CN105779326A - 化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法 - Google Patents

Abstract

化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法，它涉及生物医学技术领域。它的萃取方法为：菌种复活，菌种培养，发酵剂调配，发酵剂消毒灭菌，前发酵，本发酵，分离回收菌体，洗涤菌体，浓缩菌体，灭活菌体，膨化菌体，溶解细菌细胞壁，溶解细菌细胞壁脂质层，溶解洗脱去除细菌蛋白质，洗脱去除脂质成分，分解去除核酸，洗脱去除残余蛋白质，浓缩细菌细胞壁成分，冻干制粉，回收称重，包装出厂。它不仅适用于化脓性链球菌的标准菌株的细胞壁成分萃取也适用于化脓性链球菌的非标准菌株的细胞壁成分萃取，通过加热处理获得的化脓性链球菌细胞壁成分不含活菌并失去感染能力；通过真空干燥获得的化脓性链球菌细胞壁成分后可长期保存备于研究使用。

Description

化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法

技术领域：

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法。

背景技术：

链球菌(Streptococcus)是化脓性球菌的一类常见的细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，其中A群链球菌(groupAStreptococci)又称化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)，是人类细菌感染中最重要的病原之一。其可引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，新生儿败血症，脑膜炎，产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。链球菌抗原结构主要有三种：(1)核蛋白抗原或称P抗原，无特异性，各种链球菌均同，与葡萄球菌有交叉。(2)多糖抗原或称C抗原系统族特异性抗原，是细菌壁的组成成份。对人致病的90％属于A族，其次为B族，其它族少见。(3)蛋白质抗原或称表面抗M、R、T、S等四种不同性质的抗原组份，具有型特异性。是链球菌细胞壁的蛋白质抗原，位于C抗原外层，同族链球菌可根据表面抗原不同进行分型，如A族链状菌可据此分为60多型。按C抗原不同可分类A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T等18个族。对人致病的大多属于A族。A族又称为化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)。化脓性链球菌感染引起的疾病已知很多，但发病机制尚不清楚。倾向性观点认为致病性因素主要与菌体细胞壁成分有关，所以萃取细胞壁成分对研究化脓性链球菌感染引起疾病的发病机制以及疗效研究至关重要。

分离提纯化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)细胞壁成分，为研究化脓性链球菌感染引起疾病的发病机制提供实验材料。化脓性链球菌实验室培养要求条件苛刻，而且培养后产生释放多种酶和内外毒素，导致培养液成分复杂化，因此不利于进行致病机制研究。即使将细菌细胞洗涤破碎，也含有大量的核酸以及蛋白质等成分，只有彻底去除核酸，蛋白质以及杂质获得最高纯度的细菌细胞壁成分，才能精确阐明细菌细胞壁成分与发病的相关性及机制。有利于开发有效治疗化脓性链球菌引起的各种感染性疾病的药物，减少患者痛苦，缩短病程，避免乱投药节约医疗资源。

发明内容：

本发明的目的是提供一种化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法，它不仅适用于化脓性链球菌的标准菌株的细胞壁成分萃取也适用于化脓性链球菌的非标准菌株的细胞壁成分萃取，通过加热处理获得的化脓性链球菌细胞壁成分不含活菌并失去感染能力；通过真空干燥获得的化脓性链球菌细胞壁成分后可长期保存备于研究使用。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它的萃取方法为：菌种复活，菌种培养，发酵剂调配，发酵剂消毒灭菌，前发酵，本发酵，分离回收菌体，洗涤菌体，浓缩菌体，灭活菌体，膨化菌体，溶解细菌细胞壁，溶解细菌细胞壁脂质层，溶解洗脱去除细菌蛋白质，洗脱去除脂质成分，分解去除核酸，洗脱去除残余蛋白质，浓缩细菌细胞壁成分，冻干制粉，回收称重，包装出厂。

