CN100529059C - 一种促进动物生长的口服重组dna疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因疫苗制备技术领域，具体涉及一种促进动物生长的口服重组DNA疫苗的制备及应用。本发明包含一种细胞因子GMCSF的克隆，然后将其融合插入到现有生长抑素质粒pcS/2SS中，得到融合表达质粒pGMCSF-SS，将该融合表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中，得到具有促进动物生长的口服重组DNA疫苗。含有融合表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌CSO22/pGMCSF-SS，保藏在CCTCC，其保藏号为CCTCC M206141。本发明还公开了所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌在制备促进动物生长的口服重组DNA疫苗中的应用。

Description

一种促进动物生长的口服重组DNA疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种促进动物生长的口服重组DNA疫苗及应用。

背景技术

动物生长是遗传、营养、环境和激素调节等因素综合影响的结果，其中加强品种改良、提供全价营养及提供适宜的环境已成为提高动物生产性能的行之有效的途径，但其作用最终是通过神经内分泌的整合、调控得以实现。目前，通过改变激素分泌以调控动物生长是当前研究的热点之一。随着激素免疫学的兴起与发展，激素免疫中和技术(Hormone Immunoneutralization，HIN)应运而生，即主动诱导或被动输入抗激素抗体以中和内源性激素的生物活性。动物的生长是一个复杂的生理过程，形成了以生长激素为核心的生长轴，生长激素(Growth Hormone，GH)可以调节机体的营养分配，促进骨骼生长，促进蛋白质合成和减少脂肪沉积，GH的生成、释放受到下丘脑生长激素释放因子(Growth Hormone Release Factor，GHRF)和生长抑素(Somatostatin，SS)的双重调节，GHRF促进GH的分泌，机体内SS的浓度与生长速度间存在着显著的负相关，从而提示了可以通过降低体内SS的浓度来促进GH的释放。生长抑素(SS)是下丘脑释放的14肽激素，在动物体内具有广泛的抑制作用，特别是对生长及免疫反应具有明显的影响，促使许多学者致力于通过耗竭或免疫中和体内的SS水平相应提高GH等水平促进动物生长。SS与载体构建成抗原后，所产生的抗体与SS结合，能阻断SS与受体作用；同时在肝脏的作用下，加速循环中SS的清除，从而促进GH等多种激素的释放。早在1981年Spencer等将合成肽SS联接于人α-球蛋白，制成复合抗原(合成肽疫苗)，免疫3周龄绵羊，试验组生长速度是对照组的17.6％，证实了SS主动免疫能够促进动物生长。SS免疫羔羊的采食量降低10％，但饲料转化率提高14％，羔羊16周即达30kg屠宰体重，而对照羔羊则需20周(Spencer GSG等，Increased growth in lambs following auto-immunization against somatostatin，Anim.Prod，1981，32：376-382)。曾义祥等化学合成了SS基因，并在大肠杆菌中成功地表达了β-半乳糖苷酶(β-gal)与SS的融合蛋白，用以制备SS基因工程苗(曾义祥等，生长抑制激素基因在大肠杆菌中的表达，遗传学报，1989(3)：282-288)。通过免疫大白鼠试验，取得了一定的增重效果，但由于从菌体中提取SS需用亲和层析法，因而生产成本较高。另外该基因工程疫苗由于一个分子只与一个β-gal分子相连，即一个载体分子上只有一个半抗原决定簇，免疫原性较差。刘永庆等利用大肠杆菌高效表达系统pET32，高效、稳定地表达了SS，获得了免疫原性较好的SS亚单位疫苗(刘永庆等，生长抑素(SS)基因在pET32表达系统中的高效表达，南京农业大学学报，2003，26(1)：61-65)。该融合蛋白具有较好的免疫原性与增重效果，但要作为疫苗推广应用，必须经过纯化过程，而该表达产物是以硫氧还原蛋白为载体，提纯较困难。另外，动物试验时的硫氧还原蛋白载体效应太强烈，也影响了该疫苗的推广应用(刘永庆等，生长抑素(SS)与硫氧还原蛋白(Thioredoxin)相融合生成的2种基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表达特性，中国兽医学报，2003，23(2)：172-176)。徐文忠等将SS与HBsAg的融合基因(HBsAg/SS)克隆到痘苗病毒表达质粒pGJP-5中，通过与痘苗病毒天坛株感染细胞内重组和蚀斑挑选技术获得含融合基因的重组病毒(VV-HBsAg/SS)(徐文忠等，生长抑素与乙肝表面抗原融合基因重组痘苗病毒的构建及其表达，南京农业大学学报，1992(3)：74-80)，它保持了痘苗病毒原有的感染性，表达的HBsAg/SS杂合颗粒具有SS的免疫原性。将VV-HBsAg/SS接种到鸡胚中培养，可生产出能表达HBsAg/SS的痘苗病毒活载体苗，再制成冻干粉，被命名为激生1号痘苗。该苗的不足之处在于重组痘苗病毒作为活载体苗直接免疫动物，初次免疫后，动物体内产生抗病毒体，再次免疫时病毒不能大量复制，影响免疫效果；其次还存在减毒病毒毒力回升的风险。为弥补此缺点，杜念兴等相继设计研制了生长抑素基因工程亚单位苗，先后构建了多株基因工程体，所制的疫苗分别简称激生2号苗和激生3号苗。随着基因疫苗的兴起，杜念兴等又根据基因疫苗的优点构建了生长抑素基因疫苗基因工程体，据报道其基因疫苗免疫后，表达质粒能在动物细胞内表达2-3月，不断分泌免疫原，诱导产生SS抗体，从而促进动物生长。但并未见到关于该DNA疫苗在仔猪上的应用，而且生产该疫苗需要大量提取质粒，提取过程中有可能存在内毒素清除不净而导致动物内毒素中毒等风险，另外肌肉注射易使动物产生较大的应激，不利于大动物的生长。

