫克/毫升和通過0.2微米滅菌過濾器過濾。(SDR：18.0毫克/毫升，Prot：7.0毫克/毫升，A.A.：0.8毫克/毫升，醣：0.3毫克/毫升)。以Lowry蛋白質的毫克/毫升表示之NOx產量，0.03毫克/毫升(C1)，0.3毫克/毫升(C2)，和3.0毫克/毫升(C3)：C1：5.2μM，C2：9.8μM，C3：1.1μM。

實施例3.3：Moraxella單菌株

將2公斤的實施例2.37調整至pH 10.7和用3公升的8克/公升NaCl溶液稀釋。將稀釋之溶解產物轉移到微過濾槽。

微過濾參數為：交叉流2000 LHM，TMP 1.3巴，截切：0.45微米。超過濾參數為：交叉流1000 LHM，TMP 0.5巴，截切：30kDa滲濾體積之數目：8。

將產物稀釋至7.0毫克/毫升和通過0.2微米滅菌過濾器過濾。(SDR：19.4毫克/毫升，Prot：6.8毫克/毫升)。

實施例3.4：肺炎(Pneumoniae)單菌株

將5.0公斤的實施例2.32調整至pH 12.27和用5.0公升之8克/公升NaCl溶液稀釋。將稀釋之溶解產物轉移到微過濾槽。

微過濾參數為：交叉流2000 LHM，TMP 1.3巴，截切：0.45微米。超過濾參數為：交叉流1000 LHM，TMP 0.5巴，截切：30kDa，滲濾體積之數目：8。

將產物稀釋至7.0毫克/毫升和通過0.2微米滅菌過濾器過濾。(SDR：23.3毫克/毫升，Prot：4.3毫克/毫升)。

實施例3.5

混合500毫升的實施例2.45、500毫升的實施例2.47、和500毫升的實施例2.37且於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。用HCl將pH調整至10.5。

實施例3.6

混合300毫升的實施例2.23之溶解產物、300毫升的實施例2.31、300毫升的實施例2.32、和300毫升的實施例2.33和於9000 x g離心30分鐘。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。用HCl將pH調整至10.5。分析結果：(SDR：63.60毫克/毫升，Prot：23.00毫克/毫升，A.A.：6.00毫克/毫升，醣：1.60毫克/毫升)。

實施例3.7

混合300毫升的實施例2.48、300毫升的實施例2.56、和300毫升的實施例2.57和於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。用HCl將pH調整至10.5。(SDR：50.40毫克/毫升，Prot：22.30毫克/毫升，A.A.：4.0毫克/毫升，醣：0.97毫克/毫升)。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx 產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：1.06μM，C2：3.19μM，C3：7.62μM。

實施例3.8：

混合200毫升的實施例2.58、200毫升的實施例2.66、200毫升的實施例2.67、200毫升的實施例2.69、200毫升的實施例2.70和200毫升的實施例2.71和於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。用HCl將pH調整至10.5。(SDR：65.12毫克/毫升，Prot：24.80毫克/毫升，A.A.：7.2毫克/毫升，醣：1.12毫克/毫升)。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：0.76μM，C2：1.16μM，C3：3.79μM。

實施例3.9：

混合500毫升的實施例2.46、500毫升的實施例2.47和500毫升的實施例2.37和於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。用HCl將pH調整至10.5。(SDR：38.15毫克/毫升，Prot：13.5毫克/毫升，A.A.：3.4毫克/毫升，醣：0.80毫克/毫升)。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：2.25μM，C2：5.25μM，C3：14.21μM。

實施例3.10

混合500毫升的實施例2.34、500毫升的實施例2.35、500毫升的實施例2.36、和500毫升的實施例2.10和於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。用HCl將pH調整至10.5。(SDR：69.6毫克/毫升，Prot：28.00毫克/毫升。A.A.：7.2毫克/毫升，醣：2.48毫克/毫升)。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：0.95μM，C2：1.21μM，C3：4.44μM。

實施例3.11

10毫升的實施例2.61之溶解產物和10毫升的實施例2.27分開地於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。混合3毫升的各上澄液。用HCl將pH調整至7.2。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOX產量，0.01毫克/毫升(Cl)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：0.34μM，C2：0.66μM，C3：1.33μM。

實施例3.12

10毫升的實施例2.58和10毫升的實施例2.61分開地於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。混合3毫升的各上澄液。用HCl將pH調整至7.6。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：0.40μM，C2：0.44μM，C3：0.71μM。

實施例3.13

10毫升的實施例2.9和10毫升的實施例2.8分開地於9000 X g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。1.5毫升的第一溶解產物(實施例2.9)與4.5毫升的第二溶解產物(實施例2.8)混合。用HCl將pH調整至7.2。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：8.7μM，C2：16.90μM，C3：21.1μM。

實施例3.14

10毫升的實施例2.2和10毫升的實施例2.8分開地於9000 x g離心。上澄液通過具有孔隙度0.8微米、0.45微米和0.2微米之連續過濾器過濾。混合3毫升的各上澄液。用HCl將pH調整至7.5。以可溶性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.01毫克/毫升(C1)，0.1毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3)：C1：9.2μM，C2：11.3μM，C3：17.2μM。

