ES2432407T3

ES2432407T3 - Proteínas de Streptococcus inmunogénicas

Info

Publication number: ES2432407T3
Application number: ES08793829T
Authority: ES
Inventors: Hilda Elizabeth Smith
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2013-12-03
Anticipated expiration: 2028-08-05
Also published as: AU2008284491A1; JP5462164B2; UA103885C2; CA2695721A1; KR20100063706A; BRPI0815604A2; EP2183597B1; US20100297183A1; WO2009020391A1; EP2183597A1; CO6270172A2; JP2010535500A; JP2014095721A; AR067830A1; EP2023143A1; RU2518315C2; EP2660604A2; TW200911999A; CN101821627A; RU2010107878A

Abstract

Un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método: a) identificar al menos parte de: - una proteína segregada y/o - una proteína asociada a la superficie y/o - una proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190; b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis; y c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.

Description

Proteínas de Streptococcus inmunogénicas.

La invención se refiere al campo de la medicina. Más concretamente, la invención se refiere a proteínas de Streptococcus inmunogénicas y a sus partes, derivados y análogos inmunogénicos.

El género Streptococcus está formado por una amplia variedad de bacterias Gram-positivas patógenas y comensales que viven en una amplia gama de hospedantes, incluyendo seres humanos, caballos, cerdos y vacas. Dentro del hospedante, los estreptococos a menudo colonizan las superficies mucosas del tracto respiratorio superior. Sin embargo, en ciertas circunstancias, los estreptococos también pueden provocar enfermedades que varían de subagudas a agudas o incluso crónicas.

Hasta la fecha, muchas vacunas comerciales contra Streptococcus se basan en bacterinas de células completas. En general, dichas bacterinas producen una significativa protección frente a la exposición a serotipos homólogos, pero no protegen frente a la exposición a serotipos heterólogos. La vacunación con Streptococcus de células completas a menudo produce una respuesta inmunológica que se dirige contra la misma cepa de Streptotoccus, pero que no se dirige (suficientemente) contra otras cepas de Streptococcus, ni mucho menos contra otros serotipos de Streptococcus. Como resultado, muchas vacunas proporcionan insuficiente protección frente a cepas y/o serotipos heterólogos, porque la vacunación contra una cepa de Streptococcus en general no es eficaz para contrarrestar la infección por otra cepa de Streptococcus. Además, la vacunación contra un serotipo de Streptococcus en general no es eficaz para contrarrestar la infección por otro serotipo de Streptococcus. Por tanto, se desean composiciones inmunogénicas capaces de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus, preferiblemente contra dos serotipos de Streptococcus.

El documento WO 00/37105, y Zhang et al., Infection and Immunity, 74 (2006), 4200-4213, describen métodos para identificar proteínas de Streptococcus capaces de provocar respuestas inmunológicas. Groschup et al., Epidemiol. Infect., 107 (1991), 297-310, describen antígenos de S. uberis. Almeida et al., Vet. Microbiology, 115 (2006), 183191, y el documento WO 2004/048515, describen la identificación de la molécula de adhesión de Streptococcus uberis (SUAM).

Un objeto de la presente descripción es proporcionar proteínas Streptococcus, y sus partes inmunogénicas, derivados y/o análogos, y moléculas de ácidos nucleicos que los codifican, que son capaces de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis.

La invención proporciona un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4;

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis; y

c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa de Streptococcus uberis.

Según la presente invención, se identifica al menos una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis. Dicha proteína es adecuada para inmunizar a un individuo y/o un animal no humano porque es capaz de provocar una respuesta inmunológica amplia. Por tanto, la presente invención obvia la necesidad de proporcionar una vacuna para cada una de las cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Por tanto, el uso de una proteína inmunogénica de Streptococcus uberis de la invención ahorra tiempo y dinero. De modo más importante, una proteína inmunogénica de Streptococcus uberis de la invención es capaz, en principio, de provocar una respuesta inmunológica contra una cepa de Streptococcus uberis que aún no sea conocida, o contra la que aún no existe una vacuna específica disponible (por ejemplo, una cepa que haya evolucionado recientemente en la naturaleza). Preferiblemente, una proteína de Streptococcus uberis de la invención es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos serotipos de Streptococcus uberis. Una realización preferida de la invención, por tanto, proporciona un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos serotipos de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4;

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c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por un primer serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por un segundo serotipo de Streptococcus uberis.

En la presente se define una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis y/o serotipos de Streptococcus uberis como una respuesta inmunológica humoral y/o celular dirigida contra Streptococcus uberis de al menos dos cepas y/o serotipos diferentes. Dicha respuesta inmunológica se provoca, por ejemplo, en un animal no humano. También es posible provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis en un individuo humano para prevenir y/o contrarrestar una enfermedad relacionada con Streptococcus uberis. Una respuesta inmunológica humoral conduce a la producción de anticuerpos, mientras que una respuesta inmunológica celular potencia predominantemente la formación de células inmunológicas reactivas, tales como células T asesinas. En general, ambas partes de la respuesta inmunológica son provocadas por la administración de una proteína inmunogénica o una parte inmunogénica de esta. Una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas/serotipos de Streptococcus uberis comprende preferiblemente la producción de anticuerpos. Dicha respuesta inmunológica es preferiblemente capaz de disminuir, al menos en parte, el número de organismos de Streptococcus uberis en un individuo humano y/o un animal no humano. Además, dicha respuesta inmunológica preferiblemente es capaz de contrarrestar, al menos en parte, un trastorno provocado por Streptococcus uberis.

Una cepa de Streptococcus uberis puede identificarse mediante sus características morfológicas, bioquímicas y serológicas, tal como se conoce en la técnica. Un serotipo de Streptococcus uberis es un grupo de Streptococcus uberis cuya clasificación se basa en la presencia de polisacáridos antigénicos específicos. La clasificación de los serotipos de Streptococcus uberis también es muy conocida en la técnica.

Un método de la invención comprende identificar al menos parte de una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4. Dicha proteína se identifica de diversos modos. En una realización de la invención se emplea una estrategia genómica. Se identifica un gen que codifica una proteína segregada y/o una proteína asociada a la superficie, por ejemplo, buscando un motivo de dicha proteína segregada y/o proteína asociada a la superficie. Dicho motivo comprende preferiblemente un sitio de unión a lípidos, un sitio de ruptura de peptidasas señal y/o un sitio de unión de sortasa. Por supuesto, es posible buscar otros motivos conocidos en la técnica. Por tanto, una realización de la invención proporciona un método de la invención, en el que dicha proteína segregada y/o proteína asociada a la superficie se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que comprende un motivo de una proteína segregada y/o asociada a la superficie.

Además, o como alternativa, un gen que codifica una proteína segregada y/o una proteína asociada a la superficie se identifica mediante uno o más métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una vez se conozca un gen de Streptococcus uberis que codifique una proteína segregada y/o una proteína asociada a la superficie, es posible seleccionar otra secuencia genómica de Streptococcus uberis para la presencia de un gen con un alto porcentaje de identidad de secuencia.

En una realización, dicho método de selección comprende un método en el que dicha otra secuencia genómica de Streptococcus uberis se selecciona por su capacidad para hibridarse a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína segregada y/o asociada a la superficie de Streptococcus uberis. Por tanto, la invención proporciona un método según la invención, en el que dicha proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4 se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que es capaz de hibridarse con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos listadas en la figura 4 a 65 ºC en un tampón que tiene fosfato de sodio 0,5 M, EDTA 1 mM, y dodecilsulfato de sodio al 7% a un pH de 7,2, en el que la molécula de ácido nucleico permanece hibridada después de lavar dos veces con un tampón que contiene fosfato de sodio 40 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM y dodecilsulfato de sodio al 5% durante 30 minutos a 65 ºC, y de lavar dos veces con un tampón que contiene fosfato de sodio 40 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM y dodecilsulfato de sodio al 1% durante 30 minutos a 65 ºC.

La técnica además proporciona diversos métodos para determinar si una proteína de Streptococcus uberis tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína de Streptococcus uberis se compara con la secuencia de aminoácidos de una proteína listada en la figura 4. También es posible aplicar una estrategia genómica. Un gen que codifica una proteína de Streptococcus uberis que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4 se identifica, por ejemplo, seleccionando una secuencia genómica de Streptococcus uberis para detectar una secuencia de nucleótidos que tenga al menos 80% de identidad de secuencia con un gen bacteriano que codifica una proteína listada en la figura 4. Por tanto, una realización de la invención proporciona un método de la invención, en el que una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4 se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un ácido nucleico listado en la figura 4. Sin embargo, en la técnica se conocen muchos métodos alternativos para determinar si una proteína de Streptococcus uberis tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4.

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Tras haber identificado al menos un gen de Streptococcus uberis que codifique una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4, preferiblemente se determina si al menos uno de dichos genes se conserva a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis. Un gen de una primera cepa de Streptococcus uberis se conserva a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis si un genoma de una segunda cepa de Streptococcus uberis comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia con dicho gen de dicha primera cepa de Streptococcus uberis. Preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico tiene al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia con dicho gen. La expresión "identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos. Dos secuencias de ácidos nucleicos tienen al menos 60% de identidad de secuencia entre sí cuando dichas secuencias muestran al menos 60% de coincidencia de secuencia después de alinear las dos secuencias y de introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Los métodos y los programas informáticos para el alineamiento son muy conocidos en la técnica. Un programa informático que puede utilizarse o adaptarse para el objetivo de determinar si una secuencia candidata se ajusta a esta definición es "Align 2", desarrollado por Genentech, Inc., que se presentó con la documentación del usuario en the United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559, el 10 de diciembre, 1991.

Según una realización de la invención, si un gen de la invención se conserva a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis, la proteína codificada por dicho gen es una buena candidata para evaluar si dicha proteína, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra más de una cepa de Streptococcus uberis.

Preferiblemente, se determina si dicho gen se conserva a través de al menos dos serotipos de Streptococcus uberis, para identificar una buena proteína candidata (codificada por dicho gen) que se ensaya para su capacidad de provocar una respuesta inmunológica contra más de un serotipo de Streptococcus uberis. Por tanto, se prefiere un método de la invención que también comprende seleccionar un gen que se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Tras haber identificado un gen conservado a través de al menos dos cepas/serotipos de Streptococcus uberis, preferiblemente se obtiene una proteína codificada por dicho gen. Además,

o como alternativa, se obtiene una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de dicha proteína. La técnica proporciona diversos métodos para obtener una proteína codificada por un gen, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta. Dicho gen, por ejemplo, se expresa mediante un sistema de expresión adecuado. Los ejemplos no limitantes de sistemas de expresión comprenden células hospedantes eucariotas, tales como células hospedantes procariotas y de levaduras, tales como Escherichia coli. Preferiblemente, un gen que codifica una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una protéina listada en la figura 4, conservándose dicho gen a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis, se expresa en un sistema de expresión procariota. Se prefiere un sistema de expresión procariota porque una proteína de Streptococcus uberis (procariota), en principio, se expresa mejor en un sistema de expresión procariota. Además, un sistema de expresión procariota en general es más fácil de componer y utilizar.

Un método de la invención comprende determinar si al menos una proteína, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa de Streptococcus uberis. Preferiblemente, se determina si al menos una proteína, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por un primer serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por un segundo serotipo de Streptococcus uberis. Se conocen muchos métodos en la técnica para realizar dicho ensayo. Preferiblemente, se emplea suero de al menos dos animales infectados por al menos dos cepas diferentes de Streptococcus uberis. Como alternativa, se emplea el suero de un solo animal, estando dicho animal infectado por al menos dos cepas diferentes de Streptococcus uberis. Según una realización, un animal no humano está infectado por al menos una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un segundo animal no humano está infectado por al menos una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis. Dichas cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis se administran, por ejemplo, por vía intravenosa a dicho animal. Después, según una realización, se recoge el suero de dichos animales que comprende anticuerpos y/o células inmunológicas específicas para Streptococcus uberis. Dicho suero opcionalmente se procesa antes del uso. Por ejemplo, los anticuerpos y/o las células inmunológicas son al menos en parte concentradas y/o aisladas. Una proteína y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta preferiblemente se aísla y/o se produce de modo recombinante, y después se incuba con dicho suero (o con anticuerpos y/o células inmunológicas (parcialmente) aislados) derivado de dichos animales. Es posible administrar suero, anticuerpos y/o células inmunológicas derivados de un primer animal, junto con suero, anticuerpos y/o células inmunológicas derivados de un segundo animal. Como alternativa, se administra en primer lugar suero, anticuerpos y/o células inmunológicas derivados de un primer animal, tras lo cual se añade suero, anticuerpos y/o células inmunológicas derivados de un segundo animal. En otra realización, se administra suero, anticuerpos y/o células inmunológicas de un primer animal a un lote separado que comprende al menos una proteína y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo, y se administra suero, anticuerpos y/o células inmunológicas de un segundo animal a otro lote que comprende al menos una proteína y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo. Después de una

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incubación, dicho suero, anticuerpos y/o células inmunológicas se lavan, y se visualizan los anticuerpos y/o las células inmunológicas unidos, utilizando cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos unidos se incuban, por ejemplo, con un segundo anticuerpo capaz de unirse específicamente a dichos anticuerpos unidos, conjugándose dicho segundo anticuerpo con peroxidasa de rábano. Después de lavar el segundo anticuerpo no unido, se administra peróxido de hidrógeno. La degradación del peróxido de hidrógeno por la peroxidasa de rábano se acopla a la oxidación de un compuesto cromogénico, de modo que la reacción se hace visible. Si una proteína y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un analogo de esta parece que está unida específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica suscitada por una primera cepa de Streptococcus uberis, y a un anticuerpo y/o una célula inmunológica suscitada por una segunda cepa de Streptococcus uberis, esto indica que dicha proteína, parte inmunogénica, derivado y/o análogo es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis. En una realización preferida, se emplea un anticuerpo y/o una célula inmunológica derivada de un suero convaleciente de un animal que ha sido infectado con un Streptococcus uberis. Un suero convaleciente se deriva de un animal que ha contrarrestado con eficacia esta infección. Por tanto, un suero convaleciente de un animal que ha sido infectado con Streptococcus uberis comprende anticuerpos y/o células inmunológicas que son capaces de proteger a dicho animal frente a una exposición con la misma cepa de Streptococcus uberis. Por tanto, se prefiere la incubación con un medio convaleciente para determinar si una proteína y/o parte inmunogénica, derivado y/o análogo según la invención es capaz de provocar una respuesta inmunológica protectora. Así, una realización de la invención proporciona un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

-: obtener proteínas de Streptococcus uberis aisladas y/o recombinantes;

-: incubar dichas proteínas con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y

-: ensayar si una proteína es capaz de unirse a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.

Las proteínas de Streptococcus uberis se obtienen de diversas formas. Preferiblemente, las proteínas segregadas, las proteínas asociadas a la superficie y/o las proteínas que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4 se aislan a partir de un cultivo de Streptococcus uberis. En una realización, las proteínas asociadas a la superficie se separan de Streptococcus uberis empleando, por ejemplo, una lisozima.

En una realización, las proteínas de Streptococcus uberis se producen de modo recombinante utilizando al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de dichas proteínas. Tal como se explicó anteriormente, se emplea preferiblemente un gen que codifica una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4. Más preferiblemente, dicho gen se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Como alternativa, o además, se genera una proteína, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, de Streptococcus uberis utilizando otro método conocido en la técnica. Por ejemplo, se genera una proteína o un péptido de Streptococcus uberis utilizando un técnica de síntesis habitual, tal como la síntesis en fase sólida. Como otro ejemplo, una proteína de Streptococcus uberis se aísla a partir de un Streptococcus uberis, o se prepara de modo recombinante, tras lo cual se modifica para producir una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo.

En una realización preferida, las proteínas de Streptococcus uberis se separan sobre un gel de poliacrilamida y después se incuban con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis. Preferiblemente, se emplea un gel de poliacrilamida bidimensional.

En una realización preferida, se identifica una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de suscitar anticuerpos inductores de la opsonofagocitosis. La opsonofagocitosis es un proceso natural, en el que un microorganismo es opsonizado por opsoninas, tras lo cual dicho microorganismo es fagocitado por una célula fagocítica y muere. Muchos microorganismos deben ser opsonizados por opsoninas para potenciar su fagocitosis. La opsonización es un proceso que hace que el microorganismo sea más susceptible a la captación por un fagocito. En dicho proceso, proteínas y/o anticuerpos opsonizantes se unen a dicho microorganismo, facilitando con ello la captación de dicho microorganismo por dicho fagocito.

Por tanto, se prefiere una proteína de Streptococcus uberis, o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de esta, capaz de suscitar anticuerpos inductores de la opsonofagocitosis, porque la administración de dicha proteína y/o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de esta a un animal provoca la presencia de anticuerpos inductores de la opsonofagocitosis en dicho animal que son capaces de fagocitar a Streptococcus uberis.

Una proteína de Streptococcus uberis, o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de esta, es capaz de

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provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Para provocar una respuesta inmunológica aún más amplia, se prefiere identificar al menos dos proteínas de Streptococcus uberis diferentes y/o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de al menos una de dichas proteínas. Más preferiblemente, se identifican al menos tres proteínas de Streptococcus uberis diferentes y/o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de al menos una de dichas proteínas, etc. Cuanto mayor sea el número de proteínas y/o partes inmunogénicas, derivados y/o análogos de Streptococcus uberis diferentes identificados de la presente invención, más amplia será la respuesta inmunológica provocada.

En otra realización preferida, se identifica al menos una proteína de Streptococcus uberis y/o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo según la invención, que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos tres cepas de Streptococcus uberis. Dicha proteína y/o parte inmunogénica, derivado y/o análogo es particularmente adecuado para provocar una respuesta inmunológica amplia en un individuo humano y/o un animal no humano. Más preferiblemente, se identifica al menos una proteína de Streptococcus uberis y/o una parte inmunogénica, derivado y/o análogo según la invención, que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos tres serotipos de Streptococcus uberis.