发明内容

本发明的任务在于克服现有生长抑素基因免疫技术的缺陷，研制一种简单、有效、安全的口服重组促生长DNA疫苗，以达到促进动物生长的目的。

本发明的目的具体包括：

本发明的第一个目的是获得GM-CSF与SS基因融合表达质粒。

本发明的第二个目的是获得含有上述融合表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌株。

本发明的第三个目的是获得促进动物生长的口服重组DNA疫苗。

本发明的第四个目的是将上述融合质粒应用于制备促进动物生长的口服重组DNA疫苗上。

本发明通过如下技术方案实施：

一种促进动物生长的基因疫苗的制备是首先克隆得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，编码该基因的质粒能增强DNA疫苗的免疫效果，然后将其融合插入到现有生长抑素质粒pcS/2SS中，得到融合表达质粒pGMCSF-SS，将该融合表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中，得到具有促进动物生长的口服重组DNA疫苗。在本发明中已经成功地应用于促进动物生长中，如在断奶仔猪中促进生长的应用。

本发明具体技术方案如下：

一、pGM-CSF质粒的构建

1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因克隆及序列分析

采取三元杂交猪(品种为杜长大，来源于江苏省农业科学院畜牧研究所)的外周血，提取单核细胞总RNA，采用常规的RT-PCR方法克隆猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(本申请人克隆的该基因序列已在GenBank登录，登录号为DQ108393)。GM-CSF的cDNA开放阅读框为435bp，编码144个氨基酸，与用作PCR模板的参考序列比较，其核苷酸的同源性为97.5％，氨基酸的同源性为95.1％。同绵羊、人、牛、小鼠和犬的GM-CSF序列比较，其核苷酸的同源性分别为86.2％、80.5％、81.7％、69.7％和81.8％，氨基酸的同源性分别为78.5％、71.3％、70.3％、55.9％和71.5％。

2、pGM-CSF质粒的构建

以pcDNA3.1(-)(购自Invitrogen公司)为质粒载体，构建猪GM-CSF基因真核表达质粒pGM-CSF(详细制备如实施例11.1所述)并测序。

二、GM-CSF与SS融合表达质粒的构建

1、GM-CSF编码基因的扩增

采用Primer5.0引物设计软件，根据已在GenBank登录的猪GM-CSF序列，设计上、下游引物(引物结构如实施例22.2所述)，以真核表达质粒pGM-CSF(如实施例1)为模板进行PCR获得GM-CSF基因，然后用QIAquick PCR Purification Kit纯化，定量备用。

