CN101821627A

CN101821627A - 免疫原性链球菌蛋白质

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Publication number: CN101821627A
Application number: CN200880110303A
Authority: CN
Inventors: 希尔达·E·史密斯
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2010-09-01
Also published as: AU2008284491A1; JP5462164B2; UA103885C2; CA2695721A1; KR20100063706A; ES2432407T3; BRPI0815604A2; EP2183597B1; US20100297183A1; WO2009020391A1; EP2183597A1; CO6270172A2; JP2010535500A; JP2014095721A; AR067830A1; EP2023143A1; RU2518315C2; EP2660604A2; TW200911999A; RU2010107878A

Abstract

本发明提供了鉴定能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的链球菌蛋白质的途径和方法。发明进一步公开了能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含至少两种来源于乳房链球菌的重组和/或分离的蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。发明还公开了编码所述蛋白或其免疫原性部分的核酸分子、包含所述核酸分子的宿主细胞和重组载体、以及基于所述蛋白和核酸的疫苗和诊断检测。

Description

免疫原性链球菌蛋白质

本发明涉及医药领域。更具体地说，本发明涉及免疫原性链球菌蛋白质及其免疫原性部分、衍生物和类似物。

链球菌属包含多种病原和共生革兰氏阳性细菌，在包括人、马、猪和牛的多种宿主中可以发现这些细菌的存在。在宿主中，经常可见到链球菌聚居在上呼吸道粘膜表面。但在某些情况下，链球菌也会导致亚急性到急性甚至是慢性的疾病。

到目前为止，许多抗链球菌的商品疫苗是基于全细胞细菌。通常这类细菌对同源血清型攻击的确能够产生显著的保护作用，但是对异源血清型攻击没有保护作用。接种全细胞链球菌一般能够导致针对同样的链球菌菌株的免疫反应，但不能(有效地)抗其他链球菌菌株，更不用说其他链球菌血清型。因此，许多疫苗不能提供对异源菌株和/或血清型的有效保护，因为抗一种链球菌菌株的免疫接种通常不能有效地抵抗另一种链球菌菌株感染。并且，抗一种链球菌血清型的接种通常不能有效抵抗另一种链球菌血清型感染。因此，需要能够引发抗至少两种链球菌菌株，优选抗两种链球菌血清型的免疫反应的免疫原性组合物。

本发明目的在于提供能够引发抗至少两种链球菌菌株的免疫反应的链球菌蛋白质及其免疫原性部分、衍生物和/或类似物，以及编码它们的核酸分子。

本发明提供了鉴定能够引发抗至少两种链球菌菌株的免疫反应的链球菌蛋白质的方法，所述方法包括：

a)鉴定分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的至少一部分；

b)挑选步骤a)中鉴定到的在至少两种链球菌菌株中保守的至少一种蛋白；和

c)确定步骤b)中挑选的至少一种蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够特异结合被第一链球菌菌株感染的动物的抗体和/或免疫细胞，以及被第二链球菌菌株感染的动物的抗体和/或免疫细胞。所述第一链球菌菌株和所述第二链球菌菌株优选是相同的链球菌菌种。

优选地，所述与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白质与细菌毒力因子具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、最优选至少80％的序列同一性。

根据本发明，鉴定到了至少一种能够引发抗至少两种链球菌菌株的免疫反应的链球菌蛋白质。所述蛋白适合免疫个人和/或非人动物因为它能够引发广泛的免疫反应。因此，本发明排除了针对每一种链球菌菌株和/或血清型提供疫苗的需要。所以使用本发明的免疫原性链球菌蛋白能够节约时间和金钱。更重要的是，本发明的免疫原性链球菌蛋白理论上来说能够引发抗未知链球菌菌株，或者还没有针对其的特异疫苗的链球菌菌株(例如自然界中近期发生进化的菌株)的免疫反应。

优选地，本发明的链球菌蛋白能够引发抗至少两种链球菌血清型的免疫反应。因此本发明的优选实施方案提供了鉴定能够引发抗至少两种链球菌血清型的免疫反应的链球菌蛋白的方法，所述方法包括：

b)挑选步骤a)中鉴定到的在至少两种链球菌血清型中保守的至少一种蛋白；和

c)确定步骤b)中挑选的至少一种蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够特异结合被第一链球菌血清型感染的动物的抗体和/或免疫细胞，以及被第二链球菌血清型感染的动物的抗体和/或免疫细胞。

抗至少两种链球菌菌株和/或链球菌血清型的免疫反应在本文中定义为针对至少两种不同菌株和/或血清型链球菌的体液和/或细胞免疫反应。所述免疫反应在例如非人动物中引发。也可能为了预防和/或抵抗链球菌相关的疾病，在人类个体中引发对至少两种不同链球菌菌株和/或血清型的免疫反应。体液免疫反应导致产生抗体，而细胞免疫反应主要增加比如T杀伤细胞的反应性免疫细胞的形成。一般来说，免疫反应的这两个部分是由给与免疫原性蛋白或其免疫原性部分引发的。抗至少两种链球菌菌株/血清型的免疫反应优选包含抗体的产生。所述免疫反应优选能够至少部分地减少人类个体和/或非人动物内地链球菌生物体的数量。所述免疫反应进一步优选能够至少部分抵抗链球菌导致的疾病。

正如本领域公知的，链球菌菌株能通过其形态、生化和血清学特点进行鉴定。链球菌血清型是以特异抗原性多糖为分类基础的一组链球菌。链球菌的血清型分类也是本领域公知的。

本发明的方法包含鉴定分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的至少一部分。所述蛋白通过各种途径鉴定。在发明的一个实施方案中，利用了基因组学方法。例如通过搜索所述分泌蛋白和/或表面相关蛋白的基元来鉴定编码分泌蛋白和/或表面相关蛋白的基因。所述基元优选包含脂类附着位点，信号肽酶切割位点和/或分选酶(sortase)附着位点。当然，搜索本领域已知的其他基元也是可能的。因此发明的一个实施方案提供了本发明的方法，其中通过在链球菌的至少部分基因组序列中识别出包含分泌和/或表面相关蛋白的基元的基因来鉴定所述分泌蛋白和/或表面相关蛋白。

