CN102186500A - 结核分枝杆菌疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌复合物的活分枝杆菌用于制备药物的用途，其中zmp1基因的功能失活，由此类分枝杆菌制备的药物组合物以及使用所述药物组合物用于治疗和/或预防疾病或医学病状的方法。

Description

结核分枝杆菌疫苗

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌（M. tuberculosis）复合物的活分枝杆菌用于制备药物的用途，其中zmp1基因的功能失活，由此类分枝杆菌制备的药物组合物以及使用所述药物组合物用于治疗和/或预防疾病或医学病状的方法。

背景技术

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是今天已知的最严重病原体之一，每年杀死全世界数百万个体。结核分枝杆菌感染的标志是在吞噬作用后微生物抵抗溶酶体递送，而是位于不与溶酶体融合的吞噬体内。吞噬溶酶体配备产生肽– MHC II复合物的机制。已提出吞噬溶酶体融合的抑制代表结核分枝杆菌通过其逃避由宿主MHC II复合物的有效抗原呈递的机制。此外，衍生自颗粒性抗原且利用常规MHC I途径的肽的交叉呈递可以经由假定的吞噬体至细胞溶质机制发生。可替代地，这可以通过吞噬体与含有新合成MHC I分子的内质网衍生囊泡融合和分裂而发生。

BCG是回溯到1919年衍生自牛结核杆菌（M. bovis）的减毒活疫苗。全世界已施用超过三十亿剂量的疫苗。尽管BCG是相对安全且价廉的，但它的效力是高度可变的（Fine，P. E. M.，Lancet 346，1339-1345，1995）。关于BCG在针对肺结核的保护中的不同效力的原因知之甚少。一种解释建立于BCG在实验室减毒过程期间已丧失重要基因的观察（Behr等人，Nature 389，133-134，1997）。通过引入现有基因的另外拷贝（Horwitz等人，PNAS，USA 97，13853-13858，2000），或通过重新引入在体外减毒过程期间丧失的某些基因（Pym等人，Nat. Med. 9，533-539，2003），已进行具有不同成功的大量工作以改善BCG的效力。可替代活疫苗接种策略集中于减毒结核分枝杆菌。通常假定肺结核疾病将至少部分保护不受后续再感染。然而，在随后时间点时天然疾病保护不受再感染疾病的失败说明由天然感染引起的免疫是有限的，部分解释了用BCG疫苗接种的相对无效。有限的感染后免疫还可说明结核分枝杆菌主动逃避免疫监督。

近来，本发明人报道假定的分枝杆菌锌金属蛋白酶Zmp1可通过干扰2个病原体防御途径（炎性体激活和吞噬体成熟）在疾病发病机制中起重要作用（Master等人，Mycobacterium tuberculosis prevents inflammasome activation. Cell Host Microbe 3，224-232，2008）。

发明内容

本发明的目的是提供具有增加的免疫原性和改善的保护效力的基于活分枝杆菌的药物。

这个目的通过使用结核分枝杆菌复合物的至少一种活分枝杆菌用于制备药物得以解决，其中zmp1基因的功能至少部分失活，优选失活。

发现当与具有zmp1活性的分枝杆菌比较时，其中zmp1基因的功能至少部分失活，优选基本上或完全失活的活分枝杆菌，引发增加的免疫原性和保护效力。

如本文使用的，术语结核分枝杆菌复合物的活分枝杆菌指其为结核分枝杆菌复合物成员的分枝杆菌物种或菌株，其包括但不限于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌（M. africanum）和田鼠分枝杆菌（M. microti）。

优选地，牛分枝杆菌，优选牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌的分枝杆菌用于制备根据本发明的药物。

用于本发明的分枝杆菌是活的，即能够在宿主中繁殖，特别是在哺乳动物宿主中，优选在人宿主中。

用于医学用途的活分枝杆菌必须减毒至对有此需要的患者无害的程度，这是不言而喻的。因此，用于本发明的分枝杆菌优选是无毒力的，即负责毒力的基因已失活，并且在哺乳动物优选人中不引起或至少引起分枝杆菌感染的最小疾病症状。