本发明的具体操作步骤为：

(1)、菌种复活：将冻干保存的菌种使用琼脂平板培养基划线培养使菌种复活生长，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时，其中，所述的菌种选用一株化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)的标准菌株，其致病性极强；

(2)、菌种培养：将步骤(1)中获得的菌种使用液体培养基进行增菌培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时；

(3)、发酵剂调配制得：按如下质量比配方调配5升或10升溶液：0.1％-5％牛心脏萃取物，0.1％-5％蛋白胨，0.1％-5％葡萄糖，0.1％-5％酵母粉，0.1％-0.5％氯化钠，0.01％-0.5％磷酸氢二钠，0.1％-0.5％碳酸钠；

(4)、发酵剂消毒灭菌：将步骤(3)中调配的液体发酵剂在30℃-37℃下有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间24小时-96小时，进行高压灭菌；

(5)、前发酵：将步骤(2)中培养获得的液体细菌悬液注入到步骤(3)中制得的发酵剂的一小部分发酵剂内进行培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间5小时-12小时；

(6)、本发酵：将步骤(5)中培养获得的前发酵液体注入到发酵剂调配步骤中调配的发酵剂内进行培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时；

(7)、分离回收菌体：通过离心或过滤的方法进行菌体与发酵剂液体分离获得含极少水分的湿菌体；

(8)、洗涤菌体：将步骤(7)中获得的湿菌体使用脱离子水或蒸馏水进行反复洗涤数次并制成细菌体混悬液；

(9)、浓缩菌体：将步骤(8)中获得的细菌体混悬液进行彻底脱水而获得的含有少量水份的浓缩菌体，湿菌体：水＝1：1--1：2；

(10)、灭活菌体：将步骤(9)中获得的浓缩菌体利用高压灭菌器进行高压灭菌，灭菌条件为15大气压，105℃-121℃，5分钟—20分钟；

(11)、膨化菌体：向步骤(10)中获得的浓缩菌体内，添加浓度为0.1％-01.0％的十二烷基硫酸钠溶液(SDS)后加热处理，添加量为1：1至1：50，加热处理方法为90℃-115℃，5分钟—20分钟，高速离心分离，去掉液体获得沉淀物；

(12)、溶解细菌细胞壁脂质层：将步骤(11)中获得的沉淀物，使用丙酮或甲醇进行脂溶后使用10mM-100mMTris-HCl缓冲液(pH6.5-8.5)进行反复洗脱；脂溶次数为1-5次，洗脱次数为1-5次；通过高速离心回收沉淀物，调制成50mM-200mMTris-HCl缓冲液(pH6.5-8.5)悬浮液；

(13)、溶解洗脱去除细菌蛋白质：向步骤(12)中获得的悬浮液内添加蛋白质分解酶(pronase)溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％SDS，1.0mM-100mMCaCl2溶液，10mg-300mg蛋白质分解酶，置25℃-45℃水浴锅内反应12小时—48小时，高速离心回收沉淀物；

(14)、洗脱去除脂质成分：将在步骤(13)中获得的沉淀物使用乙醇或甲醇或氯仿或三者混合物或其中的两种的混合液进行反复溶解洗脱高速离心回收沉淀物，制成混悬液，溶解洗脱次数为1-5次；

(15)、分解去除核酸：向步骤(14)中获得的沉淀物混悬液内添加核酸酶(Nuclease)溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％马来酸盐，0.1％-1.0％NaOH，1.0mM-100mMMgCl2溶液，核酸酶25U-2500U，置25℃-45℃水浴锅内反应，12小时—48小时，高速离心回收沉淀物，超净水反复洗涤数次制成超净水混悬液；

(16)、洗脱去除残余蛋白质：将步骤(15)中获得的悬浮液使用蛋白质分解酶(pronase)溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％SDS，1.0mM-100mMCaCl2溶液，10mg-300mg蛋白质分解酶，置25℃-45℃水浴锅内反应，24小时—120小时，高速离心回收沉淀物；或添加0.1％-1.0％NaOH处理12小时—96小时，高速离心回收沉淀物，超净水反复洗涤数次制成超净水混悬液；

