CN102988988B - 一种治疗肺曲霉病的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗肺曲霉病的药物组合物，其有效成分为肺曲霉菌变应原疫苗和抗真菌剂。使用本发明的药物组合物治疗肺曲霉病，在有效抑制曲霉菌生长的同时，还能消除和降低曲霉菌变应原引起变态反应导致的机体损害和临床症状。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物组合物，具体地说，涉及一种治疗肺曲霉病的药物组合物。
背景技术
肺曲霉菌病（Pulmonary aspergillosis，PA）是临床上较少见的一种肺部感染疾病。目前，随着抗生素、激素、抗癌药物的广泛应用和诊断技术的不断提高，肺曲霉菌病的发病率呈增高趋势。曲霉菌（asperigillus，ASP）在免疫抑制患者中已成为仅次于白色念珠菌的重要致病真菌，且已成为首要的致死性真菌。ASP属于囊菌纲真正子囊菌亚纲。广泛存在于潮湿环境。在350多种曲霉菌中有7种常常造成人类感染，即烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、稻曲霉、杂色曲霉、土曲霉和巢曲霉。在诸多曲霉属中，95%以上的肺曲霉菌病是由烟曲霉所致，其次是黄曲霉菌。
肺曲霉菌病很少为原发病，绝大多数继发于慢性肺部疾病和全身性疾病及免疫缺陷患者。好发部位为右肺多于左肺，上肺叶多于下肺叶，因机体免疫状态和基础肺疾病不同分为侵袭性肺曲霉菌病（Invasive pulmonary aspergillosis,IPA）、过敏性支气管肺曲霉菌病(Allergic bron-chopulmonary aspergillosis,ABPA)和由肺曲霉菌球（pulmonary aspergilloma）所致的肺曲霉菌病。
目前临床上肺曲霉菌病的治疗主要采用抗菌药物，首选两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬争等。但临床上的治疗往往忽视了对曲霉菌变应原引起的变态反应的治疗。在部分肺曲霉菌患者中，烟曲霉霉菌sIgE水平能达到六级以上（>100IU/ml）。常规抗真菌药物和新型抗真菌药物只能抑制曲霉菌的生长，并不能消除和降低曲霉菌变应原引起变态反应导致的机体损害和临床症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的治疗肺曲霉病的药物组合物。
为了实现本发明目的，本发明的一种治疗肺曲霉病的药物组合物，所述药物组合物的有效成分为肺曲霉菌变应原疫苗和抗真菌剂。
前述药物组合物中，所述肺曲霉菌变应原疫苗为烟曲霉变应原疫苗、黑曲霉变应原疫苗、黄曲霉变应原疫苗、稻曲霉变应原疫苗、杂色曲霉变应原疫苗、土曲霉变应原疫苗或巢曲霉变应原疫苗中的一种或多种。优选为烟曲霉变应原疫苗和黄曲霉变应原疫苗。
前述药物组合物中，所述肺曲霉菌变应原疫苗任选包含至少一种药学上可接受的载体，如甘露醇、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、人血白蛋白、氢氧化铝、L-酪氨酸、磷酸钙、硫酸镁、MPL等。
前述药物组合物中，所述肺曲霉菌变应原疫苗为含氢氧化铝佐剂或酪氨酸佐剂的变应原疫苗。
前述药物组合物中，所述抗真菌剂为两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑或卡泊芬争中的一种或多种。其中，所述两性霉素B为脱氧胆酸盐形式或脂质体制剂。
前述药物组合物中，制备所述肺曲霉菌变应原疫苗的方法包括以下步骤：菌体培养、收获、灭活、脱脂、蛋白提取、纯化、脱毒和冻干。具体为：在液体培养基中培养肺曲霉菌，离心收集菌体，用70～75%乙醇灭活，灭活后真空干燥，干燥后的菌体用丙酮反复脱脂几次，直至丙酮挥发完全。然后将脱脂干燥后的菌体用高速万能粉碎机粉碎，过180～200目筛，过筛后即为肺曲霉菌变应原原料，-20℃保存。按1:10～50（g:mL）的投料比加入碳酸氢钠缓冲液或磷酸盐缓冲液中，2～8℃下搅拌提取12～48h，提取液于8000rpm，4℃离心25min，收集上清，上清依次经8μm、0.8μm、0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的液体经5kD膜超滤，直至滤出液为无色，浓缩至原体积的1/3，使蛋白浓度不低于0.1mg/ml（Bradford），向其中加入10～150μg/ml甲醛，搅拌后于2～8℃放置12～48h，然后用5kD膜超滤（5～10倍体积的缓冲液），冻干。优选地，向甲醛处理后的蛋白原液中加入2%的甘露醇，0.03%～2%HSA，分装，每瓶1ml，冻干。