此外，或者替代地，通过本领域已知的一种或多种其它方法来鉴定编码分泌蛋白和/或表面相关蛋白的基因。例如，一旦知道了一种链球菌中编码分泌蛋白和/或表面相关蛋白的基因，就可以筛选另一种链球菌基因组序列中存在的高％序列同一性的基因。

在一个实施方案中，这类筛选方法包括这样的方法，该方法中筛选另一种链球菌基因组序列与编码链球菌分泌蛋白和/或表面相关蛋白的核苷酸序列杂交的能力。因此根据发明，本发明提供了一种方法，其中所述与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白是通过在链球菌的至少部分基因组序列中鉴定这样的基因而鉴定到的，所述基因能够与图4中列出的任一核酸序列在pH 7.2的含有0.5M磷酸钠、1mM EDTA和7％十二烷基硫酸钠的缓冲液中于65℃杂交，其中核酸分子在用含有40mM磷酸钠(pH7.2)、1mM EDTA和5％十二烷基硫酸钠的缓冲液于65℃漂洗30分钟两次；并用含有40mM磷酸钠(pH 7.2)、1mM EDTA和1％十二烷基硫酸钠的缓冲液于65℃漂洗30分钟两次后仍然保持杂交。

优选地，所述与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白与细菌毒力因子具有至少60％、更优选至少70％，更优选至少75％，最优选至少80％序列同一性。

现有技术还提供了多种方法可以确定链球菌蛋白与细菌毒力因子是否有至少50％序列同一性。例如，将链球菌蛋白的氨基酸序列与细菌毒力因子的氨基酸序列进行比较。采用基因组学方法也是可能的。例如通过筛选链球菌基因组序列中与编码毒力因子的细菌基因具有至少50％序列同一性的核苷酸序列鉴定到与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的链球菌蛋白的编码基因。因此发明的一个实施方案提供了本发明的方法，其中所述与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白是通过在链球菌的至少部分基因组序列中鉴定与细菌毒力因子基因具有至少50％序列同一性的基因而鉴定到的。但是，许多替代的确定链球菌蛋白与细菌毒力因子是否具有至少50％序列同一性的方法也是本领域已知的。

一旦鉴定到编码分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的至少一个链球菌基因，优选确定所述基因中是否有至少一个在至少两种链球菌菌株中是保守的。如果第二链球菌菌株的基因组包含与第一链球菌菌株所述基因具有至少60％序列同一性的核酸序列，则所述第一链球菌菌株的该基因在至少两种链球菌菌株中是保守的。优选地，所述核酸序列与所述基因具有至少75％、更优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性。术语″序列同一性″是指两个核酸序列或氨基酸序列间的相同度百分比。当将两个核酸序列进行比对，并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，所述序列显示至少60％的序列同一性，则这两个核酸序列相互具有至少60％的序列同一性。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。可以用于或者改编用于确定候选序列是否落在这个定义范畴内的一个计算机程序是版权属于Genentech，Inc.的“Align 2”，该程序于1991年12月10日与用户文件(userdocumentation)提交至美国版权局，Washington，D.C.20559。

根据本发明的一个实施方案，如果发明所述基因在至少两种链球菌菌株中是保守的，则该基因所编码的蛋白是用于评估所述蛋白、或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够引发抗一种以上链球菌菌株的免疫反应的良好候选物。优选所述第一链球菌菌株和所述第二链球菌菌株属于相同的链球菌物种。

优选地，为了鉴定到(由所述基因编码的)好的候选蛋白，所述蛋白被用于检测其引发抗一种以上链球菌血清型的免疫反应的能力，需确定所述基因是否在至少两种链球菌血清型中是保守的。因此优选进一步包括挑选在两种链球菌菌株和/或血清型中保守的基因的发明方法。

一经鉴定到在至少两种链球菌菌株/血清型中保守的基因，优选获取由所述基因编码的蛋白。此外，或者替代地，可以获取所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或类似物。现有技术提供了多种方法可以获取基因所编码的蛋白、其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。例如通过合适的表达系统对所述基因进行表达。

表达系统的非限制性实例包括诸如酵母等真核宿主细胞和诸如大肠杆菌等原核宿主细胞。优选地，在原核表达系统中表达发明所述编码分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的基因，该基因在至少两种链球菌菌株中是保守的。优选原核表达系统是因为理论上(原核的)链球菌的蛋白在原核表达系统中能够更好地表达。并且，原核表达系统通常更容易建立和使用。

本发明的方法包括确定发明的至少一种蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够与被第一链球菌菌株感染的动物的抗体和/或免疫细胞，以及被第二链球菌菌株感染的动物的抗体和/或免疫细胞特异结合。优选地，确定发明的至少一种蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够与被第一链球菌血清型感染的动物的抗体和/或免疫细胞，以及被第二链球菌血清型感染的动物的抗体和/或免疫细胞特异结合。本领域已知许多实施这类检测的方法。优选地，使用感染了至少两种不同链球菌菌株的至少两只动物的血清。替代地，仅使用一只动物的血清，所述动物感染了至少两种不同链球菌菌株。根据一个实施方案，一个非人动物感染了至少第一链球菌菌株和/或血清型，第二非人动物感染了至少第二链球菌菌株和/或血清型。所述链球菌菌株和/或血清型通过例如静脉内给予所述动物。根据一个实施方案，随后采集包含链球菌特异性抗体和/或免疫细胞的动物的血清。任选将所述血清在使用前进行处理。例如，将抗体和/或免疫细胞至少部分浓缩和/或分离。优选本发明的蛋白质和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是分离的和/或重组产生的，并随后与来源于所述动物的所述血清、或者(部分)分离的抗体和/或免疫细胞进行温育。可以将来源于第一动物的血清、抗体和/或免疫细胞与来源于第二动物的血清、抗体和/或免疫细胞一起给予。替代地，先给予来源于第一动物的血清、抗体和/或免疫细胞，之后加入来自第二动物的血清、抗体和/或免疫细胞。再一个实施方案中，将第一动物的血清、抗体和/或免疫细胞给予包含至少一种本发明蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物的一种独立混合物(separatebatch)，将第二动物的血清、抗体和/或免疫细胞给予包含至少一种本发明蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物的另一混合物。温育后，将所述血清、抗体和/或免疫细胞洗去，利用本领域已知的任何方法使结合的抗体和/或免疫细胞显像。例如将结合抗体与能够特异结合所述结合抗体的第二抗体一起温育，所述第二抗体偶联了辣根过氧化物酶。未发生结合的第二抗体被洗去后，加入过氧化氢。过氧化氢被辣根过氧化物酶降解偶联着发光化合物的氧化，由此使得反应可视。

