CN103937837A - 干酪乳杆菌由来抑菌活性物质的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全技术领域，为干酪乳杆菌由来抑菌活性物质的分离方法，该方法采用乙酸乙酯萃取干酪乳杆菌的培养上清液，通过旋转蒸发仪对各萃取相进行浓缩。包括如下步骤：干酪乳杆菌的活化和扩大培养；干酪乳杆菌培养上清液处理；使用乙酸乙酯对干酪乳杆菌培养上清液进行萃取；随后使用旋转蒸发仪对各萃取相进行浓缩。
Description
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及干酪乳杆菌由来抑菌活性物质的分离方法。
背景技术
生物防腐是通过益生菌生长代谢产生对病原菌和腐败菌生长繁殖有害的次级代谢产物，能够争夺生长环境空间和营养，限制有害微生物的生长繁殖，直至其死亡。生物防腐技术已经在一些发达工业国家得到迅速发展，并且成熟地应用于食品发酵行业。在食品行业，酸败是引起经济浪费和威胁公共卫生安全的重要原因。调查表明，世界上每年有超过20 %的食物因被腐败菌或致病菌污染而被废弃。
在食源性生物危害中，单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、高致病性大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌以及产真菌毒素真菌等食源性致病菌一直是阻碍食品安全防控的绊脚石。1996年6-8月，在日本大阪地区发生一起因高致病性大肠杆菌0157:H7所引发的爆发流行，感染人数高达9000多人，其中死亡11人，引起世界各国健康卫生部门的极大关注。2000年，日本由金黄色葡萄球菌污染引发的雪印牛奶事件，中毒人数超过上万人，并导致该公司的破产倒闭。2011年下半年，美国爆发一起单核增生李斯特菌引起的食源性疾病暴发事件，从2011年7月31日出现首例报告病例至10月6日共报告病例109例，涉及美国24个州，这是l0多年来美国最严重的一起食源性疾病暴发事件。据世界卫生组织（WHO）统计表明，各国食源性疾病的漏报率高达90%以上，换言之，每年各国所公布的生物源性食物中毒事件只是冰山一角，实际发生数要比报告数高出300-500倍，即全世界每年生物源性食源中毒患者高达数亿人。
乳酸菌是革兰氏阳性、无孢子、不能运动、形态呈杆状或球状，能够发酵碳水化合物产生酸类物质的一类细菌统称，通过其产生的次级代谢产物，诸如有机酸、细菌素、过氧化氢等物质抑制病原菌和腐败菌的生长繁殖，从而达到生物防腐作用。乳酸、甲酸、醋酸、丙酸等是乳酸菌分泌产生有机酸的主要组成，这些有机酸可以通过降低环境体系的pH达到遏制病原菌的生长繁殖目的，由此发挥生物防腐作用（De Vuyst L, Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. Journal of molecular microbiology and biotechnology. 2007;13(4):194-9.；Sobrino-López A, Martín-Belloso O. Use of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products. International Dairy Journal. 2008;18(4):329-43）。对病原菌的抑菌效能是衡量益生菌的一个重要性能指标。乳酸菌作为益生菌定植于人体胃肠道和泌尿系统，能够维持胃肠道和泌尿系统的正常菌群平衡，有效阻止生物体内致病菌和腐败菌引起的感染性疾病。在食品行业中，源于其分泌的次级代谢产物具有提高食品口感、增加营养、延长保质期等优点，所以乳酸菌在食品生物防腐上发挥重要作用。作为益生菌，它还能有效降低血清胆固醇、减少癌症发病率、增强胃肠道黏膜的抵御能力，并且能够辅助提高机体的免疫功能和消化系统的消化功能。伴随食品安全问题的日益激化，乳酸菌的研究和应用越来越受到广大科研工作者和食品制造行业的关注，希望通过生物工程技术，将其早日应用于生物防腐领域，不但能解决因食源性病原菌污染食品导致疾病暴发及造成巨大的经济损失，同时也能提高食品的营养价值。
乳酸菌代谢产生诸如有机酸、大分子蛋白及小分子肽类细菌素、H2O2等广谱抑菌活性物质，然而有机酸和细菌素呈现显著的抑菌作用。至今，主要应用硫酸铵沉淀法分离干酪乳杆菌由来的抑菌物质，虽然该方法简单易行，但是只能分离蛋白类干酪乳杆菌素，而其他抑菌物质无法分离获得，并且其分离效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌由来抑菌活性物质的分离方法，该方法利用乙酸乙酯萃取干酪乳杆菌上清培养液，通过旋转蒸发仪浓缩萃取的各抑菌相。
具体步骤如下：
步骤一，干酪乳杆菌的活化和扩大培养，将冷冻保存于-80℃冰箱中的干酪乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中接种20μl菌液的比例，将浓度为1×109 cfu/ml的种菌液接种至灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温静止培养14-16 h后，取菌液接种于灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温静置培养48 h；
