KR20020021375A

KR20020021375A - 미코박테리움 바카이를 활용하여 면역적으로 매개된질병을 치료하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20020021375A
Application number: KR1020017014951A
Authority: KR
Inventors: 제임스디. 와트슨; 폴엘.제이. 탄; 로스엘. 프레팃지
Original assignee: 왓슨 제임스 디.; 제네시스 리서치 앤드 디벨럽먼트 코포레이션 리미티드
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2002-03-20
Also published as: AU779163B2; CN1371285A; CN1162181C; US6723327B1; AU5257900A; CA2374256A1; EP1181051A1; HK1048261A1; US6350457B1; WO2000074715A1; AR024171A1; JP2003501400A; BR0011239A; EP1181051A4

Abstract

본 발명은 호흡기 질환, 예를 들면 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium)과 같은 미코박테리아 감염, 유육종증, 천식, 알레르기성 비염, 폐암의 예방 및 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포의 유도체를 하나이상 함유하는 조성물을 환자에 투여하는 것으로 구성된다.

Description

미코박테리움 바카이를 활용하여 면역적으로 매개된 질병을 치료하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF IMMUNOLOGICALLY-MEDIATED DISEASES USING MYCOBACTERIUM VACCAE}

결핵은 만성 감염성 질환으로, 미코박테리움 튜베르쿨로시스,즉 결핵균 감염에 유발된다. 이 질환은 개발도상국에서 주로 발생하고, 선진국에서도 그 사례가 증가하고 있는데, 매년 8백만명의 새로운 환자가 발생하고, 3백만명이 사망하고 있다. 이 질병은 감염의 증상이 상당한 기간동안 드러나지 않지만, 대체로 간의만성적 염증으로 나타나고 발열 및 호흡기 증상을 유발한다. 이를 치료하지 않고 방치한다면 상당한 인명피해가 발생할 수 있다.

결핵은 일반적으로 연장된 항생제 요법으로 치료할 수 있지만, 이런 치료는 결핵의 확산을 예방하는데 충분치 않다. 감염자는 증상을 나타내지는 않지만, 일정 시간동안 전염성을 가진다. 또한, 치료 섭생에 순응하는 것이 중요하지만 환자의 행동을 모니터하는 것이 어렵다. 일부 환자의 경우는 치료과정을 완전히 마치지 않는데, 이는 치료를 무력화시키고 약제 저항성 결핵균을 발생시킬 수 있다.

결핵균이 확산되는 것을 방지하려면 효과적인 예방주사 및 질병의 정확한 초기 진단이 필요하다. 현재, 살아있는 박테리아를 이용한 예방주사가 보호면역을 유도하는데 가장 효과적인 방법이다. 이런 목적으로 이용되는 가장 흔한 결핵균속(屬)은 바실러스 칼미테-구에린[Bacillus Calmett-Guerin (BCG)]으로, 이는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비독성 균주다. 하지만, BCG의 안정성 및 효과에 대한 논쟁이 일고 있어, 미국과 같은 일부 국가에서는 일반 국민에게 예방주사를 하지 않고 있다. 미코박테리움 튜베르쿨로시스 감염을 진단하는 데에는 피부 테스트를 이용하여 이루어지는데, 이 테스트는 내피를 투베르쿨린(PPD; 단백질-정제된 유도체) 노출시키는 것이다. 주사 후 48-72시간 경에, 주사 부위에 항원-특이적인 T 세포 반응으로 경화가 나타나면 결핵균 항원에 노출되었다는 것을 의미한다. 하지만, 이 테스트의 감응성 및 특이성에서 문제가 있는데, BCG로 예방주사한 개체와 감염된 개체을 구별할 수 없다.

결핵 및 나병의 면역치료에 이용되는 좀 덜 알려진 결핵균 속은 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae)로 사람에서 비-병인성이다. 하지만, BGC와 비교하였을 경우에 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 효과에 대해서는 정보가 없어, 일반 대중을 예방접종하는데 별로 사용되지 않고 있다. 미코박테리움 보비스(M. bovis) BCG와 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 결핵균(M. tuberculosis) 감염에 노출된 개체의 면역계가 인지할 수 있는 항원 화합물을 포함하고 있는 것으로 보인다.

여러 특허 및 다른 간행물에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 다른 미코박테리아(Mycobacteria) 분취물을 비롯한 미코박테리아속(Mycobacteria)을 투여하여 다양한 질환의 치료방법을 개시한다. 미국 특허 4,716,038에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 비롯한 미코박테리아속을 투여하여 다양한 유형의 자가면역질환(예, 관절염 질환)의 진단, 이에 대한 예방접종 및 치료를 개시한다. 미국 특허 4,724,144에서는 미코박테리아속 질환, 특히 결핵 및 문둥병의 치료 및 화학요법에 대한 어쥬번트로 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 유도한 항원성 물질을 함유하는 면역요법적 약물을 개시한다. 국제 특허 출원 WO 91/01751에서는 AIDS 발병을 지연 및/또는 예방하기 위한 면역예방물질로서 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 얻은 항원성 및/또는 면역조절성 물질의 용도를 개시한다. 국제 특허 출원 WO 94/06466에서는 AIDS 및 이와 관련된 결핵의 유무하에 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유래된 항원성 및/또는 면역조절성 물질의 HIV 감염치료법에 대한 용도를 개시한다.

미국 특허 5,599,545에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 대하여 내인성이 아닌 항원으로 투여하기 위한 미코박테리아속(Mycobacteria), 특히 완전 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 어쥬번트로서의 용도를 개시한다. 상기 간행물은 어쥬번트로서의 유용한 효과는 쇼크 단백질 65(hsp 65)에 기인한다는 이론을 제시한다. 국제 특허 출원 WO 92/08484에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유래된 항원성 또는/및 면역억제성 물질의 포도막염 치료를 위한 용도를 개시한. 국제 특허 출원 WO 93/16727에서는 감염에 의해 개시된 자가면역반응과 관련된 정신질환 치료를 위한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유래된 항원성 또는/및 면역억제성 물질의 용도를 개시한다. 국제 특허 출원 WO 95/26742에서는 종양의 성장이나 확대를 지연 또는 예방하기 위한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유래된 항원성 또는/및 면역억제성 물질의 용도를 개시한다. 국제 특허 출원 WO 91/02542에서는 만성 염증질환의 치료에서 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 용도를 개시하는데, 상기 질환에서는 비정상적으로 높게 IL-6 및/또는 TNF가 방출되거나 또는 환자의 IgG에서 비정상적으로 높은 비율의 아갈락토실 IgG가 나타난다. 상기 간행물에 언급된 질환에는 건선, 류머티스 관절염, 미코박테리아(Mycobacteria) 질환, 크로온 병, 일차 담즙 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 낭창, 다발성경화증, 길랑-바레 증후군, 일차 당뇨증 및 일부 이식거부 현상이 있다.

공지된 미코박테리아(Mycobacteria)종 중에서 특히 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 가열-치사된 제형이 백신 및 면역요법적 성질을 유지한다는 점에서 독특하다. 가령, 결핵에 대한 예방주사에 사용되는 결핵균(M. tuberculosis) BCG 백신은 살아있는 균주를 이용한다. 가열-치사된 우형 결핵균(M. bovis) BCG 및 결핵균(M. tuberculosis)을 백신으로 사용되는 경우에는, 어떠한 보호 특성도 나타나지 않는다. 어쥬번트 성질을 지닌 광범위한 미코박테리아(Mycobacteria)종으로부터 다수의 화합물을 분리하였다. 이런 어쥬번트 효과는 다른 종의 항원에 대한 특정 면역 반응기전을 자극하는데 필수적이다.

어쥬번트 성질을 보이는 미코박테리아(Mycobacteria)종으로부터 분리한 화합물에는 크게 두 가지 부류가 있다. 제1화합물은 수용성 왁스 D 분취물이다(White et al., Immunology 1:54, 1958; US Patent 4,036,953). 제2화합물은 무람일 디펩티드-기초의 물질(N-아세틸글루코사민 및 대략 동몰량의 N-글리코일뮤람산)이다(U.S. 특허 3,956,481, 4,036,953). 이들 화합물은 다음과 같은 측면에서 본 발명에 따른 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 상이하다:

1. 이들은 수용성 작용제인 반면, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 수용성 용액에 녹지 않는다.

2. 이들은 미코박테리아(Mycobacteria) 세포벽 단위체의 다양한 소형 저 중합체로 이루어지며, 다양한 용매로 박테리아로부터 추출하거나 또는 효소로 세포벽으로부터 분해시킨다. 대조적으로, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 가공된 미코박테리아 세포로 구성된다.

3. 모든 단백질은 단백질분해 효소로 분해하여 이들 제형으로부터 제거한다. 이들 제형의 구성성분은 세포벽 펩티드글리칸 구조의 성분, 다시 말하면 알라닌,글루탐산, 디아미노피멜산, N-아세틸글루코사민, N-글리콜일무람산이다. 대조적으로, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 50% w/w 단백질을 보유하는데, 상기 단백질은 상이한 다수의 단백질 종으로 이루어진다.

유육종증은 다수의 신체 장기, 특히 폐, 림프절, 간을 손상시키는 육아종성 염증으로 특징지어지는 원인미상의 질병이다. 사르코이드 육아종증은 중심부에 상피 및 거대세포가 위치하는 단핵 식세포 및 T 림프구로 이루어진다. CD4 T 림프구는 상피세포와 밀접하게 연관하고, CD4와 CD8 T 림프구는 말초에 축적된다. 유육종증에서 특징적인 면역학적 이상에는 말초혈 및 기관지 폐포 세정 고-글로불린증 및 피부에서 결핵 및 다른 유사항원(예, 칸디다균과 유행성 이하선염)에 대한 '지연형' 과민감성 반응의 억제가 포함된다. 말초혈 림프구 수는 감소하고, 말초혈에서 CD4: CD8 비율은 대략 1-1.5:1로 억제된다. 이들은 일반적인 면역결함의 징후가 아니고, 질병활성부위에 '구획되는' 고조된 면역활성의 결과다. 폐 유육종증 환자에서, 기관지 폐포 세정에 의해 회수된 전체 세포수는 5 내지 10배 증가하고, 림프구의 비율은 10-14% 미만의 정상상태에서 15% 내지 50%로 증가하였다. 회수된 림프구의 90%이상이 T 림프구이고, CD4:CD8 비율은 정상 컨트롤의 1.8:1에서 10.5:1로 증가하는 것으로 알려지고 있다. T 림프구는 Th2 강(class)보다는, IFN-r과 IL-2 사이토킨을 생산하는 Th1 강(class)이다. 치료 이후, 유육종증 폐에서 Th1 림프구 증가는 조정된다.