结核分枝杆菌复合物的分枝杆菌产生与结核分枝杆菌交叉反应的内源抗原。针对此类交叉反应抗原产生的抗体还将与来自结核分枝杆菌的一种或多种抗原特异性结合，并且在哺乳动物中能够引起和/或加强针对结核分枝杆菌感染的免疫应答。例如，牛分枝杆菌BCG的交叉反应抗原将引起和/或加强针对结核分枝杆菌的免疫应答。

结核分枝杆菌复合物的分枝杆菌不仅用于表达交叉反应抗原，还具有作为递送系统用于表达外源或外来抗原和/或免疫原的应用。这种递送系统的效力在于免疫接种宿主中的长持久性（Stover等人，Nature，351，456-460，1991；Aldovini和Young，Nature，351，479-482，1991）。

用于经由结核分枝杆菌复合物的分枝杆菌递送的示例性合适抗原包括病毒、原生动物、肿瘤细胞衍生的、细菌和真菌抗原。例如，可以使用衍生自幽门螺旋杆菌（H. pylori）、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）（例如OspA）、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肺炎球菌属的种（Pneumococcus spp）（例如表面蛋白质A）、肿瘤细胞、利什曼原虫（例如表面蛋白酶gp63）、HIV或SIV的抗原。此类抗原可以用于治疗溃疡、麻疹、腮腺炎、风疹、莱姆病、疱疹、癌症、破伤风、白喉、利什曼病或AIDS。

在一个优选实施方案中，用于在本发明中的分枝杆菌还可以包含编码对于分枝杆菌是外源或外来的抗原和/或免疫原的遗传物质。更优选地，外源或外来抗原和/或免疫原选自病毒、原生动物、肿瘤细胞衍生的、细菌和真菌抗原和免疫原，优选选自来自幽门螺旋杆菌、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、伯氏疏螺旋体优选伯氏疏螺旋体的蛋白质OspA、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肺炎球菌属的种优选肺炎球菌属的种的蛋白质A、肿瘤细胞、利什曼原虫优选利什曼原虫的表面蛋白酶gp63、HIV和SIV的抗原和/或免疫原。

因此，用于制备根据本发明的药物的分枝杆菌用于预防和/或治疗受分枝杆菌的抗原和/或免疫原表达影响的疾病或医学病状。抗原引起在宿主中的抗体生产，免疫原影响宿主的免疫系统。

最显而易见以及最优选的，根据本发明由zmp1失活的分枝杆菌制备的药物用于预防和/或治疗分枝杆菌感染，优选结核分枝杆菌感染。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明用于预防和/或治疗选自下述的疾病或医学病状的用途：溃疡、麻疹、腮腺炎、风疹、莱姆病、疱疹、癌症、破伤风、白喉、利什曼病和AIDS。

具有至少部分失活的zmp1基因功能的一种或多种活分枝杆菌物种和/或菌株可以用于制备根据本发明的药物。

如本文使用的，术语“zmp1基因的功能”意指下述功能：在炎性体激活中的假定分枝杆菌锌金属蛋白酶Zmp1、半胱天冬酶-1依赖性IL-1β激活和分泌以及在哺乳动物特别是人巨噬细胞中的吞噬体成熟。

因此，通过在用目的分枝杆菌感染后研究炎性体激活、半胱天冬酶-1依赖性IL-1β激活和分泌和/或在哺乳动物特别是人巨噬细胞中的吞噬体成熟，可以直接验证和/或定量在分枝杆菌中zmp1基因的功能。当然，蛋白质Zmp1的其他直接和间接效应例如起因于IL-1β激活和/或分泌的效应，还指示zmp1基因的功能且还可以代替或添加至上述直接指示剂而使用。