本发明的肺曲霉菌变应原疫苗优选为含氢氧化铝佐剂的变应原疫苗，将甲醛脱毒超滤后的肺曲霉菌变应原和氢氧化铝混合，2～8℃搅拌过夜，铝含量为0.8mg～1.25mg/ml。
本发明的肺曲霉菌变应原疫苗优选为含酪氨酸佐剂的变应原疫苗，将甲醛脱毒超滤后的肺曲霉菌变应原和酪氨酸混合，酪氨酸含量为10～40mg/ml。
本发明还提供所述药物组合物在制备用于预防或治疗由真菌感染所致疾病的药物中的应用。
本发明进一步提供所述药物组合物在制备用于预防或治疗肺曲霉病的药物中的应用。
本发明的治疗肺曲霉病的药物组合中的肺曲霉菌变应原疫苗使用方法包括剂量递增和维持剂量两个阶段，维持剂量每针0.5ml。肺曲霉菌变应原疫苗的使用方法为：用溶媒溶解肺曲霉菌变应原疫苗，将1ml肺曲霉菌变应原注射液加入到9ml溶媒中配制稀释液10-1，梯度稀释，配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。从稀释液10-6开始注射，每个浓度初始注射剂量为0.1ml，直至注射剂量达1ml，间隔3天注射一次，每个浓度共注射10次。完成剂量递增注射后，进入到维持剂量阶段，每次注射0.5ml，间隔3天注射一次，注射1个月后，间隔1周注射一次，一年后间隔4周注射一次，治疗3年。
肺曲霉菌感染人体后的临床症状主要包括：侵袭性肺曲霉菌病（Invasive pulmonary aspergillosis,IPA）、过敏性支气管肺曲霉菌病(Allergic bron-chopulmonary aspergillosis,ABPA)和由肺曲霉菌球（pulmonary aspergilloma）所致的肺曲霉菌病。肺曲霉菌经气道侵入肺组织，伴随支气管炎症等一些症状，沿血行播散，菌体在肺内空洞处生长，菌丝在肺空洞和空腔内蔓延，血内肺曲霉菌特异性IgE升高，发生变态型支气管炎症。现临床上对于肺曲霉菌病的治疗采用抗真菌剂抑制真菌的生长，但忽略肺曲霉菌在体内的变态反应，临床效果并不佳。本发明治疗肺曲霉菌病的药物组合采用抗真菌剂和烟曲霉菌变应原疫苗的联合，不仅抑制了肺曲霉菌在肺内的生长，而且缓解和消除了肺曲霉菌引起的变态反应支气管炎症，从感染机制入手，全方位的治疗肺曲霉菌病。
本发明的一种治疗肺曲霉病的药物组合物，首次将抗真菌感染的药物（抗真菌剂）和治疗由真菌引起的变态反应疫苗（肺曲霉菌变应原疫苗）联合使用，在有效抑制曲霉菌生长的同时，还能消除和降低曲霉菌变应原引起变态反应导致的机体损害和临床症状。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1肺曲霉菌病患者血清学诊断
随机抽取2008年2月～2011年12月北京协和医院变态反应科确诊的肺曲霉菌病人，血清用Phadia UniCAP诊断系统，使用烟曲霉菌变应原包被试剂诊断。
在203例确诊的肺曲霉菌病人中，经血清学诊断，烟曲霉阳性病人为193例，3级以上共有128例。
实施例2烟曲霉菌变应原冻干疫苗的制备
1.1菌体培养和收获
将烟曲霉菌种从-80℃冰箱取出，在蛋白胨-葡萄糖琼脂培养基平皿划线培养，培养温度25℃，培养时间72h，再接种到蛋白胨-葡萄糖琼脂斜面培养基，25℃培养48h。刮取斜面培养基上的烟曲霉菌菌胎接种到1L三角瓶中的液体培养基上，25℃培养50天。液体培养基配方为：蔗糖30g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、注射用水1000ml。培养结束后，将三角瓶中的液体倒去，收集菌体，用70～75%乙醇灭活，灭活后在真空干燥器中干燥。
1.2脱脂
干燥后的菌体称重158g，按1:5（g:mL）向菌体中加入丙酮，反复脱脂几次，直至脱脂丙酮上清澄清无色。脱脂后的菌体在真空干燥器中干燥，直至没有丙酮的味道。将脱脂干燥后的菌体用高速万能粉碎机粉碎，过200目筛，过筛后即为烟曲霉变应原原料，-20℃保存。
1.3蛋白提取
用50mM磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 6.61g、NaH2PO4 0.402g、H2O1000ml)按1:25（g:mL）的投料比，将烟曲霉变应原原料加入缓冲液中，2～8℃条件下搅拌提取24h。提取液在8000rpm，4℃的条件下离心25min。将离心后的上清依次经8μm、0.8μm、0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的液体经5kD膜超滤，直至滤出液为无色，浓缩至原体积的1/3，使蛋白浓度不低于0.1mg/ml（Bradford）。