유육종증은 거의 모든 경우에 폐와 관련된다. 병소가 주로 다른 장기에서 발견되는 경우에도, 잠재적으로 폐가 연루된다. 일부 유육종증은 저절로 해결되지만, 대략 50% 환자에서 영구적인 경증도의 장기이상이 발생한다. 심한 경우에, 폐 섬유증이 발생하여, 폐이식을 필요로 하는 폐부전으로 진행된다. 유육종증에 대한 주요 치료물질은 코르티코스테로이드이다. 초기에 코르티코스테로이드에 반응을 보인 환자의 경우에도 병이 종종 재발하기 때문에, 메토트렉세이트나 사이클로스포린과 같은 다른 면역억제약물로 치료해야 한다.

천식은 일반적인 질환으로 선진국에서 주로 나타난다. 천식은 다양한 자극에 대한 기관 기관지수의 반응증가로 특징지어지고, 여기서 주요 생리장애는 기류 역류 제한인데, 이것은 자발적이거나 또는 약물에 연관하고, 병리학적 검증은 기도의 염증이다. 임상적으로, 천식은 외적 변종과 내적 변종으로 세분할 수 있다.

외적 천식에는 확인가능한 침전물이 생성되는데, 이는 아토피, 직업, 약물에 의해 유도된 것으로 생각할 수 있다. 아토피성 천식은 특정 면역글로불린 E(IgE)의 생성에 따른 Th2-형 면역반응의 강화, 일반적인 공기 알레르기원에 대한 양성 피부 검사 및/또는 아토피성 증상과 연관한다. 천식은 추가로, 증상의 계절 시기에 따라 계절형 및 다년형으로 세분할 수 있다. 외적 천식에서 기도폐쇄는 기도의 염증에 의해 야기된 비-특이적 기관지 초반응성에 기인한다. 이런 염증은 다양한 염증세포, 예를 들면 비만 세포, 호산구, 림프구에 의해 방출되는 화학물질에 의해 매개된다. 이들 매개물질은 혈관침투, 점액 분비, 기관지 평활근 수축을 야기한다. 아토피성 천식에서, 기도염증을 발생시키는 면역반응은 T 세포의 Th2 강(class)에 의해 야기되는데, 이때 상기 T 세포는 IL-4, IL-5, IL-10을 분비한다. 아토피성 천식 폐의 림프구는 활성화되는 경우, IL-4, IL-5를 생산하는 것으로 밝혀졌다. IL-4와 IL-5는 Th2 강의 사이토킨으로, 천식에서 IgE 생산 및 호산구 관여에 필요하다. 직업관련 천식은 플라스틱산업 노동자에서 무수산과 서부 연필향나무-유도 천식에서 플리카트산과 같은 단백질 합텐에 대한 IgE의 발생, 또는 톨루엔 디이소시아네이트-유도 천식에서 관찰되는 비-IgE 관련 기전과 연관하기도 한다. 약물-유도된 천식은 아스피린 또는 다른 비-스테로이드성 항-염증 약물의 투여이후 관찰할 수 있는데, 비강 폴립증과 부비강염과 같은 증상을 보이는 환자에서 대부분 나타난다. 내적 또는 잠복성 천식은 상부 호흡관 감염후 발생하는 것으로 보고되고 있으나, 중년이후의 사람들에게는 처음부터 발생할 수도 있는데, 이런 경우에 외적 천식보다 치료하기가 힘들다.

천식은 이론적으로는 자극 알레르기원을 피함으로써 예방할 수 있지만, 이것이 항상 가능한 것도 아니고 자극 알레르기원을 확인하는 것도 쉽지 않다. 천식의 치료요법은 코르티코스테로이드와 기관지 확장약의 이용에 기초하여 염증을 감소하고 및 기도폐쇄를 반전시키는 것이다. 만성 천식에서 코르티코스테로이드 치료는 수용할 수 없는 부작용을 유발한다.

천식과 유사한 면역비정상을 갖는 다른 질환은 알레르기 비염이다. 알레르기 비염은 일반적인 질환으로 전체 인구의 10% 이상이 피해를 입고 있는 것으로 평가된다. 알레르기 비염은 화분(pollen)에 대한 알레르기에 의해 발생하는 계절형(건초열)일 수 있다. 비-계절형 또는 다년형 비염은 말 진드기 또는 동물 비듬과 같은 항원에 대한 알레르기로 발병한다.

알레르기 비염에서 비정상적 면역반응은 알레르기원에 대한 특이적인 IgE 항체의 과다 생성으로 특징지어진다. 염증반응은 천식의 경우처럼 기도 아랫부분에서보다는 비강점막에서 일어난다. 천식처럼, 손상을 받은 조직에서 국소성 호산구증가증은 알레르기 비염의 주요특징이다. 이런 염증의 결과로 환자에게 재채기, 콧물 및 코막힘이 발생한다. 좀더 심한 경우에, 염증은 눈(결막염), 입천장, 귀 바깥 부분으로 확대된다. 이것이 생명을 위협하는 것은 아니지만, 알레르기 비염은 정상적인 활동을 하지 못하도록 하고 사람의 작업능력을 방해한다. 현재 치료에는 항히스타민제, 코 충혈완화제 및 천식의 경우 나트륨 크로모글리케이트와 코르티코스테로이드를 사용한다.

아토피성 습진으로 알려진 아토피성 피부염은 만성 재발성 소양성 피부염증질환으로, 알레르기 비염 및 천식과 같은 다양한 알레르기 질환에 대한 유전적 소인이 있는 가계에서 주로 발생한다. 아토피성 피부염은 어린 시절에 아토피성 피부염에 걸린 개체군에서 유병율(prevalence)이 최대 15%까지 증가한다. 주요 증상은 건조한 피부 및 얼굴, 목, 사지의 굴근부와 주름에 집중되고 심한 가려움을 동반하는 피부염(습진)이다. 이것은 일반적으로 출생후 5년이내에 시작된다. 이런 피부질환은 대략 90%의 환자에서 유아기동안 사라지지만, 증상은 성인때까지 지속될 수 있다. 게다가, 환자중 50%에서 천식이 75%에서 알레르기성 비염이 발병한다. 이것은 전 세계에서 가장 흔한 피부염중 하나다.

알레르기원은 아토피성 피부염에서 중요한 역할을 한다. 환자중 대략 80%가 다양한 음식 및 흡입 알레르기원에 대한 IgE 항체를 보유하는데, 특히 다른 형태의 아토피성 질환을 갖고 있는 심한 아토피성 피부염 환자 대부분은 상승된 수준의 혈청 IgE를 보유한다. 또한, 혈액 호산구의 순환 수준이 종종 상승한다. 아토피성 피부염에서, 피부 병소의 진피에는 대식세포, T 세포, 호산구가 침투하고, 만성 병소에서는 비만 세포의 수가 증가한다. 급성 병소에서 사이토킨 IL-4, IL-5, IL-13을 발현하는 세포가 급격하게 증가하는데, 이는 Th2 강(class)의 T 세포가 주로 축적된다는 것을 시사한다. 또한, 아토피성 피부염에서 순환 T 세포는 정상 개체에 비하여 더 많은 IL-4와 IL-5를 생산한다. Th2 사이토킨은 알레르기 반응을 시발시키는데 중요한 역할을 한다. IL-4는 IgE 아이소타입에 대한 항체 생산, Th2 세포의 발달, 호산구를 동원하는 내피 세포에서 유착 분자의 유도를 시발한다. IL-5는 호산구의 발달과 분화에 중요하다.

Th2 세포와 달리, Th1 세포는 IFN-과 IL-2를 생산한다. Th1 세포는 만성 아토피성 피부 병소에서 확인되었다. IL-2가 T 세포 성장에 중요하고 비정상적 피부 비후를 유발하기 때문에, Th1 또한 아토피성 피부염 병리의 한 원인이 된다. 생쥐에서 아토피성 피부염-유사 병소는 난알부민으로 피부표면을 수회 감작하여 발생시킬 수 있다. 이들 생쥐로부터 배수 림프절 T 세포는 시험관내 난알부민 자극에 반응하여 IL-4를 분비하지만, IFN-을 분비하지는 못한다.

알레르기성 접촉피부염은 피부의 일반적인 비-감염성 염증질환이다. 접촉 피부염에서, 면역학적 반응은 신체가 특정 항원에 감작화될 때까지는 발생하지 않는다. 연이은 피부의 항원으로의 노출 및 T 세포에 의한 이들 항원의 인식은 다양한 사이토킨의 방출, T 세포의 증식 및 동원을 야기하고, 최종적으로 피부염(습진)을 야기한다.

알레르기 접촉 피부염의 병소에서, 소수의 T 세포만이 유관한 항원에 대하여 특이적이다. 활성화된 T 세포는 가급적 항원-특이성에 상관없이 염증위치로 이동한다. 지연형 초민감성은 MHC 클래스 Ⅱ 항원을 공유한 T 세포(CD4⁺세포)에 의해서만 전달될 수 있다. 접촉 알레르기원에 대한 '반응'은 MHC 클래스 I(CD8⁺세포) 또는 클래스 Ⅱ(CD4⁺세포)분자를 공유한 T 세포에 의해 전달될 수 있다(Sunday, M.E. et al., J. Immunol. 125:1601-1605, 1980). 케라티노사이트는 T 세포에 대한 항원 제시를 용이하게 하는 인터루킨-1을 생산할 수 있다. 표면항원 세포내 부착분자-1(ICAM-1)의 발현은 케라티노사이트 및 내피에서 사이토킨 종양 괴사인자(TNF)와 인터페론-감마(IFN-r)로 유도한다.

원인을 확인할 수 있는 경우에, 이를 제거만 하여도 알레르기 접촉 피부염은 치료된다. 염증이 활발한 상황에서는, 국소성 코르티코스테로이드가 유용하다. 지연형 초민감성에서 시험관내 기폭된 T 세포의 프로-염증성 기능에 대한 사이클로스포린의 억제효과가 관찰되었다(Shidani, B. et al., Eur. J. Immunol. 14:314-318,1984). 생쥐에서 초기 단계의 T 세포 활성화에 대한 사일클로스포린의 억제효과가 또한 보고되고 있다(Milon, G. et al., Ann. Immunol.(Inst. Pasteur) 135d:237-245,1984).