如本文使用的，术语“至少部分失活的”意欲指示可直接和/或间接归于zmp1基因表达的zmp1基因功能丧失。当然，失活和失活程度可以最好地在等同实验条件但包含完全功能和表达的zmp1基因下与相同菌株的分枝杆菌直接比较进行测定。优选地，“至少部分失活的”涉及可直接和/或间接归于在分枝杆菌中的zmp1基因表达的功能超过10％、优选超过50％、更优选超过70％、最优选超过90％丧失。

用于本发明的结核分枝杆菌复合物的分枝杆菌中的基因部分和/或完全失活可以通过基因突变领域中的任何常规方法达到，例如重组插入、置换、缺失、移码和/或同源重组。用于分枝杆菌中基因特别是zmp1基因部分和/或完全失活的合适特定方法在WO 02/50262（recA突变型），Master等人，同上和下文实施例中描述。

发现当与用相应野生型（即，zmp1活化的）分枝杆菌菌株免疫接种的哺乳动物中用于诱导免疫应答所需的阈比较时，对于用zmp1缺陷型分枝杆菌菌株免疫接种的哺乳动物，在免疫接种哺乳动物中用于诱导针对结核分枝杆菌抗原的免疫应答的阈比野生型小10倍。因此，根据本发明由分枝杆菌制备的药物引起与增加的增殖和细胞因子分泌免疫应答相关的实质增加的免疫原性。

此外，用药物（即根据本发明制备的药物组合物/疫苗）免疫接种的哺乳动物针对分枝杆菌攻击的保护效力证实明显优于用相应野生型分枝杆菌菌株免疫接种的哺乳动物中达到的保护效力。在比较中，根据本发明免疫接种的哺乳动物证实在结核分枝杆菌攻击后，在肺内更显著和更频繁的淋巴细胞浸润。

最后但并非最不重要的，根据本发明制备的药物增加的免疫原性和保护效力在用有毒力结核分枝杆菌攻击后免疫接种哺乳动物实质上延长的平均存活时间中表现其自身。

因此，根据本发明制备的药物呈现关于分枝杆菌用于将内源、外源和/或外来抗原和/或免疫原递送给有此需要的哺乳动物的治疗、预防和其他医学或兽医学应用的显著改善。

本发明的第二个方面涉及包含结核分枝杆菌复合物的至少一种活分枝杆菌作为活性物质的药物组合物，其中zmp1基因的功能至少部分失活，优选失活，任选地且优选地与药学上可接受的常规赋形剂和/或载体组合。

根据本发明的药物组合物是任何组合物，优选疫苗，配制用于直接医学施用于有此需要的患者，优选哺乳动物，更优选人。

优选地，药物组合物中的分枝杆菌是牛分枝杆菌，优选牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌。还优选所使用的分枝杆菌是无毒力的。

在一个优选实施方案中，根据本发明的药物组合物是这样的，其中分枝杆菌包含编码对于分枝杆菌是外源或外来的抗原和/或免疫原的遗传物质，其中抗原和/或免疫原优选选自病毒、原生动物、肿瘤细胞衍生的、细菌和真菌抗原和免疫原，更优选选自衍生自幽门螺旋杆菌、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、伯氏疏螺旋体优选伯氏疏螺旋体的蛋白质OspA、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肺炎球菌属的种优选肺炎球菌属的种的蛋白质A、肿瘤细胞、利什曼原虫优选利什曼原虫的表面蛋白酶gp63、HIV和SIV的抗原和/或免疫原。

优选地，根据本发明的药物组合物是适合于预防和/或治疗受分枝杆菌的抗原和/或免疫原表达影响的疾病或医学病状的药物组合物，更优选预防和/或治疗分枝杆菌感染，优选结核分枝杆菌感染，还更优选用于预防和/或治疗选自下述的疾病或医学病状：溃疡、麻疹、腮腺炎、风疹、莱姆病、疱疹、癌症、破伤风、白喉、癌症、利什曼病和AIDS。