實施例3.15

將13.2公升的得自實施例2.2(參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之溶解作用、48.6公升的得自實施例3.9之混合物溶解作用、36.6公升的得自實施例3.7之混合物溶解作用、36公升的得自實施例3.8之混合物溶解作用、14.4公升的實施例3.6、和18.4公升的實施例3.10混合在一起和用8克/公升NaCl溶液稀釋至334.4公升。在雙微過濾和超過濾迴路系統中藉由切向流過濾純化溶液，如實施例3.1中所述。(SDW：21.0毫克/毫升；Prot：6.4毫克/毫升；A.A：1.9毫克/毫升；醣0.45毫克/毫升)。D-胺基酸百分比：42%D-Ala，12%Leu，53%D-Ser，37%D-Asx，35%D-Met，32%D-Phe，28%D-Glx，8%D-Tyr，16%Lys。以Lowry蛋白質的毫克/毫升表示之NOx產量，0.03毫克/毫升(C1)，0.3毫克/毫升(C2)，和3.0毫克/毫升(C3)：C1：9.3μM，C2：14.3μM，C3：11.5μM。

實施例4：在較低pH條件下之細菌溶解作用的比較例

實施例4代表一種以本發明範圍外的鹼性條件進行之方法。用以進行細菌的溶解作用之NaOH濃度低於0.1%，導致較低的pH值。

混合下列溶解產物：1.18公斤的實施例2.24、3.0公斤的實施例2.49、2.95公斤的實施例2.69、1.08公斤的實施例2.4、1.51公斤的實施例2.11、和3.98公斤的實施例2.45。用NaCl溶液8克/公升將六公斤混合物稀釋至12公斤和將pH調整至pH 12.0。微過濾參數為：交叉流2000LHM，TMP 1.3巴，截切：0.45微米。超過濾參數為：交叉流1000LHM，TMP 0.5巴，截切：30kDa，滲濾體積之數目：12。(SDR：19.4毫克/毫升，Prot：3.1毫克/毫升，A.A.：2.0毫克/毫升，醣：0.1毫克/毫升，LAL：20140EU/毫升)。以活性乾重的毫克/毫升表示之NOx產量，0.03毫克/毫升(C1)，0.3毫克/毫升(C2)，和3.0毫克/毫升(C3)：C1：9.3μM，C2：14.3μM，C3：11.5μM。

實施例5：瑞士乳桿菌(Lactobaccilus helveticus)之溶解作用

藉由在植物性培養基上發酵獲得之瑞士乳桿菌的細菌生質之等分試樣在室溫下解凍和用純化水稀釋至達80克/公升之乾重濃度。以0.2M NaOH進行鹼化作用。該溶解作用在連續攪拌下於35-40℃培養2天。在溶解期間，監測pH以使減少不超過0.5pH單位。

實施例6：在小鼠中免疫預防飛沫微粒流行性感冒病毒感染

此實驗針對藉由評估其預防病毒(即H1N1)之效能研究某些本發明具體實例之非特異性免疫活性。六週大之雌BALB/c小鼠係購自Bundesinstitut fr Risikobewertung，柏林，且用於所有的實驗。將該等動物維持在於22℃之周圍溫度和60±5%之相對濕度的正常條件下。光方案設定於12：12小時之光暗循環。用標準饍食粒(Altromin 1314，Altromin，Lage，德國)餵食動物和隨意提供自來水。

預治療

將總計60隻小鼠分成各20隻小鼠之三組，且為2個治療組和1個對照組。每天用每隻小鼠1毫克或10毫克預治療一次動物(2組)連續10天、或PBS對照組(1組)。預治療結束時，給予所有的小鼠一種小鼠適應株A/PR/8/34(H1N1)流行性感冒病毒之飛沫微粒。使用此菌株之小鼠的LD₅₀ 通常藉由鼻內路徑為10^-4.5 和藉由飛沫微粒路徑為10^-1.7 。在這些實驗中選擇用於攻毒感染之劑量以提供能夠引起明確症狀流行性感冒病毒感染但不是100%致死的稀釋。

每天觀察10隻小鼠組之死亡率經10天。呈現於圖3中之結果顯示在此實驗之劑量條件下10毫克/小鼠劑量之該萃取物可以給予完全預防再感染。對照之下，僅70%的控制組小鼠在流行性感冒病毒感染之後存活。在接受1毫克/小鼠之藥物的組別中存活為70%。流行性感冒病毒感染之後觀察治療小鼠之臨床症狀。

每天觀察10隻小鼠之各組的流行性感冒病毒感染之臨床症狀。臨床症狀評分顯示於下表中。投予10毫克劑量之該萃取物的動物2天後顯示輕臨床症狀且顯然地比對照組小鼠早健康，指示較高劑量的有利效果。在臨床得分中1毫克劑量-治療組和對照組之間沒有顯著不同。

治療小鼠之流行性感冒血球凝集抑制抗體力價

每組3隻小鼠，在第一次和第二次感染之後，在流行性感冒病毒攻毒之後第10天收集血清。將得自免疫動物之血清儲存於-20℃下。用受體破壞酶(receptor-destroying enzyme)預處理所有的血清以除去非特異性抑制劑。流行性感冒血球凝集抑制(HI)試驗係使用由世界衛生組織(WHO，2002)推薦之標準步驟，在微量滴定板中使用0.5%雞紅血球細胞和4個血細胞凝集單位進行。顯示預防流行性感冒A/PR/8/34(H1N1)病毒之幾何平均HI抗體力價的結果呈現在下表中。第一次注射之後治療組和對照組之間沒有顯著不同。

因此，第一次(原)感染之後21天用A/PR/8/34流行性感冒病毒給予小鼠第二次(增強)攻毒感染。如上所示用A/PR/8/34(H1N1)病毒攻毒之後，抗體力價之大小增加。用10毫克/小鼠劑量之OM-85BV觀察到較高程度之HI抗體力價。對照之下，1毫克/小鼠劑量具有低於10毫克/小鼠