폐암은 암으로 인한 사망의 주요원인이다. 폐암의 발생빈도는 증가되고 있으며, 세계 보건기구는 2000AD까지 매년 2백만건이 새로이 발생할 것으로 추산한다. 폐암은 주로 2가지 범주로 구분할 수 있다: 모든 폐암의 20-25%를 차지하는소세포 폐암(SCLC); 나머지 75%를 차지 비-소세포 폐암(NSCLC). 대부분의 SCLC는 흡연에 의해 야기된다. SCLC는 조기에 확산되어, 진단된 환자중 90%에서 종격 림프절의 흉부 침투가 나타난다. SCLC는 화학요법, 또는 화학요법과 방사성요법의 복합요법으로 치료한다. 완전 반응율은 10% 내지 50%가 된다. 드물지만 림프절 침투가 없는 환자의 경우, 수술과 화학요법을 병용하여 60%이상의 치료율을 보인다. NSCLC에 대한 예후는 좀더 심각한데, 그 이유는 질병의 진단시점에서 대부분의 환자의 질병이 상당히 진전되어 있기 때문이다. 종양의 수술제거는 극소수의 환자에게만 가능한데, NSCLC에 대한 5년 생존율은 5-10% 정도다.

폐암을 유발시키는 원인은 복잡하고 다원적이다. 환경 및 유전인자는 상호작용하여, 통제되지 않는 세포증식, 인접조직으로의 침투, 원거리까지 확산으로 이어지는 순차적이고 증분적인 비정상을 유발한다. 폐암 환자에서 세포-매개 면역 및 체액 면역 모두 손상되었다. 방사성치료 및 화학치료는 환자의 면역기능을 더욱 손상시킨다. 불활화된 종양세포 또는 종양항원으로 환자를 면역시켜, 숙주 항-종양 반응을 강화하려는 시도가 있었다. 바실러스(Bacillus) 칼메테-구에린(BCG)은 비-특이적 면역을 증가시키기 위하여, 폐암 수술이후 흉부강에 투여한다. 환자에 인터루킨-2로 탈체 처리한 림프구를 투여하여 항-종양 면역을 강화하려는 시도가 있었다. 이들 림포카인-활성화 림프구는 종양세포를 죽일 수 있는 능력을 획득한다. 폐암에 대한 현재의 면역요법은 개발단계에 있으며, 폐암의 표준관리를 위한 이들의 효능은 아직 확립되지 않고 있다

죽상동맥경화증은 지질, 대식세포, T 림프구, 평활근, 세포외 기질의 축적으로 특징지어지는 동맥벽의 만성 염증 질환이다. 염증 반응동안 생성되는 항-염증 사이토킨은 염증 과정을 조절하는 것으로 생각된다. 인터루킨-10(IL-10)은 Th2 림프구와 대식세포에 의해 분비되는데, 항-염증 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. Mallat등은 IL-10이 생쥐에서 죽상동맥경화증 병소의 형성과 안정성에 보호 효과를 갖는다고 보고하였다(Circ. Res. 85:e17-24, 1999). 이들 연구는 IL-10 생산을 증가시키는 약물을 활용하여 죽상동맥경화증의 정도 및/또는 중증도를 조절할 수 있다는 것을 시사한다.

IL-10 투여가 유용한 것으로 밝혀진 다른 질환에는 고콜레스테롤혈증(미국 특허 5,945,097); 그람-네거티브 박테리아 및/또는 그램-파지티브 박테리아 감염을 비롯한 박테리아 감염(미국 특허 5,838,293과 5,837,232); 인슐린-의존 당뇨병(미국 특허 5,827,513)이 포함된다. 또한, 미국 특허 5,871,725는 IL-10으로 활성화되는 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 환자에 투여하여 암을 치료하는 방법을 개시한다.

발명의 요약

전술한 바와 같이, 본 발명은 호흡기 질환[예, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)나 미코박테리움 아비움(M. avium) 감염, 유육종증, 천식, 폐암), 알레르기성 질환(예, 아토피성 피부염, 습진), 호산구증가증으로 유발되는 질병, 그리고 IL-10 생산을 조절하여 호전시킬 수 있는 질환(예, 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 암, 박테리아 감염, 인슐린-의존 당뇨병)을 비롯한 면역-매개 질환의 예방과 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

제1측면에서, 지질 및 당지질 제거된 미코박테리아 세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 지질 및 당지질 제거된 세포는 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)로부터 준비한다.

제2측면에서, 본 발명은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리아 세포의 유도체, 다음에서 선택되는 지질 및 당지질 제거된 미코박테리아 세포의 유도체: 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포; 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포; 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포; 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포; 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포; 단백분해효소 K로 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포; 무수성 수화불소산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체는 바람직하게는 전체 탄수화물의 9.7% 미만, 좀더 바람직하게는 전체 탄수화물의 5% 미만, 가장 바람직하게는 전체 탄수화물의 3.5% 미만 함량으로 갈락토스를 포함한다. 특정 구체예에서, 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체는 바람직하게는 전체 탄수화물의 3.7% 이상, 좀더 바람직하게는 전체 탄수화물의 5% 이상, 가장 바람직하게는 전체 탄수화물의 7.5% 이상함량으로 글루코사민을 포함한다.

본 발명의 다른 측면에서, 호흡기 질환을 비롯하여 환자에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 조성물을 환자에 투여하는 것으로 구성된다. 특정 구체예에서, 질환은 미코박테리아 감염, 천식, 유육종증, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 폐암에서 선택된다. 한 구체예에서, 조성물은 가급적 에어로졸 형태로 코나 입을 통한 흡입으로 폐로 이어지는 또는 여기에 위치하는 기도에 투여한다. 대안으로, 조성물은 피내, 경피 또는 피하 루트에 투여할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 투여하여 환자의 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 질환은 호흡기 조직에서 호산구증가증의 존재로 특징지어진다. 이런 질환의 예로는 천식과 알레르기성 비염을 들 수 있다. 관련된 측면에서, 본 발명은 환자에서 호산구증가증을 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본원서 밝힌 조성물중 적어도 하나를 투여하는 것으로 구성된다. 일반적으로, 호산구증가증의 감소는 20% 내지 80%로 다양하다. 폐 호산구증가증에서 감소 퍼센트는 후술한 치료 전후에, 기관지폐포 세척액에서 호산구의 수를 측정하여 결정할 수 있다.

또 다른 측면에서, IL-10의 생산을 강화하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 것으로 구성된다. 전술한 바와 같이, IL-10은 죽상동맥경화증 병소의 형성과 안정에서 보호 역할을 하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 또한, IL-10은 고콜레스테롤혈증, 암, 박테리아 감염 및 인슐린-의존 당뇨병의 치료에도 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 이런 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

더 나아가, 본 발명은 αβT세포,δT세포 또는 NK 세포를 활성화시켜 환자에서 상피를 회복하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 조성물을 환자에 투여하는 것으로 구성된다.

본 발명의 이런 측면은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고하면 더욱 명확해진다. 이 글에서 밝힌 모든 참고문헌은 본원에 순전히 참고 사항으로 포함한다.

본 발명은 면역학적으로 매개된 질환의 치료방법에 관한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 유육종증, 천식, 폐암과 같은 호흡기 질환의 치료, 아토피성 피부염, 습진과 같은 알레르기성 질환의 치료, 호산구증가증으로 유발되는 질병의 치료, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 감염과 같은 감염성 질환의 치료, 그리고 IL-10 생산을 조절하여 호전시킬 수 있는 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 임의 다른 질환의 치료를 위한 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)로부터 만들어진 성분으로 구성되는 조성물의 용도에 관한다.

도1은 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질에 의한 IL-12의 유도를 보여준다.

도2는 상이한 농도의 가열-사멸된(가압멸균된) 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질에 의한 증증합병 면역결핍(SCID) 생쥐의 비세포에서 인터페론-감마의 시험관내 촉진을 비교한다.

도3은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(Q1) 및 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체 Q2(DD-M. vaccae-KOH), Q3(DD-M. vaccae-산), Q4(DD-M. vaccae-과요오드산염), Q6(DD-M. vaccae-KOH-과요오드산염), P5(DD-M. vaccae-KOH-산), P6(DD-M. vaccae-KOH-과요오드산염)을 비강으로 예방주사한 생쥐에서, 이들 화합물에 의한 난일부민-유도된 기도 호산구증가증의 억제를 도시한다.

도4는 THP-1 세포에서 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체에 의한 IL-10의 촉진을 도시한다.

도5는 결핵균 감염이전에 생쥐에서 가열-멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 예방주사의 효과를 보여준다.

도6은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH의 재부유를 보여준다.

도7은 대식세포에서 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(R1) 및 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체 R2(DD-M. vaccae-KOH), R3(DD-M. vaccae-산), R4(DD-M. vaccae-과요오드산염), R5(DD-M. vaccae-KOH-산), R6(DD-M. vaccae-KOH-과요오드산염)에 의한 IL-12 생산의 촉진을 도시한다.

도8은 약량-의존 방식으로 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 유도체에 의한 기도 호산구증가증의 억제를 보여준다.

도9는 폐 호산구의 억제에 대한 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 비강 예방주사와 피내 예방주사의 효과를 비교한다.

도10은 기도 호산구증가증에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis), DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis) 예방주사의 효과를 보여준다.

도11은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)로 자극한 사람 PBMC와 비-유착 세포에 의한 TNF-α 생산을 보여준다.

도12A와 도12B는 각각, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)로 자극한 사람 PBMC와 비-유착 세포에 의한 IL-10과 IFN-생산을 보여준다.

도13은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체(DD-M. vaccae-산, Hvac, Evac)에 의한 알레르기원-유도된 기도 호산구증가증의 억제를 보여준다.

도14는 OVA 자극 3일후에 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산을 투여하는 생쥐에서 심한 알레르기원-유도된 기도 호산구증가증에 대한 이의 치료요법적 효과를 보여준다.

도15는 1회 또는 2회의 OVA 자극 직전, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산을 투여하는 경우에, 알레르기원-유도된 기도 호산구증가증에 대한 이의 억제 효과를 보여준다.

도16은 1차와 2차 OVA 자극사이에 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산을 1회 또는 2회 투여하는 경우에, 생쥐에서 알레르기원-유도된 호산구증가증의 억제에 대한 이의 효과를 보여준다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 면역-매개된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한다. 특정 구체예에서, 이런 질환은 호흡기 질환, 알레르기성 질환 및 IL-10 투여 및/또는 IL-10 생산의 촉진이 득이 되는 질환에서 선택된다. 호흡기질환의 예로는 미코박테리아 감염, 천식, 유육종증, 알레르기성 비염, 폐암을 들 수 있다. IL-10 투여 및/또는 IL-10 생산의 촉진이 득이 되는 질환의 예로는 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 암, 박테리아 감염, 인슐린-의존 당뇨병을 들 수 있다. 알레르기성 피부 질환의 예로는 아토피성 피부염과 습진을 들 수 있다.