如果本发明的蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物似乎与由第一链球菌菌株引发的抗体和/或免疫细胞，并与由第二链球菌菌株引发的抗体和/或免疫细胞特异结合，这表明所述蛋白、免疫原性部分、衍生物和/或类似物能够引发抗至少两种链球菌菌株的免疫反应。

在一个优选实施方案中，使用了来源于感染了链球菌的动物的恢复期血清(convalescent serum)的抗体和/或免疫细胞。恢复期血清来源于已经有效地抵抗了感染的动物。这样，感染了链球菌的动物的恢复期血清包含能够保护所述动物免于相同链球菌菌株攻击的抗体和/或免疫细胞。因此，为了确定本发明的蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够引发保护性免疫反应，优选与恢复期培养基进行温育。

因此发明的一个实施方案提供了鉴定能够引发抗至少两种链球菌菌株的免疫反应的链球菌蛋白的方法，所述方法包括：

-获得分离的和/或重组的链球菌蛋白；

-将所述蛋白与感染了第一链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞进行温育，和

-确定蛋白是否能够与感染了第一链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞结合。

链球菌蛋白质通过多种途径获得。优选地，从链球菌培养物中分离分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白。在一个实施方案中，用例如溶菌酶从链球菌中剥离表面相关蛋白。在一个实施方案中，利用编码至少一种所述蛋白的至少一个核酸序列重组产生链球菌蛋白。如上文解释的，优选使用编码分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的基因。更优选地，所述基因在至少两种链球菌菌株和/或血清型中是保守的。

替代地，或者另外地，链球菌蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是利用本领域已知的另一种方法产生的。例如，利用常见的合成技术，比如固相合成产生免疫原性链球菌蛋白或肽。作为另外一个例子，从链球菌中分离链球菌蛋白，或者重组制备，之后进行修饰以便产生免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

在一个优选实施方案中，在聚丙烯酰胺凝胶上分离链球菌蛋白，随后与感染了第一链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞进行温育。优选使用二维聚丙烯酰胺凝胶。

在优选实施方案中，鉴定到的链球菌蛋白能够引发调理吞噬(opsonophagocytosis)诱导性抗体。调理吞噬是一个自然过程，在这个过程中微生物被调理素调理，之后所述微生物被吞噬细胞吞噬并杀死。许多微生物需要被调理素调理以提高对它们的吞噬作用。调理作用是一个使得微生物更容易被吞噬细胞摄入的过程。在这个过程中，调理抗体和/或蛋白结合到所述微生物上，从而促进该微生物被所述吞噬细胞的摄入。

因此，优选能够引发调理吞噬诱导性抗体的发明所述链球菌蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物，因为将这类蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物给予动物会导致在所述动物中存在能够吞噬链球菌的调理吞噬诱导性抗体。

本发明的链球菌蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应。为了引发更广泛的免疫反应，优选鉴定至少两种不同链球菌蛋白和/或所述蛋白中至少一个的免疫原性部分、衍生物和/或类似物。更优选地，鉴定至少三种不同链球菌蛋白、和/或所述蛋白中至少一个的免疫原性部分、衍生物和/或类似物等等。鉴定到的本发明的链球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物的数目越高，越能引发更广泛的免疫反应。

在另一个优选实施方案中，鉴定到至少一种符合本发明的链球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物，它们能够引发抗至少三种链球菌菌株的免疫反应。所述蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物尤其适用于中人类个体和/或非人动物中引发广泛的免疫反应。更优选地，鉴定到至少一种符合本发明的链球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物，它们能够引发抗至少三种链球菌血清型的免疫反应。

蛋白质的免疫原性部分定义为能够在人类个体和/或非人动物中引发免疫反应的蛋白质的一部分。优选所述免疫原性部分能够引发的免疫反应与所述蛋白引发的在种类上相同，但不一定在量上相同。蛋白质的免疫原性部分优选包含所述蛋白的一或多个表位。蛋白质的表位定义为所述蛋白的一部分，该部分至少约5个氨基酸长，能够诱发能特异结合所述表位的特异抗体和/或免疫细胞。存在两种不同的表位：线性表位和构象表位。线性表位包含一段连续的氨基酸。构象表位是由正确折叠的蛋白中几段连续的氨基酸折叠至一定位置，共同形成表位。本发明的免疫原性部分可以包含一类或者这两类表位。蛋白质的免疫原性部分包含至少5个氨基酸残基。优选所述免疫原性部分包含至少10个、更优选至少15个、更优选至少25个，最优选至少30个连续氨基酸。取决于免疫原性部分所来源的蛋白质的类型，所述免疫原性部分优选最多包含500个氨基酸残基，更优选最多250个氨基酸残基。