Una parte inmunogénica de una proteína se define como una parte de una proteína que es capaz de provocar una respuesta inmunológica en un individuo humano y/o un animal no humano. Preferiblemente, dicha parte inmunogénica es capaz de provocar el mismo tipo de respuesta inmunológica, aunque no necesariamente en la misma cantidad, que dicha proteína. Una parte inmunogénica de una proteína preferiblemente comprende uno o más epitopos de dicha proteína. Un epitopo de una proteína se define como una parte de dicha proteína, con una longitud de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, que es capaz de suscitar un anticuerpo y/o una célula inmunológica específicos capaces de unirse específicamente a dicho epitopo. Existen dos tipos diferentes de epitopos: los epitopos lineales y los epitopos conformacionales. Un epitopo lineal comprende un tramo de aminoácidos consecutivos. Un epitopo conformacional está formado por varios tramos de aminoácidos consecutivos que están plegados en posición y que juntos forman un epitopo en una proteína plegada correctamente. Una parte inmunogénica es capaz de comprender uno, o ambos, de dichos tipos de de epitopos.

Una parte inmunogénica de una proteína comprende al menos 5 restos aminoácidos. Preferiblemente, dicha parte inmunogénica comprende al menos 10, más preferiblemente al menos 15, más preferiblemente al menos 25 y lo más preferiblemente al menos 30 aminoácidos consecutivos. Dicha parte inmunogénica preferiblemente comprende como máximo aproximadamente 500 restos aminoácidos, más preferiblemente como máximo aproximadamente 250 aminoácidos, dependiendo del tipo de proteína a partir de la cua se deriva dicha parte inmunogénica.

Una derivado de una proteína se define como una molécula que tiene el mismo tipo de propiedades inmunogénicas, aunque no necesariamente en la misma cantidad. Los expertos en la técnica son capaces de alterar una proteína de modo que las propiedades inmunogénicas de dicha molécula sean fundamentalmente del mismo tipo, aunque no necesariamente en la misma cantidad, comparada con dicha proteína. Un derivado de una proteína se proporciona, por ejemplo, mutando al menos un resto aminoácido de dicha proteína y/o sustituyendo un resto aminoácido por otro resto aminoácido. Preferiblemente, se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas, como por ejemplo, la sustitución de un aminoácido que comprende una cadena lateral ácida por otro aminoácido que comprende una cadena lateral ácida, la sustitución de un aminoácido voluminoso por otro aminoácido voluminoso, la sustitución de un aminoácido que comprende una cadena lateral básica por otro aminoácido que comprende una cadena lateral básica, etc.

Los expertos en la técnica son capaces de generar compuestos análogos de una proteína. Esto se realiza, por ejemplo, seleccionando un banco de péptidos o mediante programas de cambio de péptidos. Un análogo tiene fundamentalmente el mismo tipo de propiedades inmunogénicas, aunque no necesariamente en la misma cantidad, que dicha proteína. Un análogo de una proteína comprende, por ejemplo, una proteína de fusión y/o una proteína quimérica.

Para ser capaz de producir una respuesta inmunológica, una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo se proporcionan preferiblemente con las características adecuadas para permitir la producción de anticuerpos y/o células inmunológicas. Dichas características, que son muy conocidas en la técnica, por ejemplo incluyen secuencias flanqueantes adecuadas y/o sitios de ruptura proteolítica adecuados. Como alternativa, o además, una proteína, una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo se proporcionan preferiblemente con un portador inmunogénico.

Tras haber administrado una proteína o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo a un individuo humano

o animal no humano, habitualmente se encuentra en riesgo de degradación provocada por una serie de fuerzas distintas tales como, por ejemplo, proteolisis, desplegamiento, valores extremos de pH, detergentes y altas concentraciones salinas. Para prolongar la vida de una proteína, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo, su resistencia a la degradación preferiblemente se potencia, por ejemplo, sintetizando un péptido con una carboxamida C-terminal y/o acetilando el extremo N-terminal de un péptido para mantener las características de carga nativas. En una realización, la resistencia a la degradación se potencia aún más mutando una proteína o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo, de modo que un proceso de desplegamiento local, que hace que dicha proteína o parte inmunogénica, derivado y/o análogo sea susceptible a la autolisis, sea en parte inhibido. Las

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estrategias de mutación estabilizante son conocidas y se describen, por ejemplo, en Matthews (1991), Alber (1991), Vriend y Eijsink (1993), y Fersht y Serrano (1993).

Una proteína segregada se define como una proteína que se produce en la naturaleza en una célula y/o un organismo, y al menos en parte es segregada de dicha célula y/u organismo hacia su entorno. Así, si se cultiva Streptococcus uberis, una proteína segregrada está al menos en parte presente en al menos parte del medio de cultivo, al menos en algún momento. No es necesario que una proteína segregada sea producida y/o segregada continuamente. Una proteína segregada, por ejemplo, puede ser producida y/o segregada solo durante una fase concreta del ciclo de vida bacteriano. Además, no es necesario que la producción y la secreción de una proteína segregada sean al mismo tiempo. Por ejemplo, algunas proteínas segregadas primero se acumulan en el interior de una célula y son segregadas en un momento posterior.

Una proteína asociada a la superficie se define como una proteína que en la naturaleza forma parte de la superficie de una célula, o que está unida a la superficie de una célula. Cuando dicha proteína asociada a la superficie está unida a la superficie de una célula, aquella se une de modo directo o indirecto. La unión indirecta implica, por ejemplo, la presencia de al menos un conector.

La expresión "proteína aislada" se refiere a una proteína que está al menos en parte aislada de su entorno natural y/o a una proteína que está exenta de al menos parte de una secuencia con la que normalmente está asociada en la naturaleza.

La expresión "proteína recombinante" se refiere a una proteína que es producida por un sistema de expresión aislado y/o artificial, preferiblemente empleando una secuencia de ácido nucleico que codifique dicha proteína. Dicha secuencia de ácido nucleico preferiblemente está unida operablemente al menos a una secuencia reguladora tal como, por ejemplo, un promotor, un potenciador y/o un terminador. Preferiblemente, dicha secuencia reguladora es inducible, de modo que es posible controlar el grado de expresión de dicha proteína. En una realización, dicha secuencia de acido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico exógena. Una secuencia de ácido nucleico exógena es una secuencia de ácido nucleico que se presenta en un sitio en el genoma del organismo en el que dicha secuencia de ácido nucleico no está presente en la naturaleza.

Después de que se haya identificado una proteína de Streptococcus uberis capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis, mediante un método de la invención, esta preferiblemente se produce. La proteína producida es adecuada, por ejemplo, para generar una composición inmunogénica y/o para provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis en un animal. Tal como se indicó anteriormente, en la técnica se conocen diversos métodos para producir proteínas tales como, por ejemplo, la producción recombinante.

Una proteína de Streptococcus uberis y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo es particularmente adecuada para preparar una composición inmunogénica. Dicha composicion inmunogénica es capaz de producir una amplia respuesta inmunologica humoral y/o celular contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis. Preferiblemente, se emplea una proteína de Streptococcus uberis y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo capaz de producir una respuesta inmunologica humoral y/o celular contra al menos dos serotipos de Streptococcus uberis para preparar una composición inmunogénica, de modo que se logra una amplia respuesta inmunológica contra al menos dos serotipos de Streptococcus uberis. Para proporcionar una protección aún más amplia, preferiblemente se emplean al menos dos o más proteínas y/o partes inmunogénicas, derivados y/o análogos de la invención para la preparación de una composición inmunogénica. En una realización, se emplea una combinación de al menos una proteína y al menos una parte inmunogénica, derivado y/o análogo para la preparación de una composición inmunogénica.

Además de una protección más amplia, el uso de al menos dos proteínas y/o partes inmunogénicas, derivados y/o análogos de la invención disminuye la posibilidad de que se desarrollen mutantes de escape de organismos de Streptococcus uberis. Los mutantes de escape de organismos bacterianos en general se desarrollan bajo estrés ambiental, por ejemplo, en presencia de un antibiótico y/o en presencia de anticuerpos contra un epitopo de dicho organismo. Mediante la variación natural en la población de un organismo, algunos organismos escapan del efecto inhibidor de dicho estrés ambiental, tal como la presencia de dicho antibióticos y/o anticuerpos, y son capaces de multiplicarse. La posibilidad de que se desarrolle un mutante de escape para varios epitopos diferentes a la vez es menor que la posibilidad de que se desarrolle un mutante de escape para un único epitopo.

Por tanto, una composición inmunogénica preferiblemente comprende al menos dos proteínas aisladas y/o recombinantes y/o al menos una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de estas, que pueden obtenerse mediante un método de la invención. Para evitar con más eficacia la formación de mutantes de escape, una proteína preferiblemente comprende una proteína esencial. Esta es una proteína que es importante (preferiblemente, esencial) para el metabolismo, la supervivencia y/o la multiplicación de Streptococcus uberis. Así, un posible mutante de escape con una proteína esencial alterada es menos viable (o no viable).

Las tablas 5 y 6 comprenden una lista de proteínas de Streptococcus uberis preferidas que se identifican mediante un método de la invención. Estas proteínas, o al menos una parte inmunogénica, derivado y/o análogo de estas, son

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adecuadas para la preparación de una composición inmunogénica. Para proporcionar una protección aún más amplia, dicha composición inmunogénica preferiblemente comprende al menos dos proteínas, tal como se muestra en la tabla 5 y/o tabla 6, y/o partes inmunogénicas, derivados y/o análogos de estas. Lo más preferiblemente, dicha composición inmunogénica comprende al menos tres proteínas, tal como se muestra en la tabla 5 y/o tabla 6, y/o partes inmunogénicas, derivados y/o análogos de estas.

En una realización preferida, dichas al menos una, al menos dos o al menos tres proteínas, según se muestran en la tabla 5 y/o tabla 6, se seleccionan del grupo que consiste en P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, P105, proteína de exclusión de la superficie, factor de activación (ropA), y nucleósido difosfato quinasa. Estas proteínas son reconocidas por anticuerpos presentes en sueros de animales infectados por S. uberis, lo cual indica que estas proteínas son expresadas in vivo y son inmunogénicas en vacas, o presentan reactividad cruzada entre al menos dos cepas de S. uberis, tal como se muestra en la tabla 5. La numeración de las anteriores proteínas, caracterizadas por ejemplo en la tabla 5, se refiere a las proteínas mostradas, por ejemplo, en las tablas 1, 2 y 3, que muestran ejemplos no limitantes de proteínas de la superficie de

S. uberis comunes. Además, la figura 4 muestra ejemplos no limitantes de secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de estos factores de virulencia/proteínas de la superficie putativas seleccionadas de S. uberis.

Las proteínas que están muy conservadas, son expresadas in vivo y son muy inmunogénicas, tales como las proteínas que son reconocidas por sueros convalecientes de vacas infectadas por diferentes cepas, tal como se muestra en el ejemplo 11, son especialmente útiles en una composición inmunogénica descrita por la invención. En una realización aún más preferida de esta, la selección de las proteínas de la tabla 5 y/o 6 comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, y P105. Lo más preferiblemente, la selección de las proteínas de la tabla 5 y/o 6 comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en P15, P16, P54, P28, P63, y P105. Tal como se muestra en el ejemplo 11, esta última selección fue reconocida por todos los sueros convalecientes utilizados, lo cual indica que estos antígenos son expresados por todas las cepas de S. uberis que provocan la respectiva infección, que estos antígenos son expresados durante la infección en el hospedante, y que estos antígenos son muy inmunogénicos.

Otro ejemplo es una composición inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una proteína que puede obtenerse mediante un método de la invención, o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de dicha proteína. Tras la administración de dicha composición inmunogénica a un animal, dicha molécula de ácido nucleico es expresada por la maquinaria del animal, dando como resultado la expresión de al menos una proteína y/o parte inmunogénica, derivado y/o análogo según la invención. La producción y, opcionalmente, la excreción extracelular de dicha proteína y/o parte inmunogénica, derivado y/o análogo da como resultado una respuesta inmunológica.

En una realización, una proteína y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta se produce de modo recombinante. La invención describe un método para producir una composición inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus, comprendiendo dicho método proporcionar una célula u otro sistema de expresión con al menos un vector recombinante, comprendiendo dicho al menos un vector una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una proteína que puede obtenerse mediante un método de la invención y/o al menos una proteína seleccionada de la tabla 5 y/o 6 y/o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de dicha proteína. Los sistemas de expresión adecuados son conocidos en la técnica. En una realización, se expresa al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención o una parte inmunogénica de esta. En otra realización, se emplea al menos una molécula de ácido nucleico que codifica al menos dos proteínas y/o partes inmunogénicas. También es posible utilizar al menos dos moléculas de ácidos nucleicos, codificando cada molécula de ácido nucleico una o más proteínas y/o partes inmunogénicas según la invención, etc. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica (al menos) una proteína, y una molécula de ácido nucleico que codifica (al menos) una parte inmunogénica, son adecuadas. Por tanto, también son posibles variaciones en el número de moléculas de ácidos nucleicos y en el número de proteínas y/o partes inmunogénicas codificadas por dichas moléculas de ácidos nucleicos.

Una secuencia de ácido nucleico se inserta, por ejemplo, en el genoma de una célula mediante recombinación homóloga. También es posible insertar una secuencia de ácido nucleico al azar, por ejemplo, mediante electroporación. Como alternativa, o además, dicha secuencia de ácido nucleico se coloca en un vector tal como, por ejemplo, un vector plasmídico o un vector de fago, siendo dicho vector estable en un sistema de expresión seleccionado, tal como un microorganismo y/o una célula. Dicha secuencia de ácido nucleico preferiblemente se transcribe y se traduce bajo el control de una secuencia reguladora tal como, por ejemplo, un promotor, un potenciador y/o un terminador. Preferiblemente, dicho promotor, potenciador y/o terminador resulta adecuado para su uso en el sistema de expresión seleccionado. Más preferiblemente, dicha secuencia reguladora es inducible para permite la expresión controlada. Los promotores y los terminadores adecuados para diversos microorganismos se describen en Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology), vol. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan (1990)). Por ejemplo, los vectores plasmídicos adecuados para Escherichia, de modo más específico para Escherichia coli, son los plásmidos de la serie pBRy pUC, y los promotores adecuados comprenden, por ejemplo, el promotor lac (!galactosidasa), el operón trp (operón de triptófano) y el promotor tac (promotor híbrido lac-trp) y los promotores

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dervados del fago ∀ PL o PR. Los terminadores preferidos comprenden trpA o el terminador ribosómico rrnB derivado de fago. Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Streptococcus comprenden, por ejemplo, pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett., 26, 239 (1985)) y pGK1 (Appl. Environ. Microbiol., 50, 94 (1985)).

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico de la invención se emplea para provocar una respuesta inmunológica contra Streptococcus uberis. Esto se realiza preferiblemente con un portador recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica al menos una proteína que puede obtenerse mediante un método de la invención y/o se selecciona de la tabla 5 y/6 y/o una parte inmunogénica, de dicha al menos una proteína, o una molécula de ácido nucleico recombinantes de la invención. En una realización particularmente preferida, dicho portador recombinante comprende un ácido nucleico que codifica al menos dos proteínas seleccionadas de la tabla 5 y/o 6. En una realización, se permite que dicho portador recombinante produzca al menos una proteína de la invención, tras lo cual se emplea una combinación de dicha al menos una proteína recombinante y el propio portador para provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Puede utilizarse un portador recombinante muerto. Sin embargo, una realización preferida proporciona un portador recombinante vivo. En una realización, dicho portador vivo es un portador atenuado. Un portador vivo es preferiblemente capaz de infectar a un individuo humano y/o un animal no humano, tras lo cual se provoca una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis.

Un portador recombinante preferiblemente comprende una especie de Streptococcus. De esta modo, se provoca una respuesta inmunológica dirigida contra Streptococcus por la proteína o proteína y/o la parte o partes inmunogénicas, el derivado o derivados y/o el análogo o análogos codificados por dicho portador, y por dicho portador recombinante en sí mismo. A menudo, los productos de la expresión de genes capsulares de Streptococcus son muy inmunogénicos y específicos de serotipo. Por tanto, la presencia de los productos de la expresión de genes capsulares dificulta la inducción de una respuesta inmunológica dirigida contra diversas cepas y/o serotipos diferentes de Streptococcus uberis. Por tanto, en una realización, si un portador recombinante de la invención comprende un Streptococcus, dicho Streptococcus carece de al menos parte de un producto de la expresión de un gen capsular. En una realización, dicho Streptococcus es un estreptococo no capsular.

Tal como se describió anteriormente, la inmunización con al menos dos proteínas y/o partes inmunogénicas, derivados y/o análogos derivados de al menos dos cepas y/o serotipos diferentes de Streptococcus uberis proporciona una amplia protección y disminuye la probabilidad de que se formen mutantes de escape. Un portador recombinante preferido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una proteína y/o una parte inmunogénica de esta derivada de una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una proteína y/o una parte inmunogénica de esta derivada de una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis. Dicho portador recombinante preferiblemente comprende un vehíuclo recombinante vivo.

Un portador recombinante se produce, por ejemplo, en una célula hospedante adecuada.

Un portador recombinante de la invención es adecuado para la producción de una composición inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis.

Después de la administración de una composición inmunogénica a un individuo humano y/o a un animal no humano, se provoca una respuesta inmunológica contra Streptococcus uberis. Dicha respuesta inmunológica es preferiblemente capaz de, al menos en parte, contrarrestar una enfermedad relacionada con Streptococcus uberis.

Una composición inmunogénica también es adecuada para la producción de una vacuna. Dicha vacuna es preferiblemente capaz de, al menos en parte, proporcionar protección frente a una enfermedad relacionadas con Streptococcus uberis. Preferiblemente, dicha vacuna es capaz de proporcionar protección contra una infección de Streptococcus uberis.