劑量之藥物的抗體力價

在所檢測之肺病毒中治療組和對照組之間沒有顯著不同。然而，在投予10毫克劑量之根據本發明萃取物的動物中，用小鼠-病原性流行性感冒A/PR/8/34病毒飛沫微粒感染之後的臨床症狀比對照組至少晚一整天發生，和實驗組也顯然地比控制組小鼠早恢復。然而，1毫克劑量治療組和對照組之間沒有顯著不同，暗示該萃取物之效果為劑量依賴性。第一次注射之後三天，在流行性感冒血球凝集抑制抗體程度上治療組和對照組之間沒有顯著不同。然而，一旦第一次注射三週之後用A/PR/8/34流行性感冒病毒二次感染，用由於10毫克/小鼠劑量組觀察到較高和顯著大小之抗體誘導。

如藉由多參數所測定，此實施例顯示根據本發明之萃取物於每隻小鼠10毫克之劑量能夠賦予預防小鼠-病原性飛沫微粒流行性感冒A/PR/8/34(H1N1)病毒感染。本發明之具體實例因此可活體內活化預防病毒之免疫反應。在一些具體實例中，因為該萃取物可完全從病原細菌製造，如在此實施例中所試驗之該萃取物，此暗示本發明之具體實例可活化先天性免疫系統。

實施例7：本發明具體實例在小鼠一氧化氮試驗中的活性

藉CO₂ 吸入殺死六週大公C57/BL6小鼠(六週大公鼠，SPF品質，查爾斯河，FR)。從後附肢移出髀骨、大腿骨、和脛骨。切割兩端部分之後藉由將達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco^' s modified Eagle medium)(DH)注入通過骨頭從內腔萃取骨髓。洗滌之後，將幹細胞再懸浮(40,000細胞/毫升)於用20%馬血清和30%L929細胞上澄液補充之DH培養基。細胞懸浮液在培育箱中於37℃在8%CO₂ 及飽和溼氣氛圍下培養8天。然後用冰凍PBS分離巨噬細胞，洗滌和再懸浮於用5%胎牛血清(FCS)、胺基酸和抗生素補充之DH培養基(DHE培養基)中。將細胞密度調整至700,000細胞/毫升。產物之水溶液直接在微量滴定板中連續地稀釋於DHE培養基中。試驗產物一式三份和每個微量滴定板包含由培養基組成之負控制組。在各井中最終體積為100微升。將100微升之細胞懸浮液加至該稀釋產物且細胞在培育箱中於37℃在8%CO₂ 及溼氣飽和氛圍下培養22小時。在培養期結束時，將100微升之上澄液轉移到另一微量滴定板且進行革利士(Griess)反應測定在各上澄液中所產生之亞硝酸鹽濃度。將在2.5%磷酸水溶液中之100微升之革利士試劑(5毫克/毫升的磺胺+0.5毫克/毫升的N-(1-萘基)乙二胺鹽酸鹽)加至各井。用分光光度計(SpectraMax Plus，分子裝置)，於562nm對照690nm的參考讀取微量滴定板。亞硝酸鹽濃度與所形成的一氧化氮含量成比例。亞硝酸鹽含量係根據標準曲線測定。結果以μM一氧化氮(NO)給予為平均值±標準偏差且作圖成劑量反應曲線(參見圖4-7)。

實施例8：鱟變形細胞溶解物(LAL)產色試驗

為了測定內毒素樣分子的存在，用Bio-Whittaker之產色-LAL盒進行LAL試驗。

此試驗係根據藉由存在於LAL之酵素級聯利用脂多醣(LPS)或可比較結構的產物之活化作用。此酵素活化作用係藉由用蛋白酶分解連接到肽之色素原証明。酵素反應係進行於37℃和色素原經過時間之形成係測量於405nm。記錄達到D.O.之0.2單位所需時間和相對於LPS標準(標準曲線)計算內毒素活性。

關於根據本發明萃取物之該類實施例實驗的結果以相對於標準化大腸桿菌LPS的製劑之EU(內毒素單位)表示於下表中(1EU對應於0.09奈克當量LPS)。

實施例9：組織胺分泌的抑制

採用肥胖細胞之去顆粒體外大鼠模式(由CRO CEREP計畫，目錄號2006：771-c，ref Hkanson R，Rnnberg AL，Sjlund K. Anal Biochem，1972 Jun 47(2)：356-70)來研究其中本發明之具體實例(包含21種細菌菌株)抑制由化合物48/80-刺激之肥胖細胞分泌的組織胺之方法。方案和實驗條件簡略地概述在下表中：

結果的分析和表示

該等結果表示為控制組比活性之百分比：(測得之比活性/對照組比活性)x100，在試驗化合物存在下獲得。IC50值(產生對照組比活性之一半最大抑制之濃度)係藉由用平均複製品值產生之抑制曲線的非線性迴歸分析測定。使用希爾(Hill)方程式曲線擬合(Y=D+[(A-D)/(1+(C/C50)nH)]，其中Y=比活性，D=最小比活性，A=最大比活性，C=化合物濃度，C50=IC50，和nH=斜率因數)。此分析係使用Cerep(希爾軟體)開發之軟體進行和且藉由與Windows之商業軟體SigmaPlot 4.0(1997年，SPSS公司)所產生之數據比較認。

在各實驗中，同時試驗參考物與試驗萃取物以便評估分析適合性。試驗數個濃度(對於IC50值測定)，和數據與在Cerep測定的歷史值比較。根據對應標準操作步驟，如果符合適合性標準則該分析被認為是有效的。試驗萃取物和參考物(測量兩次)之測得IC₅₀ 值被指示在下表中。參考物之IC₅₀ 值在歷史平均0.5對數單位之允許極限內。