使用方法

药物即药物组合物、疫苗等对于用于医学治疗和/或预防的方法有用。因此，在一个进一步的方面，本发明涉及用于治疗和/或预防疾病或医学病状的方法，其包括给有此需要的哺乳动物优选人患者施用根据本发明的药物组合物的步骤。

在一个优选方面，本发明涉及上述方法，其中所述疾病和/或医学病状选自分枝杆菌感染优选结核分枝杆菌感染、溃疡、麻疹、腮腺炎、风疹、莱姆病、疱疹、癌症、破伤风、白喉、癌症、利什曼病和AIDS。

对于治疗和/或预防用途，本发明的药物组合物可以以任何常规方式以任何常规剂型施用。施用途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下、鼻内、滑膜内、通过输注、舌下、经皮、经口、局部或通过吸入。优选施用方式是皮下、静脉内和鼻内。

分枝杆菌可以单独或与佐剂组合施用，所述佐剂增强分枝杆菌的稳定性和/或免疫原性，促进含有其的药物组合物施用，提供增加的溶解或分散，增加繁殖活性，提供辅助治疗等，包括其他活性成分。

如上所述，本文描述的分枝杆菌的药物剂型包括普通技术人员已知的药学上可接受的载体和/或佐剂。这些载体和佐剂包括例如离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质、缓冲物质、水、盐、电解质、基于纤维素的物质、明胶、水、矿脂（pretrolatum）、动物或植物油、矿物或合成油、盐水、右旋糖或其他糖类和二醇化合物例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇、抗氧化剂、乳酸盐等。优选剂型包括片剂、胶囊、溶液、悬浮液、乳状液、可重构粉剂和经皮贴剂。用于制备剂型的方法是众所周知的，参见例如，H. C. Ansel和N. G. Popovish，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版，Lea和Febiger（1990），和特别地Pastoret等人，Verterinary Vaccinology，Elsevier March 1999）。剂量水平和需求是本领域充分公认的，并且可以由普通技术人员从适合于特定患者的可用方法和技术中选择。如技术人员应当理解的，依赖于具体因素，可能需要较低或较高剂量。例如，具体剂量和治疗方案将依赖于因素，例如患者的一般健康状况、患者的病症的严重度和过程或对于其的处置、和治疗医生的判断。

例如，本发明的药物组合物可以以与基于活分枝杆菌或基于其他细菌的常规药物组合物相同的方式施用。

在一个优选实施方案中，药物组合物包含牛分枝杆菌BCG zmp1的活细菌。

更优选地，使分枝杆菌冻干且用一般的稳定剂例如糖例如蔗糖和/或明胶稳定。药物组合物可以配制成片剂或其他固体形式，并且可以随后用水重构成用于例如经口、通过注射或鼻内施用的溶液。

应强调本发明的药物组合物可以以比基于活分枝杆菌的常规药物组合物更低的剂量施用，因为当与用常规分枝杆菌例如野生型牛分枝杆菌BCG的组合物比较时，本发明使用的分枝杆菌更具免疫原性且引发改善的保护效力。

在下文中，将参考具体实施方案更详细地举例说明本发明，所述具体实施方案不应解释为限制由所附权利要求限定的本发明的范围。

附图说明

图1：用100、1000或10000 CFU BCG WT或BCG zmp1免疫接种C57BL/6小鼠组，并且在第21天时在足垫中用PPD皮内攻击。随后在48小时后测量足垫DTH。

图2：用1000 BCG WT（空心条）或BCG zmp1（实心条）免疫接种C57BL/6小鼠组。在4周后，在体外用PPD或Ag85A或TB10.3肽再刺激脾细胞。在第3和4天时分别测量IFN-g分泌（ELISA）和增殖（3H-胸苷掺入）。* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001（Mann Whitney）。