3、GM-CSF与SS融合表达质粒的构建

将纯化、回收的GM-CSF基因片段和pcS/2SS分别进行EcoR I和XhoI双酶切，用低融点琼脂糖凝胶电泳分离回收GM-CSF目的片段和pcS/2SS大片段。4℃过夜连接后，用CaCl₂法制备新鲜感受态细菌DH5α用于重组质粒转化，之后筛选和鉴定阳性融合表达质粒pGMCSF-SS(见实施例2)，鉴定结果参见附图5。

三、疫苗的制备

1、质粒的转化

采用热休克法将上一步筛选得到的阳性克隆质粒pGMCSF-SS、原始质粒pcS/2SS和真核表达质粒pGM-CSF分别转化减毒鼠伤寒沙门氏菌(见实施例3和4)。

2、疫苗制备

取原始质粒pcS/2SS、真核表达质粒pGM-CSF和融合表达质粒pGMCSF-SS单菌落分别接种至LB液体培养基上，于37℃、150rpm振摇培养至OD₆₀₀0.3-0.4，4℃、1500g离心10min，弃上清，用灭菌的PBS溶液调整细菌浓度至10¹⁰CFU/mL，得到试验用的备用疫苗。

四、疫苗的免疫效力检验

选择40头断奶的品种为“长大”的二元杂交仔猪，随机分为4组，每组10头，公母各半，其中编号为1的组为对照组，编号为2-4的组分别口服以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的基因疫苗pcS/2SS、pGMCSF-SS和pGM-CSF+pcS/2SS，分析这些基因疫苗对断奶仔猪的生产性能、抗体水平、激素分泌和代谢物浓度的影响。结果显示，与对照组比较，pGMCSF-SS免疫组提高了仔猪的日增重和饲料利用率，分别为6.6％和15.7％。同时三个试验组均对SS的免疫产生了较强免疫应答。与对照组相比，生长抑素抗体P/N值均提高。2组、3组和4组血浆中GH的含量有升高的趋势，对照组GH的含量在整个实验期都比较平稳，第3组的GH含量总体上高于2组和4组(P＞0.05)。第2组IGF-I的含量一直处于较高的水平，第3组和4组在第2周后处于较低的分泌水平，第3组IGF-I分泌的峰值高于其它组的峰值。第1组、2组和4组T3的含量呈下降的趋势，而第3组呈上升之势，免疫后第8周，第3组的T3分泌水平显著高于2组和4组(P＜0.05)，与对照组差异显著。第1组T4的含量不断降低，而第2组、3组和4组有不断升高的趋势，2组和3组T4的分泌一直保持在较高的水平；免疫对仔猪葡萄糖和非酯化脂肪酸(NEFA)和尿素氮浓度无明显影响。

本发明克隆的GM-CSF基因可以提高SS基因疫苗的免疫效果，含有pGMCSF-SS质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌要优于含有pGM-CSF+pcS/2SS质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌共同免疫。用含有pGMCSF-SS质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服免疫断奶仔猪能产生较强的免疫应答，提高了GH、IGF-I的分泌水平，T3、T4一直保持较高的浓度，提高了断奶仔猪的日增重和饲料利用率。

附图说明

图1是本发明克隆的GM-CSF片断通过RT-PCR扩增的电泳图。

图2是本发明制备的pGM-CSF质粒酶切鉴定结果。

图3是本发明制备的融合表达质粒pGMCSF-SS构建技术路线图。

图4是本发明制备的DNA片段GM-CSF PCR扩增产物电泳图。

图5是本发明制备的融合表达质粒pGMCSF-SS酶切鉴定结果：图中各泳道表示如下：M.-DL2000；1.pGMCSF-SS/(HindIII+EcoR I)；2.pGMCSF-SS/(HindIII+XhoI)；3.pGMCSF-SS/(EcoR I+XhoI)。