Una proteína, una parte inmunogénica, un derivado, un análogo y/o un portador recombinante de la invención se administra preferiblemente a un individuo humano y/o un animal no humano junto con un portador adecuado. Dicho portador preferiblemente facilita la aceptación por parte de dicho individuo humano y/o animal de dicha proteína, parte inmunogénica, derivado, análogo y/o portador recombinante de la invención, y preferiblemente aumenta el efecto inmunogénico. Un portador adecuado, por ejemplo, comprende un adyuvante adecuado capaz de aumentar el efecto inmunizante de una composición inmunogénica de la invención. Los expertos en la técnica conocen muchos adyuvantes adecuados, con base de aceite y con base acuosa. En una realización, dicha composición adyuvante comprende Diluvac Forte y/o Specol. En otra realización, dicho portador adecuado comprende una disolución, tal como disolución salina, por ejemplo para diluir las proteínas o las partes inmunogénicas, los derivados y/o los análogos de estas. Por tanto, la presente memoria descriptiva también describe una composición inmunogénica que comprende al menos una proteína, una parte inmunogénica, un derivado, un análogo y/o un portador recombinante de la invención, y un portador adecuado.

Una composición inmunogénica es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra Streptococcus uberis en un individuo humano y/o un animal no humano y, con ello, disminuir y/o controlar el número de organismos de

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Streptococcus uberis en dicho individuo y/o animal.

Una composición inmunogénica es preferiblemente capaz de, al menos en parte, contrarrestar y/o prevenir una enfermedad relacionada con Streptococcus uberis. Cuando una enfermedad relacionada con Streptococcus uberis ya está presente, una composición inmunogénica preferiblemente es capaz de, al menos en parte, contrarrestar dicha enfermedad.

Otro ejemplo es un método para medir la inmunidad de un individuo humano y/o un animal no humano contra Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método determinar en al menos una muestra procedente de dicho individuo humano y/o animal la presencia de anticuerpos y/o células inmunológicas dirigidos contra una proteína que puede obtenerse mediante un método de la invención y/o seleccionada de la tabla 5 y/o 6, o una parte inmunogénica de esta. También se describe un kit de diagnóstico que comprende al menos una proteína que puede obtenerse mediante un método de la invención y/o seleccionada de la tabla 5 y/o 6, o una parte inmunogénica de esta, y un medio para detectar la unión de anticuerpos y/o la unión de células inmunológicas a dicha proteína, o una parte inmunogénica de esta. En una realización particularmente preferida, dicho kit de diagnóstico comprende al menos dos proteínas seleccionadas de la tabla 5 y/o 6.

Descripción detallada

Un método según la invención, en una realización preferida, se aplica para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Dicha proteína de Streptococcus uberis se emplea preferiblemente para la preparación de una composición inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis.

Streptococcus uberis se asocia con la mastitis bovina. La mastitis bovina es una infección en la glándula mamaria de una vaca, habitualmente provocada por bacterias. La respuesta inflamatoria tras la infección produce una disminución en el rendimiento y la calidad de la leche, y provoca importantes pérdidas económicas anuales en la industria lechera. Se calcula que el daño económico en los Países Bajos es de aproximadamente 100 euros por vaca anuales.

Entre las especies bacterianas que se asocian más habitualmente con la mastitis se encuentran diversas especies del género Streptococcus, que incluyen Streptococcus uberis (no tipificable), Streptococcus agalactiae (grupo B de Lancefield), Streptococcus dysgalactiae (grupo C de Lancefield), Streptococcus zooepidemicus, y los estreptococos de los grupos D, G, L y N de Lancefield. Algunas de estas especies son contagiosas (por ejemplo, S. agalactiae), mientras que otras se consideran patógenos ambientales (por ejemplo, S. dysgalactiae y S.uberis).

La mastitis que se produce a partir de una infección por S. uberis habitualmente es subclínica, y se caracteriza por una leche aparentemente normal con un aumento en los recuentos de células somáticas debido al influjo de leucocitos.

La mastitis varía en gravedad según los efectos clínicos provocados por la infección. Una forma suave de mastitis puede provocar un pequeño aumento en la temperatura corporal y/o un aumento en la temperatura de la ubre. En los casos más graves, la mastitis por S. uberis también puede tomar la forma de un trastorno clínico agudo, con signos obvios de enfermedad, tales como coágulos o decoloración de la leche, e hinchamiento o dureza de la glándula mamaria. Algunos casos de la enfermedad clínica pueden ser graves y puede estar presente pirexia. Para un informe acerca de las manifestaciones clínicas de la mastitis por S. uberis, véase Bramley (1991), y Schalm et al. (1971). Los métodos de control antibacterianos convencionales, tales como la inmersión de la teta y la terapia con antibióticos, son eficaces para el control de muchos tipos de mastitis contagiosas, pero los organismos ambientales que generalmente se encuentra en todos los establos lecheros a menudo son resistentes a estas medidas. Por tanto, estas medidas no influyen en la incidencia de la mastitis provocada por patógenos ambientales, tales como Streptococcus uberis y Escherichia coli, que en la actualidad son responsables de más del 95% de los casos de mastitis. De estas dos especies, S. uberis es el patógeno ambiental más importante, tal como se muestra en los estudios ejecutados en el Reino Unido (Hillerton et al., 1993), en Nueva Zelanda (McDougall, 1998), en EEUU (Hogan et al., 1989), y en los Países Bajos (Animal Health Service, 2000). También hay pruebas de que S. uberis, después de que la infección se haya establecido a partir del ambiente, puede extenderse directamente desde una vaca infectada a un animal susceptible (Neave et al., 1969; Oliver et al., 1999; Zadoks et al., 2001). Existen varias cepas de S. uberis que se diferencian en virulencia y antigenicidad.

El fracaso de los métodos actuales que se dirigen al control de la mastitis por S. uberis han conducido a la búsqueda de medidas de control alternativas, tales como vacunas más eficaces. Se han desarrollado varios tipos de vacunas hasta la fecha y se han ensayado en vacas.

La inmunización repetida de ganado de producción láctea con bacterias completas muertas ha dado como resultado la reducción del número de bacterias presentes en la leche tras la exposición experimental a la misma cepa (Leigh, 1999; Leigh, 2000). Sin embargo, la vacuna muerta no evita la infección ni la respuesta inflamatoria en la glándula mamaria, y no tiene efecto sobre la incidencia de la mastitis por S. uberis en el campo (Leigh, 1999). Por tanto, se

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concluye que la inmunización con bacterias muertas no es una solución al problema de la mastitis por S. uberis. La inmunización con S. uberis vivo induce una protección parcial contra la exposición experimental a la misma cepa (o una cepa homóloga) (Finch et al., 1997). Se logra protección en ausencia de actividad opsonizante y sin un gran influjo de neutrófilos. Sin embargo, la vacuna no parece proteger frente a otras cepas de S. uberis. El éxito relativamente bajo de estas estrategias de vacunas de células completas indica que es difícil proteger a un animal frente a S. uberis empleando vacunas de bacterias completas convencionales.

En fechas más recientes, se ha producido una vacuna de subunidades, basada en una proteína de S. uberis (Fontaine et al., 2002). La publicacón de dicha vacuna de subunidades no ha conducido, hasta la fecha, a un seguimiento, lo cual ha conducido a la conclusión de que las probabilidades de encontrar una única proteína que proteja a un animal frente a varios tipos de S. uberis son pequeñas, y las vacunas de subunidades de este tipo en general no son la respuesta al problema del control de la mastitis por S. uberis.

En resumen, la mastitis provocada por S. uberis no se evita ni se cura con eficacia mediante la vacunación con bacterias muertas, vivas o completas, o mediante una vacuna de subunidades que comprenda una proteína.

A pesar de los anteriores resultados desalentadores de la vacunación contra la mastitis por S. uberis, los inventores indican en la presente que la mastitis provocada por una diversidad de cepas de S. uberis puede prevenirse y/o disminuirse con éxito utilizando una composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmunológica contra

S. uberis.

La presente invención proporciona un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o tipos de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas y/o tipos de Streptococcus uberis; y

c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o tipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o tipo de Streptococcus uberis.

Además, la presente invención indica que una combinación de al menos dos proteínas de la superficie de S. uberis aisladas o recombinantes, o una parte inmunogénica de estas, en una composición antigénica potencia considerablemente la respuesta inmunológica contra cepas de S. uberis. Mientras que las vacunas de células bacterianas completas, que comprenden muchas proteínas inmunogénicas bacterianas, no provocan una amplia protección contra diversas cepas de S. uberis, dos o más proteínas, o una parte inmunogénica de estas, en una composición inmunogénica de la invención tienen el efecto deseado de potenciar la respuesta inmunológica contra

S. uberis. Los inventores indican en la presente invención que la selección de al menos dos proteínas inmunogénicas, o de una parte inmunogénica de estas, de un organismo de S. uberis, y preferiblemente de al menos dos cepas o tipos de organismos de S. uberis, y la combinación de dichas al menos dos proteínas inmunogénicas, o de una parte inmunogénica de estas, en una composición inmunogénica potencia la inmunidad frente a diferentes cepas de S. uberis, porque la respuesta inmunológica se dirige contra una gama más amplia de organismos de S. uberis diferentes.

Para provocar una respuesta inmunológica en un sujeto o un animal, preferiblemente se presenta una parte inmunogénica de una proteína a dicho sujeto o animal. En esta invención, la expresión "sitio inmunogénico" se emplea de modo intercambiable con la expresión "parte inmunogénica". Una "parte o sitio inmunogénico" significa una parte de una proteína que es capaz de provocar una respuesta inmunológica en un sujeto. Preferiblemente, dicha parte inmunogénica de una proteína comprende uno o más epitopos y, así, provoca una respuesta inmunológica. Un1a parte inmunogénica comprende al menos 5 aminoácidos, preferiblemente al menos 10-15, y lo más preferiblemente 25 o más aminoácidos consecutivos. Un epitopo conformacional en general está formado por varios tramos de aminoácidos consecutivos que están plegados en posición y que, juntos, forman un epitopo cuando la proteína toma su estructura tridimensional. La presente invención también describe el uso de epitopos conformacionales como partes inmunogénicas.

Un derivado de una proteína se define como una proteína, que tiene el mismo tipo de propiedades inmunogénicas, pero no necesariamente en la misma cantidad. Los expertos en la técnica son capaces de alterar una proteína, de modo que las propiedades inmunogénicas de dicha molécula son fundamentalmente del mismo tipo, pero no necesariamente están en la misma cantidad. Puede proporcionarse un derivado de una proteína de muchas formas, por ejemplo, mediante la sustitución de aminoácidos conservativa, por ejemplo, mediante la sustitución de un aminoácido en una proteína por otro aminoácido. En el cartografiado de sustitución convencional, se realizan preferiblemente cambios conservativos como, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido que comprende una

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cadena lateral ácida por otro aminoácido que comprende una cadena lateral ácida, aminoácidos voluminosos por aminoácidos voluminosos, aminoácidos que comprenden una cadena lateral básica por aminoácidos que comprenden una cadena lateral básica, aminoácidos que comprenden una cadena lateral polar sin carga por aminoácidos que comprenden una cadena lateral polar sin carga, y aminoácidos que comprenden una cadena lateral no polar por aminoácidos que comprenden una cadena lateral no polar. Los expertos en la técnica son capaces de generar compuestos análogos de una proteína. Esto se hace, por ejemplo, a través de la selección de un banco de péptidos o mediante programas de cambio de péptidos. Para su uso como un inmunógeno, un péptido se sintetiza con las características apropiadas para asegurar una alta probabilidad de éxito en la producción de anticuerpos. Esto incluye un grupo carboxilo libre C-terminal si el péptido es la secuencia C-terminal real de la proteína nativa, y un grupo amino N-terminal libre si el péptido es la secuencia N-terminal real de la proteína nativa. Este análogo tiene fundamentalmente el mismo tipo, pero no necesariamente en la misma cantidad, de propiedades inmunogénicas que dicha proteína.

Una proteína o un péptido se somete a una degradación mediante una serie de fuerzas diferentes tales como, por ejemplo, proteolisis, desplegamiento, valores extremos de pH, detergentes y altas concentraciones salinas. Para prolongar la vida de una proteína o un péptido recombinante, dicha proteína o péptido se prepara para que sea más estable para aguantar la degradación, por ejemplo, sintetizando dicho péptido con una carboxamida C-terminal y/o acetilando el extremo N-terminal para mantener las características de carga nativas. Esto se realiza mediante mutaciones utilizando una estrategia de mutación estabilizante para inhibir los procesos de desplegamiento locales que, en general, hacen que la proteína sea susceptible a la autolisis. Dicha estrategia de mutación estabilizante se basa en principios generalmente aceptados de estructura y estabilidad de las proteínas tal como se describe, por ejemplo, en Matthews (1991), Alber (1991), Vriend y Eijsink (1993), y Fersht y Serrano (1993).

En una realización, una composición inmunogénica comprende una composición que comprende al menos dos proteínas de la superficie aisladas o recombinantes, o un derivado o un análogo y/o partes inmunogénicas de estas, en la que la administración de la composición a un sujeto o a un animal, preferiblemente una vaca, da como resultado el desarrollo de una respuesta inmunológica humoral y/o celular a dichas proteínas de la superficie o sus partes inmunogénicas.

Una respuesta inmunogénica comprende el desarrollo de una respuesta inmunológica humoral y/o celular dirigida contra dicha proteína o sus partes inmunogénicas en un sujeto o un animal, preferiblemente una vaca. Una respuesta inmunológica humoral conduce a la producción de anticuerpos en un sujeto o un animal, mientras que una respuesta inmunológica celular potencia, de modo dominante, la formación de células inmunológicas reactivas. En general, ambas partes de la respuesta inmunológica son provocadas por la administración de una proteína inmunogénica o una parte de esta. Una respuesta inmunológica preferida contra S. uberis es la producción de anticuerpos. Preferiblemente, dicha respuesta inmunológica evita y/o disminuye la mastitis y/o disminuye el número de organismos de S. uberis en la ubre. La presente invención describe métodos para seleccionar y producir proteínas y epitopos para provocar dicha respuesta de anticuerpos. Otra respuesta inmunológica preferida contra S. uberis es la respuesta inmunológica celular. La presente invención también describe métodos para seleccionar epitopos de células T de proteínas de la superficie, y para producir epitopos de células T que provocan una reactividad potenciada de las células T, por ejemplo, acoplando múltiples epitopos de células T preseleccionados en forma de collar de cuentas como se describe, por ejemplo, en Van der Burg et al. (documento WO 97/41440).

En un ejemplo de la invención, dicha composición inmunogénica es capaz de disminuir la duración y/o la gravedad de la infección y/o aumentar la resistencia del animal a una infección por S. uberis.

La presente invención indica que se prefiere una respuesta inmunológica dirigida contra la parte exterior de S. uberis. Por tanto, la presente invención describe una composición inmunogénica, o una parte inmunogénica de esta, que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra antígenos que están localizados preferiblemente en la superficie celular, o cerca de esta, de S. uberis. Una proteína de la superficie comprende proteínas que, en la naturaleza, están preferiblemente cerca de la superficie, o sobre esta, de una bacteria de S. uberis y/o proteínas que, en la naturaleza, son preferiblemente producidas y/o excretadas de modo extracelular por una bacteria de S. uberis. Dichas proteínas de la superficie preferiblemente presentan proteínas homólogas en otras cepas de S. uberis. Por tanto, la respuesta inmunológica provocada con las proteínas inmunogénicas, o partes de estas, derivadas de una cepa de S. uberis también es eficaz contra otra cepas de S. uberis. Así, la presente invención describe una composición inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmunológica contra S. uberis, comprendiendo dicha composición al menos dos proteínas de la superficie aisladas y/o recombinantes derivadas de Streptococcus uberis y/o una parte inmunogénica de cualquiera o de ambas proteínas.

La expresión "proteína recombinante" se refiere a una proteína producida mediante técnicas de ADN recombinante, es decir, producida por una célula transformada con una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína deseada. Dicha construcción de ácido nucleico, por ejemplo, es una construcción de ADN recombinante con una secuencia reguladora, tal como una secuencia de promotor y/o terminador y/o una secuencia potenciadora, que controla la secuencia de expresión.

La expresión "proteína aislada" se refiere a una proteína discreta y separada del organismo completo, con el que la molécula se encuentra en la naturaleza y/o una proteína exenta, totalmente o en parte, de sustancias que

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normalmente están asociadas con ella en la naturaleza. Dicha composición inmunogénica comprende al menos dos proteínas, o una parte inmunogénica de estas, derivadas del mismo organismo de S. uberis, o comprende al menos una proteína, o una parte inmunogénica de esta, de un tipo de S. uberis y al menos una proteína, o una parte inmunogénica de esta, de otro tipo de S. uberis. La invención también describe la combinación de al menos 3 o 4 o más proteínas, o una parte inmunogénica de estas, de las cuales una o dos o más se derivan de otros tipos de S. uberis.

Preferiblemente, la composición inmunogénica, o una parte inmunogénica de esta, comprende proteínas de al menos dos organismos de S. uberis diferentes, porque la amplia respuesta inmunológica resultante es de protección cruzada, es decir, se dirige contra diferentes tipos de S. uberis. Además, el uso de proteínas inmunogénicas, o una parte inmunogénica de estas, de al menos dos tipos de S. uberis disminuye la probabilidad de que se desarrollen mutantes de escape de organismos de S. uberis. Los mutantes de escape de los organismos bacterianos en general se desarrollan bajo un estrés ambiental, por ejemplo, en presencia de un antibiótico o en presencia de anticuerpos contra un epitopo de dicho organismo. Mediante variaciones naturales tales como, por ejemplo, provocadas por una baja frecuencia de mutación en un organismo, algunos organismos de dicha población son más inhibidos en su replicación por dichos anticuerpos que otros, que escapan del efecto inhibidor de la presencia de dichos anticuerpos y siguen multiplicándose, obteniendo con ello un papel predominante en la nueva población. La posibilidad de que se desarrolle un mutante de escape para varios epitopos diferentes al mismo tiempo es más pequeña que la posibilidad de que se desarrolle un mutante de escape para un solo epitopo. Una composición inmunogénica y/o una parte inmunogénica de esta preferiblemente provocan una respuesta inmunológica contra al menos dos proteínas que preferiblemente provoca una protección amplia contra la infección y disminuye las señales clínicas de la mastitis.