图3：在用BCG WT、BCG zmp1或盐水（未处理（untr））疫苗接种小鼠后，产生IFN-g的CD4和CD8阳性T细胞的分析。用PdBu或PPD再刺激脾细胞，并且通过流式细胞术分析细胞内IFN-g。（A）直方图显示产生IFN-g的CD8 T细胞（平均值± s.e.）的频率。（B，C）箱形图显示产生IFN-g的CD8（B）或CD4（C）T细胞频率。箱显示25百分位数和75百分位数以及中值，而线显示10百分位数和90百分位数；显示了2个代表性实验中的一个。

图4：在小鼠死亡率模型中的BCG zmp1保护效力。用结核分枝杆菌攻击用BCG、BCG zmp1疫苗接种或未处理（对照）的小鼠组，并且监控存活。

实施例

实施例1 – 材料与方法

分枝杆菌菌株和生长条件

牛分枝杆菌BCG生长在补充有油酸白蛋白右旋糖过氧化氢酶（OADC）（Becton Dickinson）的Middlebrook 7H10琼脂板上，在Dubos琼脂上，在Tween 80（0.05 ％）的存在下补充有OADC的液体7H9培养基中或在Dubos肉汤中，并且在37℃下温育。

BCG zmp1敲除突变体的构建先前已得到描述（Master等人，同上）。简言之，从BAC克隆Rv165（Brosch等人Infect. Immun. 66，2221-2229 1998）中分离包含结核分枝杆菌zmp1（Rv0198c）及其侧翼区的4.4 kbp NotI片段，通过NheI消化去除zmp1的部分（770 bp）并且由卡那霉素抗性盒置换。将所得到的自杀载体转化到BCG菌株1721内，选择在合适抗生素的存在下补充有OADC的7H10琼脂上完成（Sander等人，rpsL+：a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Mol. Microbiol. 16，991-1000，1995）。染色体zmp1基因座由失活等位基因的替换通过DNA印迹分析加以证实。

用于分析DTH、脾细胞增殖、细胞因子分泌和FACS的小鼠免疫接种

通过皮下注射用不同剂量的BCG或BCG zmp1免疫接种小鼠。接种物在缓冲盐水中进行稀释并且注射体积是100 μl。在3周后，通过将溶解于50 μl盐水中的5 μg结核菌素纯化蛋白衍生物PPD（Statens Serums Institut，Copenhagen，Denmark）注射到右后足垫的足底侧内攻击小鼠。2天后，通过使用装弹簧的数字千分尺（Mitutoyo，Kawasaki，Japan）测量足垫肿胀来分析DTH反应。

对于脾细胞增殖和细胞因子分泌的体外分析，使小鼠安乐死并且在免疫接种后4周收获脾细胞。简言之，使6×10⁵无RBC脾细胞与PPD或结核分枝杆菌衍生的抗原Ag85A（LTSELPGWLQANRHVKPTGS）和TB10.3（GTHESNTMAMLARDG）一起在圆底96孔培养板中在补充的RPMI培养基中温育。在3天后，收集上清液并且冷冻用于通过ELISA（R&D Systems，Abingdon，United Kingdom）随后分析IFN-γ分泌。用1 μCi ³H-标记的胸苷脉冲其余细胞另外16小时用于通过β-闪烁分析增殖。

对于FACS分析，以4周间隔使小鼠引发且加强。7天后，收获脾细胞用于通过流式细胞术分析IFN-γ合成。约2×10⁶无RBC脾细胞的单细胞悬浮液在24孔板中用5 μg/ml PPD或0.5 μg/ml佛波醇12,13-二丁酸盐（PdBu；Sigma，Buchs，Switzerland）在5 μg/ml Brefeldin A（Sigma）的存在下再刺激5小时。随后洗涤细胞，在含0.01％叠氮化钠的PBS/FCS 2％中与抗CD16/CD32一起在冰上温育5分钟用于Fc受体封闭，且用抗CD4（FITC）和抗CD8（PerCP）抗体在冰上表面染色20分钟。在无蛋白质PBS/PFA 1％中固定10分钟和在PBS/NP40 0.1％中透化3分钟后，使细胞在PBS/FCS 2％中在冰上就细胞内IFN-γ（APC）染色35分钟。样品在FACSCanto上进行采集，并且使用来自BD Biosciences（San Jose，CA）的FACSCanto Diva软件进行分析。