步骤二，干酪乳杆菌培养上清液处理，将步骤一得到的培养液置于无菌离心管中，于4℃、8000 rpm离心30 min，弃去菌体沉淀，得到的上清液再通过0.45 μm超滤膜超滤，以除去残留的菌体和较大颗粒；
步骤三，使用乙酸乙酯萃取干酪乳杆菌培养上清液，将步骤二得到的上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取后得到三相，即：上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相和下层水相；
步骤四，使用旋转蒸发仪对各萃取相进行浓缩，将步骤三萃取得到的上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相、下层水相进行旋蒸浓缩，浓缩后得到乙酸乙酯相悬蒸相、乙酸乙酯相悬蒸余相、中间相悬蒸相、中间相悬蒸余相、水相悬蒸相和水相悬蒸余相，随后将浓缩的各相液体进行抑菌活性检测，同时将其置于4℃冷藏保存备用。
本发明步骤一中干酪乳杆菌的接种量为4 ‰（体积比）。
本发明所述步骤四中采用旋转蒸发仪对上层乙酸乙酯相在40-45℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩；对中间层白色絮状沉淀相在35-40℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩；对下层水相在60-65℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩。
本发明中所述干酪乳杆菌为常规市售菌种。
本发明的优点和技术效果如下：当今主要应用硫酸铵沉淀法对干酪乳杆菌由来的抑菌物质实施分离，虽然该方法简单易行，但是只能分离蛋白类干酪乳杆菌素，而其他抑菌物质无法分离获得，并且其分离效率低。
本申请应用乙酸乙酯多次萃取法对干酪乳杆菌培养上清液进行萃取，能够有效地分离不同种类的抑菌物质，并且能有效提高各种抑菌物质的分离效率，从而简化后续抑菌物质的纯化步骤。乙酸乙酯属于小极性有机溶剂，应用它对乳酸菌发酵液进行萃取时形成三层萃取相，有机酸存在于上层乙酸乙酯相；而大分子蛋白和小分子肽类存在于中间的乳化蛋白相；乙醇、H2O2等抑菌物质存在于下层水相。
本申请中干酪乳杆菌乙酸乙酯相萃取余相的抑菌效果较谭君等研究的重组干酪乳杆菌的培养上清液对食源性病原菌大肠杆菌O157:H7 (Escherichia coli) 、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）的抑菌效果强1.5倍（谭君, 侯喜林, 余丽芸, 李剑华, 王桂华, 曹宁 重组干酪乳杆菌代谢产物抑菌效果的研究. 黑龙江八一农垦大学学报. 2012; 24(4): 29-32）。此外，水相旋蒸余相也显示明显的抑菌效果，所以表明该相也含有相应的抑菌活性物质。本研究表明，主要抑菌物质存在于乙酸乙酯萃取相中。此外，乙酸乙酯属于低极性有机溶剂，不同极性的抑菌物质可能不完全溶于该溶剂中，由此还可以推测水相中也可能存在相应抑菌物质。
附图说明
图1干酪乳杆菌中分离的活性物质对食源性病原菌的抑菌照片；图中：A为大肠杆菌O157:H7； B为金黄色葡萄球菌；C为单核细胞增生李斯特菌；1为乙酸乙酯相旋蒸相；2为乙酸乙酯相旋蒸余相；3为中间相旋蒸相；4为中间相旋蒸余相；5为水相旋蒸相；6为水相旋蒸余相；7为乙酸乙酯。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂或培养基如无特殊说明的采用常规市售试剂或培养基，或按常规方法配置的试剂或培养基。
本发明的具体实施方式在于利用等体积的乙酸乙酯萃取干酪乳杆菌上清培养液，通过旋转蒸发仪浓缩萃取各相，然后采用Spot-on-lawn改进法（JW Hastings, ME Stiles . Antibiosis of Leuconostoc gelidum isolated from meat .Journal of applied bacteriology.1991; 70（2）：127-134）对大肠杆菌O157:H7菌株、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等三种食源性病原菌进行抑菌试验。
实施例1：本干酪乳杆菌由来抑菌活性物质的分离方法，具体操作如下：
步骤一：将冷冻保存于-80℃冰箱中的干酪乳杆菌取出并迅速解冻，取20 μl（1×109cfu/ml）接种至5 ml MRS肉汤培养，置于37℃恒温静止培养14-16 h，然后按4 ‰接种量，取1 ml菌液接种至250 ml灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温静置培养48 h；
将冷冻保存于-80℃的大肠杆菌O157:H7菌株、金黄色葡萄球菌菌株、单核细胞增生李斯特菌菌株等三种食源性病原菌菌株取出并迅速解冻，取20 μl分别接种至5 ml灭菌LB培养基、BHI（脑心浸出液肉汤培养基）、BHI（脑心浸出液肉汤培养基）中，30℃、200 rpm，摇床培养20 h，并测得其菌浓度为2×108 cfu/ml；
步骤二：将步骤一得到的培养液置于无菌离心管中，于4℃、8000 rpm离心30 min，弃去菌体沉淀，得到的上清液再通过0.45 μm超滤膜超滤，以除去残留的菌体和较大颗粒；