Las proteínas que son importantes para el metabolismo, la supervivencia o la multiplicación de un organismo bacteriano se conocen en general como proteínas esenciales de un organismo. La secuencia y la función de dichas proteínas esenciales en general están bastantes conservadas entre diferentes tipos de S. uberis. En un ejemplo preferido de la invención, dichas proteínas inmunogénicas son proteínas esenciales de un S. uberis. De esta manera, la respuesta inmunológica se dirige contra una proteína esencial, o una parte inmunogénica de esta, formando así una defensa contra un organismo de S. uberis homólogo, pero también una defensa de reactividad cruzada contra diferentes tipos de S. uberis, porque dicha proteína conservada o proteína esencial también está presente sobre la superficie de otros tipos de S. uberis. Por tanto, el uso de una proteína de la superficie esencial de un organismo de S. uberis como proteína inmunogénica aumenta la eficacia protectora de la respuesta inmunológica contra la infección por diferentes tipos de organismos de S. uberis y disminuye la posibilidad de que dichos organismos escapen de la respuesta inmunológica.

Los antígenos capsulares de S. uberis son, en general, buenos epitopos inmunogénicos, porque los antígenos capsulares pueden ser detectados con facilidad por sueros convalecientes de vacas (que han sufrido una mastitis por S. uberis). Dichas propiedades inmunogénicas son capaces de potenciar la respuesta inmunológica contra epitopos inmunogénicos de S. uberis relacionados. Por tanto, en otra realización, la composición inmunogénica comprende al menos un antígeno capsular, además de las proteínas inmunogénicas, porque dicho antígeno capsular aumenta la respuesta inmunológica contra dicha composición inmunogénica.

La presente solicitud de patente describe, en la tabla 5 y la tabla 6, proteínas de la superficie aisladas o recombinantes preferidas derivadas de S. uberis y seleccionadas por su capacidad para provocar una respuesta inmunológica contra diferentes cepas de S. uberis.

En un ejemplo preferido, se realiza una selección de las proteínas de la tabla 5 y/o tabla 6, y se realiza una combinación de dos o más proteínas, como por ejemplo, la proteína n.º 63 y/o una parte inmunogénica de esta de la cepa O140J de S. uberis, junto con la proteína n.º 15 o 22 y/o ambas y/o una parte inmunogénica de estas de la cepa 41-241 de S. uberis. Dicha selección proporciona proteínas, o sus partes inmunogénicas, procedentes de dos cepas diferentes de S. uberis, proporcionando con ello una amplia protección contra varias cepas de S. uberis.

En una realización preferida, la selección de las proteínas de la tabla 5 y/o tabla 6 comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, y P105. Como se indicó anteriormente, estas proteínas son reconocidas por anticuerpos presentes en sueros de animales infectados por S. uberis, lo cual indica que estas proteínas se expresan in vivo y son inmunogénicas en vacas, o presentan reactividad cruzada entre al menos dos cepas de S. uberis, según se muestra en la tabla 5.

Las proteínas identificadas en el ejemplo 11 son especialmente útiles para provocar una respuesta inmunológica. En una realización aún más preferida de estas, la selección de las proteínas de la tabla 5 y/o tabla 6 comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, y P105. Lo más preferiblemente, la selección de las proteínas de la tabla 5 y/o tabla 6 comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en P15, P16, P54, P28, P63, y P105. Como se indicó anteriormente, esta última selección de proteínas es expresada por todas las cepas de S. uberis que provocan la respectiva infección del ejemplo 11, son expresadas durane la infección en el hospedante y son muy inmunogénicas. La numeración de las anteriores proteínas, caracterizadas por ejemplo en la tabla 5, se refiere a las proteínas mostradas, por ejemplo, en las tablas

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1, 2 y 3, que muestran ejemplos no limitantes de proteínas de la superficie comunes de S. uberis. Además, la figura 4 muestra ejemplos no limitantes de secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de estos factores de virulencia/proteínas de la superficie putativas seleccionadas de S. uberis.

A menudo se encuentra un número bajo de bacterias en la leche o sobre la ubre o en la ubre bajo condiciones de campo, y no es necesario que sean perjudiciales para un animal. Una mastitis puede desarrollarse cuando el número de bacterias, por ejemplo, organismos de S. uberis, aumenta en la leche o en la ubre. Una respuesta inmunológica, provocada por las proteínas, o por partes inmunogénicas de estas, según la invención es preferiblemente eficaz para inhibir, al menos en parte, el crecimiento bacteriano de organismos de Streptococcus uberis en una ubre. La disminución del número de organismos de S. uberis en el ambiente directo también ayuda a prevenir la mastitis. La presente invención describe el modo de prevenir y/o disminuir la mastitis por S. uberis mediante la inmunización de vacas, manteniendo bajo, con ello, el número de organismos de S. uberis. Dicho nivel bajo de organismos de S. uberis se mantiene aún más bajo aplicando un régimen higiénico durante el ordeño, por ejemplo, limpiando la ubre, las tetas y todos los aparatos que se ponen en contacto con la ubre y/o las tetas.

Las proteínas de la superficie aisladas y/o recombinantes derivadas de S. uberis son producidas, en una realización, por un sistema de producción que emplea una célula procariota o una célula eucariota. Los ejemplos de células con sistemas de hospedante/vector bien desarrollados para la producción de proteínas recombinantes son, por ejemplo, para las bacterias Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus y Lactobacillus; y para las levaduras Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia y Candida; y para los hongos Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium y Trichoderma.

Para la producción de una proteína recombinante de interés, el gen que codifica dicha proteína, o una parte de esta, se integra en el genoma, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o de modo aleatorio, o dicho gen se coloca en un vector plasmídico o en un vector de fago, que se mantiene y se expresa de modo estable en el microorganismo o la célula seleccionados. Para la expresión de la construcción de ADN seleccionada en el microorganismo o la célula, el gen se transcribe y se traduce bajo el control de un promotor y un terminador. Preferiblemente, dicho promotor y terminador son adecuados para el microorganismo seleccionado. Los promotores y los terminadores adecuados para diversos microorganismos se describen en Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology), vol. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan (1990)", y los preferidos para levaduras en "Adv. Biochem. Eng., 43, 75-102 (1990)" y en "Yeast, 8, 423-488 (1992)". Por ejemplo, los vectores plasmídicos adecuados adecuados para Escherichia, más específicamente para Escherichia coli, son los plásmidos de la serie pBR y pUC, y los promotores adecuados comprenden el promotor lac (!-galactosidasa), el operón trp (operón de triptófano) y el promotor tac (promotor híbrido lac-trp) y los promotores dervados del fago ∀ PL o PR. Los terminadores preferidos comprenden trpA o el terminador ribosómico rrnB derivado de fago. Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Streptococcus comprenden, por ejemplo, pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett., 26, 239 (1985)) y pGK1 (Appl. Environ. Microbiol., 50, 94 (1985)). Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Lactobacillus comprenden, por ejemplo, los descritos para Streptococcus, como por ejemplo pAM!1 (J. Bacteriol., 137, 614 (1979)). Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Saccharomyces, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae, comprenden por ejemplo los vectores de la serie YRp, YEp, YCp y YIp. Un vector de integración (documento EP 5327456) construido aplicando la recombinación homóloga del ADN ribosómico con múltiples copias en el cromosoma resulta adecuado para la inserción de múltiples copias y para el control de genes estables. Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Kluyveromyces, preferiblemente Kluyveromyces lactis, comprenden por ejemplo la serie del plásmido 2 #m derivada de Saccharomyces cerevisiae, plásmidos de la serie pKD1 (J. Bacteriol., 145, 382390 (1981)), y el plásmido derivado de pGK11 implicado en la actividad asesina, el plásmido de la serie KARS con el gen de replicación autónoma de Kluyveromyces y un vector de integración (documento EP 537456). Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Pichia comprenden, por ejemplo, el sistema de hospedante-vector desarrollado en Pichia pastoris utilizando un gen que está implicado en la replicación autónoma en Pichia (Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)). Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Candida comprenden, por ejemplo, el sistema de hospedante-vector desarrollado en Candida maltosa, Candida albicans y Candida tropicalis (Agri. Biol. Chem., 51, 51, 1587 (1987)). Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Aspergillus comprenden, por ejemplo, un vector construido mediante la integración del gen en el plásmido o cromosoma y el promotor para la proteasa o amilasa extracelular (Trends in Biotechnology, 7, 283-287 (1989)). Los vectores plasmídicos adecuados para la producción recombinante en Trichoderma comprenden, por ejemplo, el sistema de hospedante-vector desarrollado en Trichoderma reesei, y el promotor para la celulasa extracelular, que es adecuado para la construcción del vector (Biotechnology, 7, 596-603 (1989)).

Preferiblemente, dicho sistema de producción se proporciona con una construcción de ácido nucleico, preferiblemente una construcción de ADN, que codifica una proteína de la tabla 5 y/o la tabla 6, o una parte inmunogénica de esta.

En otra realización, dicho sistema de producción se proporciona con una construcción de ADN que codifica dos o tres o cuatro o incluso más proteínas de la tabla 5 y/o la tabla 6, o una parte inmunogénica de estas.

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En otra realización, dicho sistema de producción se proporciona con al menos dos construcciones de ADN, que codifican cada una al menos una proteína de la tabla 5 y/o la tabla 6, o una parte inmunogénica de esta.

En otra realización preferida, dicha proteína de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, y P105. Aún más preferiblemente, dicha proteína de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, y P105. Lo más preferiblemente, dicha proteína de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P54, P28, P63, y P105.

En una realización más preferida, dicha construcción de ácido nucleico codifica una proteína de fusión, que comprende epitopos inmunogénicos derivados de más de una proteína de S. uberis. Más preferiblemente, dicha proteína de fusión comprende epitopos derivados de proteínas derivadas de más de una cepa de S. uberis.

En otra realización, dicha construcción de ácido nucleico codifica epitopos que han sido modificados para potenciar la respuesta inmunológica humoral y/o celular. Por tanto, la presente solicitud describe un método para producir una composición inmunogénica que comprende al menos dos proteínas de S. uberis capaces de provocar una respuesta inmunológica contra Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método proporcionar una célula con un vector recombinante, comprendiendo dicho vector un ácido nucleico que codifica al menos dos proteínas listadas en la tabla 5 y/o la tabla 6 y/o una parte inmunogénica, un análogo o un derivado de cualquiera o de ambas de dichas proteínas. Para la producción recombinante de una proteína a partir de un ácido nucleico, dicho ácido nucleico preferiblemente se coloca bajo el control de una secuencia reguladora inducible capaz de potenciar la expresión de dicha proteína, preferiblemente dando como resultado un mayor rendimiento de la proteína. Preferiblemente, la acumulación de dicha proteína recombinante, o una parte inmunogénica de esta, es citoplásmica, por ejemplo, en los casos en que la proteína recombinante producida se recolecta de las células, o la proteína se excreta, por ejemplo, cuando la proteína producida se recolecta del fluido de cultivo. Por tanto, la construcción recombinante que codifica dicha proteína inmunogénica se proporciona con las secuencias reguladoras correctas y/o un promotor unido funcionalmente para la acumulación intracelular o extracelular.

Por tanto, la presente invención describe una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos dos proteínas listadas en la tabla 5 y/o la tabla 6 y/o una parte inmunogénica, un análogo o un derivado de cualquiera o de ambas de dichas proteínas bajo el control de un promotor unido funcionalmente.

En una realización preferida, dicha proteína de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, y P105. Aún más preferiblemente, dicha proteína de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, y P105. Aún más preferiblemente, dicha proteína de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P54, P28, P63, y P105.

La solicitud también describe un portador recombinante vivo que comprende una secuencia de ácido nucleico o una molécula de ADN de la invención. En una realización preferida, el portador es una primera cepa de S. uberis, y el ácido nucleico recombinante codifica epitopos inmunogénicos de otra cepa de S. uberis. Por tanto, la presente invención describe un portador recombinante vivo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una

o más proteínas listadas en la tabla 5 y/o la tabla 6 y/o una parte inmunogénica, un análogo o un derivado de cualquiera o de ambas de dichas proteínas bajo el control de un promotor unido funcionalmente. Por supuesto, dicho portador recombinante vivo también es inmunogénico cuando muere. Por tanto, la presente invención también describe un portador recombinante muerto.

La solicitud describe también una célula hospedante aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más proteínas listadas en la tabla 5 y/o la tabla 6 y/o una parte inmunogénica, un análogo o un derivado de cualquiera o de ambas de dichas proteínas bajo el control de un promotor unido funcionalmente. Una célula hospedante aislada comprende, por ejemplo, una célula bacteriana tal como, por ejemplo, Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Lactobacillus, o una levadura tal como, por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia, Candida, o un hongo tal como, por ejemplo, Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium, y/o Trichoderma. Con la célula hospedante aislada mencionada anteriormente que comprende una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más proteínas listadas en la tabla 5 y/o la tabla 6 y/o una parte inmunogénica, un análogo o un derivado de cualquiera o de ambas de dichas proteínas bajo el control de un promotor unido funcionalmente, la presente invención describe, a los expertos en la técnica, cómo producir una molécula proteica recombinante. Debido al variación entre diferentes cepas de S. uberis, las proteínas y los péptidos procedentes de diversas cepas pueden mostrar una ligera variación en la secuencia de aminoácidos y seguir teniendo la misma función. Por tanto, una molécula proteica derivada de una cepa de S. uberis tiene identidad de secuencia con una molécula proteica idéntica desde el punto de vista funcional de otra cepa de S. uberis. La "identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos después de alinear las dos secuencias y de introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Los métodos y los programas informáticos para el alineamiento son muy conocidos en la

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técnica. Un programa informático que puede utilizarse o adaptarse para el objetivo de determinar si una secuencia candidata se ajusta a esta definición es "Align 2", desarrollado por Genentech, Inc., que se presentó con la documentación del usuario en the United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559, el 10 de diciembre, 1991. Dos secuencias de aminoácidos tienen un alto grado de "identidad de secuencia" entre sí cuando las secuencias muestran al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de las moléculas después del alineamiento. Por tanto, la presente solicitud describe una molécula proteica aislada y/o recombinante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína codificada por un ácido nucleico según la invención. En un ejemplo preferido, la invención describe una molécula proteica aislada y/o recombinante que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con una molécula proteica codificada por un ácido nucleico según la invención.

Para inducir o provocar una respuesta inmunológica en un animal contra una proteína o una parte inmunogénica de la invenciíon, a dicho animal se le proporciona una proteína y/o una parte inmunogénica que comprende al menos un sitio inmunogénico. Una parte o sitio inmunogénico de una proteína está formado por uno o más epitopos y, así, es capaz de provocar una respuesta inmunológica. Un sitio inmunogénico preferiblemente comprende al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 10-15, y lo más preferiblemente 25 o más aminoácidos consecutivos. La invención, en otro ejemplo preferido, describe una proteína, o una parte inmunogénica de esta, que comprende al menos un tramo de 25 aminoácidos consecutivos de una molécula proteica codificada por un ácido nucleico según la invención. Preferiblemente, dicho tramo de al menos 25 aminoácidos consecutivos comprende un sitio inmunogénico. Una molécula de ácido nucleico recombinante en una realización preferida codifica al menos una proteína o una proteína de fusión que codifica al menos dos proteínas, o partes inmunogénicas de estas. En una realización preferida, dicha proteína de fusión comprende partes inmunogénicas de al menos dos cepas de S. uberis. Por tanto, la invención describe un ácido nucleico que codifica una molécula proteica.

La expresión de dicho ácido nucleico en una célula hospedante proporciona una proteína inmunogénica de la invención. Dicha proteína inmunogénica se incorpora preferiblemente en una composición inmunogénica.

Dicha proteína recombinante de la invención es producida por una célula hospedante. Como célula hospedante se emplean para la producción especies bacterianas tales como, por ejemplo, E. coli y/o células de levaduras, de hongos o eucariotas.

Una composición inmunogénica que incorpora una proteína aislada y/o recombinante y/o una célula que exponga dicha proteína es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra Streptococcus uberis cuando se administra a un animal, preferiblemente una vaca. Preferiblemente, dicha célula que comprende un ácido nucleico de la invención bajo una secuencia reguladora adecuada expresa dicha proteína sobre la superficie. Dicha célula se denomina una célula portadora. Dicha célula portadora preferiblemente se incorpora en la composición inmunogénica. Preferiblemente, dicha célula que porta dicha proteína inmunogénica es un portador recombinante vivo, pero en otra realización, dicha célula portadora es capaz de provocar una respuesta inmunológica cuando la célula se mata, por ejemplo, mediante un tratamiento con formaldehído. Debido a que una causa de mastitis en las vacas es el Streptococcus uberis, en un ejemplo preferido, dicho portador recombinante vivo o muerto es una especie de Streptococcus. En un ejemplo, dicha célula hospedante es una especie de Streptococcus. La molécula proteica, entonces, se presenta preferiblemente en el contexto de otras proteínas estreptocócicas, que potencian una respuesta inmunológica. Además, la inmunogenicidad puede potenciarse mediante la sobreexpresión de las proteínas recombinantes sobre la superficie de la célula hospedante, preferiblemente una célula estreptocócica. Además, el uso de diferentes cepas de células hospedantes estreptocócicas potencia la inmunogenicidad de las proteínas inmunogénicas o de partes de estas. Existen varias especies de estreptococos que también son adecuadas como célula hospedante, por ejemplo, S. suis o S. agalactiae o S. dysgalactiae.

Debido a las diferencias entre diversas especies de Streptococcus, y debido a que algunas proteínas, que se producen en la naturaleza sobre Streptococcus uberis, son capaces de ayudar a provocar una respuesta inmunológica contra Streptococcus uberis, en una realización preferida se emplea Streptococcus uberis atenuado como portador recombinante vivo en una composición inmunogénica. Preferiblemente, dicho organismo de S. uberis expresa proteínas de otra cepa de S. uberis, describiendo con ello una vacuna diferenciadora, porque el suero de un animal vacunado con dicha vacuna es discernible del suero de un animal infectado con una infección de campo, mediante la detección de anticuerpos contra proteínas de ambas cepas. En otra realización, dicho organismo de S. uberis es sustituido como célula hospedante o como portador vivo o muerto por un S.suis, o una especie de Staphylococcus o un E.coli, vivos o muertos.