蛋白质的衍生物定义为具有类型相同，量不一定相同的免疫原性性能的分子。本领域技术人员能够改变一个蛋白质从而使得与所述蛋白相比，所述分子的免疫原性性能基本上是相同类型，但不一定等量。蛋白质的衍生物是通过例如将所述蛋白的至少一个氨基酸残基突变和/或通过将一个氨基酸残基取代为另一个氨基酸残基而提供的。优选进行的是保守氨基酸取代，例如将包含酸性侧链的氨基酸取代为另一个包含酸性侧链的氨基酸、将体积大的氨基酸取代为另一个体积大的氨基酸、将包含碱性侧链的氨基酸取代为另一个包含碱性侧链的氨基酸等等。

本领域技术人员完全能够制备蛋白质的类似化合物。这是通过例如筛选肽文库或者借助肽改变程序。本发明所述的类似物具有与所述蛋白质类型基本相同，但量不一定相同的免疫原性性能。本发明的蛋白质的类似物包含例如融合蛋白和/或嵌合蛋白。

为了能够引发免疫反应，优选本发明所述的免疫原性部分、衍生物和/或类似物具备适宜的特点从而能够保证抗体和/或免疫细胞的产生。所述特点是本领域公知的，例如包括合适的旁侧序列和/或蛋白酶水解切割位点。替代地或者另外的，本发明所述的蛋白质、免疫原性部分、衍生物和/或类似物优选带有免疫原性载体。

本发明所述的蛋白质或免疫原性部分、衍生物和/或类似物一旦被给予人类个体或非人动物，通常会有因多种不同原因而被降解的危险，比如象蛋白酶水解、解折叠、极端pH值、去污剂和高盐浓度。为了延长蛋白质或者其免疫原性部分、衍生物和/或类似物的寿命，优选增强其抵抗降解的能力，例如为了保持其天然的电荷特征，通过合成带有C末端氨甲酰的肽和/或将肽的N末端乙酰化。在一个实施方案中，通过将本发明所述的蛋白质或免疫原性部分、衍生物和/或类似物突变，从而至少部分地抑制使得所述蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物容易自溶的局部解折叠过程，由此进一步提高它们的抗降解能力。稳定化突变策略是已知的，例如Matthews(1991)，Alber(1991)，Vriend and Eijsink(1993)以及Fersht andSerrano(1993)描述过。

分泌蛋白定义为在细胞和/或生物体中天然产生的并且至少部分从所述细胞和/或生物体中分泌到环境中的蛋白质。因此，如果培养链球菌，分泌蛋白至少部分，至少在某个时刻存在于至少部分培养基中。分泌蛋白不需要是连续产生和/或分泌的。例如分泌蛋白可以是仅在细菌生命周期的某个时期产生和/或分泌的。并且，分泌蛋白的产生和分泌不必同时发生。例如，某些分泌蛋白先在细胞内积累，然后晚些时候分泌。

表面相关蛋白定义为天然形成细胞表面一部分的，或者附着到细胞表面的蛋白质。如果所述表面相关蛋白是附着到细胞表面的，可以说直接或者间接附着。间接附着包括例如存在至少一个连接分子。

术语“分离的蛋白”是指至少部分与其天然环境脱离的蛋白质，和/或缺少自然界中通常与它相关联的序列的至少一部分的蛋白质。

术语“重组蛋白”是指通过分离的和/或人工表达系统，优选利用编码所述蛋白质的核酸序列产生的蛋白质。所述核酸序列优选可操纵地连接着至少一个调控序列，比如象启动子、增强子和/或终止子。优选所述调控序列是可诱导的，从而有可能控制所述蛋白的表达程度。在一个实施方案中，所述核酸序列包含外源核酸序列。外源核酸序列是存在于生物体基因组的某个所述核酸序列不天然存在的位置的核酸序列。

通过本发明的方法鉴定到能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的链球菌蛋白后，优选制备所述蛋白。产生的蛋白质适用于例如生产免疫原性组合物和/或在动物中引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应。正如上文所概括的，本领域已知有多种方法可以制备蛋白质，比如例如重组制备。因此本发明提供了通过发明所述方法鉴定到的至少一种蛋白质的制备方法。同时还提供了能通过发明所述方法获得的能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的链球菌蛋白。

符合本发明的链球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物尤其适用于制备免疫原性组合物。所述免疫原性组合物能够引发抗至少两种链球菌菌株的广泛的体液和/或细胞免疫反应。优选利用能够引发抗至少两种链球菌血清型的免疫反应的链球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物来制备免疫原性组合物，从而能够实现抗至少两种链球菌血清型的广泛免疫反应。因此发明还提供了通过发明所述方法获得的蛋白质或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物在制备能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物中的用途，以及能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含可由发明所述方法获得的至少一种分离的和/或重组的蛋白，或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。为了提供更广泛的保护，优选利用至少两种或更多种发明所述的蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物来制备免疫原性组合物。在一个实施方案中，将符合发明的至少一种蛋白质和至少一种免疫原性部分、衍生物和/或类似物组合用于制备免疫原性组合物。

除了更广泛的保护，使用至少两种发明所述蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物降低了产生链球菌生物体的逃逸突变体的机会。细菌生物体的逃逸突变体通常是在环境压力下产生的，例如在有抗生素存在的情况下和/或有抗所述生物体的表位之抗体的情况下。由于生物群体中的天然差异，某些生物体可以躲避过所述环境压力(比如存在所述抗生素和/或抗体的情况)的抑制效果，得以增殖。几个不同表位同时产生逃逸突变体的机会比仅有一个表位产生逃逸突变体的机会小。

因此，本发明的免疫原性组合物优选包含能通过发明所述方法获得的至少两个分离的和/或重组的蛋白质，和/或其至少一个免疫原性部分、衍生物和/或类似物。为了更好地避免形成逃逸突变体，本发明的蛋白质优选包含关键的蛋白质。就是说所述蛋白质对于链球菌的代谢、存活和/或增殖很重要-优选是关键的。这样对于关键蛋白可能发生改变形成的逃逸突变体，即使有活性也会较低。