图6是本发明的融合表达质粒pGMCSF-SS酶切鉴定结果。图中各泳道表示如下：M.-DL2000；1.pGMCSF-SS/(HindIII+EcoR I)；2.pGMCSF-SS/(HindIII+XhoI)；3.pGMCSF-SS/(EcoR I+XhoI)。

图7是本发明的口服重组DNA疫苗对各个阶段仔猪日增重的效应。

图8是本发明的口服重组DNA疫苗对各个阶段仔猪的饲料转化率的效应。

具体实施方式

实施例1真核表达质粒pGM-CSF的构建

1.1反转录与PCR扩增

采用RT-PCR试剂盒(参照宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒使用说明书)，取提取的细胞总RNA 1-2μg进行反转录，反应总体积10μL，其中含：

MgCl₂2μL

OligodT引物(2.5pmol/μL)0.5μL

dNTP Mixture(各10mM)1μL

RNA酶抑制剂(40U/μL)0.25μL

反转录酶(5U/μL)0.5μL

10×RT Buffer 1μL

RNase Free dH₂O使反应总体积10μL。

按以下条件进行反转录反应：30℃10min

                          42℃30min

                          99℃5min

                          5℃5min

反应1个循环。RT产物-20℃保存，备用。

将10μL反转录产物加入到40μL(其中含5×PCR Buffer 10μL，上、下游引物各0.5μL，Taq^TM酶0.25μL，最后加灭菌蒸馏水至40μL)的体系中，总体积为50μL。

按以下条件进行PCR反应：94℃变性2min，然后94℃变性30sec、59℃退火30sec、72℃延伸1min，35个循环后72℃再延伸7min。

最后，将PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳，以DL2000作为分子量标准，观察电泳结果。(见附图1)1.2酶切和连接用QIAquick PCR Purification Kit将PCR扩增产物回收和纯化(参照上海华舜生物有限公司生产的PCR产物纯化试剂盒使用说明书)。纯化后的PCR产物与表达载体pcDNA3.1(-)分别用EcoRI和XhoI双酶切。

酶切体系：10×H buffer 6μL

          GM-CSF(或pcDNA3.1)20μL

          EcoR I和XhoI分别为1.5μL

          ddH₂O至总体积60μL，

37℃，反应2-3h，酶切后用低融点琼脂糖凝胶电泳分离回收GM-CSF目的片段和pcDNA3.1(-)大片段。

然后按如下体系进行连接反应，连接目的片段和载体，连接体系为：

10×ligase buffer 2μL

GM-CSF 6μL

pcDNA3.1(-)5μL

T₄DNA Ligase 1μL

ddH₂O至总体积20μL，4℃过夜。连接产物-20℃保存，备用。

1.3感受态细菌的制备和重组质粒转化感受态细菌

制备新鲜感受态细菌DH5α用于重组质粒转化方法如下：

(1)从LB平板上(1L LB固体培养基组成：10g氯化钠、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨，15g琼脂粉，pH 7.0)挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于10mL LB液体培养基中(1L LB液体培养基组成：10g氯化钠、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨，pH 7.0)，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1∶100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2.5h至OD₆₀₀＝0.5左右；

(2)将步骤(1)的培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min；

(3)去步骤(2)培养液的上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min后，4℃下3000g离心10min；

(4)弃去步骤(3)培养液的上清，加入4mL预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置10min，即成感受态细胞悬液。

(5)感受态细胞分装成100μL的小份，可以立刻用于转化，或者贮存于-70℃冰箱。

将连接产物转化感受态细菌DH5α，方法如下：

(6)从-70℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，置于冰上融解；

(7)加入连接产物DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min；

(8)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3min；

(9)向管中加入400μL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达DNA编码的氨苄抗生素抗性基因。

(10)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含氨苄青霉素(Amp终浓度为50mg/mL)的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。

