CN114196543A

CN114196543A - 一种粪菌冷冻保护剂及其在粪菌保藏中的应用

Info

Publication number: CN114196543A
Application number: CN202111412800.0A
Authority: CN
Inventors: 乔建军; 寇佳祥; 吴昊; 朱宏吉; 张悦
Original assignee: Zhejiang Shaoxing Research Institute Of Tianjin University
Current assignee: Zhejiang Shaoxing Research Institute Of Tianjin University
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-03-18

Abstract

本发明公开了一种粪菌冷冻保护剂及其在粪菌保藏中的应用，粪菌冷冻保护剂是按质量百分比由以下组分组成：海藻糖20％‑36％，蔗糖14％‑22％，脱脂乳粉4％‑8％，甜菜碱4％‑8％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.02％‑0.06％，D‑异抗环血酸钠0.3％‑0.7％，谷胱甘肽0.1％‑0.2％，余量为无菌水。本发明的一种粪菌冷冻保护剂在低温冷冻条件下能有效保护粪菌菌悬液初始组成比例、菌群多样性和菌存活率。本发明的粪菌冷冻保护剂能使冷冻后的菌悬液菌群组成与冷冻前菌悬液菌群组成更为接近，对科研人员准确研究肠道菌群组成有重要意义。

Description

一种粪菌冷冻保护剂及其在粪菌保藏中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种粪菌冷冻保护剂及其在粪菌保藏中的应用。

背景技术

人类肠道是一个极其复杂的生态系统，约有1000万亿的厌氧微生物寄居。肠道中的菌群便于人们吸收食物中的营养成分，增强机体免疫力，维持肠道稳态。目前与人类肠道微生物区系有关的主要研究方向有两个，一是建立准确、高效的方法来鉴定微生物群落的组成及肠道菌群蛋白质组学和代谢组学分析，二是肠道微生物群稳态变化与人类疾病之间的关系。粪便样本中的微生物区系能够较好的代表肠道菌群组成，因此常通过对粪便样本进行分析研究肠道菌群。无论是哪个研究方向，在研究之前都需要对粪便样本进行很好的保存，因此良好的粪菌保藏条件是研究的关键。

低温冷冻保存是公认的菌株长期保存的安全有效的方法，目前常用的粪菌冷冻保护剂是体积分数为10％甘油水溶液，研究表明体积分数为10％的甘油水溶液对粪菌体系有一定的保护作用，但仍有部分细菌不能受到很好保护，经甘油水溶液冷冻保存后的粪便样本不能较好的反应真实肠道区系情况，对科研人员准确了解人肠道菌群组成、深入研究肠道微生物造成一定影响，因此，亟需能够更好地保护粪菌中的微生物多样性，减少冷冻过程中细菌的损伤，更好地保护粪便样本的完整性，使粪便样本更真实的反映肠道区系组成的粪菌冷冻保护剂。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种在低温冷冻保藏中能够有效保护粪菌菌群初始组成比例、菌群多样性和菌存活率的粪菌冷冻保护剂。

本发明的第二个目的是提供一种粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种粪菌冷冻保护剂，按质量百分比由以下组分组成：海藻糖20％-36％，蔗糖14％-22％，脱脂乳粉4％-8％，甜菜碱4％-8％，L-半胱氨酸盐酸盐0.02％-0.06％，D-异抗环血酸钠0.3％-0.7％，谷胱甘肽0.1％-0.2％，余量为无菌水。

按质量百分比由以下组分组成：海藻糖28％，蔗糖18％，脱脂乳粉6％，甜菜碱6％，L-半胱氨酸盐酸盐0.04％，D-异抗环血酸钠0.5％，谷胱甘肽0.1％，余量为无菌水。

上述的一种粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用。

上述应用，包括如下步骤：将粪菌菌液与粪菌冷冻保护剂按照体积比1:1的比例混合均匀获得菌悬液，在-80℃冷冻保藏。

所述粪菌菌液用下述方法制成：收集健康志愿者新鲜粪便样本100-200g，加入相当于所述样本质量5倍的无菌生理盐水，在厌氧环境下进行匀质化处理，用无菌纱布过滤残渣，得到粪菌菌液。