(17)、浓缩细菌细胞壁成分：将步骤(16)中获得的超净水混悬液进行浓缩；

(18)、冻干制粉：将步骤(17)中获得的浓缩混悬液使用液氮或-80℃冰柜冷冻后进行低温真空干燥，即可获得纯度达到99％的化脓性链球菌细胞壁干燥粉末；

(19)、回收称重：将在步骤(18)中获得的冻干粉末进行回收称重；

(20)、包装出厂：将在步骤(19)中获得的冻干粉末进行防潮真空包装，贴标签出厂。

本发明具有以下有益效果：

通过加热处理获得的化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)细胞壁成分不含活菌并失去感染能力。

通过真空干燥获得的化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)细胞壁成分后可长期保存备于研究使用。

不仅适用于化脓性链球菌的标准菌株的细胞壁成分萃取也适用于化脓性链球菌的非标准菌株的细胞壁成分萃取。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本具体实施方式采用以下技术方案：它的萃取方法为：

(1)、菌种复活：将冻干保存的菌种使用琼脂平板培养基划线培养使菌种复活生长，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时，其中，所述的菌种选用一株化脓性链球菌(StreptococcusPyogenes)的标准菌株，其致病性极强；

(2)、菌种培养：将步骤(1)中获得的菌种使用液体培养基进行增菌培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时；

(3)、发酵剂调配制得：按如下质量比配方调配5升或10升溶液：0.1％-5％牛心脏萃取物，0.1％-5％蛋白胨，0.1％-5％葡萄糖，0.1％-5％酵母粉，0.1％-0.5％氯化钠，0.01％-0.5％磷酸氢二钠，0.1％-0.5％碳酸钠；

(4)、发酵剂消毒灭菌：将步骤(3)中调配的液体发酵剂在30℃-37℃下有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间24小时-96小时，进行高压灭菌；

(5)、前发酵：将步骤(2)中培养获得的液体细菌悬液注入到步骤(3)中制得的发酵剂的一小部分发酵剂内进行培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间5小时-12小时；

(6)、本发酵：将步骤(5)中培养获得的前发酵液体注入到发酵剂调配步骤中调配的发酵剂内进行培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时；

(7)、分离回收菌体：通过离心或过滤的方法进行菌体与发酵剂液体分离获得含极少水分的湿菌体；

(8)、洗涤菌体：将步骤(7)中获得的湿菌体使用脱离子水或蒸馏水进行反复洗涤数次并制成细菌体混悬液；

(9)、浓缩菌体：将步骤(8)中获得的细菌体混悬液进行彻底脱水而获得的含有少量水份的浓缩菌体，湿菌体：水＝1：1--1：2；

(10)、灭活菌体：将步骤(9)中获得的浓缩菌体利用高压灭菌器进行高压灭菌，灭菌条件为15大气压，105℃-121℃，5分钟—20分钟；

(11)、膨化菌体：向步骤(10)中获得的浓缩菌体内，添加浓度为0.1％-01.0％的十二烷基硫酸钠溶液(SDS)后加热处理，添加量为1：1至1：50，加热处理方法为90℃-115℃，5分钟—20分钟，高速离心分离，去掉液体获得沉淀物；

(12)、溶解细菌细胞壁脂质层：将步骤(11)中获得的沉淀物，使用丙酮或甲醇进行脂溶后使用10mM-100mMTris-HCl缓冲液(pH6.5-8.5)进行反复洗脱；脂溶次数为1-5次，洗脱次数为1-5次；通过高速离心回收沉淀物，调制成50mM-200mMTris-HCl缓冲液(pH6.5-8.5)悬浮液；