疫苗接种实验

使用在实验开始时8 – 10周龄的雌性小鼠。生成无凝块对数中期分枝杆菌悬浮液，并且在常规血球计数器中通过过滤分枝杆菌悬浮液的显微镜检查直接估计接种物，并且调整至所需浓度。通过铺平板3倍连续稀释，并且分别在37℃下温育3和20天后评分小菌落和可见菌落来进行接种物的杆菌计数，证实通过显微镜检查法的CFU计数估计准确度> 90 ％。小鼠通过皮下接种10⁶ CFU的BCG、BCG zmp1进行疫苗接种或未进行处理（盐水对照）。疫苗接种后6周，使用吸入暴露系统（Glas-Col，Terre Haute，IN），通过气溶胶感染用10² CFU有毒力结核分枝杆菌H37Rv攻击小鼠。为了评估脾脏和肺中的分枝杆菌载量，在每个时间点将来自4只单独的小鼠的全器官匀浆物的0.1 ml连续10倍稀释铺平板到琼脂上，并且在37℃下温育18 – 20天后计数菌落。对于存活曲线，使用6 – 9只小鼠/组。处死垂死动物。

组织病理学

由结核分枝杆菌感染后22周，就病理学检查肺组织。在电动冷冻切片机中使用-60℃到-20℃的温度梯度冷冻肺组织（右中叶），并且跨越叶的最宽区域获得连续6 – 8 μm厚切片。切片用苏木精和伊红进行染色并且通过有经验的病理学家进行检查。

统计分析

对于2个独立样品使用双侧Mann Whitney U检验或对于3个或更多个样品使用Kruskal-Wallis H检验与Dunn’s事后检验分析非参数数据。执行双因素方差分析（GLM单变量方差分析），用足垫肿胀、IFN-γ分泌或增殖作为独立变量和BCG菌株（+/- zmp1）或免疫接种剂量（10² – 10⁴ CFU）作为固定因子。在ANOVA前，计算关于误差变量等同性的Levene’s检验，并且需要时，将幂转化应用于数据以符合等误差变量假设。显著性水平设为5％。

实施例2 – zmp缺失增加BCG的免疫原性

为了分析Zmp1在BCG免疫原性中的作用，用滴定的剂量的野生型和zmp1缺陷型菌株免疫接种小鼠。在用PPD足垫攻击后测量DTH应答，对于2种疫苗菌株观察到关于诱导的不同阈。虽然需要10³ CFU野生型菌株的接种物以产生显著足垫肿胀，但用突变体这个剂量的十分之一足以诱导等价应答，在10⁴和10⁵ CFU之间观察到最大限度足垫肿胀（数据未显示）。我们进一步分析在10²-10⁴接种物时的足垫肿胀程度。如图1中所示，在10³（P=0.0006；Mann Whitney）和10⁴（P=0.0262）CFU时，zmp1突变体诱导比BCG野生型明显更强的DTH应答。重复实验，并且组合数据的单变量方差分析显示不依赖于接种物大小，BCG zmp1引起比野生型BCG更强的DTH应答（P<0.001）。

zmp1缺陷型BCG菌株增加的免疫原性与来自用BCG野生型或BCG zmp1免疫接种的小鼠脾细胞在体外增加的增殖和细胞因子分泌免疫应答相关。图2举例说明该作用，在体外用PPD（通过Mann Whitney P=0.0147）或结核分枝杆菌抗原Ag85A（P=0.0133）或TB10.3（P=0.0005）再刺激后，在10³ CFU的接种物时，来自BCG zmp1免疫接种小鼠的脾细胞显示比野生型明显更多的IFN-γ产生。类似地，细胞增殖在来自用BCG zmp1免疫接种小鼠的细胞中显著增加（图2）。将双因素ANOVA应用于所有数据，不依赖于体内BCG剂量或用于在体外再刺激的抗原类型，揭示zmp1突变体引起比野生型BCG更有效的IFN-γ分泌（P=0.023）和增殖（P<0.001）。