表5和6包含通过发明所述方法鉴定到的优选乳房链球菌(Streptococcusuberis)蛋白质的列表。这些蛋白质，或者至少其一个免疫原性部分、衍生物和/或类似物适用于制备本发明的免疫原性组合物。因此本文也提供了本发明的用途，其中所述蛋白选自表5和/或表6；以及本发明的免疫原性组合物，所述组合物包含至少一种表5和/或表6中列举的分离的和/或重组的蛋白质，或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。为了提供更广泛的保护，所述免疫原性组合物优选包含至少两种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。最优选地，所述免疫原性组合物包含至少三种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

在优选实施方案中，所述至少一种、至少两种或至少三种表5和/或表6列举的蛋白质选自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100、P105、表面排斥蛋白、触发因子(ropA)以及核苷二磷酸激酶。这些蛋白质或者是被感染乳房链球菌的动物的血清中存在的抗体所识别，表明这些蛋白在奶牛中是体内表达的并且是免疫原性的；或者是如表5所示在至少两个乳房链球菌菌株中是交叉反应性的。以上蛋白质在例如表5中进行了表征，它们的编号参照例如显示乳房链球菌常见表面蛋白的非限制性实例的表1、2和3中列举的蛋白质。图4中进一步显示了这些选中的推测的表面蛋白/毒力因子的核酸和氨基酸序列之非限制性实例。

高度保守的、在体内表达并且是高度免疫原性的蛋白质，比如象实施例11所示的被来自感染不同菌株的奶牛的恢复期血清所识别的蛋白质尤其适用于符合本发明的免疫原性组合物。因此在更优选的实施方案中，从表5和/或表6中挑选的蛋白质包含选自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105的蛋白。最优选地，从表5和/或表6挑选的蛋白包含选自P15、P16、P54、P28、P63和P105的蛋白。正如实施例11所示，后面的选择被所有使用的恢复期血清识别，表明这些抗原在导致各自感染的所有乳房链球菌中都有表达，这些抗原是在宿主发生感染的过程中表达的，而且这些抗原是高度免疫原性的。

还有一个实施方案提供了能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含能通过本发明的方法获得的至少一种蛋白质或者所述蛋白质的免疫原性部分、衍生物和/或类似物的至少一种编码核酸分子。所述免疫原性组合物一经给予动物，即由动物的机构表达所述核酸分子，导致表达符合本发明的至少一种蛋白质和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物。所述蛋白质和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物的产生以及任选的分泌到胞外引起免疫反应。

在一个实施方案中，本发明的蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是重组产生的。发明提供了生产能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物的方法，所述方法包括给细胞或者另外的表达系统提供至少一种重组载体，所述至少一种载体包含的核酸序列编码至少一种能通过本发明的方法获得的蛋白、和/或至少一种选自表5和/或表6的蛋白，和/或所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或类似物。合适的表达系统是本领域已知的。在一个实施方案中，编码本发明的一种蛋白质或其免疫原性部分的至少一种核酸序列被表达。在另一个实施方案中，使用了编码至少两种蛋白质和/或免疫原性部分的至少一种核酸分子。还可以使用至少两种核酸分子，每个核酸分子编码一或多种符合本发明的蛋白质和/或免疫原性部分，等等。例如，一种核酸分子编码(至少)一种蛋白质，一种核酸分子编码(至少)一种免疫原性部分是合适的。因此核酸分子的数目以及所述核酸分子所编码的蛋白质和/或免疫原性部分的数目有可能存在差别。

本发明的核酸序列通过例如同源重组插入细胞的基因组。也有可能通过例如电穿孔随机插入核酸序列。替代的或者另外的，将所述核酸序列置于诸如质粒载体或噬菌体载体的载体中，所述载体在选定的表达系统(比如微生物和/或细胞)中是稳定的。优选发明所述核酸序列在诸如启动子、增强子和/或终止子的调控序列的控制下进行转录和翻译。优选地，所述启动子、增强子和/或终止子适合用于选定的表达系统。更优选地，为了能够可控性地表达，所述调控序列是诱导型的。(Biseibutsugaku Kisokoza(BasicMicrobiology)，Vol.8，Genetic Technology，Kyoritsu Shuppan(1990))中公开了适合各种微生物的启动子和终止子。例如，适合埃希氏菌，更具体说适合大肠埃希氏菌的质粒载体是pBR和pUC系列的质粒，合适的启动子包括例如lac启动子(β-半乳糖苷酶)、trp操纵子(色氨酸操纵子)以及tac启动子(lac-trp杂合启动子)以及来源于λ-faag PL或PR的启动子。优选的终止子包括trpA-或来源于噬菌体的rrnB核糖体终止子。适用于在链球菌中进行重组制备的质粒载体包括例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))。

因此本发明提供了这样的重组核酸分子，所述核酸分子包含的核酸序列处于功能性地连接的调控序列(比如启动子)之下，编码至少两种能通过发明所述方法获得的链球菌蛋白质，和/或选自表5和/或表6的蛋白质，和/或至少一种所述蛋白质的免疫原性部分。还提供了分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码至少两种能通过发明所述方法获得的链球菌蛋白质，和/或选自表5和/或表6的蛋白质，和/或至少一种所述蛋白质之免疫原性部分的核酸序列。所述宿主细胞优选包含原核宿主细胞。

在优选实施方案中，本发明的核酸分子被用于引发抗链球菌的免疫反应。优选这是利用重组载体实现的，所述重组载体包含编码至少一种能通过发明所述方法获得的链球菌蛋白质，和/或选自表5和/或表6的蛋白质，和/或至少一种所述蛋白质的免疫原性部分的核酸，或者本发明的重组核酸分子。因此还提供了所述重组载体。最优选地，提供的重组载体包含编码至少一种选自表5和/或表6的蛋白质的核酸。在一个特别优选的实施方案中，所述重组载体包含编码至少两种选自表5和/或表6的蛋白质的核酸。在一个实施方案中，让所述重组载体产生至少一种本发明蛋白，然后利用至少一种重组蛋白和载体本身的组合来引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应。在一个实施方案中，提供了灭活的发明所述重组载体。而在另一个优选实施方案中，提供了活的发明所述重组载体。在一个实施方案中，所述活载体是减毒的载体。本发明的活载体优选能够感染人类个体和/或非人动物，之后引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应。