암뿐만 아니라 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 같은 특정 병원균은 세포-매개 면역으로 알려진 CD4+ T세포 주도의 면역 공격에 의해 효과적으로 차단된다. 폴리오바이러스와 같은 다른 병원균은 감염을 위해 B 세포가 생산하는 항체를 필요로 한다. 이들 상이한 면역 공격세포(T 세포 또는 B 세포)는 Th1과 Th2 세포로 통칭되는 CD4+ T세포의 상이한 하부개체군에 의해 조절된다.

이들 2가지 타입의 Th 세포 하부집합은 뮤린 모델에서 잘 특성화되었는데, 활성화 직후에 방출하는 사이토킨으로 정의한다. Th1 하부집합은 IL-2, IFN-, 종양괴사인자를 분비하고, 식세포 활성화 및 지연형 초감감성 반응을 매개한다. Th2 하부집합은 B 세포 활성화를 자극하는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10을 방출한다. Th1 및 Th2 하부집합은 서로를 저해하고, 따라서 IL-4는 Th1-형 반응을 저해하고, IFN-은 Th2-형 반응을 저해한다. 유사한 Th1 및 Th2 하부집합이 사람에서 발견되었는데, 뮤린 모델에서 관찰된 것과 동일한 사이토킨이 방출된다. Th1-형 면역반응의 증폭은 결핵, 유육종증, 천식, 알레르기 비염, 폐암과 같은 호흡기 질환을 비롯하여 다수의 질환에서 질병상태 반전의 핵심이다. IL-12는 Th1 반응을 상향-조절하는 반면, IL-10은 Th2 반응을 하향-조절하는 것으로 밝혀졌다. Zuany-Amorim등은 IL-10이 백혈구가 항원-자극한 생쥐의 기도에 침투하는 것을 조절한다는 것을 밝혔는데, 이는 IL-10이 폐에서 알레르기성 염증 과정을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다(J. Clin. Invest. 95:2644-2651, 1995). Borish등은 천식 환자의 기관지폐포액이 정상 공여체의 기관지폐포액에 비하여 감소된 수준의 IL-10을 보유한다는 것을 발견하였다(J. Allergy Clin. Immunol. 97:1288-96,1996).

한 측면에서, 호흡기 및/또는 폐 질환의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리아속 세포, 바람직하게는 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis) 세포 및/또는 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis) 세포를 환자에 투여하는 것으로 구성된다. 관련된 측면에서, 본 발명은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리아속 세포를 투여하여, 환자의 호흡기 및/또는 폐 질환, 예를 들면 결핵, 유육종증, 천식, 알레르기성 비염, 폐암을 면역치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 이런 방법은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체중 적어도 하나를 투여하는 것으로 구성된다. 후술한 바와 같이, 본원 발명자는 생쥐 모델을 활용하여 천식 치료에서 이런 조성물의 효능을 입증하였다. 이들 조성물은 천식-유도성 Th2 면역반응을 억제하는 능력으로 인해, 천식과 같은 질환의 치료에 유용할 것으로 생각된다. 한 구체예에서, 조성물은 폐로 이어지는 또는 폐에 위치한 기도의 점성 표면으로 직접 전달한다. 대안으로, 조성물은 피내 또는 피하 루트로 투여할 수 있다.

이 글에서, "호흡기"는 폐, 비강통로, 기도, 기관지를 의미한다.

이 글에서, "폐로 이어지는 또는 폐에 위치한 기도"에는 비강통로, 입, 편도선 조직, 기도, 기관지가 포함된다.

이 글에서, "환자"는 항온 동물, 가급적 사람을 의미한다. 이런 환자는 질환으로 고통받거나 또는 감지가능한 질병이 없을 수도 있다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 방법은 질병의 예방 또는 치료를 위한 보호면역을 유도하는데 활용할 수 있다.

이 글에서, "불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)"는 아래의 실시예 1에서 자세히 밝힌 바와 같이 열, 또는 2.5 megarad 일회 선량에서 방사선(⁶⁰코발트)에 노출시켜 죽인 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포를 의미한다. 이 글에서 "변형된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)"에는 지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포, 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포, 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)세포 및 이의 유도체가 포함된다. DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 하기 실시예 1에서 밝힌 대로 만들 수 있고, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체는 하기 실시예 2에서 밝힌 대로 만들 수 있다. 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(DD-M.smegmatis)의 준비는 하기 실시예 10에서 밝힌다. 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis) 유도체와 미코박테리움 스메그마티스(DD-M.smegmatis) 유도체, 예를 들면 산-처리된, 알칼리-처리된, 과요오드산염-처리된, 단백분해효소 K-처리된,및/또는 수화불소산 처리된 유도체는 본원에서 밝힌 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체의 제조 과정을 활용하여 만들 수 있다.

DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체는 바람직하게는 전체 탄수화물의 9.7% 미만, 좀더 바람직하게는 전체 탄수화물의 5% 미만, 가장 바람직하게는 전체 탄수화물의 3.5% 미만 함량으로 갈락토스를 포함한다. 특정 구체예에서, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체는 바람직하게는 전체 탄수화물의 3.7% 이상, 좀더 바람직하게는 전체 탄수화물의 5% 이상, 가장 바람직하게는 전체 탄수화물의 7.5% 이상 함량으로 글루코사민을 포함한다. 알칼리로 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)를 처리하여 만든 유도체, 예를 들면 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(Kvac)는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)에 비하여 세포벽의 아라비노갈락탄에 미콜산을 연결하는 에스테르 결합의 수가 적다. 산으로 처리하여 만든 유도체, 예를 들면 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산(Avac)은 세포벽의 펩티드글리칸에 아라비노갈락탄 측쇄를 부착하는 포스포디에스테르 결합의 수가 적고, 따라서 아라비노갈락탄이 결핍된다. 또한, 이런 유도체는 DNA가 결핍된다. 과요오드산염으로 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)를 처리하여 만든 유도체, 예를 들면 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-과요오드산염(Ivac)은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)에 비하여 cis-디올-함유 슈거 잔기의 수가 적고, 아라비노갈락탄이 결핍된다. 단백분해효소 K로 처리하여 만든 유도체(예, Evac)는 단백질과 펩티드가 결핍된다. 수화불소산으로 처리하여 만든 유도체, 예를 들면 수화불소산 처리한 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(Hvac)은 글리코시드 결합이 결핍된다.

일반적으로, 본 발명에 따른 조성물은 주사(예, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비강(예, 흡입), 경구 또는 피부 표면(피부에 국소도포)에 투여한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 폐로 이어지는 또는 폐에 위치한 기도의 점성 표면에 전달하는데 적합한 형태다. 가령, 조성물은 에어로절 형태로 또는 천식 치료에 활용되는 것과 유사한 분무기로 환자에 전달하기 위한 액체 제형에 부유시킬 수 있다.

치료용도로 사용되는 본 발명에 따른 조성물은 생리학적으로 수용가능한 담체 및/또는 면역 반응을 유도하거나 촉진하는 면역촉진물질(예, 어쥬번트 또는 리포좀)을 추가로 함유할 수 있는데, 여기에 폴리펩티드를 통합한다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물에 당업자에게 공지된 임의의 적당한 담체를 이용할 수 있지만, 담체의 유형은 투여 형태에 따라 달라진다. 피하 주사와 같은 장관외 투여의 경우, 담체는 가급적 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액으로 구성된다. 경구 투여의 경우, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 활석, 셀룰로오스, 포도당, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고형 담체 또는 상기 담체중 임의 하나를 이용할 수 있다. 또한, 생분해성 소구체(가령, 폴리락트 갈락티드)를 본 발명에 따른 제약학적 조성물의 담체로 이용할 수 있다. 적절한 생분해성 소구체는 미국 특허 4,897,268; 5,075,109에서 개시한다.

본 발명의 조성물에 임의의 다양한 어쥬번트를 이용하여, 면역반응을 강화시킬 수 있다. 대부분의 어쥬번트는 신속한 대사분해로부터 항원을 보호하기 위한물질(예, 수산화 알루미늄 또는 미네랄 오일) 및 면역 반응의 비-특이적 촉진물질(예, 지질 A, 보르데텔라 페루투시스(Bordetella pertussis), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M.tuberculosis), 또는 하기에서 밝힌 바와 같은 미코박테리움 바카이(M. vaccae))을 포함한다. 적절한 어쥬번트로는 프레운드 불완전 어쥬번트(Freund's Incomplete Adjuvant)와 프레운드 완전 어쥬번트(Freund's Complete Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI), 머랙 어쥬번트 65(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)등이 시판되고 있다. 다른 적절한 어쥬번트에는 칼륨명반, 생분해성 소구체, 모노포스포릴 지질 A, Quil A가 포함된다.

투여의 적절한 빈도 및 효과량은 개인마다 다르다. DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 및 이의 유도체의 경우, 1회 분량에 존재하는 함량은 바람직하게는 10㎍ 내지 1000㎍, 좀더 바람직하게는 10㎍ 내지 100㎍이다. 복용 회수는 최대 12개월동안 1 내지 10회다.

1회 분량에서 활성 성분의 함량과 관련하여 본원 명세서에서 사용된 "약"은 언급한 함량에서 최고 5% 변이를 의미한다. 호산구의 퍼센트 감소와 관련하여 사용된 "약"은 언급된 퍼센트에서 최대 10% 변이를 의미한다.

다음의 실시예를 설명을 위한 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 준비

본 실시예는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 상이한 구성성분을 처리 과정 및 이들의 면역 조절 특성을 설명한다.

가열-사멸된 미코박테리움 바카이( M. vaccae ) 및 이의 배양 여과물

미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC 15483)는 37℃ 멸균배지90(효모 추출물, 2.5g/ℓ; 트립톤, 5g/ℓ; 글루코스 1g/ℓ)에서 배양한다. 세포는 원심분리로 수거하고, 하루동안 37℃에서 글루코스를 함유한 미들브룩 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI)로 옮긴다. 이후, 배지는 원심분리하여 박테리아를 펠렛하고, 배양 여과물은 옮긴다. 박테리아 펠렛은 ㎖당 10¹⁰미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 해당하는 10mg/㎖ 농도로 인산염 완충식염수에 재부유시킨다. 이후, 세포 현탁액은 120℃에서 15분동안 가압멸균한다. 배양 여과물은 0.45㎛ 필터에 통과시키고 멸균 병에 모은다.

