CN105726539A - 盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用 - Google Patents

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邓旭明
张勇
刘雁
王建锋
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Abstract

本发明涉及盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，以人宫颈癌细胞(Hela)为感染载体，通过庆大保护性实验、体外生化实验以及小鼠沙门氏菌感染模型均证实盐酸血根碱对沙门氏菌感染有显著的抑制作用。抗生素在治疗沙门氏菌感染的过程中，易诱导耐药性的产生，对比抗生素治疗，中药化合物盐酸血根碱可以直接抑制沙门氏菌三型分泌系统的功能而发挥抗感染的作用，并且不易诱导耐药性的产生，具有治愈率高的特点。

Description

盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用
技术领域
本发明涉及盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，属于医药领域。
背景技术
血根碱(Sanguinarine)，主要存在于白屈菜的全草、紫堇的块根、博落回的全草、血水草的地上部分，具有多种药理学活性，如抗菌、杀虫、改善肝功能、增强免疫力、抗肿瘤等药理作用。在临床医学占用重要的地位。但是目前国内外未见盐酸血根碱在用于抗沙门氏菌感染的报道。
沙门氏菌是引发人类和动物食物中毒的首要食源性病原菌之一,也是在全球公共卫生学上有重要意义的人兽共患病病原菌。沙门氏菌在自然界有广泛的宿主谱，绝大多数对人和动物均适应。沙门氏菌感染动物后常导致严重的疾病，使之发生伤寒、败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症，并可导致怀孕母畜流产、死胎等致死性感染。对于免疫力低下的人群，如果不能够及时给予药物治疗，将极大的增加感染患者的死亡率风险。我国由沙门氏菌引起的食源性疾病居细菌性食源性疾病的首位。2006-2010年间我国报告的病因明确的细菌性食源性疾病暴发事件中，70％-80％是由沙门氏菌所致。目前国内针对沙门氏菌的感染，普遍采用抗生素进行治疗。但应用抗菌药物并不能缩短病人的病程，反而促使肠道产生耐药菌株，使排菌时间延长，造成治疗上的困难。传统抗生素的滥用以及其不可避免的易诱导耐药性等因素导致了近年来沙门氏菌耐药性逐渐增强，耐药谱逐渐加宽。这种现象的发生对于临床上抗沙门氏菌感染的治疗雪上加霜。因此临床上亟待研发全新机制的抗感染药物来预防和治疗沙门氏菌感染。
发明内容
盐酸血根碱的分子结构如下：
本发明通过人宫颈癌细胞(Hela)损伤的保护性试验以及小鼠肠出血大肠杆菌感染模型证实其抗肠出血性大肠杆菌O157：H7感染中的作用。
附图说明
附图1：盐酸血根碱对沙门氏菌三型分泌系统功能的影响
附图2：盐酸血根碱对沙门氏菌生长的影响分析
附图3：盐酸血根碱对沙门氏菌内化的影响
附图4：盐酸血根碱对沙门氏菌三型分泌系统主要效应蛋白SipA量的分析
附图5：盐酸血根碱对沙门氏菌感染小鼠的保护率
附图6：盐酸血根碱抑制沙门氏菌感染小鼠引起的体重下降
附图7：盐酸血根碱对沙门氏菌感染小鼠靶器官菌落定殖量计数和肠道炎症因子检测
具体实施方式
1、沙门氏菌三型分泌系统功能的检测试验
本实验通过体外构建SL1344-TEM-SipA重组菌，将盐酸血根碱和SL1344-TEM-SipA在37℃180rpm共同孵育4h，以Hela细胞为载体，以MOI＝20向细胞培养体内加入药物处理组和未处理中的菌液，阴性对照加入DMEM，37℃条件下感染30min。使用PBS清洗细胞三次，随后加入CCF4荧光底物通过荧光显微镜观察细胞的颜色变化，检测盐酸血根碱对沙门氏菌三型分泌系统功能的检测。实验结果表明，盐酸血根碱显著抑制沙门氏菌三型分泌系统的功能。从流式细胞图可知，盐酸血根碱处理后，沙门氏菌三型分泌系统效应蛋白的分泌量显著减少(从72.3％降致13.5％)(见附图1)。
2、生长曲线的测定
将沙门氏菌于LB液体培养基内过夜培养(37℃，200rpm),1:100扩大培养至OD600nm值为0.1左右，分别设定阳性组、阴性对照组和加药组。继续培养，并且没隔30min测定其各个样品的光密度值，直至平台期。实验结果表明：盐酸血根碱在抑制沙门氏菌功能的有效作用浓度下并不影响沙门氏菌的生长(见附图2)。