用試驗萃取物獲得之對應抑制曲線顯示於圖8中。

該等結果指示試驗萃取物為一種由化合物48/80-刺激之肥胖細胞所誘導的組織胺分泌之可能抑制劑。

實施例10：本發明之具體實例以大腸桿菌感染模式在小鼠之LPS-不敏感菌株中的效果

本發明之具體實例係在公認大腸桿菌細菌感染之活體內模式試驗(參見Hopkins等人，在雌C3H/HeJ小鼠中對誘導大腸桿菌膀胱和腎臟感染之敏感性的遺傳，J Infect Dis.2003 Feb 1；187(3)：418-23)。將C3H/HeJ小鼠之Toll樣受體基因(TLR4)突變，且對TLR4促效劑例如LPS不敏感。因此此模式適合於檢測經由其他路徑而非TLR4作用之藥效。

一組10-12週大雌C3H/HeJ小鼠(8隻小鼠)在大腸桿菌感染之前用類似於實施例3.15(亦參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之萃取物口服地治療10天。

動物維持在於18-26℃之周圍溫度和30至70%之相對濕度的正常條件下。光方案設定於12：12小時之光暗循環。

動物餵食由Harlan Sprague Dawley(印地安那波利斯(Indianapolis)，IN)實驗室提供之標準膳食。隨意提供自來水，除非別處另有指示。

治療之動物每隻動物萃取物的每次投予口服地接受143毫克之冷凍乾產物(也就是25毫克(17.5%)之細菌萃取物和118毫克(82.5%)之賦形劑)。

接種

根據非常減少腎臟的返流接種之可能性和在所有接種的動物中誘發感染之最小接種方案，用PBS或用尿道致病性大腸桿菌膀胱切緣注射(intravesically)接種小鼠。在這些實驗中使用大腸桿菌菌株1677，單離自具有發熱性UTI之婦女的小便。為了製備接種物，在胰化蛋白腖肉湯(Difco實驗室)中藉由2個通路在從凍結原料生長細菌，用PBS洗滌，和再懸浮到2 x 10¹⁰ 細菌/毫升之濃度。剝奪小鼠之水1小時和在接種之前立刻從他們的膀胱擠出尿。在異氟醚麻醉下藉由導尿法將十微升之細菌接種物滴入膀胱內，產生每隻小鼠2 x 10⁸ 大腸桿菌之劑量。使該等動物從麻醉恢復和1小時後恢復水。

接種10天之後殺死小鼠以評估膀胱和腎臟感染之強度。移除各動物之膀胱和兩個腎臟，秤重，和在滅菌PBS中均質化，其後將均質物連續地展平在列文氏(Levine's)伊紅-亞甲藍瓊脂(Difco實驗室)上。在37℃下培養過夜之後計算在各板上之大腸桿菌菌落之數目且用以計算在各膀胱或每對腎臟中的細菌之總數。

使用費雪測驗保護下的最小顯著差數法(Fisher's protected least significant difference test)測定不同組小鼠之平均總菌落形成單位(CFU)值之間的統計上顯著不同(PBS、未治療之感染組、和治療且感染組)。膀胱和腎臟感染數據使用總CFU=log10[(CFU+100)/毫克組織]轉換，其中CFU為每個組織樣品所計算之菌落形成單位總數。

膀胱和腎臟之所得結果分別地顯示於圖9a和9b中。接種10天之後犧牲小鼠以評估膀胱和腎臟感染之強度。移除各動物之膀胱或二個腎臟，秤重，和在滅菌PBS中均質化，其後將均質物連續地展平在列文氏(Levine's)伊紅-亞甲藍瓊脂(Difco實驗室)上。在37℃下培養過夜之後計算在各板上之大腸桿菌菌落之數目，和100CFU加至所得結果之後，在各情況中獲得之總數除以組織之毫克(也就是總CFU=log10[(CFU+100)/毫克組織]以便計算細菌之平均總數+/-SEM。細菌萃取物將所獲得之對數值減少因子>3(膀胱)和>2(腎臟)，暗示從膀胱和腎臟培養的菌落之數目分別地減少至少1000和100之因子。這些結果証明本發明具體實例的免疫活性。

實施例11：本發明之具體實例以腹膜內鼠傷寒沙氏桿菌感染之小鼠模式在C57/bl小鼠中的效果

本發明之一具體實例也以腹膜內鼠傷寒沙氏桿菌感染之小鼠模式試驗。C57BL/6小鼠在口服投予之前保持7天。治療動物每次投予每隻動物接受85毫克的冷凍乾產物(也就是15毫克(17.5%)的細菌萃取物和70毫克(82.5%)的賦形劑)。實驗由一20隻用類似於實施例3.15(亦參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)的萃取物治療之小鼠的實驗組，和20隻用水治療之小鼠的對照組所組成。為了治療，每天將萃取物溶解在蒸餾水中以便在0.5毫升之最終體積中具有單一劑量。用鼠傷寒沙氏桿菌菌株415腹膜內攻毒所有小鼠之前，將此0.5毫升體積一天一次口服給予於各小鼠連續10天(疫苗和血清之I.Mechnokov學會，俄羅斯醫學科學院(Russian Academy of Medical Sciences))。

萃取物係以85毫克每隻小鼠之單一劑量(也就是15毫克之活性成分與82.5%的賦形劑)引入。對照組中之小鼠接受10天之使用每天口服投予0.5毫升水的假治療。達到攻毒之初步劑量範圍在每隻小鼠從102至105 CFU之沙門氏菌(Salmonellae )。主實驗選擇104CFU之劑量，因為在未治療動物中此劑量提供大約50%的存活者。

攻毒之後，將小鼠保持在實驗用動物之標準條件下。在感染後之21天期間每天進行死亡之觀察和紀錄。該萃取物之抗感染效能(參見下表)根據感染後存活率(SR)、和感染後平均壽命(ADL)、和防禦因數(DF)、和製劑效能指數(EI)評估，計算每個實驗組。SR當做在感染後第21天實驗組中的活動物之百分比。