本发明的重组载体优选包含链球菌菌种。这样抗链球菌的免疫反应就是由所述载体编码的蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物，以及所述重组载体本身共同引发的。链球菌的荚膜基因表达产物经常是高度免疫原性和血清型特异性的。因此，荚膜基因表达产物的存在会妨碍抗各种不同链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的诱发。因此，在一个实施方案中，如果本发明的重组载体包含链球菌，所述链球菌缺少至少部分荚膜基因表达产物。在一个实施方案中，所述链球菌是无荚膜型的链球菌。

正如上文描述的，接种来源于至少两种不同链球菌菌株和/或血清型的至少两种蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或类似物能够提供广泛的保护，并且减少形成逃逸突变体的机会。因此本发明的优选实施方案提供了发明所述重组载体，其包含编码来源于第一链球菌菌株和/或血清型的至少一种蛋白质和/或其免疫原性部分的核酸序列，以及编码来源于第二链球菌菌株和/或血清型的至少一种蛋白质和/或其免疫原性部分的核酸序列。所述重组载体优选包含活的重组载体。

在例如合适的宿主细胞中产生重组载体。因此也提供了包含本发明的重组载体的分离的宿主细胞。

本发明的重组载体适用于生产能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物。因此这里也提供了能够引发抗链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含本发明的重组载体。

将本发明的免疫原性组合物给予人类个体和/或非人动物后，引发了抗链球菌的免疫反应。所述免疫反应优选能够至少部分地抵抗链球菌相关的疾病。因此这里还提供了本发明的免疫原性组合物作为药物的用途，以及本发明的免疫原性组合物用于制备抗链球菌相关疾病的药物的用途。

本发明的免疫原性组合物还适用于生产疫苗。所述疫苗优选能够至少部分地提供抗链球菌相关疾病的保护作用。优选地，所述疫苗能够提供抗链球菌感染的保护作用。因此本发明提供了发明所述免疫原性组合物用于制备疫苗的用途。

优选将本发明的蛋白质、免疫原性部分、衍生物、类似物和/或重组载体与合适的载体一起给予人类个体和/或非人动物。所述载体优选能够促进所述人类个体和/或动物对发明所述蛋白、免疫原性部分、衍生物、类似物和/或重组载体的接受，并且优选增强免疫原性效果。合适的发明所述载体包含例如适宜的佐剂，所述佐剂能够增强本发明的免疫原性组合物的免疫效果。许多合适的佐剂(油基和水基的)是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，所述佐剂包含Diluvac Forte和/或Specol。在另一个实施方案中，所述合适的载体包含例如用于稀释蛋白质及其免疫原性部分、衍生物和/或类似物的例如盐水的溶液。因此，本发明还公开了发明所述免疫原性组合物，所述组合物包含至少一种本发明的蛋白质、免疫原性部分、衍生物、类似物和/或重组载体以及合适的载体。

本发明的免疫原性组合物能够在人类个体和/或非人动物中引发抗链球菌的免疫反应，从而减少和/或控制所述个体和/或动物中的链球菌生物的数目。因此本发明提供了用于减少和/或控制人类个体和/或非人动物中链球菌生物体数目的方法，所述方法包括给所述个体和/或非人动物提供本发明的免疫原性组合物。

本发明的免疫原性组合物优选能够至少部分地抵抗和/或预防链球菌相关疾病。一旦链球菌相关疾病已经存在，本发明的免疫原性组合物优选能够至少部分地抵抗所述疾病。因此本文也提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的免疫原性组合物，并且优选还包含合适的载体，比如例如Diluvac Forte和/或Specol。

本发明还有一个实施方案提供了测量人类个体和/或非人动物抗链球菌的免疫能力的方法，所述方法包括确定来自所述个体和/或动物的至少一个样本中是否存在这样的抗体和/或免疫细胞，所述抗体和/或免疫细胞抗能通过发明的方法获得的蛋白质，和/或选自表5和/或表6的蛋白质，或所述蛋白质的免疫原性部分。因此本文还提供了诊断试剂盒，其包含至少一种能通过发明的方法获得的和/或选自表5和/或表6的蛋白质，或其免疫原性部分，以及检测与所述蛋白质或其免疫原性部分发生抗体结合和/或免疫细胞结合的工具(means)。在特别优选的实施方案中，所述诊断试剂盒包含至少两种选自表5和/或表6的蛋白质。

发明详述

在优选实施方案中，本发明的方法被用于鉴定能够引发抗至少两种乳房链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的乳房链球菌蛋白质。这类乳房链球菌蛋白质优选用于制备能够引发抗至少两种乳房链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物。因此本文还提供了能够引发抗至少两种乳房链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物，及其用于制备抗乳房链球菌乳腺炎的药物的用途；所述免疫原性组合物包含至少一种，优选至少两种能通过本发明的方法获得的分离的和/或重组蛋白，或其至少一个免疫原性部分、衍生物和/或类似物。发明还提供了分离的或重组的核酸分子，所述核酸分子包含的核酸序列编码至少两种能通过本发明的方法获得的，和/或选自表5和/或表6的乳房链球菌蛋白质。另外提供的还有重组载体、宿主细胞和包含所述核酸的免疫原性组合物，及其用途。

乳房链球菌与牛乳腺炎相关联。牛乳腺炎是奶牛乳腺发生的感染，通常是由细菌引起的。感染后的炎症反应造成牛奶产量和质量下降，每年给奶制品行业造成重大的经济损失。在荷兰，每年每只奶牛的经济损失估计在大约100欧元。