1.4阳性克隆的筛选、鉴定与测序

从上步的平板中挑取阳性克隆，接种于含Amp(终浓度为50mg/mL)的LB液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照上海华舜生物有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，EcoRI和XhoI双酶切，酶切体系为：10×H buffer 1.6μL，重组质粒9μL，EcoR I和XhoI分别为0.8μL，加ddH₂O至总体积16μL，37℃，反应2-3h，观察酶切结果，电泳条带与目的条带大小相符，送上海英骏生物技术有限公司测序。获得的阳性克隆命名为猪pGM-CSF。(见附图2)

实施例2融合表达质粒pGMCSF-SS的构建

2.1质粒pGM-CSF提取与纯化

从LB平板上挑取新活化的pGM-CSF单菌落，接种至10mL LB液体培养基中，37℃、240rpm培养过夜，按体积比1∶250的比例稀释到适当体积LB中，继续培养12h，离心收集菌体，抽提纯化pGM-CSF质粒(参照上海华舜生物有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)。

2.2GM-CSF编码基因的扩增

参见附图4，采用Primer5.0引物设计软件，以猪的真核表达质粒pGM-CSF(实施例1)为模板进行PCR获得GMCSF基因。上游引物(P1)为：5’-GTAT

CTCAGAAGGATGTGGC-3’，引入了限制性内切酶XhoI位点(方框内为其序列)，下游引物(P2)为：5’-GGCG

TAACTTTTTGACTGGC-3’，引入限制性内切酶EcoRI位点(方框内为其序列)。引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

以pGM-CSF质粒为模板，按照如下PCR反应体系进行GM-CSF基因的扩增。

5×PCR buffer 10μL

MgCl₂(25mmol/L)4μL

dNTP(10mmol/L)1μL

pGMCSF质粒0.5μL

上、下游引物各0.5μL(P1、P2引物浓度为20pmol/μL)

Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL

ddH₂O至总体积50μL

反应条件：94℃预变性2min，然后94℃变性30sec，58.5℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收，然后用QIAquick PCR Purification Kit(参照上海华舜生物有限公司的PCR产物纯化试剂盒使用说明书)纯化，定量备用。

2.3GM-CSF与SS融合表达质粒的构建

如附图3所示的技术路线，将纯化、回收得到的GM-CSF基因片段和pcS/2SS(原始质粒)分别按如下体系进行EcoR I和XhoI双酶切，反应体系为：10×H buffer 6μL、GM-CSF15μL(或pcS/2SS 20μL)、EcoR I和XhoI分别为1.5μL、加ddH₂O至总体积60μL，37℃，反应2-3h，酶切后，用低融点琼脂糖凝胶电泳分离回收GM-CSF目的片段和pcS/2SS大片段。

然后按如下体系进行连接反应：10×ligase buffer 2μL、GM-CSF 6μL、pcS/2SS 5μL、T4DNA ligase1μL、加ddH₂O至总体积20μL，4℃过夜，CaCl₂法制备新鲜感受态细菌DH5α用于重组质粒转化(具体步骤同实施例1.3)。

2.4阳性重组质粒(pGMCSF-SS)的筛选和鉴定

挑取阳性克隆，接种于含Amp的LB液体培养，提取质粒DNA，进行酶切鉴定，分别用EcoR I和XhoI双酶切、EcoR I和HindIII、HindIII和XhoI双酶切鉴定重组质粒，酶切体系为：10×H buffer 1.6μL、重组质粒9μL、EcoR I和XhoI(或HindIII)分别为0.8μL、加ddH₂O至总体积16μL，37℃，反应2-3h，1.2％琼脂糖电泳检测，电泳条带与目的条带大小相符(见附图5)，送上海英骏生物技术有限公司进行DNA测序。融合表达质粒被命名为pGMCSF-SS。

实施例3以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体制备口服重组DNA疫苗

3.1pGMCSF-SS质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌

采用同上述的方法制备新鲜感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌，将融合表达质粒pGMCSF-SS转化感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌(具体操作步骤同实施例1.3)。

含有融合表达质粒的减毒鼠伤寒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CSO22/pGMCSF-SS已于2006年12月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M206141。