La administración de una proteína inmunogénica, o de una parte de esta, o la administración de un ácido nucleico que codifica dicha proteína de la invención, provoca una respuesta inmunológica. Dicho ácido nucleico, cuando se administra a una vaca, se expresa en las células de dicha vaca y es reconocido por el sistema inmunológico de dicha vaca. Con ello, el ácido nucleico actúa como composición inmunogénica como, por ejemplo, una vacuna de ADN contra la mastitis.

Debido a que la composición inmunogénica provoca una respuesta inmunológica en un animal, preferiblemente una vaca, la proteína reduce las enfermedades relacionadas con la mastitis y mejora la salud de dichas vacas, haciendo con ello que las vacas sean mucho más resistentes a otras infecciones (secundarias).

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Preferiblemente, la composición inmunogénica se emplea para fabricar un medicamento contra la mastitis por Streptococcus uberis que reduce la enfermedad específica como resultado de una mastitis provocada por Streptococcus uberis.

Una composición inmunogénica también se emplea para producir o formular una vacuna contra la mastitis. Una vacuna, en general, evita que animales o seres humanos contraigan una enfermedad. Preferiblemente, la composición inmunogénica es capaz de prevenir la mastitis.

En otra realización, la composición inmunogénica se emplea preferiblemente para disminuir y/o controlar el número de organismos de S. uberis en la leche y/o en la ubre de la vaca. El proceso de ordeño en una granja de producción láctea comprende un peligro potencial de transferir organismos de S. uberis desde una vaca enferma a otra vaca. Por tanto, la disminución del número de organismos de S. uberis es lo más adecuado para evitar la dispersión de la infección desde la teta de una ubre a otra teta de la ubre y/o de un animal a otro animal.

Para la administración de una composición inmunogénica a un sujeto, la mezcla de las proteínas, o las partes inmunogénicas de estas, o las células hospedantes con un portador adecuado facilita la aceptación por un sujeto de la composición inmunogénica y aumenta el efecto inmunogénico de la composición. Un portador adecuado comprende, por ejemplo, un adyuvante adecuado para aumentar el efecto inmunizante de dicha composición inmunogénica. Los expertos en la técnica conocen muchos adyuvantes adecuados, con una base de aceite o con una base acuosa, por ejemplo, el adyuvante Diluvacforte® o el adyuvante Specol®. En una realización, dicho portador adecuado comprende, por ejemplo, una disolución como, por ejemplo, disolución salina para diluir bacterias

o proteínas, o partes inmunogénicas de estas.

En un animal, preferiblemente una vaca, que se inmuniza con una composición inmunogénica descrita por la invención, se producen anticuerpos que se dirigen contra S. uberis. La presencia y el nivel de dichos anticuerpos son indicativos de la inmunidad después de la inmunización con una composición inmunogénica o una vacuna. Dichos anticuerpos preferiblemente no se dirigen contra epitopos que están presente en cepas de S. uberis de tipo salvaje en el campo. Para discernir entre un animal vacunado y un animal que tiene una infección del tipo de campo, la inmunidad de dicho animal vacunado, en una realización, preferiblemente se mide midiendo los anticuerpos dirigidos contra dicha composición inmunogénica. El antisuero de dicha vaca vacunada también se ensaya para la presencia de anticuerpos contra antígenos de S. uberis, que no están presentes en la composición inmunogénica. La detección de anticuerpos contra un antígeno de S. uberis que no está presente en la composición inmunogénica o vacuna es una indicación de una infección de tipo salvaje. Por tanto, la presente invención describe un método para medir la inmunidad de un animal contra S. uberis, comprendiendo dicho método determinar, en al menos una muestra procedente de dicho animal, la presencia de anticuerpos dirigidos contra una proteína seleccionada de la tabla 5 y/o la tabla 6, o una parte inmunogénica de esta. En una realización preferida, dicha proteína seleccionada de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, y P105. Aún más preferiblemente, dicha proteína seleccionada de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, y P105. Lo más preferiblemente, dicha proteína seleccionada de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P54, P28, P63, y P105.

Para la detección de anticuerpos que se unen a la composición inmunogénica descrita por la invención, un kit de diagnóstico que comprenda al menos una de las proteínas de la tabla 5 y/o la tabla 6, o una parte inmunogénica de estas, es adecuado. La unión de un anticuerpo a dicha proteína, o a una parte inmunogénica de esta, se detecta mediante, por ejemplo, detección de anticuerpos inmunofluorescentes o detección de anticuerpos acoplados a enzimas o mediante cualquier otro medio de detección de anticuerpos unidos a dicha proteína, o a una parte inmunogénica de esta.

En una realización preferida, dicha al menos una de las proteínas de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, y P105. Aún más preferiblemente, dicha al menos una de las proteínas de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93, y P105. Lo más preferiblemente, dicha al menos una de las proteínas de la tabla 5 y/o 6 se selecciona del grupo que consiste en P15, P16, P54, P28, P63, y P105.

Por tanto, la presente invención describe un kit de diagnóstico que comprende al menos una proteína seleccionada de la tabla 5 y/o la tabla 6, o una parte inmunogénica de esta, y un medio para detectar un anticuerpo que se une a dicha proteína, o a dicha parte inmunogénica de esta. Este kit de diagnóstico es, por ejemplo, un ensayo ELISA o cualquier otro ensayo adecuado para seleccionar sueros. Preferiblemente, dicho kit de ensayo es adecuado para seleccionar un gran número de sueros.

En otra realización, se emplea un ácido nucleico para la detección de animales infectados por cepas de S. uberis de tipo salvaje en una población de animales vacunados con una composición inmunogénica o una vacuna. Esta detección se logra, por ejemplo, utilizando una PCR.

La presente solicitud de patente indica que las proteínas inmunogénicas adecuadas son moleculas proteicas y/o proteínas accesibles para los anticuerpos en la superficie bacteriana y comunes a una serie de cepas de S. uberis. Como ejemplo, se identificaron proteínas de la superficie a partir de secuencias del genoma de las cepas 41-241 y

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O140J mediante la selección de genes que contienen una o más secuencias que se encuentran habitualmente en las proteínas de la superficie de bacterias gram-positivas como, por ejemplo, un motivo de sortasa LPXTG necesario para anclar la proteína a la pared celular, o un motivo de unión de lípidos necesario para lipoproteínas, o una secuencia señal o una región transmembrana que predice una localización en la superficie de la proteína codificada.

La presente solicitud describe la presencia de proteínas seleccionadas en cepas de S. uberis, según se estudia sondando el ADN cromosómico de una serie de cepas de S. uberis con productos de la PCR obtenidos a partir de los genes seleccionados como se ha mencionado anteriormente.

La invención se explica más a fondo en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que solo sirven para aclarar la invención. Pueden realizarse muchas realizaciones alternativas, que están dentro del alcance de la presente invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Análisis FACS de cepas de S. uberis intactas. Se incubaron las cepas 41-241 (A) y O140J (B) de S. uberis con suero inmunológico de ratón (barras oscuras) o con el correspondiente suero preinmunológico (barras claras). Los anticuerpos unidos se detectaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con FITC. Los datos se expresan como la mediana de la fluorescencia asociada con las células bacterianas. Se consideró que una fluorescencia ∃ 10 (2 x fondo) era positiva. Los números de los sueros utilizados se refieren a los números del gen/proteína según se indica en las tablas 1 a 4.

Figura 2. Patrones del proteoma bidimensionales teñidos con azul brillante de Coomassie. Se sondaron lisados de las cepas 41-241 (A) y O140J (B) de S. uberis en crecimiento exponencial con suero bovino obtenido de vacas después de una infección experimental con la cepa O140J. Se identificaron las proteínas encerradas en un círculo como proteínas inmunogénicas. Las propiedades de las proteínas identificadas se analizaron mediante una digestión tríptica dentro del gel. La espectrometría de masas MALDI-TOF se muestra en la tabla 6.

Figura 3. Infección de vacas con la cepa O140J o la cepa 41-241 de S. uberis.

3A. Las vacas 6716 y 6717 fueron infectadas a través del conducto de la leche con la cepa O140J de S. uberis. Las vacas 6720 y 6721 fueron infectadas a través del conducto de la leche con la cepa 41-241 de S. uberis. Nótese que la vaca 6720 se infecta con 5000 cfu de S. uberis, y la vaca 6721 se infecta con 500 cfu de S. uberis. SSC significa recuentos de células somáticas en la leche. BO significa investigación bacteriana y se presenta como el número de organismos como unidades formadoras de colonias (cfu) aisladas a partir de la leche. RV significa cuarto anterior derecho. LA significa cuarto posterior izquierdo.

3B. Señales clínicas y resultados bacterianos y citológicos de las vacas 6718 y 6719 después de una infección con la cepa O140J de S. uberis.

3C. Señales clínicas y resultados bacterianos y citológicos de las vacas 6722 y 6723 después de una infección con la cepa 41-241 de S. uberis.

Figura 4. Secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de las proteínas de S. uberis de la tabla 5.

Ejemplos

Ejemplo 1: Selección de antígenos de la superficie comunes

Análisis de la secuencia de ADN. Se ha determinado la secuencia de ADN de la cepa 41-241 de S. uberis con una cobertura 2x. Los datos de secuenciación se reunieron para obtener 572 secuencias contiguas que contienen 1815 ORF. La cepa O140J de S.uberis (Hill, 1988) se secuenció en el centro Sanger. También se reunieron los datos de la secuencia disponibles en el sitio de Sanger en abril de 2002 para obtener 61 cóntigos que contienen 1938 OFR.

Selección de antígenos de la superficie comunes. Los antígenos de vacunas satisfactorios son proteínas que son accesibles a los anticuerpos en la superficie bacteriana y son comunes a una serie de cepas de S. uberis. Las proteínas de la superficie se identificaron a partir de secuencias del genoma de las cepas 41-241 y O140J seleccionando los genes que contienen una o más secuencias que forman un motivo de firma (véase M&M) que se encuentran habitualmente en proteínas de la superficie de bacterias gram-positivas. Entre todos los ORF analizados, 17 ORF contenían un motivo de sortasa LPXTG (tabla 1) necesario para anclar la proteína a la pared celular. Cuatro (P12, P23, P24 y P25) de estas 17 proteínas se encuentran exclusivamente en la cepa 41-241.

Treinta y un ORF contenían un motivo de unión de lípidos necesario para lipoproteínas (tabla 2).

Se encontraron todas estas proteínas en la cepa O140J, así como en la cepa 41-241. Además, se seleccionaron 87 ORF que contenían una secuencia señal o una región transmembrana que predice una localización en la superficie de la superficie codificada (tabla 3).

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Se encontraron estas proteínas en la cepa O140J, así como en la cepa 41-241.

Ejemplo 2: Distribución de los genes seleccionados entre diversos aislados clínicos y subclínicos de S. uberis

Para estudiar la presencia de los genes seleccionados entre diversas cepas de S. uberis, se realizaron experimentos de hibridación de manchas en los que el ADN cromosómico de un número considerable de cepas de S. uberis clínicas se sondaron con productos de la PCR obtenidos a partir de 99 de los genes seleccionados. Los datos (tabla 4) demuestran que la mayoría de los genes seleccionados se hibridan con la mayoría de las cepas de S. uberis, lo cual sugiere que la mayoría de los genes seleccionados están presentes de modo común entre las diversas cepas de S. uberis. Por contraste, 4 de los 99 genes ensayados solo se hibridan con un número limitado de cepas. Todos estos genes están presentes en la cepa 41-241 y codifican proteínas que tienen un motivo de sortasa LPXTG necesario para anclar la proteína a la pared celular.

Ejemplo 3: Inmunogenicidad de proteínas de la superficie seleccionadas

Para evaluar el papel de las proteínas como candidatos de vacunas, se clonaron las proteínas codificadas por los 115 genes seleccionados y se expresaron en E. coli con marcadores de polihistidina. Los productos de 106 de estos genes se clonaron con éxito y se expresarn en E. coli. Después se ensayaron los sueros obtenidos de vacas infectadas por S. uberis y de conejos inmunizados con células de S. uberis sonicadas o muertas con formaldehído para la presencia de anticuerpos específicos dirigidos contra las proteínas expresadas mediante un análisis de la transferencia Western. Los resultados (tabla 5) muestran que 19 de las proteínas expresadas fueron reconocidas por los anticuerpos presentes en el suero de animales infectados por S. uberis, lo cual indica que estas proteínas se expresan in vivo y son inmunogénicas en vacas. Además, 30 de las proteínas expresadas fueron reconocidas por anticuerpos presentes en el suero de conejos inmunizados con células de S. uberis sonicadas o muertas con formaldehído. Doce de las proteínas expresadas fueron reconocidas por los sueros obtenidos de vacas infectadas por S. uberis, así como por los sueros de conejos inmunizados con células de S. uberis sonicadas o muertas con formaldehído. Estos datos indican que la mayoría de las proteínas son antigénicas.

La tabla 5 también muestra que algunas proteínas fueron reconocidas por antisueros inducidos después de una infección experimental con ambas cepas 41-241 y O140J. Sin embargo, otras proteínas reaccionaron de modo positivo exclusivamente con los sueros obtenidos después de una infección con la cepa O140J o con los sueros obtenidos después de una infección con la cepa 41-241. Esto probablemente indica que existen diferencias entre las dos cepas en la expresión de proteínas in vivo o en la accesibilidad de las proteínas para el sistema inmunológico.

Ejemplo 4: Purificación de las proteínas seleccionadas

Para evaluar más a fondo el papel de las proteínas como candidatos a vacunas, se purificaron las 36 proteínas reconocidas por los sueros procedentes de vacas infectadas y/o por los sueros procedentes de conejos inmunizados. Además, se purificaron 4 proteínas que contenían un motivo de sortasa pero que no reaccionaron con ambos sueros. Treinta y una de las 40 proteínas recombinantes seleccionadas fueron sobreexpresadas con éxito en forma soluble y pudieron purificarse bajo condiciones nativas, mientras que 5 proteínas fueron expresadas como cuerpos de inclusión insolubles. Estas proteínas fueron purificadas utilizando condiciones desnaturalizantes y las proteínas se volvieron a plegar después de la purificación. Cuatro proteínas no pudieron ser purificadas en cantidades suficientes para la inmunización. Las 36 proteínas purificadas se utilizaron después para inmunizar ratones. Tal como muestran las transferencias Western, ninguna de las proteínas fue reactiva con el suero obtenido de los ratones antes de la inmunización. Sin embargo, por contraste, las proteínas tienen una fuerte reacción con los sueros inmunológicos obtenidos de los ratones (tabla 5), lo cual indica que las proteínas son muy inmunogénicas en ratones. La especificidad de los anticuerpos inducidos fue confirmada mediante una inmunotransferencia contra lisados (o sobrenadantes de protoplastos) de células de S. uberis. Los resultados demuestran que la mayoría de los anticuerpos inducidos reaccionan específicamente con una proteína de S. uberis con la masa molecular esperada, lo cual indica claramente que estas proteínas representan antígenos (de la superficie) que son capaces de inducir una respuesta inmunológica en ratones.

Ejemplo 5: Características funcionales de los anticuerpos inducidos

Los inventores utilizaron los sueros de los ratones en un análisis FACS para estudiar la unión de los anticuerpos a células de S. uberis encapsuladas completas (cultivadas en Todd-Hewitt). Tal como se muestra en la figura 1, ninguno de los sueros obtenidos de los ratones antes de la inmunización fue capaz de unirse a células de S. uberis completas. Sin embargo, por contraste, ocho de los sueros inmunológicos (sueros inducidos contra las proteínas P11, P15, P17, P20, P25, P26, P27, P63) se unían con fuerza a las células bacterianas completas, mientras que dos de los sueros (dirigidos contra las proteínas P17, P18) mostraron una unión débil a las células bacterianas completas. Esto indica claramente que las proteínas reconocidas por estos sueros fueron expresadas bajo las condiciones utilizadas para cultivar las células bacterianas de S. uberis, y que son accesibles para la unión a los anticuerpos. Además, la figura 1 demuestra claramente que la expresión y/o accesibilidad en la superficie de las proteínas difiere entre las dos cepas utilizadas. La expresión y/o la accesibilidad en la superficie se conservó en tres de las proteínas (P17, P18 y P20). Por contraste, P11 y P63 fueron exclusivamente detectadas empleando la cepa

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O140J, mientras que P15, P18, P25 y P26 fueron exclusivamente detectadas empleando la cepa 41-241. P27 estaba expuesta en la superficie en ambas cepas 41-241 y O140J, pero solo fue débilmente reconocida por el antisuero sobre la cepa 41-241.

Tomados conjuntamente, estos datos demuestran claramente que 10 de los antígenos seleccionados son expresados sobre la superficie de las bacterias cultivadas in vitro y que están disponibles para la unión del anticuerpo sobre células encapsuladas intactas. Tres de estas proteínas estaban conservadas en las dos cepas utilizadas.

Ejemplo 6: Estrategia del proteoma serológico

Como estrategia alternativa para la identificación de candidatos a vacunas de S. uberis, se aplicó un análisis del proteoma serológico.

Se separaron proteínas de cepas de S. uberis cultivadas en caldo de cultivo TH mediante una electroforesis en gel bidimensional y se sondaron con anticuerpos presentes en sueros de animales infectados con S. uberis. Se identificó una serie de proteínas de S. uberis muy inmunogénicas (los datos no se muestran). Se hicieron corresponder con éxito tres manchas a las proteínas presentes sobre un gel bidimensional teñido con azul brillante de Coomassie (figura 2). A partir de estas proteínas, se analizaron los productos de la digestión tríptica mediante Q-TOF, y las huellas de péptido-masa resultantes se compararon con las huellas de péptido-masa generadas in silico de todas las proteínas predichas a partir del análisis de la secuencia del genoma de las cepas 41-241 y O140J. Además, se emplearon dos péptidos trípticos importantes seleccionados de cada huella para una MS en tándem. La secuencia de aminoácidos resultante de los péptidos después se comparó con las secuencias predichas a partir de las secuencias del genoma de S. uberis. Se hicieron corresponder con éxito las tres proteínas utilizando este procedimiento. Las propiedades de las proteínas identificadas se listan en la tabla 6. Uno de estos candidatos a vacuna también se identificó utilizando la estrategia genómica (P63). Esto subraya la importancia de esta proteína como candidata a vacuna.