本发明的优点：

本发明的一种粪菌冷冻保护剂在低温冷冻条件下能有效保护粪菌菌悬液初始组成比例、菌群多样性和菌存活率。本发明的粪菌冷冻保护剂能使冷冻后的菌悬液菌群组成与冷冻前菌悬液菌群组成更为接近，对科研人员准确研究肠道菌群组成有重要意义。

附图说明

图1为粪菌悬液冷冻前和冷冻后门水平的菌群相对丰度的分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种粪菌冷冻保护剂，按质量百分比由以下组分组成：海藻糖28％，蔗糖18％，脱脂乳粉6％,甜菜碱6％，L-半胱氨酸盐酸盐0.04％，D-异抗环血酸钠0.5％，谷胱甘肽0.1％，余量为无菌水。

实施例2

一种粪菌冷冻保护剂，按质量百分比由以下组分组成：海藻糖20％，蔗糖22％，脱脂乳粉4％,甜菜碱8％，L-半胱氨酸盐酸盐0.02％，D-异抗环血酸钠0.7％，谷胱甘肽0.1％，余量为无菌水。

实施例3

一种粪菌冷冻保护剂，按质量百分比由以下组分组成：海藻糖36％，蔗糖14％，脱脂乳粉8％,甜菜碱4％，L-半胱氨酸盐酸盐0.06％，D-异抗环血酸钠0.3％，谷胱甘肽0.2％，余量为无菌水。

实施例4

粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用

收集健康志愿者新鲜粪便样本150g，加入相当于所述样本质量5倍的无菌生理盐水，在厌氧环境下进行匀质化处理，用无菌纱布过滤残渣，得到粪菌菌液。

将粪菌菌液与实施例1的粪菌冷冻保护剂按照体积比1:1的比例混合均匀获得菌悬液。

取1mL菌悬液利用稀释涂布法检测活菌数并进行微生物多样性分析，微生物多样性分析方法：对1mL菌悬液进行总DNA提取及16s rRNA扩增子测序，测序后得到的序列在各个分类学水平上进行菌种种类数统计。剩余菌悬液放置于-80℃冰箱进行冷冻保藏。保藏3个月后，取出菌悬液在37℃环境解冻后，取1mL菌悬液利用稀释涂布法检测活菌数并进行微生物多样性分析，方法同上。

实施例5

粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用：

收集健康志愿者新鲜粪便样本100g，加入相当于所述样本质量5倍的无菌生理盐水，在厌氧环境下进行匀质化处理，用无菌纱布过滤残渣，得到粪菌菌液。

将粪菌菌液与实施例2的粪菌冷冻保护剂按照体积比1:1的比例混合均匀获得菌悬液，在-80℃冷冻保藏。保藏3个月后，取出菌悬液在37℃环境解冻，进行稀释涂布法活菌数检测及微生物多样性分析，分析方法同实施例4。

实施例6

粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用：

收集健康志愿者新鲜粪便样本200g，加入相当于所述样本质量5倍的无菌生理盐水，在厌氧环境下进行匀质化处理，用无菌纱布过滤残渣，得到粪菌菌液。

将粪菌菌液与实施例3的粪菌冷冻保护剂按照体积比1:1的比例混合均匀获得菌悬液，在-80℃冷冻保藏。保藏3个月后，取出菌悬液在37℃环境解冻，进行稀释涂布法活菌数检测及微生物多样性分析，分析方法同实施例4。

对照例1

将粪菌菌液与体积浓度为10％甘油水溶液按照体积比1:1的比例混合均匀获得菌悬液，在-80℃冷冻保藏。保藏3个月后，取出菌悬液在37℃环境解冻，进行稀释涂布法活菌数检测及微生物多样性分析，分析方法同实施例4。

对照例2

收集健康志愿者新鲜粪便样本150g，加入相当于所述样本质量5倍的无菌生理盐水，在厌氧环境下进行匀质化处理，用无菌纱布过滤残渣，得到粪菌菌液。在-80℃冷冻保藏。保藏3个月后，取出菌悬液在37℃环境解冻，进行稀释涂布法活菌数检测及微生物多样性分析，分析方法同实施例4。