3.2重组鼠伤寒沙门氏菌中质粒的鉴定

挑取步骤3.1得到的阳性克隆单菌落接种于含Amp的LB液体培养基中37℃培养过夜，从鼠伤寒沙门氏菌中抽提质粒(参照上海华舜生物有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将从鼠伤寒沙门氏菌中抽提的质粒用热休克法回转至E.coliDH5α(方法同实施例1.3)，抽提的质粒分别用HindIII+EcoR I、HindIII+XhoI、EcoR I+XhoI双酶切，酶切体系：10×H buffer 1.6μL，重组质粒9μL，EcoR I和XhoI分别为0.8μL，加ddH₂O至总体积16μL，37℃，反应2-3h，1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果如附图6所示。

3.3重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗的制备

挑取pGMCSF-SS的减毒鼠伤寒沙门氏菌单菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃、150rpm振摇培养至OD₆₀₀0.3-0.4，4℃、1500g离心10min，弃上清，用灭菌的PBS溶液(PBS溶菌液为pH 7.4、10mmol/L的磷酸盐缓冲液)调整细菌浓度至10¹⁰CFU/mL，备用。

实施例4本发明口服重组DNA疫苗在仔猪上促生长中的应用

4.1疫苗制备：

按实施例1.3方法所述分别将pcS/2SS、pGM-CSF转化感受态鼠伤寒沙门氏菌，之后按照3.3方法所述制备含有pcS/2SS、pGM-CSF和pGMCSF-SS三种质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗，并调整细菌浓度至10¹⁰CFU/mL，备用。

4.2试验动物：

试验动物来自江西农业大学种猪场，选择来源相同、体重相近(8.8kg左右)，35日龄的断奶“大长”二元仔猪40头，随机分为4组，每组10头，公、母各半，其中第1组为对照组，口服PBS缓冲液；第2组口服免疫含有原始质粒pcS/2SS的减毒鼠伤寒沙门氏菌；第3组口服免疫含有融合表达质粒pGMCSF-SS的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌液；第4组同时口服免疫含pGM-CSF质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌液和含有pcS/2SS质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌液。

4.3免疫方法：

受免疫的动物(35日龄断奶仔猪)免疫前12h禁食禁水，免疫前30min，预先口服7.5％的NaHCO₃(5mL/头)以中和胃酸，免疫剂量为4×10¹⁰CFU/头。初次免疫后2周以相同剂量、相同方法加强免疫一次。

4.4饲养管理：

试验用35日龄断奶仔猪，采用一次断奶，离母不离仔。断奶仔猪在原栏饲养5-7d后转入小猪栏。小猪舍为单列式，南面为运动场，供断奶仔猪自由运动。试验开始前先进行7d的预饲期，在预饲期内对小猪进行驱虫和去势。预饲期结束后，称重初始重，经统计分析，差异不显著，进入试验期，试验期为56d。试验猪日喂3次，自动饮水器自由饮水，保持舍内清洁、卫生，及时清除舍内粪尿，保持舍内干燥。

4.5称重和血浆制备：

以初次免疫为0周，分别在第0、2、4、6、8周早晨空腹称取试验猪的重量，并采用清箱底的方法，记录每次称重时的饲料消耗；称重的同时前腔静脉采取血样，肝素钠抗凝，制备血浆，-20℃保存，用以抗体、激素和代谢物浓度的检测(参照杨利国等主编.酶免疫测定技术，[M].南京：南京农业大学出版社，1998：138-139)。

4.6测定指标

4.6.1日增重和饲料转化率

记录每次断奶仔猪的称重和饲料消耗，计算各个阶段断奶仔猪的日增重和饲料转化率。

本发明的重组口服DNA疫苗对断奶仔猪生长性能的影响：

如表1所述，本发明第3组试验猪全期平均日增重最高，达427.3±40.70g，分别比1组、2组和4组提高了6.6％、8.4％和17.2％。第3组饲料转化率最高，为1.67∶1；第1组最差，高达1.98∶1。2组、3组和4组分别比对照组提高了1.0％、15.7％和9.6％，断奶仔猪各个阶段的日增重和饲料转化率分别如附图7和附图8所示：