(13)、溶解洗脱去除细菌蛋白质：向步骤(12)中获得的悬浮液内添加蛋白质分解酶(pronase)溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％SDS，1.0mM-100mMCaCl2溶液，10mg-300mg蛋白质分解酶，置25℃-45℃水浴锅内反应12小时—48小时，高速离心回收沉淀物；

(14)、洗脱去除脂质成分：将在步骤(13)中获得的沉淀物使用乙醇或甲醇或氯仿或三者混合物或其中的两种的混合液进行反复溶解洗脱高速离心回收沉淀物，制成混悬液，溶解洗脱次数为1-5次；

(15)、分解去除核酸：向步骤(14)中获得的沉淀物混悬液内添加核酸酶(Nuclease)溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％马来酸盐，0.1％-1.0％NaOH，1.0mM-100mMMgCl2溶液，核酸酶25U-2500U，置25℃-45℃水浴锅内反应，12小时—48小时，高速离心回收沉淀物，超净水反复洗涤数次制成超净水混悬液；

(16)、洗脱去除残余蛋白质：将步骤(15)中获得的悬浮液使用蛋白质分解酶(pronase)溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％SDS，1.0mM-100mMCaCl2溶液，10mg-300mg蛋白质分解酶，置25℃-45℃水浴锅内反应，24小时—120小时，高速离心回收沉淀物；或添加0.1％-1.0％NaOH处理12小时—96小时，高速离心回收沉淀物，超净水反复洗涤数次制成超净水混悬液；

(17)、浓缩细菌细胞壁成分：将步骤(16)中获得的超净水混悬液进行浓缩；

(18)、冻干制粉：将步骤(17)中获得的浓缩混悬液使用液氮或-80℃冰柜冷冻后进行低温真空干燥，即可获得纯度达到99％的化脓性链球菌细胞壁干燥粉末；

(19)、回收称重：将在步骤(18)中获得的冻干粉末进行回收称重；

(20)、包装出厂：将在步骤(19)中获得的冻干粉末进行防潮真空包装，贴标签出厂。

本具体实施方式不仅适用于化脓性链球菌的标准菌株的细胞壁成分萃取也适用于化脓性链球菌的非标准菌株的细胞壁成分萃取，通过加热处理获得的化脓性链球菌细胞壁成分不含活菌并失去感染能力；通过真空干燥获得的化脓性链球菌细胞壁成分后可长期保存备于研究使用

以上所述仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法，其特征在于它的萃取方法为：菌种复活，菌种培养，发酵剂调配，发酵剂消毒灭菌，前发酵，本发酵，分离回收菌体，洗涤菌体，浓缩菌体，灭活菌体，膨化菌体，溶解细菌细胞壁，溶解细菌细胞壁脂质层，溶解洗脱去除细菌蛋白质，洗脱去除脂质成分，分解去除核酸，洗脱去除残余蛋白质，浓缩细菌细胞壁成分，冻干制粉，回收称重，包装出厂。

2.根据权利要求1所述的化脓性链球菌细胞壁成分萃取方法2，其特征在于它的具体操作步骤为：

(1)、菌种复活：将冻干保存的菌种使用琼脂平板培养基划线培养使菌种复活生长，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时，其中，所述的菌种选用一株化脓性链球菌的标准菌株，其致病性极强；

(2)、菌种培养：将步骤(1)中获得的菌种使用液体培养基进行增菌培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时；

(3)、发酵剂调配制得：按如下质量比配方调配5升或10升溶液：0.1％-5％牛心脏萃取物，0.1％-5％蛋白胨，0.1％-5％葡萄糖，0.1％-5％酵母粉，0.1％-0.5％氯化钠，0.01％-0.5％磷酸氢二钠，0.1％-0.5％碳酸钠；

(4)、发酵剂消毒灭菌：将步骤(3)中调配的液体发酵剂在30℃-37℃下有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间24小时-96小时，进行高压灭菌；