3、庆大保护性试验
分别向沙门氏菌SL1344菌液内加入终浓度为0、4、8、16μg/ml的盐酸血根碱，37℃180rpm共同孵育4h共，以Hela细胞为载体，以MOI＝20向细胞培养体内加入药物处理组和未处理中的菌液，37℃条件下感染30min。使用PBS清洗细胞三次，向细胞培养体系内加入庆大霉素共同作用1h，使用PBS清洗细胞三次，收集细胞并用皂素裂解细胞，倍比稀释涂于固体培养基，进行菌落计数。实验结果表明：野生型沙门氏菌在不同药物浓度处理下的侵入率逐渐下降，且呈现药物剂量依赖性(见附图3)。
3、三型分泌系统效应蛋白SipA蛋白免疫印迹试验
分别向沙门氏菌SL1344菌液内加入终浓度为0、16μg/ml的盐酸血根碱，37℃180rpm共同孵育4h，使用紫外分光光度计测定其OD600的吸光值，收集相同的菌量，离心收集上清液。沉淀使用相同体积的SDS-PAGEBuffer垂悬，随后煮沸10min。分别将置于好的上清和沉淀样品用于Western-Blot分析。实验结果表明：盐酸血根碱处理导致SipA蛋白水平显著下降。左图为培养上清液SipA量的变化，中间图为菌体内的SipA量的变化，右图为点样对照异柠檬酸脱氢酶(ICDH)(见附图4)。
4、小鼠沙门氏菌感染的治疗学研究
4.12.1建立小鼠沙门氏菌感染模型
使用链霉素处理6-8周龄小鼠，感染前对其禁水6h，采用口服感染的方式灌服沙门氏菌，建立沙门氏菌感染动物模型。保护率试验、病理学试验口服给予1×108个菌量。
2.2保护率实验
以1×108个菌量感染小鼠，并于感染后6h给予50mg/kg体重的盐酸血根碱进行药物治疗，平均12h/次，治疗5天。统计小鼠感染沙门氏菌24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h后的死亡个数，计算死亡率。结果表明，阳性组小鼠分别在6-8天相继死亡，在感染后8天全部死亡，死亡率为100％，而给药组小鼠分别在第七天和第八天各死亡两只，死亡率为40％，保护率达到了60％(见附图5)。
2.3体重监测试验
以5×107个菌量感染小鼠，并于感染后6h给予50mg/kg体重的盐酸血根碱进行药物治疗，平均12h/次，治疗5天。统计小鼠感染沙门氏菌24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h后的体重数据。实验结果表明：通过分析不同组小鼠的体重变化，发现给药后可以显著的缓解沙门氏菌感染小鼠的体重下降(见附图6)。
2.4靶器官菌落定殖量计数和肠道炎症因子检测
以1×108个菌量感染小鼠，并于感染后6h给予50mg/kg体重的盐酸血根碱进行药物治疗，平均12h/次，治疗5天。于第六天处死小鼠，摘取小鼠的盲肠，组织研磨盲肠组织，制备10％的组织匀浆液，其中部分匀浆液倍比稀释后涂链霉素平板并计数，另一部分匀浆液离心去匀浆液上清，使用ELISA试剂盒测定器官裂解液中IL-1β，IL-6和TNF-α的含量。实验结果表明：盐酸血根碱药物处理组，其盲肠组织内沙门氏菌的菌落定植量显著减少(见附图7A)。盐酸血根碱药物处理后，其盲肠组织内细胞因子含量较阳性组显著降低(见附图7B)。
综上所述，本研究以沙门氏菌感染哺乳动物细胞，建立细胞感染水平的药物保护效果评价模型。以口服感染沙门氏菌的方式成功建立了沙门氏菌动物感染模型，并且发现盐酸血根碱可显著降低沙门氏菌感染小鼠的死亡率，缓解沙门氏菌感染小鼠的肠道炎症并抑制感染小鼠体重的下降，表明盐酸血根碱治疗后可明显改善沙门氏菌感染小鼠的肠道炎症反应。

Claims (4)

1.盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，其特征在于所述的药物盐酸血根碱为药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，其特征在于所述的药物盐酸血根碱为血根碱的盐酸盐。
4.如权利要求1所述盐酸血根碱在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，其特征在于所述的沙门氏菌感染是指由沙门氏菌引起的人畜感染，包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和鸡白痢等疾病。
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