ADL、DF和EI係使用下列公式計算：

ADL=(X1+X2+...+Xn)：N，

其中ADL為平均壽命、X1至Xn為實驗小鼠#1至#n之感染後壽命，和N-為實驗組中動物之總數。

DF=CD：ED，

其中DF為防御因子，CD為對照組中之死亡百分比，和ED為實驗組之死亡百分比。

EI=[(DF-1)：DF]x 100%，

其中EI為製劑效能指數和DF為防御因子。

在實驗期間顯然該萃取物出現良好耐受性。在用水預治療之小鼠的對照組中，在觀察期間(21d)存活率為58%，和ADL發生是15.3天。對照之下，所有接受根據本發明萃取物的小鼠在攻毒之後存活。這些結果暗示本發明之具體實例扺抗人類中的某些細菌感染是有利的。

實施例12：本發明之具體實例在過敏原攻毒期間對在黏膜氣管中調節T細胞之產生的影響。

以急性過敏性發炎之模式試驗本發明具體實例之免疫調節可能性。進行實驗以測定，在PVG大鼠中，如果投予根據本發明之萃取物會增加可利用的黏膜歸巢調節性T(mucosal-homing T regulatory，Treg)細胞之綜合大小，導致在偶發性發炎期間Tregs在氣道黏膜組織的數目之增加。

飼養天生PVG大鼠和維持一般大鼠病原體之自由。自始至終利用任意地選擇之年齡8-13週的兩性別動物。

用400微克之所提供的冷凍乾產物/克之體重(或400毫克/公斤/天)進行每天連續餵食(胃管灌食法)。在研究組中表現型地鑑定在PVG大鼠之氣道組織中的Treg口數。大鼠氣管組織的表現型定性需要綜合5至10隻動物之組大小以產生用於分析之足夠細胞。膠原酶/DN酶中消化氣管組織以產生單一細胞懸浮液接著CD4、CD25、Foxp3和TCR α β之表面表現的流動式細胞測量分析。首先，動物在第零天(d0)用OVA敏感化和從d10至d17用類似於實施例3.15(亦參照實施例1：細菌培養物，其包含實施例1.1、1.2、1.3、1.4及1.5)之萃取物或安慰劑餵食；在d18用氣霧化OVA攻毒動物和24小時後測量所產生之Th細胞/Treg(FoxP3)反應。為了Fox p3之細胞內染色，如製造商所描述使用得自eBioscience(聖地牙哥，加州)之抗-小鼠/大鼠FoxP3-FLR染色試劑盒。在FACSCalibur流動式細胞測量儀(BD Biosciences)上獲得數據和使用Flowjo軟體(4.6.1版，Tree Star公司)分析。OVA得自Sigma化學公司(聖路易斯，密蘇里)。

圖10a和10b顯示最初流動式細胞測量儀數據(在圖10a中標記為CD14對FoxP3，和在圖10b中標記為TCR對FoxP3)。細胞係得自在OVA敏化大鼠之後(在第0天i.p.)中和飛沫微粒OVA攻毒(第18天)24小時之後的氣道黏膜。圖10a和10b中之右邊顯示當動物從第10天至第18天口服劑量萃取物時，有增加的FoxP3正CD4細胞(及TCR分別地)的百分比，當與顯示於左邊之照組(用OVA敏化之未治療動物和OVA攻毒之動物)比較時。

此實施例顯示在發炎過敏性危症之情形中本發明之具體實例可具有治療價值。

額外的實施例包括：

一種來自一種或更多種細菌物種之萃取物，該細菌物種選自：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、血鏈球菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、變異鏈球菌、咽峽炎鏈球菌、緩鏈球菌、唾液鏈球菌、乾燥奈瑟菌、副流感嗜血桿菌、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)、和侵蝕艾肯菌，其中，在該萃取物之製備期間，該一種或更多種細菌菌株係溶解於大於12之pH，和該萃取物經處理以除去核酸；及其中該萃取物一旦投予至病患不引起朊蛋白病的風險。

前段之萃取物，其係得自各下列細菌物種之至少一種菌株：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、血鏈球菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、變異鏈球菌、咽峽炎鏈球菌、緩鏈球菌、唾液鏈球菌、乾燥奈瑟菌、副流感嗜血桿菌、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)、和侵蝕艾肯菌。

前段之萃取物，其係得自各下列細菌菌株：卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)3622、卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)3625、卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)I-045、流感嗜血桿菌8467、肺炎克雷白菌臭鼻亞種5050、肺炎克雷白氏菌肺炎亞種(Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae)204、克肺炎克雷白氏菌肺炎亞種5056、金黃色葡萄球菌I-049、金黃色葡萄球菌I-050、金黃色葡萄球菌I-051、金黃色葡萄球菌I-052、金黃色葡萄球菌I-053、金黃色葡萄球菌I-054、肺炎鏈球菌7465、肺炎鏈球菌7466、肺炎鏈球菌7978、肺炎鏈球菌10319、化膿鏈球菌8191、血鏈球菌I-046、血鏈球菌I-047、血鏈球菌I-048、溶血葡萄球菌11042、糞腸球菌103015、變異鏈球菌10449、咽峽炎鏈球菌10713、緩鏈球菌12261、唾液鏈球菌102503、乾燥奈瑟菌103345、副流感嗜血桿菌7857、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)52.105、和侵蝕艾肯菌10596。