Ejemplo 7: ELISA de sobrenadantes de cultivo con sueros inmunológicos de ratones

P93 y P105 fueron reconocidos con gran intensidad en los sobrenadantes de los cultivos de ambas cepas, lo cual indica que estas proteínas son segregadas por las bacterias.

Ejemplo 8: Análisis FACS empleando células de S. uberis cultivadas en suero para imitar las condiciones in vivo

Se siguió el procedimiento del ejemplo 5 para ensayar la unión de anticuerpos a células de S. uberis que se cultivaron en un medio que imita a la leche.

Ejemplo 9: Conservación de antígenos entre diversas cepas de S. uberis

Se estudia la conservación de la expresión de las proteínas seleccionadas y la accesibilidad a anticuerpos entre diversos aislados de S. uberis mediante análisis FACS. Estos estudios permiten la selección de candidatos a vacunas dirigidos a diversas cepas de S. uberis.

Ejemplo 10: Vacunación y exposición en ganado vacuno

Infección experimental de animales no vacunados. Se determinó la virulencia de las cepas O140J y 41-241 de S. uberis después de una infección experimental. Una ubre se divide en cuatro partes, denominadas en general cuartos. Cada cuarto comprende células secretoras de leche, conductos de la leche, una cisterna de la leche y una teta. En este experimento, cada cuarto se infecta de modo individual en la cisterna de la leche a través del conducto de la leche en la teta. Seis de ocho cuartos inoculados con la cepa O140J se infectaron con éxito (figura 3, tabla 7). Se aislaron cultivos puros de la cepa O140J de S. uberis a partir de la leche obtenida de estos cuartos y se detectaron niveles mayores de recuentos de células somáticas (SCC). En dos cuartos (de dos vacas diferentes; las vacas 6717 y 6719; figuras 3A y 3B) no puedo detectarse infección después de la exposición. Ambos cuartos siguen siendo bacteriológicamente negativos durante el desarrollo del experimento. En uno de los dos cuartos se observó un ligero aumento en SCC. Por contraste, en los ocho cuartos expuestos a la cepa 41-241 se estableció una infección (figuras 3A y 3C, tabla 7). Cuatro de estos cuartos (vacas 6721 y 6723) fueron inoculados con una dosis de 5 x 102 cfu de la cepa 41-241, mientras que los otros cuatro cuartos fueron inoculados con una dosis de 5 x 103 cfe (vacas 6720 y 6722). Se observaron efectos más graves después de la inoculación con la dosis mayor: la temperatura corporal de las vacas aumentó de modo más significativo y se observaron señales clínicas de enfermedad más graves (coágulos en la leche y consistencia firme de la ubre) (tabla 7, figuras 3A y 3C). Sin embargo, también se indujeron señales de mastitis utilizando la cepa 41-241 con una dosis de inoculación de 5 x 102 cfu. Previamente se habían observado datos similares para la cepa O140J (Hill, 1988).

Comparado con la cepa 41-241, las señales clínicas de mastitis obtenidas con la cepa O140J (dosis de inoculación de 5 x 102 cfu y estudiado durante 16 días) parecen más graves (figuras 3B y 3C). Tres de cuatro cuartos se infectaron con éxito con la cepa O140J y los tres mostraron señales clínicas de mastitis durante al menos 16 días

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después de la infección. Dos de estos cuartos permanecieron bacteriológicamente positivos durante 16 días después de la infección (figura 3B), y en un cuarto se detectó un nivel mayor de SCC durante 35 días (los datos no se muestran). Los cuatro cuartos infectados con la cepa 41-241 mostraton señales clínicas de mastitis durante 10-13 días después de la inoculación, pero fueron negativos a las señales clínicas desde el día 13 en adelante (figura 3C). Dos de estos cuartos (vaca 6723) siguieron siendo bacteriológicamente positivos durante el desarrollo del experimento (16 días), lo cual indica la persistencia de S. uberis en la glándula mamaria (figura 3C).

El estudio histológico del material de ubre recogido 3-5 días después de la infección en general se corresponde con las observaciones clínicas. Ambas vacas infectadas con la cepa 41-241 y una vaca infectada con la cepa O140J mostraron una mastitis de moderada a grave a través de toda la glándula, con acumulación intraalveolar multifocal de granulocitos polimorfonucleares, alteración focal de la capa epitelial en los alveolos e infiltración intersticial moderada de células mononucleares (los datos no se muestran). La segunda vaca infectada con la cepa 0140J presentaba una mastitis catarral multifocal suave.

Tomados conjuntamente, estos detaso demuestran que ambas cepas O140J y 41-241 son patógenas en las vacas.

Inmunización de vacas lecheras. Se generaron anticuerpos policlonales contra proteínas de S. uberis en vacas. Las vacas se inmunizaron mediante diversos calendarios de inmunización, utilizando una inoculación subcutánea y/o intramuscular y/o intramamaria.

La composición inmunogénica se formuló con un disolvente, como por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato, y un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de agua en aceite o adyuvante sin aceite.

Después de la inmunización se recogió una muestra de sangre y se ensayó el suero para detectar anticuerpos contra S. uberis.

Infección experimental de animales vacunados. Se expusieron a una infección con 500 cfu de la cepa O140J de

S. uberis a vacas vacunadas y no vacunadas. Cada cuarto de ubre se infectó de modo individual a través del conducto de la leche en la teta.

Después de la exposición, las vacas vacunadas con una composición inmunogénica de la invención muestran menos señales clínicas de mastitis, menos alteraciones en la leche, menores niveles de SCC, un periodo más corto de mastitis clínica, menos fiebre. Las puntuaciones clínicas y las pruebas histológicas de las ubres demuestran claramente que la inmunización según la presente invención es eficaz contra la mastitis provocada por S. uberis.

Ejemplo 11: Reactividad de los antígenos con suero convaleciente

Se ensayó la capacidad de una serie de proteínas seleccionadas (P15, P16, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P68, P75, P93 y P105) para inducir anticuerpos convalecientes mediante un análisis de la transferencia Western utilizando sueros de campo obtenidos de 14 vacas que se habían recuperado de una infección reciente por S. uberis. Seis de los 12 antígenos seleccionados (P15, P16, P54, P28, P63, P105) fueron reconocidos por los 14 sueros convalecientes utilizados. Estos datos indican que estos antígenos son expresados por todas las cepas de S. uberis que provocaron las respectivas infecciones, que estos antígenos se expresan durante la infección en el hospedante, y que estos antígenos son muy inmunogénicos. Cinco de los antígenos (P68, P27, P20, P93 y P22) fueron reconocidos por 8, 9, 10, 11 o 12 de los sueros convalecientes, respectivamente. Con uno de los antígenos no pudo detectarse reacción con ninguno de los sueros convalecientes (P75).

Ejemplo 12: Conservación de los antígenos entre diversas cepas de S. uberis. Para indicar la idoneidad de los antígenos para conferir protección frente a diversas cepas de S. uberis, se determinó la conservación y la expresión de los 12 antígenos seleccionados (P15, P16, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P68, P75, P93 y P105) entre una colección de cepas de campo recientemente aisladas (35 cepas). La expresión de los antígenos se demostró mediante el ensayo de selección de transferencias Western blots con sueros inmunológicos de raton frente a los antígenos purificados. Cinco de los 12 antígenos (P15, P16, P28, P75 y P105) fueron expresados en >97% de las cepas ensayadas; dos de los antígenos (P27, P63) fueron expresados en 94% de las cepas, y cuatro de los antígenos (P20, P22, P54, P93) fueron expresados en 81-92% de las cepas. Estos datos demuestran claramente que la expresión de la mayoría de los antígenos está muy conservada entre las diversas cepas de S. uberis.

Materiales y métodos

Cepas de bacterianas y condiciones de cultivo

Se aisló una cepa 41-241 de S. uberis en 1998 de una granja de producción láctea holandesa comercial en la que se observó un brote de mastitis por S. uberis (Hill, 1988). La cepa 41-241 mostró una huella RAPD de tipo B que se encuentra predominantemente en el rebaño concreto durante el brote (Zadoks et al., 2003). La cepa se aisló de una vaca infectada con S. uberis durante al menos dos meses. La aparición de la infección fue subclínica y fue seguida de múltiples recrudecimientos clínicos.

Las cepas O140J y EF20 de S. uberis fueron una amable donación del doctor J. Leigh, Institute for Animal Health,

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Compton, Reino Unido. Otras cepas de S. uberis y S. parauberis, aisladas a partir de casos clínicos de mastitis en diversas granjas de producción láctea holandesas fueron una amable donación del doctor D. Mevius, CIDC, Lelystad, Países Bajos; de la doctora O. Sampimon, Animal Health Service, Deventer, Países Bajos; o de Dierenartsen Praktijk, Diessen, Países Bajos. Todas las demás especies estreptocócicas procedieron de la colección del laboratorio de ASG, Lelystad, Países Bajos. Las cepas estreptocócicas se cultivaron en caldo de cultivo Todd-Hewitt (código CM189, Oxoid), y se cultivaron sobre una base de agar-sangre Columbia (código CM331, Oxoid) que contenía sangre de caballo al 6% (en v/v) y aesculina al 0,1% (en p/v), a menos que se indique lo contrario. Las cepas de E. coli se cultivaron en caldo de cultivo Luria (18) y se cultivaron sobre caldo de cultivo Luria que contenía agar al 1,5% (en p/v). Si fue necesario, se añadieron 50 #g/ml de kanamicina.

Preparación del suero. La leche bruta se obtuvo de una granja de producción láctea sin infecciones por S. uberis en su historia (Waiboerhoeve, Lelystad, Países Bajos). La leche se centrifugó durante 30 minutos a 12.800 x g y se eliminó la grasa. Después se añadieron 40 #l/ml de renina (Lactoferm, Brouwland, Bélgica) y la leche se incubó durante 2 hr a 37 ºC con mezclado frecuente. La leche coagulada se retiró mediante tamizado, y el sobrenadante remanente se centrifugó durante 30 minutos a 12.800 x g. El sobrenadante aclarado se esterilizó mediante filtración sobre un filtro Sartobran P de 0,2 um (Sartonus, Goettingen, Alemania).

Muestras de leche y sueros. Las muestras de leche y los sueros se obtuvieron de casos de mástitis por S. uberis clínicos de diversas granjas de producción láctea holandesas (doctora O. Sampimon, Animal Health Service, Deventer, Países Bajos). Ninguno de los animales habían sido tratados con antibióticos antes de que las muestras se recogiesen.

Además, se recogió leche y suero de vacas en diversos momentos después de una infección experimental con las cepas O140J y 41-241 de S. uberis.

Antisuero de conejo. Se generaron en conejos anticuerpos policlonales dirigidos contra células de S. uberis enteras matadas con formaldehído, así como contra células de S. uberis sonicadas. Los conejos se inmunizaron por vía subcutánea utilizando 2-4 x 109 células muertas en adyuvante de agua en aceite. Las inoculaciones se repitieron dos, tres y cuatro semanas después. Después de 6 semanas, los conejos se sacrificaron y se recogió el suero.

Para preparar los antígenos, las cepas de S. uberis se cultivaron durante 16 h en caldo de cultivo Todd-Hewitt. Los cultivos se diluyeron 10 veces en 1 litro de caldo de cultivo Todd-Hewitt precalentado y las células se hicieron crecer hasta que la densidad óptica (600 nm) alcanzó 0,5. Los cultivos se centrifugaron durante 15 min a 10.000 x g, y los sedimentos se disolvieron en 100 ml de PBS (NaCl 136,89 mM, KCl 2,68 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 2,79 mM, pH 7,2). Después, la densidad óptica (600 nm) se ajustó a 1,0 con PBS. Para preparar las células fijadas con formaldehído, porciones de 10 ml de estas células se centrifugaron durante 20 min a 10.000 x g y los sedimentos se resuspendieron en 2,5 ml de PBS. A esta suspensión se le añadieron 250 #l de formaldehído al 3% y se mantuvo durante 16 h a temperatura ambiente. La suspensión se comprobó para determinar la ausencia de bacterias vivas mediante cultivo en placas de agar Columbia. Para eliminar el formaldehído, las células se lavaron dos veces con PBS. Para preparar las células sonicadas, porciones de 10 ml de las células se centrifugaron durante 20 min a

10.000 x g, y los sedimentos se resuspendieron en 250 #l de PBS. Las células se sonicaron durante 15 min utilizando un sonificador de punta a 100% de salida, 50% de ciclo de trabajo. Después de la sonicación, las células se diluyeron 10 veces en PBS. Ambos antígenos se mezclaron 1:1 con Specol para producir emulsiones de agua en aceite.

Secuenciación del genoma. El ADN genómico se aisló de la cepa 41-241 de S. uberis tal como se describe en Sambrook et al. (1989). El ADN se sometió a cizallamiento y se empleó para crear un banco de plásmidos. Se secuenciaron clones aleatorios utilizando la química de tinte-terminador y se analizaron con un analizador de ADN ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Los datos de secuenciación se recopilaron para obtener 572 secuencias contiguas. Se identificó un conjunto inicial de marcos de lectura abiertos (ORF) con los programas informáticos GLIMMER y GENEMARK. Se predijeron las hélicas transmembrana y las localizaciones subcelulares en los genes con un programa informático denominado TMHMM, disponible en www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM. Para buscar en cada ORF para determinar la presencia de péptidos señal se empleó el programa informático SignalP (Nielsen et al., 1999). Se realizaron predicciones alternativas de péptidos señal utilizando el programa informático PSORT disponible en http://psort.nibb.ac.jp, y un programa denominado GCG-SPScan, disponible en http://www.biology.wustl.edu/gcg/spscan.html. Se descubrieron las lipoproteínas utilizando el programa informático GCG-Findpatterns con las siguientes expresiones:

PS00013: %(D,E,R,K)6(L,I,V,M,F,W,S,T,A,G)2(L,I,V,M,F,Y,S,T,A,G,C,Q)(A,G,S)C; g-lpp: <(M,V)X{0,13}(R,K)%(D,E,R,K,Q){6,20}(L,I,V,M,F,E,S,T,A,G)(L,V,I,A,M)(I,V,M,S,T,A,F,G)(A,G)C; y g-lpp_rvh: (M,V,L)X{0,13}(R,K)%(D,E,R,K,Q){6,20}(L,I,V,M,F,E,S,T,A,G)(L,V,I,A,M)(I,V,M,S,T,A,F,G)(A,G)C. Se identificaron las proteínas con dominios de anclaje a la pared celular utilizando InterPro registro IPR001899. Se empleó el programa informático BLAST para buscar las secuencias de proteínas con identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos deducidas.

Transferencia de puntos, transferencia Southern e hibridación. El ADN cromosómico se aisló como se describe

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en Sambrook et al. (1989). Para la transferencia de puntos, se estableció una mancha de 1 #g de ADN cromosómico sobre membranas Genescreen Plus. Las membranas se incubaron en NaOH 0,4 M-NaCl 1 M a temperatura ambiente durante 10 min para desnaturalizar el ADN, y durante 10 min en NaCl 0,6 M, citrato de sodio 0,06 M (pH 7,0) para la neutralización. Para la transferencia Southern, los fragmentos de ADN se separaron sobre geles de agarosa al 0,8% y se transfirieron a membranas Gene-Screen Plus (NEN), según se describe en Sambrook et al. (1989). Las sondas de ADN se marcaron con [(&-32P]dCTP (3000 Ci mmol-1, Amersham) utilizando un kit de marcaje de cebado aleatorio (Boehringer). El ADN sobre las transferencias se hibridó a 65 ºC en un tampón que tenía fosfato de sodio 0,5 M, EDTA 1 mM, y dodecilsulfato de sodio al 7% a un pH de 7,2, con las sondas de ADN apropiadas según recomienda el suministrador de las membranas Gene Screen Plus. Después de la hibridación, las membranas se lavaron dos veces con una disolución de fosfato de sodio 40 mM, pH 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 5% durante 30 min a 65 ºC, y dos veces con una disolución de fosfato de sodio 40 mM, pH 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 1% durante 30 min a 65 ºC. Se detectaron señales sobre un Phosphor-Imager (Storm, Molecular Dynamics).

Clonación y expresión de proteínas seleccionadas. Los ORF seleccionados se amplificaron mediante PCR con cebadores oligonucleotídicos específicos para la clonación en pET200/D-TOPO (Invitrogen). Las proteínas se clonaron sin secuencias señal putativas ni regiones transmembrana predichas. Las construcciones se transformaron en Escherichia coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen) para la expresión de las proteínas recombinantes.

Para la reacción de PCR (25 #l) se empleó la ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen) según describe el suministrador. La amplificación del ADN se realizó en un termociclador Perkin Elmer 9700, y el programa consistió en una incubación durante 5 min a 94 ºC, 35 ciclos de 15 seg a 94 ºC, 30 seg a 57 ºC, y 2 min a 68 ºC, y 5 min a 68 ºC.

Inmunodetección de los antígenos expresados. Las proteínas se separaron mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS utilizando el sistema de minicélulas XCell SureLock (Invitrogen). Las proteínas en el gel se visualizaron utilizando tinción de SYPRO-Orange (Molecular Probes, Sunnyvale, Calif.), según las recomendaciones del fabricante. Se detectaron señales en un Phosphor-Imager (Storm, Molecular Dynamics).

Las proteínas se trasladaron a una membrana de nitrocelulosa mediante procedimientos convencionales (19). Las membranas se bloquearon en Blotto: disolución salina tamponada con Tris (TBS) (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM) que contenía leche desnatada al 4%, suero de ternera fetal al 5% y Tween 20 al 0,05% a temperatura ambiente (TA) durante 16 h. Para detectar los antígenos recombinantes, las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra 6 x marcador HIS (Clontech, Palo Alto, CA). Los anticuerpos unidos se detectaron y se visualizaron utilizando un anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina y nitro-azul-tetrazolio/5-bromo-4cloro-3-indolfosfato, según se describe en Sambrook et al. (1989).