1.4脱毒
向蛋白原液中加入50μg/ml甲醛，于2～8℃放置12～48h，然后用5kD膜超滤（8倍体积缓冲液）去除甲醛。
1.5分装冻干
向甲醛处理后的蛋白原液中加入2%的甘露醇，1%HSA，分装，每瓶1ml，冻干。
实施例3烟曲霉菌变应原含氢氧化铝佐剂疫苗的制备
1.1菌体培养和收获
将烟曲霉菌种从-80℃冰箱取出，在蛋白胨-葡萄糖琼脂培养基平皿划线培养，培养温度25℃，培养时间72h,再接种到蛋白胨-葡萄糖琼脂斜面培养基，25℃培养48h。刮取斜面培养基上的烟曲霉菌菌胎接种到1L三角瓶中的液体培养基上，25℃培养50天。液体培养基的配方为：蔗糖30g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、注射用水1000ml。培养结束后，将三角瓶中的液体倒去，收集菌体，用70～75%乙醇灭活，灭活后在真空干燥器中干燥。
1.2脱脂
干燥后的菌体称重138g，按1:5（g:mL）向菌体中加入丙酮，反复脱脂几次，直至脱脂丙酮上清澄清无色。脱脂后的菌体在真空干燥器中干燥，直至没有丙酮的味道。将脱脂干燥后的菌体用高速万能粉碎机粉碎，过180～200目筛，过筛后即为烟曲霉变应原原料，-20℃保存。
1.3蛋白提取
用50mM磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 6.61g、NaH2PO4 0.402g、H2O1000ml)按1:25（g:mL）的投料比，将烟曲霉变应原原料加入缓冲液中，2～8℃条件下搅拌提取24h。提取液在8000rpm，4℃的条件下离心25min。将离心后的上清依次经8μm、0.8μm、0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的液体经5kD膜超滤，直至滤出液为无色，浓缩至原来体积的1/3，蛋白浓度不低于0.1mg/ml（Bradford）。
1.4脱毒
向蛋白原液中加入50μg/ml甲醛，于2～8℃放置12～48h，然后用5kD膜超滤（8倍体积缓冲液）去除甲醛。
1.5半成品配制
将烟曲霉变应原原液和等体积铝含量为2.5mg/ml的氢氧化铝混合后4℃搅拌过夜。分装，每瓶5ml。
实施例4烟曲霉菌变应原含酪氨酸佐剂疫苗的制备
1.1菌体培养和收获
将烟曲霉菌种从-80℃冰箱取出，在蛋白胨-葡萄糖琼脂培养基平皿划线培养，培养温度25℃，培养时间72h,再接种到蛋白胨-葡萄糖琼脂斜面培养基，25℃培养48h。刮取斜面培养基上的烟曲霉菌菌胎接种到1L三角瓶中的液体培养基上，25℃培养50天。液体培养基的配方为：蔗糖30g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、注射用水1000ml。培养结束后，将三角瓶中的液体倒去，收集菌体，用70～75%乙醇灭活，灭活后在真空干燥器中干燥。
1.2脱脂
干燥后的菌体称重166g，按1:5（g:mL）向菌体中加入丙酮，反复脱脂几次，直至脱脂丙酮上清澄清无色。脱脂后的菌体在真空干燥器中干燥，直至没有丙酮的味道。将脱脂干燥后的菌体用高速万能粉碎机粉碎，过180～200目筛，过筛后即为烟曲霉变应原原料，-20℃保存。
1.3蛋白提取
用50mM磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 6.61g、NaH2PO4 0.402g、H2O1000ml)按1:25（g:mL）的投料比，将烟曲霉变应原原料加入缓冲液中，2～8℃条件下搅拌提取24h。提取液在8000rpm，4℃的条件下离心25min。将离心后的上清依次经8μm、0.8μm、0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的液体经5kD膜超滤，直至滤出液为无色，浓缩至原来体积的1/3，蛋白浓度不低于0.1mg/ml（Bradford）。
1.4脱毒
向蛋白原液中加入50μg/ml甲醛，于2～8℃放置12～48h，然后用5kD膜超滤8倍体积缓冲液去除甲醛。
1.5半成品配制
将L-酪氨酸用3.9M盐酸溶解配制为24%的酪氨酸酸溶液。向15L10000AU/ml烟曲霉变应原原液中加入1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液5L，在搅拌的条件下缓慢滴入L-酪氨酸酸溶液和3.2M NaOH维持pH7.0-8.0。离心沉淀，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤沉淀两次，向沉淀中加入PBS 30L溶解。分装，每瓶5ml。