为了分析IFN-γ分泌是衍生自CD8还是CD4阳性T细胞，使来自免疫接种小鼠的脾细胞染色且通过流式细胞术分析。2个T细胞亚组均能够产生IFN-γ，其频率高达7-9％（图3）。然而，当比较在BCG疫苗接种小鼠中的CD8 IFN-γ生产细胞频率与未处理小鼠中的该频率时，野生型与本底水平并无显著不同，如通过Kruskal-Wallis检验与Dunn’s多重比较检验分析的（P>0.1）。相比之下，当用PdBu或PPD再刺激时，BCG zmp1对于CD4和CD8 T细胞产生显著水平的IFN-γ（P<0.05）。2种BCG菌株的直接比较显示不依赖于T细胞亚组（CD4或CD8）或再刺激抗原（PdBu或PPD），BCG zmp1引起强烈增加的IFN-γ产生。

实施例3 - zmp1缺失增加BCG的保护效力

在肺结核小鼠模型中测试牛分枝杆菌BCG zmp1突变体的保护效力。小鼠（C57BL/6）组通过BCG、BCG zmp1突变体的皮下注射进行免疫接种，或未进行处理。在6周后，通过气溶胶感染用低剂量（10² CFU）结核分枝杆菌H37Rv攻击小鼠，并且监控CFU、肺脏病理学和死亡率。气溶胶攻击后3周，对照小鼠的肺含有高数目的结核分枝杆菌。疫苗接种在感染前3周中使肺和脾脏中的细菌负荷减少约1-2个对数。在攻击后3和23周之间，小鼠能够控制感染，并且CFU计数稳定。

感染后22周，来自所有3个动物组（未接种疫苗的对照、BCG疫苗接种的、BCG zmp1疫苗接种的）的肺切片显示具有减少的开放肺泡腔的肺实质区域，肺泡壁的可变加宽和填充空隙的巨噬细胞，其中影响肺实质的非特异性弥漫性炎症水平在BCG zmp1疫苗接种小鼠中最低。与未接种疫苗对照比较，在血管周围和细支气管上皮附近存在的淋巴细胞浸润在疫苗接种组中增加，并且在BCG zmp1疫苗接种动物中最显著。在扫描放大下，BCG zmp1小鼠中的淋巴细胞性浸润是最密集的，具有汇合的趋势，而未接种疫苗的对照和BCG疫苗接种动物具有较不密集的淋巴样浸润，仅具有小聚集物。为了进一步定量不同动物组中的淋巴细胞性浸润程度，选择形态测定方法，使用AnalySIS系统（Olympus，Switzerland）。在每个动物肺切片中，鉴定20个淋巴细胞聚集物。测量淋巴样浸润的平均直径，并且计算淋巴样浸润/肺切片的比例。与BCG wt中的0.13 mm和对照组中的0.18比较，BCG zmp1疫苗接种组中的平均直径是0.31 mm。此外，与BCG wt（1.85％）和对照动物（2.2％）比较，淋巴样聚集物百分比/肺切片在BCG zmp1（7.2％）中增加。

