CN103638520B - 柴胡皂苷a和柴胡皂苷d疫苗免疫佐剂用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作为疫苗佐剂的用途，采用本发明的佐剂，可以提高兽医临床动物疫苗的使用效果，治疗动物免疫抑制性疾病，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力。

Description

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d疫苗免疫佐剂用途

技术领域

本发明属于兽药领域，具体的涉及柴胡皂苷a和柴胡皂苷d疫苗免疫佐剂用途。

背景技术

目前我国养猪生产面临着日趋严峻的疫病威胁，发病情况复杂多变，生产风险与日俱增，控制成本显著提高，经济损失无法估量。其重要原因在于猪群中普遍存在免疫抑制性疾病。免疫抑制是指机体免疫系统损伤，免疫功能下降，对病原微生物高度易感的一种免疫异常状态。猪免疫抑制性疾病是通过损伤免疫组织，影响细胞活性，干扰抗原递呈，抑制抗体形成等途径，导致机体抗病能力显著下降的一类疾病。同时也是当前疫苗免疫失败与诱发混合感染的重要因素。猪群中普遍存在的免疫抑制性疾病包括猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型感染、猪瘟、猪支原体肺炎、猪伪狂犬、猪附红细胞体等疫病。由于这些免疫抑制性疾病常以亚临床感染的形式出现，易被忽视，因此，必须加强对免疫抑制性疾病的重视，并做好防控工作。

猪的免疫系统是机体保护自身的防御性结构，不仅能抵御外来细菌、病毒和其他有害物质的侵袭，还能清除体内衰老、突变、恶化或死亡的细胞，增进健康。免疫抑制的两种主要表现形式可以概括为“一高一低”，即机体对疾病的易感性增高和对疫苗免疫应答的反应性降低。猪免疫抑制性疾病直接导致在疾病诊治过程中使用大量药物，造成病原微生物的耐药性日新月异。同时动物机体的特异性和非特异性免疫力下降，对各种疫苗无法免疫应答，或产生的抗体效价低下。造成低致病力的病原体或弱毒疫苗也可能感染猪体发病，更为严重的是由免疫抑制所带来的混合感染，使疾病更为复杂，有时会造成新的综合征，甚至达到难以控制的程度。给养猪生产造成巨大的经济损失，同时带来公共卫生安全隐患。

柴胡皂苷(Saikosaponins，SS)A

理化性质：Molish反应阳性，Lieberman-Burchard反应产生紫色。

易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。

分子式：C42H68O13

分子量：780.99

Mp：225-232°

UV：无最大吸收。

来源：伞形科植物北柴胡，狭叶柴胡。

柴胡皂苷(Saikosaponins，SS)D

[植物来源]伞形科植物柴胡及狭叶柴胡等的干燥根.

理化性质：白色粉末。Molish反应阳性，Lieberman-Burchard反应产生紫色。[α]23D+37°(乙醇)；+36.8°(c=1.9，乙醇)

Mp：212-218℃

UV：无最大吸收。

[分子式]C42H68O13

[分子量]780.98

[化学登陆号]20874-52-6

[药理作用]具有抗病毒、抗炎、抗肝损害作用.

然而，现有技术中没有公开过柴胡皂苷a和柴胡皂苷d具有提高疫苗免疫活性的作用。

发明内容

本发明的目的是涉及柴胡皂苷a和柴胡皂苷d疫苗免疫佐剂用途。

本发明另一方面柴胡皂苷a和／或柴胡皂苷d作为疫苗免疫佐剂的用途，所述的疫苗是猪圆环病毒2型(PCV2)病毒灭活疫苗或猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗。

本发明另一方面涉及一种疫苗，所述的疫苗包括柴胡皂苷a和／或柴胡皂苷d以及灭活疫苗，所述的灭活疫苗是猪圆环病毒2型(PCV2)病毒灭活疫苗或猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的灭活疫苗是指病毒通过甲醛溶液在37℃灭活10h，优选15h以上得到的疫苗。

在本发明的一个优选实施方式中，柴胡皂苷a和／或柴胡皂苷d在灭活疫苗中加入量为8-12mg／mL，病毒灭活之前的活性为1-20*10^4.0TCID₅₀／mL。

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作为疫苗佐剂，用于提高兽医临床动物疫苗的使用效果，治疗动物免疫抑制性疾病，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力。

具体实施方式

实施例1

取猪圆环病毒2型(PCV2)病毒株，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。将病毒稀释为10^5.0TCID₅₀／mL，用终浓度为2mL／L的甲醛溶液，在37℃灭活16h。灭活病毒液经安全检验符合要求后，置4℃冰箱待用。中国药品生物制品鉴定所提供的SSa(SSa)和SSd(SSd)作为佐剂，都按10mg／mL与PCV2灭活疫苗混合均匀，进行小鼠免疫试验。