实施例5烟曲霉变应原安全性检验
将疫苗成品按每只小鼠0.5ml，腹腔注射体重为18-20g的小鼠，共40只，一个月内应无死亡，小鼠体重增加应等同于正常生理盐水对照组，结果见表1。
表1烟曲霉变应原疫苗安全性检验
实施例6治疗肺曲霉病的药物组合物的临床评价
本实施例中进行的临床试验，主要评价治疗肺曲霉菌病的药物组合-烟曲霉变应原疫苗和抗真菌剂（两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬争）联合应用的效果。本实施例采用单中心对照双盲的方案，共招募到202名肺曲霉菌病患者，男性患者135名，女性患者67名。最小年龄为25岁，最大年龄为65岁。共分为三组，组1为67例患者，用安浮特克（两性霉素B脂质体）治疗；组2为70例患者，用烟曲霉菌变应原疫苗和安浮特克联合治疗；组3为65例患者，用烟曲霉变应原疫苗和伊曲康唑联合治疗。
烟曲霉变应原疫苗的使用方法为：用溶媒溶解烟曲霉变应原疫苗，将1ml烟曲霉变应原注射液加入到9ml溶媒中配制稀释液10-1，梯度稀释，配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。从稀释液10-6开始注射，每个浓度初始注射剂量为0.1ml，直至注射剂量达1ml，间隔3天注射一次，每个浓度共注射10次。完成剂量递增注射后，进入到维持剂量阶段，每次注射0.5ml，间隔3天注射一次，注射1个月后，间隔1周注射一次，一年后间隔4周注射一次，治疗3年。
安浮特克和伊曲康唑的使用方法按使用说明，治疗时长为6个月。与烟曲霉变应原疫苗同步治疗使用。
治疗评价指标：主要包括三项特征，临床症状（高热、干咳、呼吸困难、胸痛）的改善、IPA X线和CT影像学特征、微生物学检查（Ⅰ合格痰液经镜检未发现菌丝，ASP培养两次为阴性；Ⅱ支气管肺灌洗液经直接镜检未发现菌丝，ASP培养为阴性；Ⅲ血液标本ASP半乳甘露聚糖抗原ELISA检查连续两次为阴性；Ⅳ血液标本1,3-β-D葡聚糖试验连续两次为阴性），以上三项指标均符合，为治愈。结果见表2。
表2治疗肺曲霉菌病联合用药的临床评价
以上结果表明，采用烟曲霉变应原疫苗和抗真菌剂联合用药治疗肺曲霉菌病，治疗效果要优于单一使用抗真菌剂（P<0.05）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种治疗肺曲霉病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分为肺曲霉菌变应原疫苗和抗真菌剂；
制备所述肺曲霉菌变应原疫苗的方法为：在液体培养基中培养肺曲霉菌，离心收集菌体，用70～75%乙醇灭活，灭活后真空干燥，干燥后的菌体用丙酮反复脱脂几次，将脱脂后的菌体真空干燥，直至丙酮挥发完全，然后粉碎菌体，过180～200目筛，然后按g:mL计1:10～50的投料比加入碳酸氢钠缓冲液或磷酸盐缓冲液中，2～8℃下搅拌提取12～48h，提取液于8000rpm，4℃离心25min，收集上清，上清依次经8μm、0.8μm、0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的液体经5kD膜超滤，直至滤出液为无色，浓缩至原体积的1/3，使蛋白浓度不低于0.1mg/ml，向其中加入10～150μg/ml甲醛，搅拌后于2～8℃放置12～48h，然后用5kD膜超滤，冻干。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述肺曲霉菌变应原疫苗为烟曲霉变应原疫苗、黑曲霉变应原疫苗、黄曲霉变应原疫苗、稻曲霉变应原疫苗、杂色曲霉变应原疫苗、土曲霉变应原疫苗或巢曲霉变应原疫苗中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述肺曲霉菌变应原疫苗任选包含至少一种药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述肺曲霉菌变应原疫苗为含氢氧化铝佐剂或酪氨酸佐剂的变应原疫苗。
5.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述抗真菌剂为两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑或卡泊芬争中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述两性霉素B为脱氧胆酸盐形式或脂质体制剂。
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