(5)、前发酵：将步骤(2)中培养获得的液体细菌悬液注入到步骤(3)中制得的发酵剂的一小部分发酵剂内进行培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间5小时-12小时；

(6)、本发酵：将步骤(5)中培养获得的前发酵液体注入到发酵剂调配步骤中调配的发酵剂内进行培养，培养条件为30℃-37℃，有氧或厌氧或兼性厌氧培养，培养时间12小时-96小时；

(7)、分离回收菌体：通过离心或过滤的方法进行菌体与发酵剂液体分离获得含极少水分的湿菌体；

(8)、洗涤菌体：将步骤(7)中获得的湿菌体使用脱离子水或蒸馏水进行反复洗涤数次并制成细菌体混悬液；

(9)、浓缩菌体：将步骤(8)中获得的细菌体混悬液进行彻底脱水而获得的含有少量水份的浓缩菌体，湿菌体：水＝1：1--1：2；

(10)、灭活菌体：将步骤(9)中获得的浓缩菌体利用高压灭菌器进行高压灭菌，灭菌条件为15大气压，105℃-121℃，5分钟—20分钟；

(11)、膨化菌体：向步骤(10)中获得的浓缩菌体内，添加浓度为0.1％-01.0％的十二烷基硫酸钠溶液后加热处理，添加量为1：1至1：50，加热处理方法为90℃-115℃，5分钟—20分钟，高速离心分离，去掉液体获得沉淀物；

(12)、溶解细菌细胞壁脂质层：将步骤(11)中获得的沉淀物，使用丙酮或甲醇进行脂溶后使用10mM-100mMTris-HCl缓冲液进行反复洗脱；脂溶次数为1-5次，洗脱次数为1-5次；通过高速离心回收沉淀物，调制成50mM-200mMTris-HCl缓冲液悬浮液；

(13)、溶解洗脱去除细菌蛋白质：向步骤(12)中获得的悬浮液内添加蛋白质分解酶溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％SDS，1.0mM-100mMCaCl2溶液，10mg-300mg蛋白质分解酶，置25℃-45℃水浴锅内反应12小时—48小时，高速离心回收沉淀物；

(14)、洗脱去除脂质成分：将在步骤(13)中获得的沉淀物使用乙醇或甲醇或氯仿或三者混合物或其中的两种的混合液进行反复溶解洗脱高速离心回收沉淀物，制成混悬液，溶解洗脱次数为1-5次；

(15)、分解去除核酸：向步骤(14)中获得的沉淀物混悬液内添加核酸酶溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％马来酸盐，0.1％-1.0％NaOH，1.0mM-100mMMgCl2溶液，核酸酶25U-2500U，置25℃-45℃水浴锅内反应，12小时—48小时，高速离心回收沉淀物，超净水反复洗涤数次制成超净水混悬液；

(16)、洗脱去除残余蛋白质：将步骤(15)中获得的悬浮液使用蛋白质分解酶溶液，该溶液为50mM-200mMTris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.5，内含0.1％-1.0％SDS，1.0mM-100mMCaCl2溶液，10mg-300mg蛋白质分解酶，置25℃-45℃水浴锅内反应，24小时—120小时，高速离心回收沉淀物；或添加0.1％-1.0％NaOH处理12小时—96小时，高速离心回收沉淀物，超净水反复洗涤数次制成超净水混悬液；

(17)、浓缩细菌细胞壁成分：将步骤(16)中获得的超净水混悬液进行浓缩；

(18)、冻干制粉：将步骤(17)中获得的浓缩混悬液使用液氮或-80℃冰柜冷冻后进行低温真空干燥，即可获得纯度达到99％的化脓性链球菌细胞壁干燥粉末；

(19)、回收称重：将在步骤(18)中获得的冻干粉末进行回收称重；

(20)、包装出厂：将在步骤(19)中获得的冻干粉末进行防潮真空包装，贴标签出厂。