CN110065688B - 一种猪粪源生物肥料的生产包装方法 - Google Patents

一种猪粪源生物肥料的生产包装方法 Download PDF

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Abstract

一种猪粪源生物肥料的生产包装方法，包括以下步骤：步骤(1)预冻：将腐熟猪粪于‑83℃～‑78℃下预冻至完全冻实；步骤(2)升华：升华干燥板温为‑45℃～‑40℃，升华干燥压力为10Pa，升华时间为20～30小时；步骤(3)解析：解析干燥板温为‑5℃～5℃，解析干燥压力为25Pa，至再无水份逸出为解析完成；步骤(4)待冷冻干燥设备恢复至常温常压后，将所得产品移出冷冻干燥设备并将其进行密封包装。本发明制得的冻干猪粪源生物肥料性质稳定，无需冷藏，储存方便，且具有较好的复溶性，复溶的猪粪源生物肥料基质中的微生物基本能恢复至接收冻干处理之前的生物活性。

Description

一种猪粪源生物肥料的生产包装方法
技术领域
本发明属于有机肥料加工领域，具体地，涉及一种猪粪源生物肥料的生产包装方法。
背景技术
随着我国畜禽养殖业规模的不断扩大，畜禽粪便的排放量也随之增加，造成了严重的环境污染。目前畜禽粪污的处理有以下几种：一是制备有机肥，二是厌氧发酵后直接还田，三是利用食腐性昆虫如黑水虻来进行处理。猪粪本身是一种优良的营养源，猪饲料中70％的氮通过粪和尿排出，植物饲料中2/3的磷以植酸磷形态存在而不能被猪利用。彭丽(2017)等采集杨凌地区不同养殖场粪便测定养分结果表明：粪便中氮的含量达0.71％-3.56％，全磷的含量达0.43％-7.42％，全钾的含量达1.2％-8.93％。在猪粪厌氧发酵的过程中，猪粪不仅能够作为基质为多种益生菌提供生长、增殖的场所，也能够作为营养来源为益生菌提供丰富的物质条件。
益生菌具有促进肠道健康，增强免疫力及减轻慢性病症状等作用，近年来，益生菌已经被越来越多地被应用于不同领域。根据联合国粮食及农业组织和世界卫生组织对益生菌的定义，益生菌是一种食用者摄取适当量后，能对食用者健康发挥有益作用的活菌。目前，主要利用冷冻干燥技术将微生物制成冻干制剂以便于转移和保存。但在加工过程中，冷冻干燥会对微生物细胞会产生一定的破坏作用，在冻干过程中，细胞膜脂的性质、结构和功能会发生一定的变化，而这些变化有可能使细胞膜固有的功能丧失，另一方面，细胞内某些重要的蛋白质如酶蛋白或者抑制因子会变性失活，由此导致微生物细胞正常生理代谢失调，进一步导致微生物死亡。因此如何提高冷冻干燥过程中益生菌的存活率是目前微生态制剂研究的核心问题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪粪源生物肥料的生产包装方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，提供一种猪粪源生物肥料的生产包装方法，包括以下步骤：步骤(1)预冻：将腐熟猪粪于-83℃～-78℃下预冻至完全冻实；步骤(2)升华：升华干燥板温为-45℃～-40℃，升华干燥压力为10Pa，升华时间为20～30小时；步骤(3)解析：解析干燥板温为-5℃～5℃，解析干燥压力为25Pa，至再无水份逸出为解析完成；步骤(4)待冷冻干燥设备恢复至常温常压后，将所得产品移出冷冻干燥设备并将其进行密封包装。
优选地，在步骤(1)中，将腐熟猪粪转入所述冷冻干燥设备后，使冷冻干燥设备以30℃/h的降温速率从室温降至预冻温度。
优选地，在进行步骤(1)前还包括预处理步骤，预处理步骤包括：将腐熟猪粪在8℃下保温3～8小时。
优选地，在进行步骤(1)前还包括预处理步骤，预处理步骤包括：采用洗涤液洗涤腐熟猪粪，洗涤液选自生理盐水和/或蛋白胨水溶液。