表1不同生长抑素DNA疫苗对断奶仔猪生长性能的影响

注：同行数据小写字母不相同者表示差异显著。

4.6.2生长抑素抗体检测

采用间接ELISA方法检测血浆中抗生长抑素抗体。步骤如下：

包被标准生长抑素抗原每孔100ng/100μL，4℃反应12h，弃反应液，于自动洗板机上洗涤6次，每次30秒；加封闭液(5％的脱脂牛奶溶液)200μL/孔，37℃反应1.5h，弃反应液，洗涤6次，每次30秒；仔猪血浆稀释50倍，加待测血浆100μL/孔，同时设对照孔(调零孔：不加任何反应液；非特异性吸附孔：用PBS缓冲液代替血浆)，每个样本三个重复，37℃反应1h，弃反应液，洗涤6次，每次30秒；加兔抗猪IgG-HRP 1∶5000稀释，每孔100μL，37℃反应1h，弃反应液，洗涤6次，每次30秒；加TMB底物液，每孔150μL，37℃反应25min；加2mol/L硫酸终止反应，每孔50μL；OD450读数。以P/N值≥2判为阳性，其中P为待测血样的吸光值，N为阴性对照血样吸光值，其测定结果见表2。

本发明的口服重组疫苗第一次口服免疫后的第2周P/N值就达高峰，其它3个组P/N值高峰期均在一免后的第4周，随后4个组P/N值都有所下降，但试验组均高于对照组(P＞0.05)。pGMCSF-SS组直到第6周仍然高于其它各组。

在整个抗体监控期(全期)总的抗体阳性猪的比例显著高于对照组(P＜0.05)，对照组没有出现抗体阳性猪。三个试验组中以pGM-CSF+pcS/2SS免疫组阳性比例为最大，达到30％，其次是pcS/2SS组和pGMCSF-SS，阳性比例均为20％，差异不显著(P＞0.05)。

表2口服不同DNA疫苗断奶仔猪血浆中生长抑素抗体P/N值及阳性猪比例

注：全期的抗体阳性率是指整个抗体监控期内检出抗体阳性次数≥1的仔猪的百分数。

4.6.3血浆中GH、IGF-I、T3和T4的检测

采用北京市福瑞生物工程公司生产的试剂盒检测GH、T3和T4，采用天津九鼎医学生物工程有限公司生产的试剂盒检测IGF-I，具体操作按上述单位提供的试剂盒的使用说明书进行。试验开始时对照组GH浓度略高于试验组，随着免疫时间的延长，试验2、3、4组血浆中GH的含量有升高的趋势，pcS/2SS、pGM-CSF+pcS/2SS免疫组在第6周时达到高峰，融合表达质粒pGMCSF-SS组GH含量的最大值出现在第8周，而对照组GH的含量在整个实验期都比较平稳。pGMCSF-SS免疫组的GH含量总体上高于2、4组(P＞0.05)。这可能是生长抑素抗体中和了体内的SS，促进了GH的合成和分泌，提示SS基因疫苗对保持体内生长激素(GH)较高水平有明显作用，GM-CSF有一定的免疫增强作用(见表3)。

表3断奶仔猪不同时期血浆中GH的浓度变化(ng/mL)

注：同列(行)数据大写(小写)字母不相同者，表示差异显著(P＜0.05)，下同。

试验开始时对照组IGF-I浓度略高于试验组，随着免疫时间的延长，其浓度的变化类似于GH的动态变化。1组、2组和4组分泌的最高峰是在第2周，以pGM-CSF+pcS/2SS组为最高，但差异不显著；2组IGF-I的分泌从第2周开始一直高于其它组，3组和4组在第2周后处于较低的分泌水平。第3组的分泌高峰出现在第4周，高于其它组的高峰分泌水平。这可能是由于SS水平的下降，促进了GH的合成和分泌，GH分泌的增加提高了血液中IGF-I的分泌水平，但组间差异不明显(P＞0.05)(见表4)。

表4断奶仔猪不同时期血浆中IGF-I的浓度变化(ng/mL)