任何三個前段之萃取物，其中該萃取物包含小於100微克/毫升核酸。

任何三個前段之萃取物，其中該萃取物包含至少0.3毫克/毫升的醣類。

任何三個前段之萃取物，其中該萃取物包含介於0.3和4.5毫克/毫升之間的醣類。

任何前段之萃取物，其中至少一種醣類係選自由單醣類、二醣類、和多醣類組成之群組。

前段之萃取物，其中至少一種多醣為支鏈多醣。

任何前段之萃取物，其中至少一種醣類被化學修飾。

任何前段之萃取物，其中該萃取物包含介於1.5至2.5毫克/毫升之間的游離胺基酸。

任何上段之萃取物，其中溶解作用係在12.6至13.4之pH進行。

任何前段之萃取物，其中該萃取物經處理以除去顆粒及/或不溶成分。

任何前段之萃取物，其中各細菌菌株係培養於不引起朊蛋白病的風險之培養基中。

任何前段之萃取物，其中至少一種選自天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、和離胺酸之胺基酸被外消旋至少10%。

任何前段之萃取物，其中該萃取物之游離胺基酸包含介於1和80%之間的D-胺基酸。

任何前段之萃取物，其中該萃取物之游離胺基酸包含介於10和45%之間的D-胺基酸。

前段之萃取物，其中該萃取物之游離胺基酸包含介於25和35%之間的D-胺基酸。

任何前段之萃取物，其中該萃取物包含至少一種選自D-天門冬胺酸和D-天門冬醯胺酸、D-麩胺酸和D-麩醯胺酸、D-絲胺酸、D-甲硫胺酸、D-組胺酸、D-丙胺酸、D-精胺酸、D-苯丙胺酸、D-酪胺酸、D-白胺酸、D-離胺酸、D-纈胺酸、和D-蘇胺酸之D-胺基酸。

前段之萃取物，其中任何一種D-胺基酸的濃度包含介於1和50%之間的游離胺基酸濃度。

前段之萃取物，其中任何一種D-胺基酸的濃度包含介於10和40%之間的游離胺基酸濃度。

前段之萃取物，其中任何一種D-胺基酸的濃度包含介於15和35%之間的游離胺基酸濃度。

任何前段之萃取物，其中該萃取物包含介於6和75毫克/毫升之間的一種或更多種蛋白質。

前段之萃取物，其中該萃取物包含介於6和8毫克/毫升之間的一種或更多種蛋白質。

任何前段之萃取物，其中該一種或更多種蛋白質具有小於30kDa之分子量。

任何前段之萃取物，其中該一種或更多種蛋白質具有小於10kDa之分子量。

任何前段之萃取物，其中至少8隻具有野生型LPS敏感性之小鼠用鼠傷寒沙氏桿菌攻毒之後13天的存活率為至少70%，其中選擇該鼠傷寒沙氏桿菌之劑量為以使至少8隻控制組小鼠的存活率為60%或更低。

前段之萃取物，其中該存活率為至少80%。

前段之萃取物，其中該存活率為至少90%。

任何前段之萃取物，其中該萃取物包含小於5000奈克的根據鱟變形細胞溶解物(LAL)產色試驗之LPS當量。

一種醫藥組成物，其包含任何上段之萃取物。

一種用於治療罹患呼吸失調症或於發展呼吸失調症之風險的個體之方法，其包含將有效量之任何上段之萃取物投予至該個體。

前段之方法，其中該個體為人類或馴養的哺乳動物。

二個前段之任一個方法，其中該呼吸失調症或過敏性症狀為上和下呼吸道感染、異位性皮膚炎、鼻咽炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃腺炎、喉炎、氣管炎、咽喉炎、流行性感冒、肺炎、支氣管肺炎、支氣管炎、下呼吸道感染、過敏性鼻炎、過敏性氣喘、鼻炎、鼻咽炎、咽炎、鼻竇炎、扁桃腺炎、喉炎、喉氣管炎、支氣管炎、具有急性下呼吸道感染之阻塞性肺部疾病、或具有急性惡化之阻塞性肺部疾病。

一種製備萃取物之方法，該萃取物係得自一種或更多種選自下列之細菌物種：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、血鏈球菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、變異鏈球菌、咽峽炎鏈球菌、緩鏈球菌、唾液鏈球菌、乾燥奈瑟菌、副流感嗜血桿菌、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)、和侵蝕艾肯菌，其包含：

(b)在不引起朊蛋白病的風險之培養基中培養各細菌菌株；

(c)在大於12之初pH溶解各菌株；及

(d)將(b)之產物通過微過濾器至少一次和通過超過濾器至少一次。

前段之方法，其中該萃取物係得自各下列細菌物種之至少一種菌株：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、血鏈球菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、變異鏈球菌、咽峽炎鏈球菌、緩鏈球菌、唾液鏈球菌、乾燥奈瑟菌、副流感嗜血桿菌、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)、和侵蝕艾肯菌。

前段之方法，其中該萃取物係得自各下列細菌菌株：卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)3622、卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)3625、卡他莫拉菌(莫拉氏菌屬)I-045、流感嗜血桿菌8467、肺炎克雷白菌臭鼻亞種5050、克雷白氏肺炎菌204、克雷白氏肺炎菌5056、金黃色葡萄球菌I-049、金黃色葡萄球菌I-050、金黃色葡萄球菌I-051、金黃色葡萄球菌I-052、金黃色葡萄球菌I-053、金黃色葡萄球菌I-054、肺炎鏈球菌7465、肺炎鏈球菌7466、肺炎鏈球菌7978、肺炎鏈球菌10319、化膿鏈球菌8191、血鏈球菌I-046、血鏈球菌I-047、血鏈球菌I-048、溶血葡萄球菌11042、糞腸球菌103015、變異鏈球菌10449、咽峽炎鏈球菌10713、緩鏈球菌12261、唾液鏈球菌102503、乾燥奈瑟菌103345、副流感嗜血桿菌7857、伴放線放線桿菌(嗜血桿菌屬)52.105、和侵蝕艾肯菌10596。任何前段之方法，其中該溶解作用係在大於12.5之初pH進行。