优选地，在进行所述步骤(1)前还包括预处理步骤，预处理步骤包括：向腐熟猪粪中加入冻干保护剂，两者的重量比为，冻干保护剂：腐熟猪粪＝1～1.5:1；冻干保护剂的有效成分包括海藻糖、β-环糊精、蔗糖和维生素C中的至少一种，其中冻干保护剂中的各有效成分含量为：海藻糖0～10％、β-环糊精0～5％、蔗糖0～10％、维生素C 0～1.5％。
优选地，冻干保护剂包括以下有效成分：海藻糖6％、β-环糊精4％、蔗糖4％和维生素C 1％。
优选地，在进行步骤(1)前还包括预处理步骤，所述预处理步骤包括：调节腐熟猪粪的酸碱度至pH＝7-8，并加入pH缓冲剂。
优选地，在预处理步骤所使用的所有试剂在使用前均预冷至5℃。
优选地，预处理步骤的具体过程包括：步骤A：将腐熟猪粪在8℃下保温3～8小时；步骤B：利用中性生理盐水洗涤腐熟猪粪；步骤C：向腐熟猪粪中加入冻干保护剂，冻干保护剂：腐熟猪粪＝1～1.5:1，并使两者充分混合20分钟；步骤D：调节腐熟猪粪的酸碱度至pH＝7-8，并加入由Na2CO3和NaHCO3复配而成的pH缓冲剂。
优选地，在步骤(4)中，包装具体为充氮包装。
本发明采用海藻糖、β-环糊精、蔗糖和维生素C共同复配作为冻干保护剂的有效成分，四种有效成分协同增效：海藻糖和蔗糖能够渗透到细胞内部，并填充在蛋白质等活性大分子周围，当干燥失水后，海藻糖和蔗糖的羟基可与生物分子的极性基团形成氢键，代替极性基团周围失去的水分子，从而维持蛋白质结构的稳定性。海藻糖和蔗糖分别与生物膜磷脂极性基团之间的氢键结合可以阻止脱水导致的膜之间彼此靠近，从而抑制膜融合。糖与膜脂的直接相互作用使得膜脂脱水后主相变温度变化不大，低于操作温度，这样膜脂始终处于液晶相，从而避免了脱水-再水化过程中的相变以及由此导致的膜内容物的泄漏。另外，β-环糊精具有独特的包含结构，其在生物分子周围形成玻璃态，处于玻璃态的糖类黏度较高，分子扩散系数低，因此包在玻璃体内部的生物分子的链段运动受阻，分子的伸展和聚集受到抑制，从而维持其三维结构的稳定高效地保护了基质中的微生物。而维生素C具有抗氧化作用，可抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，防止冻干操作对细胞膜造成不可逆转的破坏。
另一方面，为了提高粪样微生物对冷冻环境的抵抗力，本发明对冻干工艺也进行了一列合理的设计：通过设置粪样的冷应激处理，使菌株产生了胁迫交叉反应，从而更能适应后续的低温胁迫，同时，进一步调节细胞代谢，使菌株具有稳定的细胞结构；而在利用中性生理盐水洗涤腐熟猪粪，能够除去益生菌分泌的多余酸类物质，从而减少酸类物质对活体菌株产生的酸抑制效应。最后，通过充氮包装，降低了菌株在储存过程中死亡的概率，进一步地提高了基质中活性菌株的存活率。
由此制得的冻干猪粪源生物肥料性质稳定，无需冷藏，储存方便，且具有较好的复溶性，复溶的猪粪源生物肥料基质中的微生物基本能恢复至接收冻干处理之前的生物活性。
附图说明
附图1为对比实施例2的样品益生菌活菌数变化率统计图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
主要设备：上海继谱GIPP品牌FD-1A-80真空冷冻干燥机
本实施例所采用的试剂类型及其具体组成如下，以下所有试剂在使用前预冷至5℃：
洗涤液：中性生理盐水；
冻干保护剂：海藻糖6％、β-环糊精4％、蔗糖4％和维生素C 1％；
酸碱度调节剂：10％Na2CO3溶液；
pH缓冲剂：pH＝7.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
1.预处理过程
冷应激处理：将一定量的腐熟猪粪置于8℃下保温5小时；
洗涤处理：利用洗涤液洗涤腐熟猪粪，沥干水分，目的是除去益生菌分泌的多余酸类物质；
预混处理：向腐熟猪粪中加入冻干保护剂，两者的重量比为，冻干保护剂：腐熟猪粪＝1.3:1，使两者充分混合20分钟；
酸碱度调节：利用酸碱度调节剂调节体系pH至7.5，并加入pH缓冲剂。
2.预冻过程
将腐熟猪粪放入冷冻干燥剂的冷阱内，使板温以30℃/h的降温速率从室温降至-80℃，保温8小时。