步骤三：将步骤二得到的上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复3次，萃取后得到上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相和下层水相；
步骤四：将步骤三萃取得到的上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相、下层水相进行旋蒸浓缩，上层乙酸乙酯相在40℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩，中间层白色絮状沉淀相在35℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩，下层水相在60℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩，浓缩后得到乙酸乙酯相旋蒸相、乙酸乙酯相旋蒸余相、中间相旋蒸相、中间相旋蒸余相、水相旋蒸相和水相旋蒸余相；
采用spot-on-lawn 改进法对浓缩后的各相进行抑菌实验；spot-on-lawn改进法的优点是为其提供固相支持物，充分考虑抑菌因子分泌的细胞群体感应效应，并能更加真实模拟发酵环境，具体步骤：吸取5μl各相分别滴加于含有106 cfu/ml的大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的25 ml 且含1%凝胶琼脂固体平板（大肠杆菌O157:H7采用LB凝胶琼脂固体平板，金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌采用BHI凝胶琼脂固体平板）中，将平板先置于4 ℃冰箱中使各抑菌相均匀冷散2 h后再倒置放入30℃的培养箱中，培养20 h（培养基及培养温度以指示菌而定）后观察有无抑菌圈及抑菌圈差异（如表1）。
表1 干酪乳杆菌萃取相对食源性病原菌的抑菌效果
实施例2：分离方法同实施例1，不同在于步骤四：将步骤三萃取得到的上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相、下层水相进行旋蒸浓缩，上层乙酸乙酯相在45℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩，中间层白色絮状沉淀相在40℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩，下层水相在65℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩，浓缩后得到乙酸乙酯相旋蒸相、乙酸乙酯相旋蒸余相、中间相旋蒸相、中间相旋蒸余相、水相旋蒸相和水相旋蒸余相。
Claims (3)
1.一种干酪乳杆菌由来抑菌活性物质的分离方法，其特征在于采用乙酸乙酯对干酪乳杆菌培养上清液进行等体积萃取，使用旋转蒸发仪对各萃取相进行浓缩，所述具体步骤为：
步骤一，干酪乳杆菌的活化和扩大培养，将冷冻保存于-80℃冰箱中的干酪乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中接种20μl菌液的比例，将浓度为1×109 cfu/ml的种菌液接种至灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温静止培养14-16 h后，取菌液接种于灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温静置培养48 h；
步骤二，干酪乳杆菌培养上清液处理，将步骤一得到的培养液置于无菌离心管中，于4℃、8000 rpm离心30 min，弃去菌体沉淀，得到的上清液再通过0.45 μm超滤膜超滤；
步骤三，使用乙酸乙酯萃取干酪乳杆菌培养上清液，将步骤二得到的上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取后得到上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相和下层水相；
步骤四，使用旋转蒸发仪对各萃取相进行浓缩，将步骤三萃取得到的上层乙酸乙酯相、中间层白色絮状沉淀相、下层水相进行旋蒸浓缩，浓缩后得到乙酸乙酯相悬蒸相、乙酸乙酯相悬蒸余相、中间相悬蒸相、中间相悬蒸余相、水相悬蒸相和水相悬蒸余相，将浓缩后的各相液体进行抑菌活性检测，随后置于4℃冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌中抑菌活性物质分离方法，其特征在于：步骤一中干酪乳杆菌的接种量为体积比4 ‰。
3.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌中抑菌活性物质分离方法，其特征在于：所述步骤四中采用旋转蒸发仪对上层乙酸乙酯相在40-45℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩；对中间层白色絮状沉淀相在35-40℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩；对下层水相在60-65℃、120 rpm条件下进行旋蒸浓缩。
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