最常见与乳腺炎相关的细菌是链球菌属的多个种，包括乳房链球菌(Streptococcus uberis)(不可分型的(untypeable))、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(兰氏分群(Lancefield group)B群)、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)(兰氏C群)、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)以及兰氏D、G、L和N群链球菌。这些菌种中有些是感染性的(例如，无乳链球菌)，而其他的被认为是环境病原菌(例如停乳链球菌和乳房链球菌)。

感染乳房链球菌导致的乳腺炎通常是亚临床的，其特征在于显然是正常的牛奶，以及由于白细胞涌入造成的体细胞计数增加。

根据感染造成的临床效果，乳腺炎的严重程度不一。较温和的乳腺炎可能导致体温有所上升，和/或乳房温度上升。在某些严重的病例中，乳房链球菌性乳腺炎也可能表现出急性临床症状，有明显的病征，比如牛奶凝块或变色，以及乳腺的肿大或变硬。有些临床病例可能非常严重，有可能存在发热。关于乳房链球菌性乳腺炎的临床表现的综述，参见Bramley(1991)和Schalm et al.(1971)。

常规的抗菌控制方法，比如乳头药浸和抗生素疗法能够有效控制许多类型的传染性乳腺炎，但是在所有奶场都能发现的常见环境生物体经常对这类措施有抗性。因此这些措施没能影响由诸如乳房链球菌和大肠埃希氏菌等环境病原菌导致的乳腺炎的发生率，目前95％以上的乳腺炎病例是由它们导致的。对于这两种菌种，在英国(Hillerton et al.，1993)、新西兰(McDougall，1998)、美国(Hogan et al.，1989)以及荷兰(Animal Health Service，2000)进行的调查显示，乳房链球菌是最重要的环境病原菌。还有证据表明，一旦从环境中被感染乳房链球菌，该菌可以直接从被感染的奶牛传播给易感动物(Neave et al.，1969，Oliver et al.，1999，Zadoks et al.，2001)。存在几种毒力和抗原性不同的乳房链球菌菌株。

目前方法在控制乳房链球菌性乳腺炎的失败使得人们寻找替代的控制措施，比如更有效的疫苗。至今已开发了几种类型的疫苗，并已在奶牛中进行了测试。

给奶牛反复接种灭活全细菌，再用同样的菌株进行试验性攻击后，牛奶中存在的细菌数目减少(Leigh，1999；Leigh，2000)。但是灭活疫苗不能防止乳腺中的感染或炎症反应，并且对野外乳房链球菌乳腺炎的发生率没有效果(Leigh，1999)。因此，结论是免疫接种灭活细菌不是乳房链球菌乳腺炎的解决方法。

接种活的乳房链球菌诱发对用相同(或同源)菌株进行的试验性攻击的部分保护(Finch et al.，1997)。保护是在没有调理活性，没有大量嗜中性粒细胞涌入的情况下实现的。但是，疫苗似乎不能提供对其他乳房链球菌菌株的保护作用。这些全细胞疫苗策略的较低成功率表明很难用常规的全细胞疫苗给动物提供抗乳房链球菌的保护作用。

近来，基于乳房链球菌的一个蛋白质生产出了亚基疫苗(Fontaine et al.2002)。所述亚基疫苗在发表后至今没有后续进展，这使我们得到的结论是能够找到可以使动物抗几种类型的乳房链球菌的单个蛋白的机会很小，这类亚基疫苗通常不是控制乳房链球菌乳腺炎的解决方法。

总之，接种全细菌，无论活的或者灭活的，或者包含一种蛋白质的疫苗都不能有效地防止或者治愈乳房链球菌导致的乳腺炎。

尽管以上描述的抗乳房链球菌性乳腺炎的疫苗结果令人沮丧，我们在本文中披露，根据本发明，利用能够引发抗乳房链球菌的抗原性组合物成功地预防和/或消除了由多种乳房链球菌菌株引起的乳腺炎。

本发明提供了用于鉴定能够引发抗至少两种乳房链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的乳房链球菌蛋白的方法，所述方法包括：

a)鉴定至少部分分泌蛋白、表面相关蛋白和/或与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白；

b)挑选至少一种步骤a)鉴定到的蛋白质，所述蛋白在至少两种乳房链球菌菌株和/或型别中是保守的；以及

c)确定步骤b)挑选的至少一种蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够特异结合感染了第一乳房链球菌菌株和/或型别的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二乳房链球菌菌株和/或型别的动物的抗体和/或免疫细胞。

优选地，所述与细胞毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白质与细菌毒力因子具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，最优选至少80％序列同一性。

本发明另外还公开了至少两种分离的或重组的乳房链球菌表面蛋白或其免疫原性部分组合成的抗原性组合物大大增强了抗乳房链球菌菌株的免疫反应。虽然包含多种细菌免疫原性蛋白的全细菌细胞疫苗不能引发抗各种乳房链球菌菌株的广泛保护，本发明的免疫原性组合物中的两种或多种蛋白质或其免疫原性部分具备增强抗乳房链球菌的免疫反应的预期效果。我们在本发明中公开了挑选乳房链球菌生物体(优选是乳房链球菌生物体的至少两种菌株或型别)的至少两种免疫原性蛋白质或其免疫原性部分，将所述至少两种免疫原性蛋白质或其免疫原性部分组合成免疫原性组合物，从而提高对乳房链球菌不同菌株的免疫力，因为免疫反应是针对更广泛的不同乳房链球菌生物体。