3.升华过程
使板温以10℃/min的升温速率升至-42℃，调节升华压力为10Pa，维持24小时。
4.解析过程
使板温以10℃/min的升温速率升至0℃，调节解析压力为25Pa，至再无水份逸出，若在关闭冷阱和冷凝器之间的阀门后30～60秒内，压力上升不超过3～8Pa，则说明基本无水份逸出，可以结束冻干。
5.充氮包装
待冷阱内温度恢复至常温常压后，将所得产品迅速移出，并对产品进行充氮密封包装。
对比实施例1
1.实验组设置方式
设置本实施例以作为实施例1的对比实施例。本实施例以冻干保护剂的有效成分作为变量，以探究冻干保护剂的有效成分对生物肥料中的微生物活菌数的影响。本实施例各试验组所采用的冻干保护剂的有效成分具体组成如表1所示，除了冻干保护剂的有效成分外，所有试剂配方、操作步骤及工艺参数均与实施例1保持一致。
表1本实施例各试验组采用的冻干保护剂的有效成分具体组成
Figure BDA0002034981170000051
2.益生菌有效活菌数测试
在腐熟猪粪进行冷应激处理之前(标记为“未经预处理粪样”)以及密封包装后存放30天取样，对已经进行冻干处理的样品进行微生物复苏的预处理，对样品进行益生菌有效活菌数计数，并计算相应的活菌数变化率，计算方法如下：活菌数变化率＝100％×(未经预处理粪样活菌数－复苏冻干样品活菌数)/未经预处理粪样活菌数。
在超净工作台内取1g样品于无菌试管中，加入PBS缓冲液9mL，磁力振荡器振荡5分钟，此液为10-1稀释液，吸取1mL此溶液装于盛有9mL无菌PBS缓冲液试管中进行10-2稀释，振荡5分钟，并依次进行10-3-10-6倍稀释。采用平板计数法计数测定经过稀释的粪样中的细菌、放线菌、真菌、硝化菌和氨化菌。
3.测试结果
本实施例的测试结果如表2所示，空白组对应的五种益生菌的变化率显著低于其余各实验组，由于没有提供冻干保护剂对微生物进行保护，空白组的基质中的微生物在进行冻干操作的过程中大量地死亡，导致进行包装时，其基质中的活菌数被大大减少。对比实验1-5组的活菌数变化率统计数据，含有不同有效组分的冻干保护剂对基质中的不同菌种的保护强度不同，总的来说，对应实施例1的5种益生菌的活菌变化率分别达到了所有组别种对应参数的最小值。由此，说明冻干保护剂可以有效地降低基质活菌在冻干操作过程种死亡的可能，实验1组(同实施例1)对应的冻干保护剂对细菌、放线菌、真菌、硝化菌和氨化菌的保护效果最佳。
表2本实施例各实验组的样品的益生菌活菌数变化率/(％)
组别 细菌 放线菌 真菌 硝化菌 氨化菌
空白组 32.55 38.55 28.64 11.05 9.46
实验1组 0.84 0.76 0.54 0.42 0.78
实验2组 2.13 1.17 1.96 1.42 1.12
实验3组 1.33 3.02 5.95 0.89 1.08
实验4组 3.79 1.54 1.94 1.06 1.37
实验5组 1.58 5.98 3.41 0.93 1.13
对比实施例2
1.实验组设置方式
设置本实施例以作为实施例1的对比实施例。本实施例以腐熟猪粪与冻干保护剂的重量比作为变量，除此之外，所有试剂配方、操作步骤及工艺参数均与实施例1保持一致，以探究腐熟猪粪与冻干保护剂的重量比对生物肥料中的微生物活菌数的影响。本实施例分别以腐熟猪粪：冻干保护剂＝1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5设施实验组。
2.益生菌有效活菌数测试
在腐熟猪粪进行冷应激处理之前(标记为“未经预处理粪样”)以及密封包装后存放30天取样，对已经进行冻干处理的样品进行微生物复苏的预处理，对样品进行益生菌有效活菌数计数，并计算相应的活菌数变化率。具体的操作取样步骤以及计算方法与对比实施例1保持一致。
3.测试结果
如图1，腐熟猪粪和冻干保护剂的不同比例对基质中的活菌株的存活率产生显著的影响，随着腐熟猪粪比和冻干保护剂之间的比例增大，各菌种的活菌数变化率呈现先下降再上升的趋势，综合该比例数值对各种菌株活菌数的影响，以腐熟猪粪：冻干保护剂＝1.3:1作为其两者的最佳比值。