Se ensayó la inmunogenicidad de los antígenos expresados utilizando muestras de suero obtenidas de vacas infectadas clínica o subclínicamente con S. uberis o utilizando antisuero anti-S. uberis de conejo. Los anticuerpos unidos se detectaron con inmunoglobulinas de conejo anti-vaca o de cabra anti-conejo conjugadas con fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch) y se visualizaron utilizando nitro-azul-tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato, según se describe en Sambrook et al. (1989).

Purificación de proteínas. Las proteínas se purificaron por afinidad a partir de sedimentos celulares solubilizados utilizando una cromatografía en columna de ácido Ni-nitrilotriacético (Ni2+-NTA), según describe el fabricante (Qiagen). Brevemente, las células se hicieron crecer hasta la fase exponencial, se añadió IPTG 1 mM y se dejó que las células crecieran durante 4 hr más a 37 ºC. Después, las células se recolectaron y se lisaron. Los sobrenadantes aclarados se cargaron sobre columnas de agarosa Ni2+-NTA. Las columnas se lavaron y la proteína se eluyó. Se emplearon diferentes tampones para la purificación desnaturalizante y nativa. Las proteínas purificadas bajo condiciones desnaturalizantes se renaturalizaron mediante una diálisis empleando un gradiente lineal de urea 6 M-0 M en NaCl 286,89 mM, KCl 2,68 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 2,79 mM, pH 7,2. Las proteínas purificadas después se concentraron utilizando filtros Amicon Ultra-4 5000 MWCO (Millipore).

Concentración de proteínas. Se determinó la concentración de proteínas en las muestras después de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Las proteínas en el gel se visualizaron utilizando tinción de SYPRO-Orange (Molecular Probes, Sunnyvale, Calif.), según las recomendaciones del fabricante. Se detectaron señales en un Phosphor-Imager (Storm, Molecular Dynamics). Se empleó un intervalo de concentraciones de albúmina de suero bovina conocidas como patrón para calcular las cantidades de proteínas presentes en el gel. Se empleó el programa Molecular Dynamics para los cálculos.

Inmunogenicidad de las proteínas purificadas. Ratones OF1 fueron inmunizados por vía subcutánea utilizando 20 #g de proteínas purificadas en adyuvante completo de Freund. Las inoculaciones se repitieron tres semanas después utilizando 20 #g de proteínas purificadas en adyuvante incompleto de Freund. Tres semanas después de la segunda inoculación se sacrificaron los ratones y se recogió el suero.

Análisis FACS. Se cultivaron células de S. uberis en caldo de cultivo Todd-Hewitt hasta que la DO600 alcanzó 0,5. Las células se recogieron mediante centrigugación, se lavaron una vez con tampón FACS (PBS-13, pH 7,2 [NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 2,8 mM], BSA al 0,5%) y la densidad celular se ajustó a

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aproximadamente DO600 1,0 en tampón FACS. Las células (250 #l) se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en 50 #l de tampón FACS que contenía antisuero de ratón (en una dilución 1:50). La muestra se incubó durante 45 minutos sobre hielo. Para retirar los anticuerpos no unidos, las células se lavaron dos veces con 250 #l de tampón FACS. Después, las células se incubaron con 50 #l de tampón FACS que contenía anticuerpo secundario anti-ratón de conejo marcado con isotiocianato (FITC) (dilución 1:100, DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) durante 30 minutos sobre hielo. Las células se lavaron dos veces con 250 #l de tampón FACS, se resuspendieron en 100 #l de tampón FACS y el anticuerpo unido se detectó con un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS Calibur, Benton Dickinson, Franklin Lakes, EEUU).

ELISA con células completas. Células de S. uberis en crecimiento exponencial se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en tampón de revestimiento, pH 9,6 (NaHCO3 0,05 M, Na2CO3 0,05 M) y la densidad celular se ajustó a DO600 1,0. Placas de 96 pocillos de unión alta se revistieron con 100 #l de esta suspensión por pocillo durante 16 hr a 4 ºC. Los pocillos se lavaron 4 veces con tampón ELISA (Tween-80 al 5%, Na-azida al 0,02%), se añadió suero (diluido 1:20 en PBS-13 que contenía Tween-80 al 0,05%, NaCl al 2% y suero de ternera fetal al 5%) y las placas se incubaron durante 1 hr a 37 ºC. Para eliminar los anticuerpos no unidos, los pocillos se lavaron cuatro veces con tampón ELISA. Después, se añadió un anticuerpo secundario (100 #l de antiratón de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (DAKO) diluido 1:250 en PBS-13 que contenía Tween-80 al 0,05%, NaCl al 2% y suero de ternera fetal al 5%) y las placas se incubaron durante 1 hr a 37 ºC. Los pocillos de nuevo se lavaron cuatro veces con tampón ELISA y los anticuerpos unidos se detectaron a temperatura ambiente utilizando 100 #l de tetrametilbenzidina (TMB) (CeDi-Diagnostics, Lelystad, Países Bajos). Las reacciones se detuvieron después de 15 min mediante la adición de 100 #l de H2SO4 0,5 M por pocillo. Se leyó la absorbancia utilizando un lector de ELISA (Thermo Labsystems, Franklin, EEUU) a 450 nm.

Preparación de las muestras para la electroforesis en gel bidimensional. Las cepas de S. uberis se cultivaron durante 16 h en 100 ml de caldo de cultivo Todd-Hewitt. Los cultivos se diluyeron 20 veces en 1 litro de caldo de cultivo Todd-Hewitt precalentado y las células se hicieron crecer hasta que la densidad óptica (600 nm) alcanzó 0,5. Los cultivos se centrifugaron durante 20 min a 10.000 x g, y los sedimentos se lavaron una vez con un volumen igual de sacarosa 250 mM/Tris 25 mM, pH 8,0, y una vez con un volumen igual de superQ. Los sedimentos resultantes se disolvieron en 5 ml de superQ. Se sonicaron porciones de 15 ml de estas suspensiontes durante 15 min utilizando un sonicador de punta (sonificador Branson 250, intervalo del 50%, amplitud 3). Después, las suspensiones se trataron con ADNasa I y MgCl2 (concentración final de 6,5 #g/ml y 10 mM, respectivamente) durante 10 min a 37 ºC. Se añadieron los inhibidores de proteasas pepstatina A, leupeptina, pefabloc y aprotinina a unas concentraciones finales de 2,5 #g/ml, 5 #g/ml, 25 #g/ml y 1 #g/ml, respectivamente. Las muestras se centrifugaron durante 30 min a

10.000 x g, los sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron durante 30 min más a 100.000 x g. Los sobrenadantes se recogieron y se determinó la concentración de proteínas en las muestras utilizando el ensayo de proteínas RC DC (BioRad) según las instrucciones del fabricante.

Electroforesis en gel bidimensional. Se solubilizaron muestras que contenían 50-100 #g de proteínas en 450 ul de tampón de muestras (urea 8 M, CHAPS al 2%, IPG-tampón 3-10 al 0,5%, ditiotreitol 70 mM y trazas de azul de bromofenol). Las proteínas se separaron en la primera dimensión mediante enfoque isoeléctrico utilizando tiras Immobiline 18 cm DryStrips (3-10 NL Amersham Pharmacia Biotech) sobre un IPGphor (Amersham Pharmacia Biotech) después de la rehidratación de las tiras según las instrucciones del fabricante. Inmediatemente después del enfoque, las tiras se equilibraron durante 15 min en tampón de equilibrio (urea 6 M, glicerol al 30%, SDS al 2%, Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, trazas de azul de bromofenol) que contenía ditiotreitol 10 mg/ml, y durante 15 min en tampón de equilibrio que contenía yodoacetamida 25 mg/ml. Las proteínas se separaron en la segunda dimensión mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS sobre geles Ettan DALT premoldeado al 12,5% (Amersham Pharmacia Biotech) en un sistema Ettan DALT 12 (Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones del fabricante.

Tinción. Las proteínas en los geles se tiñeron con plata utilizando el kit de tinción de plata PlusOne∋ (Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones del fabricante, o con azul brillante de Coomassie según se describe en Sambrook et al. (1989) con unos tiempos de incubación prolongados debido a la capa protectora de plástico de los geles.

Digestión de las proteínas de los geles bidimensionales. Las manchas de las proteínas identificadas sobre geles teñidos con Coomassie se cortaron de forma manual. Los trozos de gel se congelaron en ácido acético al 0,1% a -80 ºC hasta su uso. Las proteínas en los geles se digirieron con tripsina, tal como se describe en Li et al. (2003).

Espectrometría de masas de las manchas de proteínas digeridas trípticamente de los geles bidimensionales.

Se empleó un espectrómetro de masas Micromass Q-TOF para analizar las masas de las manchas de proteínas digeridas trípticamente, tal como se describe en Li et al. (2004).

Experimentos de infección experimental

Animales. Se emplearon vacas Holstein-Friesian clínicamente sanas, 2-4 semanas en su primera lactancia, para la infección. Las vacas se ordeñaron dos veces diarias a 7:00 a.m. y 4:00 p.m. Todas las vacas tenían unos recuentos

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de células somáticas (SCC) por debajo de 2,0 x 105 células/ml, eran negativas para patógenos de la mastitis basándose en una evaluación microbiológica repetida de la lecha durante los últimos 14 días antes de la infección, y no tenían historia de mastitis.

Preparación del inóculo e inoculación. Se emplearon como inóculos las cepas de S. uberis O140J y 41-241. Se trasladaron colonias individuales, cultivadas sobre placas de agar Columbia que contenía sangre de caballo al 6% (en v/v) y aesculina al 0,1% (en p/v), hacia 90 ml de caldo de cultivo Todd-Hewitt (Oxoid) y se cultivaron durante la noche a 37 ºC. Los cultivos cultivados durante la noche se diluyeron de 1 a 10 en el mismo medio, y las bacterias se hicieron crecer hasta una concentración de aproximadamente 3 x 108 cfu/ml (fase de crecimiento logarítmico). Las células después se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron y se diluyeron en PBS.

Dos cuartos de cada vaca se inocularon por vía intracisternal con 5 x 102 (de la cepa O140J o de la cepa 41-241) o 5 x 103 (cepa 41-241) cfu por 5 ml de PBS. Los cuartos control fueron inoculados con 5 ml de PBS. Las inyecciones se realizaron justo después del ordeño de la tarde utilizando cánulas para tetas desechables. Antes de la inoculación, las tetas se limpiaron con alcohol. Los inóculos se masajearon hacia arriba para que se introdujesen en las cisternas de las glándulas.

Un grupo de cuatro vacas se expuso a 5 x 102 cfu de la cepa O140J. Otro grupo de cuatro vacas se expuso a la cepa 41-241. Dos de estas vacas fueron expuestas a 5 x 102 cfu, y las otras dos vacas a 5 x 103 cfu. Las vacas se utilizaron en dos experimentos consecutivos, uno terminó después de 45 a 80 horas, y el segundo después de 16 días.

Toma de muestras y puntuaciones clínicas. Se recogieron muestras de leche de forma aséptica de todos los cuartos en cada ordeño. Las muestras se estudiaron bacteriológicamente sobre placas de agar sangre que contenía sangre de caballo al 6% (en v/v) y aesculina al 0,1% (en p/v), y se determinó el SCC utilizando procedimientos convencionales (International Dairy Federation, 1981). Además, las muestras de leche se conservaron a -20 ºC hasta el análisis para determinar la respuesta de anticuerpos. En cada ordeño se determinó la temperatura corporal de las vacas y la producción de leche, y las vacas se controlaron para determinar la aparición de señales clínicas de mastitis (consistencia de la ubre y coágulos en la leche). Una vez a la semana se recogieron muestras de sangre para el análisis de las respuestas de anticuerpos en el suero.

Patología. Para el estudio histológico, se tomaron muestras de tejido de la glándula mamaria de cada cuarto de diferentes sitios de tres secciones transversales horizontales diferentes, a saber, en la base de la glándula, a mitad de camino entre la base y la cisterna, y en la cisterna de la glándula. Las muestras de tejido se fijaron en formaldehído tamponado al 4% y se sumergieron en parafina. Para los estudios histológicos se cortaron secciones de tejido y se tiñeron con tinte de hematoxilina/eosina.

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Tabla 1. Proteínas de la superficie de S. uberis que contienen un motivo de sortasa LPxTGE

Proteína: n.º de cóntigo n.º de aa Homología en la base de datos (n.º de registro) % de identidad Señal de clasificación predicha

P11: 231c11 1270 Exo-beta-Dfructosidasa de S. mutans (U78296) 54 LPMTSD SNNNLEELGILVILTTLGAFLGRVILKKEK

P12: S00737 317 Proteína hipotética desconocida de S. agalactiae (Q8CM32) 60 LPNTGE SSIAPFTAIGAIILSVLGLLGFKKRRTY

P13: 129h4 484 Proteína similar al colágeno de S. pyogenes (AY069936) 45 LPSTGD KANPFFTAAALAVMASAGMVAVSRKRKED

P14: K00518 565 Proteína similar al colágeno de S. pyogenes (AF336814) 44 LPSTGD KANPFFTAAALAVMASAGMVAVSRKRKED

P15: 130g06 693 5'-nucleotidasa de S. pyogenes (NC_ 004070) 46 LPTTSS QEDTAILLSLLGASSLAMAVALKKKENN

P16: 223b05 268 Sin homología -- LPSTGE DYQAYLVAAAMALIASSGMVAYGSYRKKKQK

P17: 52g05 1074 Desconocido de Bacillus halodurans (NC_ 002570) 34 LPALAD GSHKDDSKLFWVTGLLVASGGLFAALKRREED

P18: 240d11 499 Homólogo de proteína de unión al fibrinógeno de S. aureus (AJ005646) 26 LPMAGE RGSRLFTFIGLSLILGIAGYLLKHKKVKS

P19: 32a09 278 Precursor de beta-Nacetil-hexosaminidasa de S. pneumoniae (NC_003098) 32 LPPTGS QESGIFSLFSALISTALGLFLLKSNKND

P20: 122b06 506 Proteína de unión a lactoferrina de S.uberis (AAQ83577.1) 42 LPSTGD KPVNPLLVASGLSLMIGAGAFVYAGKRKKG

P22: 130g06 1483 Precursor de serina proteinasa PrtA de S. pneumoniae (AF127143) 25 LPETRD SSSMANWSLAFFLSAVICFFKGRRKRLNKL

P23: S03520 456 Sin resultados -- LPTTGD KADGSIVQMVIGALMVSFVGFSALKDRKKEK

P24: S00737 238 Proteína hipotética desconocida de S. agalactiae (Q8CH3) 46 LPHTGE EKGFLSIIGGTILSFVAFLFKKKITLN

P25: S00737 876 Proteína hipotética desconocida de S. agalactiae (Q8CMF2) 49 LPHTGE EGLSILTVIGASILSVLGLSVLKKPKEN

P26: 224g12 649 Proteína hipotética de Schizosaccharomyces pombe (NC_003421) 22 LPTTGD DQNLLVTLMSSLLLMSLGLGLKKKEDE

P27: 113f05 1144 Peptidasa C5a de S. pyogenes (NC_004070) 34 LPKTDS QKTMTFLGIAMLFGGILQVLWSYFKKRD

P115: 69h12 818 Ciclonucleótido fosfodiesterasa de S. suis (AB066354) 64 LPKAGS QESKGLFFMGLSLLGLAGLITKKEERQ

Tabla 2. Lipoproteínas putativas de S. uberis

P30: 198g02 293 Proteína de unión a fosfato de S. pneumoniae (AAL00697.1) 71 MKIMKMNKMLTLAVLTLSSFGLAAC

P31: 111h03 451 Proteína de unión a azúcar de S. pneumoniae (AAK75762.1) 24 MSKKILKLATLAILPFVGLTAC

P32: 32a09 309 Adhesión a laminina de S. pyogenes (AAL98544.1) 62 MKRKFLSFILVLTFFLPFLVGLSAC

P33: 71g04 314 Proteína de maduración de proteasa de S. pyogenes (AAK34209.1) 61 MNTSKKIVTGFVTLASVLTLAAC

P34: 113f05 416 Proteína de unión a maltosa/maltodextrina de S. pyogenes (AAL97920.1) 85 MKSWQKIIVSGASLTLASTLLVGC

P35: 121e03 212 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34138.1) 57 MIGLLMKTQKSITLLLLSVLC

P36: 121e03 277 Proteína de unión a aminoácidos de S. uberis (AF086736) 97 MNLKKILLTTLALASTLFLVAC

P37: 108f04 351 Lipoproteína putativa de S. pyogenes (AAK34087.1) 78 MNKKFIGLGLASVAILSLAAC

P38: 108f04 285 Proteína de unión a fosfato de S. pyogenes (AAK34100.1|) 80 MKKFFLVGMLTLSMLTLTAC

P39: 45f07 282 Proteína de unión a aminoácidos de B. subtilis (CAB12132.1) 49 MKKLFIYLSLMSLLVGAC

P40: 198g02 310 Proteína de unión a metales de S. pyogenes (AAL97215.1) 79 MKKKLSLAIMAFLGLLMLGAC

P41: 130c11 311 Proteína de unión a ferricromo de S. pyogenes 70 MKKLLVTLVLIFSTLSLIAC

(AAL97215.1)

P42: 130c11 307 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK33400.1) 70 MKIKLNRILFSGLALSILITLTGC

P43: 130c11 281 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97072.1) 76 MSYKKILGLIGLTLVSSVLVAC

P44: 130c11 274 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97071.1) 66 MTLKKNLGILSLTLGTLAILAAC

P45: 240d11 434 Proteína de unión a azúcar de S. mutans (AAN59568) 52 MIKFETKKGQKLFLFGLILCFC

P46: 141f06 272 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK33324.1|) 67 MKVKKNIKIAALLPMLTLLAAC