40只体重20g清洁级的BALB／c小鼠，购自扬州大学比较医学中心。分SSa组、SSd组、对照组和空白组，每组10只，雌雄各半。各组动物分别腹 腔注射含佐剂SSa的灭活疫苗、含佐剂SSd的灭活疫苗、灭活疫苗和生理盐水，剂量均为0.2mL／只。免疫后第14天，动物眼球采血与解剖。酶联免疫吸附法(ELISA)测定动物血清中PCV2抗体水平。结果发现SSa组和SSd组抗体效价在1：1600-1：800，对照组抗体效价在1：100-1：200。流式细胞仪检测动物T淋巴细胞亚群数量，结果发现SSa组的CD₄ ⁺／CD₈ ⁺值为2.247，SSd组的CD₄ ⁺／CD₈ ⁺值为2.524，对照组的CD₄ ⁺／CD₈ ⁺值为1.839。说明两种皂苷药物可以刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平。

通过实时荧光定量(RT-PCR)法检测动物肺脏和淋巴结中PCV2数量，结果发现SSa组和SSd组脏器中均检测不到圆环病毒抗原，对照组动物存在病毒血症。通过ELISA法检测动物血清中白细胞介素2(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)含量，结果发现SSa组和SSd组两者水平均比对照组高，其中SSa组IL-2值为80.48pg／mL，SSd组IL-2值为84.33pg／mL，对照组IL-2值为72.25pg／mL。SSa组IFN-γ值为14.26pg／mL，SSd组IFN-γ值为15.46pg／mL，对照组IFN-γ值为12.08pg／mL。提示两种皂苷药物可以非特异性增强动物机体抗病毒的免疫功能。

动物肺脏和淋巴结的病理切片显微观察显示，SSa组和SSd组的器官组织无明显病理变化，对照组器官组织出现水肿与炎性渗出，显示两种皂苷药物作为动物疫苗免疫佐剂的安全性与良好应用前景。

实施例2

取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。将病毒稀释为10^5.0TCID₅₀／mL，用终浓度为2mL／L的甲醛溶液，在37℃灭活16h。灭活病毒液经安全检验符合要求后，置4℃冰箱待用。中国药品生物制品鉴定所提供的SSa(SSa)和SSd(SSd)作为佐剂，都按10mg／mL与PRRSV灭活疫苗混合均匀，进行猪体免疫试验。

20头健康普通级35日龄“杜×大×长”三元杂交断奶仔猪，购自南京农业大学江浦试验猪场。分SSa组、SSd组、对照组和空白组，每组5只。各组动物分别腹腔注射含佐剂SSa的灭活疫苗、含佐剂SSd的灭活疫苗、灭活疫苗和生理盐水，剂量均为2mL／只。免疫后第14天，动物前腔静脉采血与解剖。 酶联免疫吸附法(ELISA)测定动物血清中PRRSV抗体水平。结果发现SSa组和SSd组抗体效价在1：800-1：400，对照组抗体效价在1：100-1：200。流式细胞仪检测动物T淋巴细胞亚群数量，结果发现SSa组的CD₄ ⁺／CD₈ ⁺值为2.519，SSd组的CD₄ ⁺／CD₈ ⁺值为2.663，对照组的CD₄ ⁺／CD₈ ⁺值为1.958。说明两种皂苷药物可以刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平。

通过实时荧光定量(RT-PCR)法检测动物肺脏和淋巴结中PCV2数量，结果发现SSa组和SSd组脏器中均检测不到猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，对照组动物存在病毒血症。通过ELISA法检测动物血清中白细胞介素2(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)含量，结果发现SSa组和SSd组两者水平均比对照组高，其中SSa组IL-2值为79.96pg／mL，SSd组IL-2值为84.51pg/mL，对照组IL-2值为70.17pg／mL。SSa组IFN-γ值为16.74pg／mL，SSd组IFN-γ值为18.52pg／mL，对照组IFN-γ值为13.44pg／mL。提示两种皂苷药物可以非特异性增强动物机体抗病毒的免疫功能。

试验猪肺脏和淋巴结的病理切片显微观察显示，SSa组和SSd组的器官组织无明显病理变化，对照组器官组织出现水肿与炎性渗出，显示两种皂苷药物作为动物疫苗免疫佐剂的安全性与良好应用前景。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d作为疫苗免疫佐剂的用途，其特征在于，所述的疫苗是猪圆环病毒2型病毒灭活疫苗或猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗；所述的灭活疫苗是指病毒通过甲醛溶液在37℃灭活10h以上得到的疫苗；柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d在灭活疫苗中加入量为8-12mg/mL，病毒灭活之前的活性为1-20*10^4.0TCID₅₀/mL。

2.一种疫苗，所述的疫苗包括柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d以及灭活疫苗，所述的灭活疫苗是猪圆环病毒2型病毒灭活疫苗或猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗；所述的灭活疫苗是指病毒通过甲醛溶液在37℃灭活10h以上得到的疫苗；柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d在灭活疫苗中加入量为8-12mg/mL，病毒灭活之前的活性为1-20*10^4.0TCID₅₀/mL。