对比实施例2
1.实验组设置方式
设置本实施例以作为实施例1的对比实施例，以探究预处理工艺和包装工艺对生物肥料中的微生物活菌数的影响。本实施例各实验组的变量设置如表3所示，每组实验组除了表3所列举的变量外，所有试剂配方、操作步骤及工艺参数均与实施例1保持一致。
表3本实施例各试验组的变量设置方式
Figure BDA0002034981170000071
2.益生菌有效活菌数测试
在腐熟猪粪进行冷应激处理之前(标记为“未经预处理粪样”)以及密封包装后存放30天、60天、90天、120天和150天取样，对已经进行冻干处理的样品进行微生物复苏的预处理，对样品进行益生菌有效活菌数计数，并计算相应的活菌数变化率。具体的操作取样步骤以及计算方法与对比实施例1保持一致。
3.测试结果
本实施例的测试结果如表4所示，随着存放时间的延长，各组的益生菌活菌数都呈下降趋势。其中，对应对照组的五种益生菌的活菌变化率分别达到了本实施例所有实验组中的对应指标的最小值，说明按实施例1提供的方案对猪粪源生物肥进行包装，能够很大程度地保护了基质中的活菌。实验A、B、C、D组对应的活菌数变化率在存放第30天时显著低于对照组的对应数值，而随着存放时间增长，对应的活菌变化率的增长较缓慢，说明对应实验A、B、C、D组基质中的活菌主要在冻干操作的过程中发生死亡。然而，实验E组对应的活菌数变化率随着存放时间的延长而迅速上升，证明该组的基质活菌主要是在存放的过程中发生死亡。
表4本实施例各实验组的样品的益生菌活菌数变化率/(％)
Figure BDA0002034981170000081
Figure BDA0002034981170000091
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (5)

1.一种猪粪源生物肥料的生产包装方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理步骤：步骤A，将腐熟猪粪在8℃下保温3～8小时；步骤B，利用中性生理盐水洗涤所述腐熟猪粪；步骤C，向所述腐熟猪粪中加入所述冻干保护剂，所述冻干保护剂：所述腐熟猪粪＝1～1 .5:1，并使两者充分混合20分钟，所述冻干保护剂包括以下有效成分：海藻糖6％、β-环糊精4％、蔗糖4％和维生素C 1％；步骤D，调节所述腐熟猪粪的酸碱度至pH＝7-8，并加入由Na2CO3和NaHCO3复配而成的pH缓冲剂；
步骤(1)预冻：将腐熟猪粪于-83℃～-78℃下预冻至完全冻实；
步骤(2)升华：升华干燥板温为-45℃～-40℃，升华干燥压力为10Pa，升华时间为20～30小时；
步骤(3)解析：解析干燥板温为-5℃～5℃，解析干燥压力为25Pa，至再无水份逸出为解析完成；
步骤(4)待冷冻干燥设备恢复至常温常压后，将所得产品移出冷冻干燥设备并将其进行密封包装。
2.如权利要求1所述猪粪源生物肥料的生产包装方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，将所述腐熟猪粪转入所述冷冻干燥设备后，使所述冷冻干燥设备以30℃/h的降温速率从室温降至预冻温度。
3.如权利要求1所述猪粪源生物肥料的生产包装方法，其特征在于，在进行所述步骤(1)前还包括预处理步骤，所述预处理步骤包括：将所述腐熟猪粪在8℃下保温3～8小时。
4.如权利要求1所述猪粪源生物肥料的生产包装方法，其特征在于：在所述预处理步骤所使用的所有试剂在使用前均预冷至5℃。
5.如权利要求1所述猪粪源生物肥料的生产包装方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述包装具体为充氮包装。
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