지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 준비 및 조성 분석

지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 준비하기 위해, 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 원심분리하여 펠렛하고, 상기 펠렛은 물로 세척하고 원심분리하여 다시 수거하고, 냉동 건조시킨다. 이런 냉동 건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 일부용액은 동결 건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)라고 한다. 실험에서 사용할 경우에는 원하는 농도로 PBS에 재부유시킨다. 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 실온에서 60분간 클로로포름/메탄올(2:1)로 처리하여, 지질을 추출하고, 추출은 한번 더 반복한다.클로로포름/메탄올 추출에서 얻은 지질제거된 잔류물은 2시간동안 환류하에서 50% 에탄올로 처리하여, 당지질을 제거한다. 50% 에탄올 추출은 2회 반복한다. 50% 에탄올 추출물을 모아서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질의 원료로 사용한다(하기 참조). 50% 에탄올 추출의 잔류물은 냉동-건조시키고, 칭량한다. 준비된 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 이용된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 처음 습식 중량의 11.1%에 상응하였다. 생물분석을 위해, 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(DD-M. vaccae)는 초음파분쇄하여 인산염-완충된 염에 재부유시키고, 가압멸균하여 살균시킨다.

가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 조성 분석은 표1에 제시한다. 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물과 비교할 때, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 지방산 조성 및 아미노산 조성에서 큰 변화가 관찰된다. 표1에 제시한 데이터에서 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물은 10%w/w 지질을 함유하고, 총 아미노산 함량은 2750nmoles/㎎ 또는 약 33%w/w임을 알 수 있다. DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 1.3%w/w 지질 및 4250nmoles/mg(약 51%w/w) 아미노산을 함유한다.

가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물은 10% w/w 지질을 함유하고, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 1.3% w/w 지질을 함유한다.

아미노산 조성물

가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물의 총 아미노산 함량은 2750nmoles/mg, 또는 약 33% w/w이다. DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 총 아미노산 함량은 4250nmoles/mg, 또는 약 51% w/w이다.

미코박테리움 바카이( M. vaccae ) 당지질

전술한 바와 같이 모아진 50% 에탄올 추출물은 회전 증발시켜 건조시키고, 물에 다시 용해시키고, 냉동-건조한다. 수거된 당지질의 함량은 사용된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 초기 습식 중량의 1.2%이다. 생물분석을 위해 당지질은 인산염 완충 식염수에 용해시킨다.

대식세포로부터 인터루킨-12의 생산

완전 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 상이한 사이토킨 촉진 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. Th1 면역 반응의 촉진은 대식세포로부터 인터루킨-12(IL-12)의 생산으로 강화된다. IL-12 생산을 촉진하는 상이한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 제형의 능력은 다음과 같이 확인한다.

C57BL/6J 생쥐군에 DIFCO 티오글리콜레이트를 복막 주사한다. 3일 후에, 복막의 대식세포를 수거하고 3시간동안 인터페론-감마를 함유하는 세포 배양액에 둔다. 배양 배지는 교체하고, 다양한 농도의 완전 가열-사멸된(가압멸균된) 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(지질-당지질 제거된M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질을 첨가한다. 37℃에서 3일간 추가 배양한 후에, 배양 상층액에서 대식세포에 의해 생산된 IL-12의 존재를 검사한다. 도1에서 보인 바와 같이, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 제형은 대식세포로부터 IL-12의 생산을 촉진한다.

대조적으로, 이들 동일한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 제형은 자연 킬러(NK) 세포에서 인터페론-감마(IFN-) 생산을 촉진하는 능력에 대해 검사한다. 중증합병 면역결핍(SCID) 생쥐로부터 비세포를 준비한다. 이들 개체군은 75-80% NK 세포를 보유한다. 비장 세포는 상이한 농도의 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질을 함유하는 배지에서 37℃로 배양하였다. 도2에서 보인 데이터에서, 완전히 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움바카이(M. vaccae) 당지질은 인터페론-생산을 촉진하는 반면, DD-미코박테리움 바키이(M. vaccae)는 상대적으로 적게 인터페론-감마를 촉진하는 것을 알 수 있다. 도1과 2의 자료를 종합하여 보면, 완전 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 비교할 때, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 인터페론 감마보다는 IL-12를 좀더 효과적으로 자극하는 물질이라는 것을 알 수 있다.

실시예 2

다른 미코박테리움 바카이( M. vaccae ) 유도체의 제조 및 특징

DD-미코박테리움 바카이( M. vaccae )의 알칼리 가수분해

상기 과정은 알카리 용해에 취약한 결합, 예를 들면 미코박테리아 세포벽의 아라비노갈락탄에 미콜산을 연결하는 에스테르 결합을 절단하기 위한 것이다.

실시예 1에서 밝힌 대로 만들어진 1g DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 에탄올에 녹인 20㎖의 0.5% 수산화칼륨(KOH) 용액에 부유시킨다. KOH와 에탄올 대신에 당분야에 공지된 다른 알칼리 약물과 용매를 사용할 수 있다. 상기 혼합물은 48시간동안 주기적으로 교반하면서 37℃에 배양한다. 고형 잔류물은 원심분리로 수거하고, 에탄올로 2번 디에틸 에테르로 1번 세척한다. 생성된 산물은 하룻밤동안 공기-건조시킨다. 여기서 1.01g(101%) KOH-처리된 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)[DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(Kvac)]가 산출된다. 상기 유도체는 본원에서 밝힌 다른 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체보다 더 높은 가용성을 보이는 것으로 밝혀졌다.

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 산 가수분해

상기 과정은 산에 취약한 결합, 예를 들면 미코박테리아 세포벽의 펩티도글리칸에 미아라비노갈락탄 측쇄를 부착시키는 포스포디에스테르 결합을 절단하기 위한 것이다.

DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(100㎎)는 1㎖의 50mM H₂SO₄에 2번 세척하고, 이후 재부유 및 원심분리한다. 황산 대신에 당분야에 공지된 다른 산을 사용할 수 있다. 산 가수분해 단계에서, 고형 잔류물은 1㎖의 50mM H₂SO₄에 재부유시키고, 72시간동안 60℃로 배양한다. 원심분리로 고형 잔류물을 수거한 이후, 잔류물을 물로 5회 세척하여 산을 제거한다. 동결-건조된 고형 잔류물에서 58.2㎎ 산-처리된 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)[DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산(Kvac)] 또는 36.7㎎ 산-처리된 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)-KOH(DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-산)가 산출된다.

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 과요오드산 절단

상기 과정은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae)에서 cis-디올-보유 슈거 잔기, 예를 들면 펩티도글리칸 골격에서 아라비노갈락탄 사슬 유착부위 주위의 람노오스 잔기를 절단하기 위한 것이다.

DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(100㎎)는 3% 아세트산에 녹인 1㎖의 1% 과요오드산에 부유시키고 실온에서 1시간동안 배양하고, 고형 잔류물은 원심분리로 수거한다. 과요오드산 처리는 3회 반복한다. 고형 잔류물은 원심분리로 수거하고, 실온에서 1시간동안 5㎖의 0.1M 소디움 보로하이드라이드 처리를 반복한다. 원심분리후, 고형 잔류물은 물로 4회 세척하고 동결-건조시켜, 62.8㎎ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-과요오드산염(Ivac) 또는 61.0㎎ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-과요오드산염을 얻는다.

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 또는 DD-미코박테리움 바카이( M. vaccae )-KOH의 재부유

DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(각 11㎎)은 인산염 완충식염수(5.5㎖)에 부유시킨다. 샘플은 실온에서 다양한 시점에서 Virtis 프로브 소니케이터로 초음파 파쇄한다(미니-프로브, 15% 산출). 이후, 샘플은 60초동안 볼텍스하고 5분동안 방치하여 큰 입자를 침강시킨다. 600nm에서 잔류 현탁액의 흡수도를 측정한다. 도6에서 보인 바와 같이, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(도6에서, DDMV-KOH)는 1분간의 초음파파쇄이후 완전히 재부유되는데, 추가로 초음파파쇄하여도 흡수도는 더 이상 증가하지 않는다. 5분간의 초음파파쇄후, DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae)(도6에서, DDMV)의 재부유는 상기 현탁액의 흡수도에서 판단할때 여전히 불완전하다. 이들 결과는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH 가 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)보다 훨씬 높은 가용성을 보인다는 것을 시사한다.

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 단백분해효소 K 가수분해

상기 과정은 대부분의 다른 물질은 원상태로 유지시키면서 단백질과 펩티드를 절단하기 위한 것이다.

실시예 1에서 밝힌 대로 만든 100㎎ DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 초음파파쇄하여 9㎖ 물에 부유시킨다. 황산도데실나트륨(SDS)은 1%w/v 최종농도로 첨가하고, 단백분해효소 K는 100㎍/㎖ w/v 최종 농도로 첨가한다. 반응 혼합물은 16시간동안 50℃에 배양된다. 산물은 원심분리로 수거하고, 인산염 완충식염수로 세척하고, 동결건조시킨다. 산출물은 59㎎(59%) 단백분해효소 K-처리된 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(EVac)이다.

KOH-처리된 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 수화불소산 가수분해

상기 과정은 대부분의 다른 물질은 원상태로 유지시키면서 무수성 수화불소산 가수분해에 취약한 결합, 예를 들면 글리코시드 결합을 절단하기 위한 것이다.

전술한 바와 같이 만든 1g DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH는 자유-라디컬 소거제로 아니솔을 함유하는 15㎖ 액체 플루오르화 수소에 부유시킨다. 혼합물은 1시간동안 교반하면서 0℃에 배양한다. 플루오르화 수소(HF)는 증류로 제거하고, 고형 잔류물은 디에틸 에테르로 세척하여 아니솔을 제거한다. 생성된 산물은 물로 추출하여, 수용성과 비수용성 분취물을 산출한다. 산출물은 250㎎(25%) 수용성 물질과 550㎎(55%) 비수용성 HF-가수분해된 KOH-처리된 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(HVac)이다.

실시예 3

생쥐에서 천식에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )와 유도체 예방주사의 효과

알레르기 면역 반응의 발생을 저해하는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 및 이의 유도체의 능력은 천식-유사 알레르기원 특이적 폐질환의 생쥐 모델에서 검사한다. 이런 알레르기 질환의 중증도는 기도에 축적되는 다수의 호산구로 반영된다.

BALB/cByJ 생쥐는 0일과 14일째 복강 루트로 2㎎ 칼륨명반 어쥬번트에 녹인 2㎍ 난알부민을 투여하고, 이후 28일째 비강 루트로 50㎕ 인산염 완충식염수(PBS)에 녹인 100㎕ 난알부민을 투여한다. 생쥐의 기도에 축적된 호산구는 마취된 생쥐의 기도를 식염수로 세척하여 검출하고, 세척액(기관지폐포 세척액 또는 BAL)을 수거하고, 호산구의 수를 계산한다.

DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae) 유도체는 전술한 바와 같이 만든다. 10마리 생쥐군은 난알부민의 비강 자극 1주일전에, 200㎍의 PBS, DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae)유도체(Q1:DD-M. vaccae; Q2:DD-M. vaccae-KOH; Q3:DD-M. vaccae-산; Q4:DD-M. vaccae-과요오드산염; Q6과 P6:DD-M. vaccae-KOH-과요오드산염; P5:DD-M. vaccae-KOH-산)중의 하나를 투여한다. 도3에 보인 바와 같이, 대조군 생쥐에 비하여 난알부민 자극 6일후에 수거된 BAL 세포의 호산구 퍼센트에서 통계학적으로 유의성있는 감소가 관찰되었다. 또한, 상기 데이터는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산과 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-과요오드산염(Q3, Q6, P6)의 기도 호산구증가증 억제가 DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae)(Q1)에 의해 달성되는 억제보다 크다는 것을 보여준다. 도3에서 데이터는 생쥐군당 평균±SEM으로 나타낸다.

호산구는 알레르기성 천식에서 기도에 두드러지게 나타나는 혈세포다. 호산구의 분비산물은 알레르기성 천식에서 기도 점막벽의 종기와 염증의 원인이 된다. 도3에서 보인 데이터는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 또는 이의 유도체를 활용한 치료가 폐 호산구의 축적을 감소시켜 기도, 비강 점막, 상부 호흡관에서 호산구와 관련된 염증을 줄이는데 효과적이라는 것을 시사한다. 따라서, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 또는 이의 유도체를 투여하여, 천식 및 유사한 면역적 비정상과 관련된 질환(예, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 습진)의 중증도를 감소시킬 수 있다.

또한, 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae)를 예방주사한 생쥐로부터 혈청 샘플을 수거하고, 표준 효소-면역흡착법(EIA)으로 난알부민에 대한 항체의 수준을 측정한다. 하기 표2에서 보인 바와 같이, BCG로 감염된 생쥐의 혈청은 PBS 대조군의 혈청보다 더 높은 수준의 난알부민-특이적 IgG1을 보유한다. 대조적으로, 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)를 예방주사한 생쥐는 유사한 또는 더 낮은 수준의 난알부민-특이적 IgG1을 보유한다. IgG1 항체가 Th2 면역 반응의 특징이라는 점에서, 이들 결과는 천식-유도성 Th2 면역 반응에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 억제 효과와 일치한다.

가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)로 예방주사한 생쥐에서 낮은 항원-특이적 IgG1 혈청 수준

처리군	혈청 IgG1
	평균	SEM
M. vaccae i.n.	185.00	8.3
M. vaccae s.n.	113.64	8.0
DD-M. vaccae i.n.	96.00	8.1
DD-M. vaccae s.n.	110.00	4.1
BCG, Pasteur	337.00	27.2
BCG, Connaught	248.00	46.1
PBS	177.14	11.4

실시예 4

THP-1 세포에서 IL-10 생산에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 유도체의 효과

IL-10은 Th1 세포의 사이토킨 생산을 저해하고, 피부에서 실험적으로-유도된 염증 반응의 억제에 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Berg et al., J. Exp. Med. 182:99-108, 1995). 최근에 IL-10은 건선 환자를 치료하기 위한 2번의 임상 실험에 성공적으로 사용되었다(Reich et al., J. Invest. Dermatol. 111:1235-1236, 1998 and Asadullah et al., J. Clin. Invest. 101:783-794, 1998). DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체 존재하에 배양된 사람 단구성 세포주(THP-1)에 의해 생산된 IL-10의 수준은 다음과 같이 평가한다.

THP-1 세포(ATCC 번호 TIB-202)는 0.5㎎/ℓ 스트렙토마이신, 500U/ℓ페니실린 2㎎/ℓL-글루타민, 5x10^-5Mβ-멀캡토에탄올, 5% 우태아혈청(FBS)로 보충한 RPMI배지(Gibco BRL Life Technologies)에서 배양한다. 분석 하루전, 세포는 5x10⁵세포/㎖로 새 배지에 계대배양한다. 세포는 24시간동안 5% CO₂를 함유하는 습식 대기에서 37℃로 배양하고, 이후 흡인하고 50㎖ 배지로 원심분리하여 세척한다. 세포는 5㎖ 배지에 재부유시키고, 세포 농도와 생존율은 트립탄 블루(Sigma, St Louis MI) 염색으로 측정하고, 혈구계수기로 분석한다. 50㎕ PBS에 녹인 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체(전술한 바와 같이 만듦)와 대조군 촉진물질은 100㎕ 배지를 함유하는 96 웰 평판의 웰에 삼중으로 첨가하고, 적절히 희석한다. 리포폴리사카라이드(LPS)(300㎍/㎖; Sigma)와 PBS는 대조군으로 한다. 각 웰에, 2x10⁶세포/㎖ 농도로 100㎕ 세포를 첨가하고, 평판은 24시간동안 5% CO₂를 함유하는 습식 대기에서 37℃로 배양한다. 각 웰에서 IL-10의 수준은 제조업자의 프로토콜에 따라, 사람 IL-10 ELISA 시약(PharMingen, San Diego CA)으로 측정한다. 도4에 보인 바와 같이, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 산과 과요오드산염 유도체는 IL-10 생산 수준을 현저하게 촉진한다. PBS 대조군, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-과요오드산염, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-산 유도체는 IL-10을 생산하는 THP-1 세포를 촉진하지 않는다.

실시예 5

생쥐에서 결핵에 대한 미코박테리움 바카이( M. vaccae )와 DD-미코박테리움바카이(DD- M. vaccae ) 예방주사의 효과

본 실시예는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 자극에 앞서, 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 예방주사의 효과를 설명한다.

생쥐는 개별적으로 3주동안 2가지 경우에 대하여 다음의 제형중 하나를 복강에 주사한다:

(a) 인산염 완충식염수(PBS, 대조군);

(b) 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(500㎍);

(c) DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(50㎍).

마지막 복강 예방주사 3주후에, 생쥐는 5x10⁵살아있는 H37Rv 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 감염시킨다. 다시 3주후에, 생쥐는 죽이고, 이들의 비장은 균질화시켜 감염 중증도의 지표인 콜로니 형성 유니트(CFU)에 대하여 분석한다.

도5는 각 포인트가 개별 생쥐를 나타내는 데이터를 도시한다. PBS 단독 주사한 대조군 생쥐에서 얻은 CFU 수치는 기저수준으로 한다. 실험 생쥐에서 얻은 모든 데이터는 대조군 생쥐에 대한 기저수준이하 CFU의 로그 수치로 나타낸다(또는 로그 보호). 도5에 보인 바와 같이, 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)로 면역된 생쥐는 각각 >1 또는 0.5 로그 CFU의 평균 감소를 보였다. 상기 데이터는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 예방주사의 효능을 입증하고, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)를 결핵에 대한 백신으로 개발할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 6

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )와 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 유도체의 조성 분석

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )와 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 유도체의 탄수화물 조성 분석

DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체의 탄수화물 조성은 표준 기술을 활용하여 측정한다. 표3에 결과를 도시하는데, 여기서 DDMV는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)를; DDMV-KOH는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH를; DDMV-A는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산을; DDMV-I는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-과요오드산염을; DDMV-KOH-A는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-산을; DDMV-KOH-I는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-과요오드산염을 나타낸다.

상기 결과는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체가 세포의 산, 과요오드산염 또는 알칼리 처리의 상이한 효과에서 예측한대로 상이한 탄수화물 함량을 갖는다는 것을 입증한다. 또한, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체와 비교할 때, 현저하게 상이한 탄수화물 조성을 갖는다. 예상대로, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산과 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-과요오드산염 유도체에서 갈락토오스 함량은 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH보다 적다. 이들 수치는 유도체의 제조에서, 펩티도글리칸 골격으로부터 아라비노갈락탄 측쇄를 절단하는 산과 과요오드산염의 작용을 반영한다.

DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )와 DD-미코박테리움 바카이(DD- M.vaccae ) 유도체의 핵산 분석

단백분해효소 K로 처리한 이후, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체의 핵산 함량에 대한 겔 전기영동 분석에서 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-과요오드산염, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH는 소량의 DNA를 함유하는 반면, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산에서는 검출가능한 핵산이 관찰되지 않는다는 것을 알 수 있다.

실시예 7

대식세포에 의한 IL-12 생산에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 유도체의 효과

Th1 면역 반응의 촉진은 대식세포로부터 인터루킨-12(IL-12)의 생산에 의해 강화된다. IL-12 생산을 촉진하는 상이한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 제형의 능력은 다음과 같이 입증한다.

BALB/cByJ 생쥐군은 티오글리콜레이트(Difco Laboratories, Detroit, MI)를 복강에 주사하였다. 3일후, 복막 대식세포를 수거하고 4시간동안 IFN-(2U/㎖)를 함유한 세포 배양액에 둔다. 세포는 110㎎/ℓ 피루베이트, 116㎎/ℓL-아르기닌, 36㎎/ℓ L-아스파라긴, 6㎎/ℓ포름산, 0.5㎎/ℓ스트렙토마이신, 500U/ℓ페니실린, 2㎎/ℓL-글루타민, 5x10^-5M 2-멀캡토에탄올, 5% 우태아혈청(FBS)으로 보충하고 2x10⁶세포/㎖ 최종 농도로 조정한 50㎖ 냉각 DMEM 배지(Gibco Life Technologies,Gaithersburg MD)에서 3회 세척한다. 다양한 농도의 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)(도7에서 RI), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH(도7에서 R2), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산(도7에서 R3), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-과요오드산염(도7에서 R4), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-산(도7에서 R5), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-과요오드산염(도7에서 P6)을 첨가한다. 각 웰에, 0.1㎖의 IFN--처리된 대식세포를 2x10⁶세포/㎖ 최종 농도로 첨가한다. 37℃에서 24시간동안 추가 배양한 이후, 세포 상층액은 수거하고 대식세포에 의해 생성된 IL-12의 존재를 분석한다. DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체로 촉진한 대식세포에 의한 IL-12 생산 수준은 도7에 도시한다. 상기 데이터는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체로 촉진한 대식세포에 의한 IL-12 생산이 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 거의 동일한 수준임을 시사하는데, 상기 유도체에서 IL-12 생산을 적게 유도하는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-KOH-산은 제외한다.