随着免疫时间的延长，1组、2组和4组T3的分泌呈下降的趋势，它们的最高峰出现在0和2周。而第3组T3的分泌呈上升之势，最高峰在第8周，与0周分泌水平相比，差异显著(P＜0.05)。尽管在后期，各组T3的分泌水平均有所下降，但pGMCSF-SS免疫组(3组)的T3分泌水平显著高于2组和4组，与1组差异显著。这可能是pGMCSF-SS疫苗的免疫耗竭了体内SS，解除SS对T3分泌的抑制作用，促进了T3分泌(见表5)。

表5断奶仔猪不同时期血浆中T3的浓度变化(nmol/L)

随着免疫时间的延长，T4的分泌第1组不断降低，而2组、3组和4组有不断升高的趋势，2组和4组的最大值出现在第6周，第3组在第4周就达到78.73±4.64nmol/L，此后T4的分泌一直保持在较高的水平，这与T3的分泌是一致的，说明pGMCSF-SS疫苗的免疫耗竭了体内SS，解除SS对T4分泌的抑制作用，促进了T4分泌。(见表6)

表6仔猪不同时期血浆中T4的浓度变化(nmol/L)

4.6.4血浆葡萄糖、尿素氮和游离脂肪酸的测定

采用上海荣盛生物技术有限公司生产的试剂盒检测葡萄糖(Glu)，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测尿素氮(BUN)、游离脂肪酸(NEFA)，具体操作按试剂盒使用说明书进行。

试验开始时1组、3组和4组葡萄糖的浓度高于3组。用基因疫苗免疫后，从动态变化分析来看，pcS/2SS免疫组葡萄糖的浓度变化不大，pGM-CSF+pcS/2SS免疫组呈现下降的趋势，融合表达质粒pGMCSF-SS免疫组则出现上升的态势，至最后几周与前几周相比，差异显著(P＜0.05)。而对照组葡萄糖的浓度一直变化不明显。提示SS基因免疫对血浆葡萄糖的浓度影响不明显，融合表达质粒pGMCSF-SS则可提高血浆葡萄糖的浓度。(见表7)

表7断奶仔猪不同时期血浆中葡萄糖的浓度变化(mmol/L)

从动态变化分析来看，血浆游离脂肪酸的浓度pcS/2SS免疫组第4周达到高峰，pGM-CSF+pcS/2SS免疫组的分泌高峰在0周，而对照组和pGMCSF-SS免疫组在第6周达到高峰，尔后对照组急剧下降，免疫后第8周时，2组、3组和4组血浆游离脂肪酸的浓度显著高于对照组(P＜0.05)。提示SS基因免疫对血浆游离脂肪酸的分泌水平无明显影响。(见表8)

表8断奶仔猪不同时期血浆中游离脂肪酸的浓度变化(mmol/L)

在不同的免疫时期血浆尿素氮的浓度变化不明显，从动态变化分析来看，pGMCSF-SS免疫组有上升的趋势，在第2周、4周和6周血浆尿素氮的浓度高于其它三个组(P＞0.05)，pcS/2SS免疫组则随免疫时间的延长而逐渐下降。对照组和pGM-CSF+pcS/2SS免疫组一直保持比较平稳的态势。(见表9)

表9断奶仔猪不同时期血浆尿素氮的浓度变化(mmol/L)

Claims (4)

1、含有融合表达质粒pGMCSF-SS的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CSO22/pGMCSF-SS，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M206141，所述的融合表达质粒pGMCSF-SS的结构是图3所示的质粒pGM-CSF/SS。

2、包含权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M206141的鼠伤寒沙门氏菌制备的促进猪生长的口服重组DNA疫苗。

3、一种适用于制备促进猪生长的口服重组DNA疫苗的融合表达质粒pGMCSF-SS，其特征是将猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF基因插入到原有pcS/2SS质粒的XhoI和HindIII位点融合构建而成，所述的融合表达质粒pGMCSF-SS的结构是图3所示的质粒pGM-CSF/SS。

4、权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌在制备促进猪生长的口服重组DNA疫苗中的应用。

Images