P47: 125g06 539 Proteína de unión al sustrato de S. pneumoniae (AAK75869.1) 76 MKKRWIASSVIVLASTIVLGAC

P49: 122b05 347 Transportador ABC putativo de S. pyogenes (AAM78733.1) 65 MNKKLTSLALLSAAIIPLAAC

P50: 161c09 552 Proteína asociada a hialuronato de S. equi (AF100456) 79 MTVAQKSTFKRFGLGAVTLASAALLMAC

P51: 198b02 268 Proteína de unión al sustrato de S. pyogenes (AAL97497.1) 52 MKTKKILKAAIGLMTLVSMTAC

P52: 198g02 270 Peptidil-prolil cistrans isomerasa de S. pyogenes (AAM78928.1) 67 MKKIISFALLTLSLFSLSAC

P53: 231c11 173 Proteína hipotética de Methanosarcina acetivorans (AAM03977.1) 29 MKKTFTSTLVLLSALMLTAC

P54: 53f09 286 Estreptoquinasa de S.uberis (AJ131604) 100 MKKWFLILMLLGIFGC

P55: 68d07 127 Proteína hipotética de S. pyogenes (AE014145) 61 MGNYFKSLCLLLFSFLLVAC

P56: 69h12 357 Sin homología -- MSKIVKKIFFLTAFLIMFFLSAC

P57: 87h02 390 Proteína de unión a aminoácidos de cadena ramificada de S. pneumoniae (AE007382) 46 MKKKLLVSTIACLSLLSLAAC

P58: 69h12 221 Hidrolasas asociadas a la pared celular de Clostridium acetobutylicum (AE007516) 44 MINKKIIFTSLTVICISNC

P112: 231c11 320 Lipoproteína putativa de S. agalactiae (NP_ 689064) 45 MKKGMRFSLILLALMLLTAC

P113: 52g05 322 Proteína de unión a ribosa de L. lactis (NP_689064.1) 59 MKCIKKLGFLALFLSMLLLLGAC

P117: 198g02 291 Proteína de unión a fosfato de S. 72 MKMNKMLTLAVLTLSSFGLAAC

pneumoniae (AE007497)

Tabla 3. Factores de virulencia/proteínas de la superficie putativas seleccionadas de S. uberis

Proteína: n.º de cóntigo n.º de aa Homología en la base de datos (n.º de registro) % de identidad Secuencia señal escindible predicha

P2: 130c11 183 Proteína de la membrana citoplásmica de S. pyogenes (AAK33386.1) 80 -

P3: 130c11 297 Proteína de choque térmico de S. pyogenes 66 MLYQQIAQNKRKTIFLILAFFFLLTAIGA (AE014141)

P4: 198g02 452 Detector de histidina quinasa de S. pyogenes (AE014144) 82 -

P5: 67h05 362 Proteína de unión a colina de S. pyogenes(AE006476) 52 MKFIKILLSQIVSLFLLLTISLHALETVNA

P6: 113f05 416 Nucleasa de entrada al ADN de S. pneumoniae(NP_346391.1) 60 MSNKYPSGKKISAILIALLITGLTALSQG

P7: 231c11 300 Transportador ABC de S. pyogenes (AAL96916.1) 47 -

P9: 231c11 146 Proteína de competencia de S. pyogenes (AE014138) 40 MKISCCHSKAFTLAESLLCLAVTTFTILLLSSSLAGV

P21: 80b12 246 Aciltransferasa de S. pyogenes (AAM79682.1) 77 -

P28: 130g06 246 Peptidoglicano hidrolasa de S. pyogenes (AE006536|) 60 MRFLKGKKVFLAVIGLAVMMTLVIMFQPQAKN

P29: 224g12 550 Proteína hipotética de S. pyogenes 46 MKKIFQRKWFKRTSIVLGILLVALLALG (AAK34725.1)

P59: 111h03 174 YpkK de Corynebacterium jeikeium 43 MKKKFLKIMTCIIAICSIFPYLSSMASTVYA (AF486522_8)

P60: 113b07 248 D,D-carboxipeptidasa de S. pyogenes (AAM80142.1) 70 MMKNNKLLSFLFQLLVILLFIFCLFYYIKA

P61: 130c11 195 N-acetilmuramidasa de S. pyogenes (AAL98352.1) 45 MRNRLTFSYFIGIFLTFLFLLITPLIVNSQA

P62: 130c11 421 Proteína DltD de S. pyogenes 67 MLRKLLTIVGPVFLALLLVLVTIFS (AAM79598.1)

P63: 114a06 878 Proteína de exclusión de la superficie de S. pyogenes (AAK33344.1) 36 MEFENTKSNQIKTTLALTSTLALLGTGVGMGHTVNA

pyogenes (AAK33344.1)

P64: 115e06 428 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK33154.1|) 57 MKKLLACMLMVFFLSPISVISTEKSIS

P65: 115e06 400 Serina proteasa de S. pyogenes (AAK34840.1|) 71 MPVSKFKHFFKYIMIVGLGFIGGALAFFVMNLLPHPSST

P66: 115e06 656 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAM80444.1) 71 MKKFRFETIHLVMMGLILFGLLALCVRIMQSKMLIILA

P67: 115e06 302 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34806.1) 22 MKTWKKTILITSLCLLISGAALAGFGFIRGGWS

P68: 115e06 216 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34820.1) 41 MIRKENFKKRYISFGILGFAVALLALVFAF

P69: 121e03 185 Peptidasa señal I de S. pyogenes (AAM79518.1) 54 MVKRDFIRNIILALLAIVIFILLRIFVFS

P70: 129h04 318 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAM79277.1) 73 MKSFFNSRIWLGLVSVFFAIVLFLTA

P71: 130c11 535 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34403.1|) 77 -

P72: 130c11 739 Proteína de unión a penicilina 1A de S. pyogenes (AAL98205.1) 80 -

P73: 130g06 307 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97680.1|) 68 MRRQKKQQKKIIPLFLILLFSTLLLFTGFLFKKELRA

P74: 130g06 317 Proteína hipotética de S. pneumoniae(AAK99735.1) 61 MFKKKLMLTGLILFSGMTVSTASA

P75: 133f06 241 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAM80084.1|) 29 MKPSNTEKLFLILSLLTLILAGSFYLFFARNHIGNA

P76: 141f06 212 Sin resultados significativos -- MKKIQKIFLALSTMILLLSNIFSTIIYA

P77: 141f06 304 UDP-glucosa pirofosforilasa de S. uberis (AJ400707) 100 MTKVRKAIIPAAGLGTRFLPATKALA

P78: 141g05 386 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34063.1) 48 -

P79: 149b09 304 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97494.1) 63 -

P80: 153a02 1058 Carbamoíl-fosfato sintasa de S. pneumoniae(Q97QE4) 75 -

P81: 153f08 518 Proteína de adhesión de S. pyogenes (AAL97448.1) 69 MKKKTLVMMGLAGLVAGGQLYQAKAVLA

P82: 198g02 441 Histidina quinasa de S. pneumoniae (AAL00696) 57 -

P83: 198g02 288 Peb1 de S. thermophilus (AF327739) 61 MKKFKPRKKSDIKRRIAMNQFKKWTFFCLMTLLTLIFMPKASA

P84: 198g02 126 Sin resultados significativos -- MLLRKARHSLKRRHMMLEVLLIVSTFFLFIIFISLLIGIKRRS

P85: 224g12 774 Proteína de unión a penicilina 2A de S. pyogenes (AAL98575.1) 77 -

P86: 224g12 498 Dipeptidasa de S. pyogenes (AAM80370.1) 80 MNTKKFTLATVTVMTALACYSSA

P87: 224g12 386 Sin resultados significativos -- MFKTKKEIFSIRKTALGVGSVLLGVILTTQVASA

P88: 231c11 119 Proteína hipotética de S. pyogenes (AE009962) 37 -

P89: 231c11 772 Proteína de unión a penicilina 1B de S. pyogenes (AAK33215.1) 77 -

P90: 238b05 331 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97637.1) 63 -

P91: 238b05 550 Proteína similar a la proteína de unión afibronectina de S. pyogenes (AAK33911.1) A80 -

P92: 240d11 200 Sin resultados significativos -- MANYKKITSLSLLTLLSLATFSATQYSKVYA

P93: 31e02 758 N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa de Bacillus halodurans (BAB07384.1) 32 MKSKKSYVLLLAPFVLASFWQSKMVSA

P94: 38f04 143 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34637.1) 27 MKKRKNKWRFFMIKMRKSQLSVSLALFALLTFAASPIYA

P95: 40c10 747 Proteína de unión a penicilina 2X de S. pyogenes (AAK34426.1) 74 -

P96: 45f07 200 Cps9F de S. suis (AAF 18949) 77 MYQVVKRLLAILISGLAIIILSPVLLAVAIA

P97: 45f07 424 CpsA de S. agalactiae (AF349539) 61 MASLLLILLKKAKLLTMIGLILANIGLAVTLFA

P98: 52g05 347 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34330.1) 68 MKVIKTYKWWVLSILSMVLILFALFFPLPYYIEMPGGA

P99: 52g05 506 Amidasa de B. anthracis (NP_655785) 40 -

P100: 53f09 169 Proteína desconocida de L. lactis (AAK04688.1) 50 -

P101: 67h05 425 Glicoproteína inmunodominante de S. mutans(AAK94501.1) 41 MKKRILSAVLVSGVTLGTATTVNA

P102: 67h05 137 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL96870.1) 57 -

P103: 68d07 280 Endolisina de S. pyogenes (AAL97346.1) 73 MRRRIKPIVVLVFFLLFALLLIIGKTHS

P104: 71g04 429 Peptidoglicano GlcNAc desacetilasa putativa de S. pyogenes (AAM79651.1) 47 MKKFYVIVGTLLSIFILSVSLFVYS

P105: 71g04 727 Internalina A de S. pyogenes (AAL97968.1) 52 MKKKTYLFVAGITVTCGTAL

P106: 77f12 393 D,D-carboxipeptidasa de S. pyogenes (AAM78820.1) 62 MIKKILLFLSIFALTISTIPVIA

P107: 77f12 400 D-alanil-D-alanina carboxipeptidasa de S. pyogenes (AAM78821.1) 38 MKKTILSTIIVGLFLWTLSTLVLA

P108: 77f12 415 D-alanil-D-alanina carboxipeptidasa de S. pyogenes (AAM78821.1) 60 MKKMLLLCFIFLILFPINFVNA

P109: 80b12 202 Superóxido dismutasa [Mn] de S. pyogenes (AAM79678.1) 89 -

P110: 80b12 350 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL98000.1) 71 MRLQMMTFLRKINSTKVLIFLCVSLFLGLVVTVSA

P111: 198g02 128 Proteína hipotética de S. pneumoniae(AAL00353.1) 36 MKRKISLFLFLASIFATTNSVFA

P116: 84d07 427 RopA de S. pyogenes (AAM80241.1) 82 -

P118: 108f04 115 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97738.1) 34 MKAKRDGLIIGLVTGVVAGTLSYLSLSHS

P119: 113f05 301 ARNt sopentenilpirofosfato transferasa de S. pyogenes (AAL97618.1) 68 MTKKEKIIVIVGPTAVGKTALGIQVAQA

P120: 115e06 216 Hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Bacillus halodurans (BAB05714.1) 52 MTNIKTIGVVGAGAMGGGIANLFA

P121: 115e06 287 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de B. halodurans (BAB05714.1) 43 MTNIKTIGVVGAGAMGGGIANLFA

P122: 130c11 589 Aminodesoxicorismato liasa de S. pyogenes(AAL97146.1) 52 -

P123: 130g06 331 Tiorredoxín reductasa de S. pyogenes (AAM79182.1) 80 -

P124: 130g06 203 Peptidoglicano hidrolasa de S. pyogenes (AAK33784.1) 68 -

P125: 130g06 246 Peptidoglicano hidrolasa de S. pyogenes (AAK33785.1) 61 MRFLKGKKVFLAVIGLAVMMTLVIMFQPQAKNKSVSAE

P126: 130g06 357 Transportador ABC de espermidina/putrescina deS. pyogenes (AAK33983.1) 80 MRRLYSFIAGVLGIILILASSTFILQKKTGSA

P127: 130g06 200 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAL97729.1) 74 -

P128: 133f06 609 Alfa-glicerofosfato oxidasa de S. pyogenes(AAK34439.1) 80 -

P129: 198g02 337 Autolisina de Listeria monocytogenes (AF035424) 38 -

P130: 19e05 289 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAM79683.1) 78 -

P131: 224g12 545 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34725.1) 46 MKKIFQRKWFKRTSIVLGILLVALIALGS

P132: 240d11 308 Proteína desconocida de L. lactis (AAK06265.1) 29 MKSNDPLALLAKKRRRKTFLMTIVFSLLATLLLFALCFKLLS

P133: 240d11 322 Transportador ABC de ribosa de Clostridiumacetobutylicum (AAK79421.1) 39 -

P134: 24d11 485 Proteína hipotética de Staphylococcus aureus(BAB95577.1) 29 MLSYRVVKRRLGMVKKQVAIIGMGVSGLAVLLALS

P135: 241b08 195 Proteína hipotética de S. pyogenes (AAK34290.1) 58 MRKKRTINWWKWSFLILLALNLAFVCVIA

P136: 45f07 347 Glicosil transferasa de Chlorobium tepidum (AAM71444.1) 31' -

P137: 52g02 393 Proteína de división celular de Streptococcuspyogenes (AAK34317.1) 43 -

P138: 68d07 280 Endolisina de S. pyogenes (AAL97346.) 73 MRRRIKPIVVLVFFLLFALLLIIGKTHSD

P139: 7f09 197 Peptidasa señal I de S. pyogenes (AAK34563.1|) 69 MKHFFKEWGLFTLVILIFGISRLFFWQPVKVDG

Tabla 4: Cepa

Tabla 6: Proteínas inmunogénicas de S. uberis identificadas en geles bidimensionales y caracterizadas mediante espectrometría de masas.

n.º de mancha: nombre de la proteína masa (kDa) pI

1: proteína de exclusión de la superficie 94,8 5,8

2: factor de activación (ropA) 47,3 4,3

3: nucleósido difosfato quinasa 16,2 5,7

Tabla 7: Resumen de los resultados de infecciones intramamarias experimentales con las cepas O140J y 41-241 de S. uberis

n.º de vaca: cepa el experimentotermina después de dosis deinoculación(cfu) SCC máx. SCC antes de lainoculación temp.máx. no se infectó con éxitoningún cuarto puntuaciónmáx. de BO1) puntuación máx.de coágulos enla leche2) puntuación máx.de consistenciade la ubre3)

6716: O140J 50 horas 5 x 102 2,7 x 107 2,7 x 104 40,2 2 3 0 0

6717: O140J 80 horas 5 x 102 9,7 x 105 1,2 x 105 38,6 1 1 0 0

6720: 41-241 45 horas 5 x 103 2,8 x 107 4,8 x 104 40,8 2 3 2 0

6721: 41-241 67 horas 5 x 102 7,2 x 106 0,9 x 105 38,7 2 3 1 0

6718: O140J 16 días 5 x 102 2,9 x 107 0,9 x 105 40,9 2 3 4 3

6719: O140J 16 días 5 x 102 2,4 x 107 0,9 x 105 40,0 1 3 3 3

6722: 41-241 16 días 5 x 103 2,7 x 107 4,4 x 104 41,0 2 3 3 2

6723: 41-241 16 días 5 x 102 2,1 x 107 3,6 x 104 39,5 2 3 2 1

1) Puntuación BO: BO negativo: 0; <103 cfu/ml de leche: 1; >103 <10 5 cfu/ml de leche: 2; >105 cfu/ml de leche: 3.2) leche normal: 0; pocos coágulos: 1; numerosos coágulos: 2; leche con pus: 3; leche con sangre: 4.3) puntuación de consistencia: consistencia normal: 0; cambios suaves: 1; cambios moderados: 2; cambios graves: 3.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de:

-

una proteína segregada y/o

-

una proteína asociada a la superficie y/o

-

una proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190;

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis; y

c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.
2.- Un método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína segregada y/o proteína asociada a la superficie se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que comprende un motivo de una proteína segregada y/o asociada a la superficie.
3.- Un método según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158,SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186,SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190 se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen con al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:187 y SEQ ID NO:189.
4.- Un método según la reivindicación 1 o 2 o 3, en el que dicha proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158,SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190 se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que se hibrida con la secuencia de nucleótidos de longitud completa de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:187 y SEQ ID NO:189 a 65 ºC en un

tampón que tiene fosfato de sodio 0,5 M, EDTA 1 mM, y dodecilsulfato de sodio al 7% a un pH de 7,2, en el que la molécula de ácido nucleico permanece hibridada después de: -lavar dos veces con un tampón que contiene fosfato de sodio 40 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM y dodecilsulfato de

sodio al 5% durante 30 minutos a 65 ºC, y;

5 -lavar dos veces con un tampón que contiene fosfato de sodio 40 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM y dodecilsulfato de sodio al 1% durante 30 minutos a 65 ºC. 5.- Un método según la reivindicación 2, 3 o 4, que comprende además seleccionar un gen que se conserva a través

de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. 6.- Un método según la reivindicación 5, que comprende además obtener una proteína codificada por dicho gen, o 10 una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de dicha proteína.
7.- Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que dicho gen se expresa en un sistema de expresión procariota. 8.- Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende: - obtener proteínas de Streptococcus uberis aisladas y/o recombinantes;

15 - incubar dichas proteínas con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y

-

ensayar si una proteína es capaz de unirse a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por

una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal 20 infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.
9.- Un método según la reivindicación 8, que comprende además expresar dicha proteína utilizando una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína.
10.- Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho anticuerpo y/o célula inmunológica se deriva de un suero convaleciente.

25 11.- Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha proteína de Streptococcus uberis es capaz de suscitar anticuerpos inductores de la opsonofagocitosis.
12.- Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que se identifican al menos dos proteínas de Streptococcus uberis capaces de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis.

Figura 4. Secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de las proteínas de S. uberis de la tabla 5.

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87