通过分析在感染后的平均存活时间（MST）在小鼠进一步研究zmp1破坏对BCG保护效力的生物学作用。图4中的结果显示未接种疫苗的小鼠在攻击后106天开始死亡，并且所有未接种疫苗的对照在270天后死亡，BCG疫苗接种小鼠到第189天时开始死亡，并且最后一只小鼠在第305天时死亡，BCG zmp1免疫接种小鼠在第244天时开始死亡，并且最后一只小鼠在第364天时死亡。MST对于对照小鼠是203.8 +/- 13.9天，对于BCG疫苗接种小鼠是254.8 +/- 15.7天，并且对于BCG zmp1免疫接种小鼠是297.1 +/- 15.0天（BCG与未免疫接种比较对数秩p=0.02；BCG zmp1与BCG比较p=0.082；BCG zmp1与未免疫接种比较p=0.00009）。与BCG比较，BCG zmp1突变体在延长存活中几乎是2倍有效（与未接种疫苗对照的ΔMST，对于BCG zmp1的94天与对于BCG的51天比较）； BCG与未免疫接种比较危害比（HR）=33％和p=0.032；BCG zmp1与BCG比较HR=26％和p=0.01；BCG zmp1与未免疫接种比较HR=11％和p=0.000001。

Claims (15)

1. 结核分枝杆菌复合物的至少一种活分枝杆菌用于制备药物的用途，其中所述zmp1基因的功能至少部分失活，优选失活。

2. 根据权利要求1的用途，其中所述分枝杆菌是牛分枝杆菌、优选牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌。

3. 根据权利要求1或2的用途，其中所述分枝杆菌是无毒力的。

4. 根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述分枝杆菌包含编码对于所述分枝杆菌是外源或外来的抗原和/或免疫原的遗传物质。

5. 根据权利要求4的用途，其中所述抗原和/或免疫原选自病毒、原生动物、肿瘤细胞衍生的、细菌和真菌抗原和免疫原，优选选自衍生自幽门螺旋杆菌、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、伯氏疏螺旋体、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肺炎球菌属的种、肿瘤细胞、利什曼原虫、HIV和SIV的抗原和/或免疫原。

6. 根据权利要求1-5中任一项的用途用于预防和/或治疗受分枝杆菌的抗原和/或免疫原表达影响的疾病或医学病状。

7. 根据权利要求1-6中任一项的用途用于预防和/或治疗分枝杆菌感染、优选结核分枝杆菌感染。

8. 根据权利要求1-7中任一项的用途用于预防和/或治疗选自下述的疾病或医学病状：溃疡、麻疹、腮腺炎、风疹、莱姆病、疱疹、癌症、破伤风、白喉、利什曼病和AIDS。

9. 一种药物组合物，其包含结核分枝杆菌复合物的至少一种活分枝杆菌作为活性物质，其中所述zmp1基因的功能至少部分失活，优选失活，任选地与药学上可接受的赋形剂和/或载体组合。

10. 根据权利要求9的药物组合物，其中所述分枝杆菌是牛分枝杆菌，优选牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌。

11. 根据权利要求9或10的药物组合物，其中所述分枝杆菌是无毒力的。

12. 根据权利要求9-11中任一项的药物组合物，其中所述分枝杆菌包含编码对于所述分枝杆菌是外源或外来的抗原和/或免疫原的遗传物质。

13. 根据权利要求9-12中任一项的药物组合物，其中所述抗原和/或免疫原选自病毒、原生动物、肿瘤细胞衍生的、细菌和真菌抗原和免疫原，优选选自衍生自幽门螺旋杆菌、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、伯氏疏螺旋体、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、破伤风毒素、白喉霉素、肺炎球菌属的种、肿瘤细胞、利什曼原虫、HIV和SIV的抗原和/或免疫原。

14. 用于治疗和/或预防疾病或医学病状的方法，其包括给有此需要的哺乳动物优选人患者施用根据权利要求9-13中任一项的药物组合物的步骤。

15. 根据权利要求14的方法，其中所述疾病和/或医学病状选自分枝杆菌感染优选结核分枝杆菌感染、溃疡、麻疹、腮腺炎、风疹、莱姆病、疱疹、破伤风、白喉、癌症、利什曼病和AIDS。

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