실시예 8

생쥐에서 상이한 용량의 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 유도체 예방주사의 효과

본 실시예는 폐에서 알레르기성 면역 반응의 발생에 대한 상이한 용량의 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체 예방주사의 효과를 설명한다. 이는 천식-유사 알레르기원-특이적 폐질환의 생쥐 모델에서 확인한다. 이런 알레르기 질환의 중증도는 기도에 축적되는 다수의 호산구로 반영된다.

BALB/cByJ 암컷 생쥐는 0일과 7일째 10㎍ 난알부민(OVA)과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 14일과 21일째, 생쥐는 마취시키고 200㎍의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 또는 PBS를 비강 또는 피내에 예방주사한다. 28일과 32일째, 생쥐는 마취하고 100㎍ OVA를 비강에 자극한다. 생쥐는 35일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도8에 보인 바와 같이, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산은 약량-의존 방식으로 기도 호산구증가증(호산구%)을 현저하게 억제하는데, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 용량을 증가시킬수록 더 높은 수준의 억제가 관찰된다.

실시예 9

생쥐에서 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ) 유도체 예방주사의 경로 효과

본 실시예는 천식-유사 알레르기원-특이적 폐질환의 생쥐 모델에서 기도 호산구증가증의 억제에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체 예방주사의 상이한 경로 효과를 설명한다.

BALD/cByJ 암컷 생쥐는 0일과 7일째 10㎕ 난알부민(OVA)과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 14일과 21일째, 생쥐는 마취시키고 200㎕의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 또는 PBS를 비강 또는 피내에 예방주사한다. 생쥐는 35일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PSB를 이용하여 실시한다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도9에서 보인 바와 같이, 대조군 생쥐에 비하여 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산을 비강 면역주사한 생쥐로부터 난알부민 자극 6일후에 수건된 BAL 세포에서 호산구%의 현저한 감소가 관찰된다. 또한, 상기 데이터는 비강으로 투여된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산에 의한 기도 호산구증가증 억제가 피내 투여된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산에 의한 기도 호산구증가증 억제보다 더 크다는 것을 보여준다. 대조군 생쥐는 PBS를 비강 투여한다. 도9에서 데이터는 생쥐군당 평균 ±SEM으로 나타낸다.

실시예 10

지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-( M. tuberculosis )와 미코박테리움 스메그마티스(DD- M. smegmatis )의 준비 및 조성 분석

미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-( M. tuberculosis )와 미코박테리움 스메그마티스(DD- M. smegmatis ) 배양 여과물

미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)(ATCC 27199) 배양물은 1% 글루코스 첨가된 배지90에서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 대하여 실시예 1에서 밝힌 바와 같이 성장시킨다. 5일동안 37℃에서 배양한 이후, 세포는 원심분리로 수거하고, 배양 여과물은 옮긴다. 박테라아 펠렛은 ㎖당 10¹⁰미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)에 해당하는 10㎎/㎖ 농도로 인산염 완충식염수에 재부유시킨다. 이후, 세포 현탁액은 120℃에서 15분동안 가압멸균한다. 배양 여과물은 0.45㎛ 필터에 통과시키고 멸균 병에 모은다.

미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 균주 H37Rv(ATCC 번호 27294)의 배양물은 GAS 배지(0.3g 박토카시톤(Difco Laboratories, Detroit MI), 0.05g 시트르산철암모늄, 4g K₂HPO₄, 2g 시트르산, 1g L-알라닌, 1.2g MgCl₂.6H₂O, 0.6g K₂SO₄, 2g NH₄Cl, 1.8㎖ NaOH (10N), 5㎖ 글리세롤, pH 7.0)에서 37℃로 5일동안 성장시킨다. 세포의 수거 및 추가적인 처리는 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)에 대하여 전술한 바와 동일하다.

지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD- M. tuberculosis )와 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 스메그마티스(DD- M. smegmatis )의 준비 및 조성 분석

지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)를 준비하기 위해, 가압멸균한 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)를 원심분리하여 펠렛하고, 상기 펠렛은 물로 세척하고 원심분리하여 다시 수거하고, 냉동 건조시킨다. 이런 냉동 건조된 미코박테리움튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)는 각각, 동결 건조된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)라고 한다. 실험에서 사용할 경우 동결 건조된 물질은 원하는 농도로 PBS에 재부유시킨다.

지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 준비를 위하여 실시예 1에서 밝힌 바와 동일하게 준비한다. 생물분석을 위해, 동결 건조된 DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)는 초음파분쇄하여 인산염-완충된 염에 재부유시키고, 가압멸균하여 살균시킨다.

DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)의 조성 분석은 표4와 5에 제시한다. DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 단당류 조성과 비교할 때, DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)의 단당류의 일부 성분에서 큰 변화가 관찰된다. 표4에 제시한 데이터에서 DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 28.1몰%에 비하여, 각각 1.3%와 0.0몰% 글루코오스를 함유한다는 것을 알 수 있다.

DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)의 아미노산 조성은 표5에 제시한다. DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)는 6537.9nmoles/㎎(약 78.5%w/w) 아미노산을 함유하고, DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)는 6007.7nmoles/mg 아미노산(약 72.1%w/w 단백질)을 함유한다. 표1에 제시한 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 아미노산 분석과 비교할 때, DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(55.1%)보다 더 많은 총 단백질%를 보유한다.

실시예 11

생쥐에서 천식에 대한 DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD- M. tuberculosis )와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD- M. smegmatis ) 예방주사의 효과

알레르기 면역 반응의 발생을 저해하는 DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)의 능력은 실시예 8에서 밝힌 바와 같이, 천식-유사 알레르기원 특이적 폐질환의 생쥐 모델에서 검사한다. 결과는 기도에서 호산구증가증 억제에 대한 DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis) 예방주사의 효과 및 이들의 면역 조절 특성을 입증한다.

BALB/cByJ 암컷 생쥐는 0일과 7일째 10㎍ 난알부민과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 13일과 21일째, 생쥐는 마취시키고 200㎍의 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis), DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis) 또는 PBS를 비강 또는 피내에 예방주사한다. 28일과 32일째, 생쥐는 마취하고 100㎍ OVA를 비강에 자극한다. 생쥐는 35일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도10에 보인 바와 같이, DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis) 처리는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 예방주사에 따른 감소와 유사하게 폐 호산구의 축적을 감소시키고, 따라서 DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis)는 기도, 비강 점막, 상부 호흡관에서 호산구증가증과 관련된 염증을 줄이는데 효과적일 수 있다. 따라서, DD-미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis)와 DD-미코박테리움스메그마티스(DD-M. smegmatis)의 투여는 천식 및 유사한 면역적 비정상을 보이는 질환(예, 알레르기성 비염)의 중증도를 감소시킬 수 있다.

실시예 12

사람 말초혈 단핵구 세포에서 IL-10, TNF-알파, IFN-감마의 생산에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )의 효과

본 실시예는 사람 말초혈 단핵구 세포(PBMC)에서 사이토킨 생산을 촉진하는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 능력을 조사한 것이다.

사람 혈액은 PBMC와 비-유착 세포로 분리하고, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 자극이후 각 분취물의 사이토킨 보호는 다음과 같이 측정한다. 혈액은 동일 부피의 식염수로 희석하고, 10㎖ Ficoll(Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD)에 15-20㎖ 층을 구성한다. 림프구 층은 20분동안 1,800rpm으로 원심분리한 이후 떼어내고, RPMI 배지(Gibco BRL)에서 3회 세척하고, 트립판 블루를 활용하여 계수한다. 세포는 5% 가열-불활화된 자가혈청을 함유하는 RPMI에서, 2x10⁶/㎖ 농도로 재부유시킨다. 세포 샘플은 분리하여 비-유착 세포를 준비한다.

비-유착 세포는 5% CO₂를 함유하는 습식 대기에서 혈청(상기와 동일)으로 보충한 RPMI에서 20㎖ 림프구를 1시간동안 배양하여 준비한다. 비-유착 세포는 새 플라스크에 옮기고, 한번 더 배양한다. 비-유착 세포는 떼어내고, 계수하고, RPMI 보충배지에서 2x10⁶/㎖ 농도로 재부유시킨다. DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 연속 희석은 200㎍/㎖로 시작하고, 96-웰 평판에서 100㎖ 배지(보충된RPMI)에 첨가한다. PBMC와 비-유착세포는 웰(100㎕)에 첨가하고, 평판은 5% CO₂를 함유하는 습식 대기에서 48시간동안 37℃에서 배양한다. 각 웰로부터 150㎕씩 빼내고, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 자극이후 상이한 세포에 의해 생산된 사이토킨의 함량을 측정한다.

DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는 PBMC를 자극하여 TNF-α와 IL-10(각각, 도11과 12A)을 분비하고, 비-유착세포를 자극하여 IFN-(도12B)를 생산한다. 이들 데이터는 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)-자극한 PBMC에서 IFN-생산이 IL-10의 동시 분비에 의해 저해된다는 것을 암시한다.

실시예 13

가열-사멸된 미코박테리움 바카이( M. vaccae )와 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae )에 의한 세포의 활성화

사람 T세포와 자연 킬러(NK) 세포를 활성화시키는 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)의 능력은 다음과 같이 검사한다.

사람 말초혈 단핵구 세포(PBMC)는 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 함께 24시간동안 5x10⁶/㎖ 농도로 배양한다. 이후, 배양된 세포는 활성화된 세포에 의해 발현되는 분자인 CD69에 대한 단클론 항체와 결합하는 CD56(NK 세포에 대한 마크), αβT세포 또는δT세포에 대한 단클론 항체로 염색한다. 그 다음, 세포는 유세포분석법으로 분석한다.CD69를 발현하는 세포의 퍼센트는 표6에 제시한다.

가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)에 의한 사람 T 세포와 NK 세포의 활성화

	αβT세포	δT세포	NK 세포
대조군	3.8	6.2	4.8
가열-사멸된M. vaccae	8.3	10.2	40.3
DD-M. vaccae	10.1	17.5	49.9

이들 결과는 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)가 NK 세포를 비롯하여 αβT세포와δT세포를 활성화시킨다는 것을 시사한다.

Holt와 Sly의 최근 연구(Nature Medicine5:1127-1128, 1999)에 따르면, 천식에서δT세포는 정상적인 기도 반응성을 유지하는데 중요하고,δT세포-매개된 손상에 대한 기도 상피의 "회복" 반응을 조절함으로써 알레르기원 자극에 대한 기도 반응성을 하향 제어한다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)는δT세포를 활성화시킬 수 있어,δT세포가 발견되는 신체, 예를 들면 기도, 폐, 피부, 소화관의 병든 부위에서 정상 상피를 회복시키는데 효과적일 것으로 생각된다.