任何前段之方法，其中該溶解作用係在12.6至13.4之初pH進行。

任何前段之方法，其中該溶解作用係在30-60℃之溫度進行從40小時至10天之週期。

任何前段之方法，其中該微過濾器為0.45微米和超過濾器為30KDa。

任何前段之方法，其中(c)部分包含切向流過濾。

前段之方法，其中該切向流過濾係進行5至15次循環。

任何前段之方法，進一步包含將(c)之產物通過於0.2微米之第二個微過濾器。

任何前段之方法，其中(b)部分係用10-120克/公升細菌乾重之物質進行。

任何前段之方法，其中該切向流過濾係如圖1中所述進行。

任何前段之方法，其中該切向流過濾係如圖1中所述進行，以蛇形模式。

一種藉由任何前段之方法獲得之產物。

一種用於治療罹患呼吸失調症或於發展呼吸失調症之風險的個體之方法，其包含將有效量之一種藉由任何前段之方法獲得之產物投予至該個體。

前段之方法，其中該個體為人類或馴養的哺乳動物。

圖1：細菌溶解之後製備細菌萃取物的切向流過濾(TFF)系統之圖示。該圖示顯示二種過濾器之不同配置：其中所有過濾器同時操作之平行模式和其中過濾器以連續模式配置之蛇形模式。

圖2：藉由用來自實施例2.2、3.6、3.7、3.8、3.9和3.10之萃取物的純化混合物之連續稀釋液培養的人類PBMC之IL-6和TNF-α製備。

圖3：用病毒H1N1攻毒的小鼠在感染之後3週期間之存活。Me Neman：對10毫克治療組對對照組，試驗*p=0.023。

圖4：於小鼠巨噬細胞中之一氧化氮生物分析中NaOH濃度、生質之量(以克乾重每毫升表示)，和溶解期間(小時)對純化HAIN 8467萃取物(實施例2.1、2.5、2.8)之生物活性的影響。

圖5：肺炎雙球菌(Diplococcus pneumonia)萃取物(實施例3.6)的純化混合物之小鼠巨噬細胞中的一氧化氮生物分析。

圖6：在小鼠巨噬細胞中之一氧化氮生物分析中，實施例3.1和實施例3.3之萃取物的生物活性(分別地標記3和3c)。

圖7：在小鼠巨噬細胞中之一氧化氮生物分析中，來自實施例2.2、3.6、3.7、3.8、3.9、和3.10之萃取物的純化混合物之生物活性。

圖8：根據本發明之萃取物對從化合物48/80-刺激大鼠肥胖細胞分泌組織胺的影響。

圖9：不同實驗組之(a)膀胱和(b)腎臟組織中的平均總菌落形成單位(CFU)值。

圖10：在小鼠之LPS-不敏感株的大腸桿菌感染模式中本發明一具體實例之效果。該圖顯示用(a)標記CD14對FoxP3，和(b)TCR對FoxP3之流動式細胞測量儀數據。左邊顯示未治療組織而右邊顯示治療組織。