实验结果：

菌悬液存活率检测：

表1菌悬液冷冻前后活菌数

实施例4、实施例5、实施例6中菌悬液在冷冻保藏三个月后，存活率均在80％以上，对照例1使用10％甘油水溶液作为保护剂，存活率为49.43％，远低于使用本发明保护剂的存活率，对照例2菌悬液中无保护剂的添加，存活率仅为20.11％，由菌悬液冷冻后存活率的差异可以看出本发明的冷冻保护剂具有好的保藏效果。

菌悬液中菌种种类统计分析：

粪菌菌悬液中包含许多菌种，研究菌种多样性变化可以体现保护剂对粪菌的保护效果。通过对菌悬液总DNA提取及16s高通量测序，对菌悬液中菌种在各个分类水平上进行分类学分析，结果如表1所示，实施例4、实施例5、实施例6的粪菌菌液在各个水平冷冻前与冷冻后物种数差别不大，冷冻前粪菌悬液菌群组成与冷冻后粪菌悬液组成接近，冷冻后的粪菌悬液能够真实反映冷冻前粪菌悬液的组成比例。对照例1，对照例2的粪菌悬液在各个水平冷冻前与冷冻后物种数差别明显，冷冻前粪菌悬液菌群组成与冷冻后粪菌悬液组成差别很大，冷冻后的粪菌悬液不能真实反映冷冻前粪菌悬液的组成比例。

表2粪菌菌悬液中菌种种类

组别	界	门	纲	目	科	属	种
								实施例4冷冻前	1	16	28	58	104	209	227
实施例4冷冻后	1	16	28	58	104	207	223
								实施例5冷冻前	1	16	28	56	100	202	220
实施例5冷冻后	1	16	28	55	93	192	212
								实施例6冷冻前	1	15	27	54	92	191	216
实施例6冷冻后	1	15	27	53	88	187	209
								对照例1冷冻前	1	15	27	54	94	194	214
对照例1冷冻后	1	11	22	32	71	131	154
								对照例2冷冻前	1	15	27	53	94	191	215
对照例2冷冻后	1	4	12	21	32	57	60

由图1粪菌悬液冷冻前和冷冻后门水平的菌群相对丰度的分布情况可以看出，实施例4、实施例5、实施例6三组菌悬液在冷冻前和冷冻后菌群中各菌种比例未发生明显变化，则冷冻后的菌悬液能够真实反映冷冻前菌悬液菌群组成。对照例1和对照例2在冷冻前和冷冻后菌群中各菌种比例发生明显变化，冷冻后的菌悬液无法真实反映冷冻前菌悬液菌群组成。表1、表2及图1的结果说明本发明提供的冷冻保护剂能够有效保护粪菌菌群初始组成比例、菌群多样性和菌存活率。

以上详细说明是针对本发明其中之一的可实施例的具体说明，而非对其限制；基于本发明的实施例，本领域内技术人员在没有创造性劳动前提下获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于按质量百分比由以下组分组成：海藻糖20%-36%，蔗糖14%-22%，脱脂乳粉4%-8%，甜菜碱4%-8%，L-半胱氨酸盐酸盐0.02%-0.06%，D-异抗环血酸钠0.3%-0.7%，谷胱甘肽0.1%-0.2%，余量为无菌水。

2.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于按质量百分比由以下组分组成：海藻糖28%，蔗糖18%，脱脂乳粉6%，甜菜碱6%，L-半胱氨酸盐酸盐0.04%，D-异抗环血酸钠0.5%，谷胱甘肽0.1%，余量为无菌水。

3.权利要求1或2所述的一种粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是包括如下步骤：将粪菌菌液与粪菌冷冻保护剂按照体积比1:1的比例混合均匀获得菌悬液，在-80℃冷冻保藏。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是所述粪菌菌液用下述方法制成：收集健康志愿者新鲜粪便样本100-200g，加入相当于所述样本质量5倍的无菌生理盐水，在厌氧环境下进行匀质化处理，用无菌纱布过滤残渣，得到粪菌菌液。