실시예 14

생쥐에서 천식에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD- M. vaccae ), DD-미코박테리움 바카이( M. vaccae )-산, Hvac, Evac 예방주사의 효과

본 실시예는 폐에서 알레르기 면역 반응의 발생에 대한 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 유도체인 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산, Hvac, Evac 예방주사의 효과를 설명한다. 이는 천식-유사 알레르기원 특이적 폐 질환의 생쥐 모델에서 입증한다. 이런 알레르기 질환의 중증도는 기도에 축적되는 다수의 호산구로 반영된다.

BALB/cByJ 암컷 생쥐는 0일과 7일째 10㎍ 난알부민과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 14일과 21일째, 생쥐는 마취시키고 200㎍의 DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산, Hvac, Evac 또는 PBS를 비강 또는 피내에 예방주사한다. 28일과 32일째, 생쥐는 마취하고 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 자극한다. 생쥐는 35일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도13에 보인 바와 같이, DD-미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae), Hvac, Evac는 기도 호산구증가증을 현저하게 억제하였다(호산구%로 표시).

실시예 15

OVA 자극이후 투여된 DD-미코박테리움 바카이( M. vaccae )-산에 의한 기도 호산구증가증의 억제

본 실시예는 천식-유사 알레르기원 특이적 폐 질환의 생쥐 모델에서 입증된바와 같이, 폐에서 알레르기성 면역 질환의 발생에 대한 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 효과를 설명한다. DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산은 심한 기도 호산구증가증을 유발하기 위한 OVA 자극 3일후에 투여한다.

BALB/cByJ 암컷 생쥐(군당 10마리)는 0일과 7일째 10㎍ 난알부민과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 14일과 18일째, 생쥐는 마취시키고 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 자극한다. 21일째, 생쥐는 다시 마취하고 200㎍의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산을 비강에 투여한다. 생쥐는 25일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. 대조군 생쥐는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 대신에 PBS를 투여하고, 이후 실험 생쥐와 동일한 처리섭생을 따른다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도14에 보인 바와 같이, 기도 호산구증가증의 현저한 억제(호산구%로 표시)가 관찰되는데, 이는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 치료효과를 입증한다. PBS-와 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산-처리된 생쥐 모두에서, 2번의 OVA-자극간의 시간 간격이 증가함에 따라 기도 호산구증가증의 중증도가 감소하였다. 또한, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산은 사용된 3개 생쥐군 모두에서 호산구% 수치의 통계학적으로 유의성있는 억제를 보였다. 상기 데이터는 기도 호산구증가증 유도이후에 투여된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산이 치료요법적 효과를 나타낸다는 것을 입증한다.

실시예 16

OVA 자극직전에 투여된 DD-미코박테리움 바카이( M. vaccae )-산에 의한 기도 호산구증가증의 억제

본 실시예는 천식-유사 알레르기원 특이적 폐 질환의 생쥐 모델에서 심한 기도 호산구증가증을 유발하기 위한 2번의 OVA 자극 하루전에 1회 또는 2회 투여한 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 치료요법적 효과를 설명한다.

2군의 BALB/cByJ 암컷 생쥐는 0일과 7일째 10㎍ 난알부민과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 14일째, 생쥐는 마취시키고 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(200㎍)를 비강 투여한다. 15일째, 생쥐는 마취시키고 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 자극한다. I군 생쥐는 19일째 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 2차 자극한다. II군 생쥐는 18일째 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산(200㎍)을 2차 투여하고, 19일째 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 2차 자극한다. 양 군의 생쥐는 22일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. 2군의 대조군 생쥐는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 대신에 PBS를 투여하고, 이후 실험 생쥐와 동일한 처리섭생을 따른다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도15에 보인 바와 같이, 기도 호산구증가증의 통계학적으로 유의성있는억제(p=0.0000015)가 관찰되는데, 이는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 치료효과를 입증한다. 1번의 자극에 앞서 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산-처리된 생쥐에서, 호산구가 20% 감소한다. 2번의 자극에 앞서 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산-처리된 생쥐에서 기도 호산구증가증의 억제가 향상되는데, 여기서 호산구% 수치는 40% 감소한다.

실시예 17

OVA 자극이후에 투여된 DD-미코박테리움 바카이( M. vaccae )-산에 의한 기도 호산구증가증의 억제

본 실시예는 천식-유사 알레르기원 특이적 폐 질환의 생쥐 모델에서 폐에서 알레르기성 면역반응의 발생에 대한 OVA 자극 3일전 2번의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 예방주사의 치료요법적 효과를 설명한다.

3군의 BALB/cByJ 암컷 생쥐는 0일과 7일째 10㎍ 난알부민과 1㎎ 칼륨명반 어쥬번트를 함유하는 200㎕ 에멀젼을 복강 주사하여 난알부민에 감작화시킨다. 14일째, 생쥐는 마취시키고 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 자극한다. 18일째, 생쥐는 다시 마취시키고 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산(200㎍)을 비강 투여한다. I군 생쥐는 21일(1차 자극 7일후)째 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA를 비강에 2차 자극한다. 이들 생쥐는 24일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. II군 생쥐는 25일(1차 자극 11일후)째 OVA로 2차 자극하고, 28일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. III군 생쥐는 25일째 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산(200㎍)을 2차 투여한다. 이들 생쥐는28일(1차 자극 14일후)째 50㎕ PBS에 녹인 100㎍ OVA로 2차 자극하고, 31일째 죽이고, 기관지폐포 세척(BAL)은 PBS를 이용하여 실시한다. 3군의 대조군 생쥐는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산 대신에 PBS를 비강 투여하고, 이후 실험 생쥐와 동일한 처리섭생을 따른다. BAL 세포 샘플은 유세포분석법으로 분석하여, 호산구 함량(호산구%)을 결정한다. BAL 호산구 총수는 수득된 백혈구 총수로 호산구%수치를 곱하여 얻는데, 상기 백혈구 총수는 혈구계수기로 측정한다.

도16에 보인 바와 같이, 기도 호산구증가증의 통계학적으로 유의성있는 억제(호산구%로 표시)가 관찰되는데, 이는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 치료효과를 입증한다. PBS-와 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산-처리된 생쥐 모두에서, 2번의 OVA-자극간의 시간 간격이 증가할수록 기도 호산구증가증의 중증도가 감소한다. 또한, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산은 3가지 프로토콜 모두에서 호산구% 수치의 통계학적으로 유의성있는 억제를 보인다.

1차 자극 4일후 및 2차 자극 3일후(자극 지연 = 7일) DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산으로 처리한 생쥐에서, 기도 호산구증가증은 약 15% 감소한다(I군; p=0.034). 2차 자극이 4일 더 지연되면, 약간 더 높은 수준의 억제(대략 25%)가 관찰된다(II군; p=0.036). 2차 자극에 앞서 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산으로 2번 처리한 생쥐에서, 기도 호산구증가증은 56% 억제된다(III군; p=0.0000027). 상기 데이터는 기도 호산구증가증 유도후에 투여된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)-산의 치료요법적 효과를 보여준다.

본 발명은 설명목적으로 다소 자세하게 기술하였지만, 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 개변을 실시할 수 있고, 본 발명은 첨부된 청구항으로만 한정한다.

Claims

다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물:

(a) 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-Mycobacterium vaccae) 세포;

(b) 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(c) 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(d) 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(e) 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(f) 단백분해효소 K로 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(g) 수화불소산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포.
제 1항에 있어서, 성분은 전체 탄수화물의 9.7% 미만 함량으로 갈락토스를함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 성분은 전체 탄수화물의 3.7% 이상 함량으로 글루코사민을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 성분은 처리되지 않은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 비교하여 미콜산이 없는 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 성분은 처리되지 않은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 비교하여 아라비노갈락탄이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 성분은 처리되지 않은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 비교하여 단백질이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 성분은 처리되지 않은 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)와 비교하여 글리코시드 결합이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 어쥬번트를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
환자에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제1항에 따른 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 구성되고, 상기 질환은 호흡기 질환과 알레르기 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 질환은 미코박테리아 감염, 천식, 유육종증, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 폐암에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 호흡기 질환은 천식인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 호흡기 질환은 호흡기 조직에서 호산구증가증으로 특징지어지는 것을 특징으로 하는 방법.
환자에서 호산구증가증을 감소시키는 방법에 있어서, 제 1항에 따른 조성물을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
IL-10 생산을 강화하는 방법에 있어서, 다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(b) 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(c) 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(d) 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(e) 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(f) 단백분해효소 K로 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포.
제 14항에 있어서, 조성물은 어쥬번트를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
환자에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(b) 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae) 세포;

(c) 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(d) 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(e) 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(f) 단백분해효소 K로 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

여기서, 질환은 죽상동맥경화증, 암, 고콜레스테롤혈증, 박테리아 감염, 인슐린-의존 당뇨병에서 선택된다.
제 16항에 있어서, 조성물은 어쥬번트를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 성분은 전체 탄수화물의 9.7%미만 함량으로 갈락토스를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 성분은 전체 탄수화물의 3.7% 이상 함량으로 글루코사민을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물:

(a) 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아(mycobacterial) 세포;

(b) 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아 세포;

(c) 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아 세포;

(d) 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아 세포;

(e) 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아 세포;

(f) 단백분해효소 K로 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아 세포;

(g) 수화불소산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리아 세포.
제 20항에 있어서, 미코박테리아 세포는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
환자에서 호흡기 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제20항에 따른 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 조성물은 다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 튜베르쿨로시스(DD-M. tuberculosis);

(b) 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 스메그마티스(DD-M. smegmatis).
제 22항에 있어서, 호흡기 질환은 미코박테리아 감염, 천식, 유육종증, 알레르기성 비염, 폐암에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 호흡기 질환은 천식인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 호흡기 질환은 호흡기 조직에서 호산구증가증으로 특징지어지는 것을 특징으로 하는 방법.
환자에서 αβT세포,δT세포 또는 NK 세포를 활성화시키는 방법에 있어서, 다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포;

(b) 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(c) 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(d) 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(e) 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(f) 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(g) 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포.
환자에서 상피세포를 회복시키는 방법에 있어서, 다음에서 선택되는 성분중 적어도 하나를 함유하는 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 가열-사멸된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포;

(b) 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(c) 알칼리 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(d) 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(e) 과요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M.vaccae) 세포;

(f) 알칼리 가수분해 및 산 가수분해 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포;

(g) 알칼리 가수분해 및 요오드산 처리된 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae) 세포.