Claims

一種來自一種或更多種細菌物種之萃取物，該細菌物種選自：卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、和血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)，其中，在該萃取物之製備期間，一種或更多種細菌菌株係在大於12之pH溶解，且該萃取物經處理以除去核酸；且其中該萃取物不引起朊蛋白病(prion disease)的風險。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其係得自各下列細菌物種之至少一種菌株：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、和血鏈球菌。
根據申請專利範圍第2項之萃取物，其係得自下列細菌菌株之每一者：卡他莫拉菌3622、卡他莫拉菌3625、卡他莫拉菌I-045、流感嗜血桿菌8467、肺炎克雷白菌臭鼻亞種(Klebsiella pneumoniae ssp.ozaenae)5050、肺炎克雷白氏菌肺炎亞種(Klebsiella pneumoniae ssp.pneumoniae)204、肺炎克雷白氏菌肺炎亞種5056、金黃色葡萄球菌I-049、金黃色葡萄球菌I-050、金黃色葡萄球菌I-051、金黃色葡萄球菌I-052、金黃色葡萄球菌I-053、金黃色葡萄球菌I-054、肺炎鏈球菌7465、肺炎鏈球菌7466、肺炎鏈球菌7978、肺炎鏈球菌10319、化膿鏈球菌8191、血鏈球菌I-046、血鏈球菌I-047，及血鏈球菌I-048。
根據申請專利範圍第1、2、或3項之萃取物，其中該萃取物包含小於100微克/毫升核酸。
根據申請專利範圍第1、2、或3項之萃取物，其中該萃取物包含至少0.3毫克/毫升的醣類。
根據申請專利範圍第5項之萃取物，其中該萃取物包含介於0.3和4.5毫克/毫升之間的醣類。
根據申請專利範圍第5項之萃取物，其中至少一種醣類係選自由單醣類、二醣類、和多醣類組成之群組。
根據申請專利範圍第7項之萃取物，其中至少一種多醣為支鏈多醣。
根據申請專利範圍第5項之萃取物，其中至少一種醣被化學修飾。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中溶解作用係在12.6至13.4之pH進行。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中該萃取物經處理以除去顆粒及/或不溶成分。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中各細菌菌株係在不引起朊蛋白病的風險之培養基中培養。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中該萃取物包含介於1.5至2.5毫克/毫升之間的游離胺基酸。
根據申請專利範圍第13項之萃取物，其中至少一種選自天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、和離胺酸之胺基酸被外消旋至少10%。
根據申請專利範圍第13和14項中任一項之萃取物，其中在該萃取物中游離胺基酸包含介於1和80%之間的D-胺基酸。
根據申請專利範圍第15項之萃取物，其中在該萃取物中游離胺基酸包含介於10和45%之間的D-胺基酸。
根據申請專利範圍第16項之萃取物，其中在該萃取物中游離胺基酸包含介於25和35%之間的D-胺基酸。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中該萃取物包含介於6和8毫克/毫升之間的一種或更多種蛋白質。
根據申請專利範圍第18項之萃取物，其中該一種或更多種蛋白質具有小於30kDa之分子量。
根據申請專利範圍第18項之萃取物，其中該一種或更多種蛋白質具有小於10kDa之分子量。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中該萃取物包含小於5000奈克的根據鱟變形細胞溶解物(limulus amoebocyte lysate，LAL)產色試驗之LPS當量。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中至少8隻具有野生型LPS敏感性之小鼠用鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)攻毒之後13天的存活率為至少70%，其中選擇該鼠傷寒沙氏桿菌之劑量使至少8隻用水治療之控制組小鼠的存活率為60%或更低，和其中在攻毒之前實驗組和控制組小鼠用該萃取物治療或用水治療10天之期間。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中該存活率為至少80%。
根據申請專利範圍第1項之萃取物，其中該存活率為至少90%。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1-24項中任一項之萃取物。
根據申請專利範圍第25項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係用於治療罹患呼吸失調症或過敏性症狀或於發展呼吸失調症或過敏性症狀之風險的個體。
根據申請專利範圍第26項之醫藥組成物，其中該個體為人類或馴養的哺乳動物。
根據申請專利範圍第26或27項之醫藥組成物，其中該呼吸失調症或過敏性症狀可為上呼吸道感染或下呼吸道感染。
根據申請專利範圍第28項之醫藥組成物，其中該上呼吸道感染可進一步包含選自鼻咽炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃腺炎、喉炎、咽喉炎、氣管炎、喉氣管炎以及流行性感冒之症狀。
根據申請專利範圍第28項之醫藥組成物，其中該下呼吸道感染可進一步包含選自肺炎、支氣管肺炎、支氣管炎、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、過敏性氣喘、鼻炎、具有急性下呼吸道感染之阻塞性肺部疾病以及具有急性惡化之阻塞性肺部疾病之症狀。
一種製備萃取物之方法，該萃取物係得自一種或更多種選自下列之細菌物種：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、和血鏈球菌，其包含：(b)在不引起朊蛋白病的風險之培養基中培養各細菌菌株；(c)在大於12之初pH細胞溶解各菌株；及(d)將(b)之產物通過微過濾器至少一次和通過超過濾器至少一次。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中該萃取物係得自各下列細菌物種之至少一種菌株：卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、和血鏈球菌。
根據申請專利範圍第32項之方法，其中該萃取物係得自下列細菌菌株之每一者：卡他莫拉菌3622、卡他莫拉菌3625、卡他莫拉菌I-045、流感嗜血桿菌8467、肺炎克雷白菌臭鼻亞種5050、肺炎克雷白氏菌肺炎亞種204、肺炎克雷白氏菌肺炎亞種5056、金黃色葡萄球菌I-049、金黃色葡萄球菌I-050、金黃色葡萄球菌I-051、金黃色葡萄球菌I-052、金黃色葡萄球菌I-053、金黃色葡萄球菌I-054、肺炎鏈球菌7465、肺炎鏈球菌7466、肺炎鏈球菌7978、肺炎鏈球菌10319、化膿鏈球菌8191、血鏈球菌I-046、血鏈球菌I-047，及血鏈球菌I-048。
根據申請專利範圍第31、32或33項之方法，其中該溶解作用係在大於12.5之初pH進行。
根據申請專利範圍第34項之方法，其中該溶解作用係在12.6至13.4之初pH進行。
根據申請專利範圍第31、32或33項之方法，其中至少一部分之該溶解作用係在0.05至0.4N的初氫氧離子濃度進行。
根據申請專利範圍第31、32或33項之方法，其中至少一部分之該溶解作用係在0.5至1N的初氫氧離子濃度進行。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中該溶解作用係在30-60℃之溫度進行從40小時至10天之期間。
根據申請專利範圍第31、32或33項之方法，其中該溶解作用係在30至40℃進行20至240小時之期間。
根據申請專利範圍第34項之方法，其中該溶解作用係在30至40℃進行20至240小時之期間。
根據申請專利範圍第35項之方法，其中該溶解作用係在30至40℃進行20至240小時之期間。
根據申請專利範圍第36項之方法，其中該溶解作用係在30至40℃進行20至240小時之期間。
根據申請專利範圍第37項之方法，其中該溶解作用係在30至40℃進行20至240小時之期間。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中該微過濾器為0.45微米和該超過濾器為30KDa。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中(c)部分包含切向流過濾(tangential flow filtration)。
根據申請專利範圍第45項之方法，其中該切向流過濾係進行5至15次循環。
根據申請專利範圍第31項之方法，進一步包含將(c)之產物通過於0.2微米之第二個微過濾器。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中(b)部分係用5-120克/公升細菌乾重之物質進行。
根據申請專利範圍第48項之方法，其中(b)部分係用5-90克/公升細菌乾重之物質進行。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中至少一部分之該等菌株係在溫和溶解條件下溶解，其中該溫和溶解包含使用0.1N至0.4N的氫氧離子濃度。
根據申請專利範圍第31項之方法，其中至少一部分之該等菌株係在強溶解條件下溶解，其中該強溶解條件包含使用0.6N至1.1N的氫氧離子濃度。
一種藉由申請專利範圍第31-51項中任一項之方法獲得之產物。
一種用於治療罹患呼吸失調症或過敏性症狀或於發展呼吸失調症或過敏性症狀之風險的個體之醫藥組成物，其包含有效量之根據申請專利範圍第52項之任何產物。
根據申請專利範圍第53項之醫藥組成物，其中該個體為人類或馴養的哺乳動物。