为了在个体或动物中引发免疫反应，优选将蛋白质的免疫原性部分递呈成所述个体或动物。在本发明中，术语“免疫原性部位”与术语“免疫原性部分”可以互换使用。“免疫原性部分或部位”意味着能够在个体中引发免疫反应的蛋白质部分。优选所述蛋白质的免疫原性部分包含一或多个表位，从而能够引发免疫反应。免疫原性部分包含至少5个氨基酸，优选至少10-15个，最优选25或更多个连续氨基酸。因此发明在另一个实施方案中提供了包含由发明所述核酸编码的蛋白性分子中至少30个连续氨基酸的蛋白质或其免疫原性部分。构象表位通常是在蛋白质处于其三维结构时，由几段连续氨基酸折叠至一定位置，共同形成表位。本发明还公开了将构象表位作为免疫原性部分。

蛋白质的衍生物定义为具有类型相同，量不一定相同的免疫原性性能的蛋白质。本领域技术人员能够改变蛋白质使得所述分子类型基本相同，但量不一定相同。通过多种途径可以提供蛋白质的衍生物，例如通过诸如将蛋白质中的一个氨基酸取代为另一个氨基酸这样的保守氨基酸取代。在常规替换做图中，优选进行的是保守性变化，例如将包含酸性侧链的氨基酸取代为另一个包含酸性侧链的氨基酸、将体积大的氨基酸取代为另一个体积大的氨基酸、将包含碱性侧链的氨基酸取代为另一个包含碱性侧链的氨基酸、将包含不带电荷的极性侧链的氨基酸取代为包含不带电荷的极性侧链的氨基酸、将包含非极性侧链的氨基酸取代为包含非极性侧链的氨基酸。本领域技术人员很容易制备蛋白质的类似化合物。这能通过例如筛选肽文库或者利用改变肽的程序来实现。为了作为免疫原，合成具有适宜特性的肽以便保证更高的成功率产生抗体。这包括如果肽是天然蛋白质的真实的C末端序列，需要C末端的游离羰基；如果肽是天然蛋白质的真实的N末端序列，需要游离的N末端基团。这样的类似物与所述蛋白具有基本相同类型的免疫原性性能，但不一定量相同。

蛋白质或者肽会发生多种因素导致的降解，象例如蛋白质水解、解折叠、极端pH值、去污剂和高盐浓度。为了延长重组蛋白质或肽的寿命，将所述蛋白或肽制备地更稳定以经受降解，例如通过合成带有C末端甲酰胺的蛋白质和/或将N末端乙酰化从而维持天然的电荷特性。这还可以进一步通过突变，利用稳定化突变策略来抑制通常会使蛋白质容易被自溶的局部解折叠过程。所述稳定化突变侧链基于蛋白质结构和稳定性的公认原理，正如例如Matthews(1991)、Alber(1989)、Vriend and Eijsink(1993)以及Fershtand Serrano(1993)中描述的。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含含有至少两种重组或分离的表面蛋白或其衍生物或类似物和/或免疫原性部分的组合物，其中将所述组合物给予个体或者动物，优选给予奶牛，导致对所述表面蛋白或其免疫原性部分建立起体液和/或细胞免疫反应。

免疫反应包括在个体或动物，优选奶牛中建立起针对所述蛋白或其免疫原性部分的体液和/或细胞免疫反应。体液免疫反应导致个体或动物中产生抗体，而细胞免疫反应主要会增加应答性免疫细胞的形成。一般来说，免疫反应的这两部分是由给予免疫原性蛋白或其部分引发的。优选的抗乳房链球菌的免疫反应是产生抗体。优选地，所述免疫反应能够预防和/或减弱乳腺炎，和/或减少乳房中乳房链球菌生物体的数目。本发明公开了选择和制备用于引发所述抗体反应的蛋白和表位的方法。另一种优选的抗乳房链球菌的免疫反应是细胞性免疫反应。本发明也公开了挑选表面蛋白的T细胞表位的方法，以及制备导致T细胞反应性增强的T细胞表位的方法，例如通过象Van der Burg et al(WO 97/41440)描述的将多个预先挑选的T细胞表位偶联成珠串的方式。

在发明的一个实施方案中，所述免疫原性组合物能够减弱感染的持续时间和/或严重程度或者提高动物对乳房链球菌感染的抵抗力。

本发明公开了优选针对乳房链球菌外部的免疫反应。因此，本发明公开的免疫原性组合物或其免疫原性部分能够引发针对优选位于或者靠近乳房链球菌细胞表面的抗原的免疫反应。本发明的表面蛋白包含优选天然地靠近或者位于乳房链球菌细菌表面的蛋白质，和/或优选由乳房链球菌细菌天然地产生和/或分泌到胞外的蛋白质。优选在乳房链球菌的其他菌株中存在所述表面蛋白的同源蛋白。因此，来源于一种乳房链球菌菌株的免疫原性蛋白或其部分所引发的免疫反应也能有效抗其他乳房链球菌菌株。因此本发明公开了能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含至少两种来源于乳房链球菌的重组和/或分离的表面蛋白，和/或所述蛋白中任一种或者两者的免疫原性部分。

术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术，即通过转化了编码所需蛋白之核酸构建体的细胞产生的蛋白质。所述核酸构建体是例如带有控制表达序列的调控序列，比如启动子和/或终止子序列和/或增强子序列的重组DNA构建体。

术语“分离的蛋白”是指与其天然所存在的整个生物体分开和离散的蛋白质；和/或完全或部分地不含有正常情况下与它相关联的物质的蛋白质。

所述免疫原性组合物包含来源于相同乳房链球菌生物体的至少两种蛋白质或其免疫原性部分；或者包含来自一类乳房链球菌的至少一种蛋白或其免疫原性部分，以及来自另一类乳房链球菌的至少一种蛋白或其免疫原性部分。发明还公开了至少3种或4种或者更多种蛋白质或其免疫原性部分的组合，其中的一种或两种或更多种来源于其它类型的乳房链球菌。

优选地，本发明的免疫原性组合物或其免疫原性部分包含来自至少两种不同乳房链球菌生物体的蛋白质，因为这样产生的广泛免疫反应可以交叉保护，即可以对抗不同类型的乳房链球菌。而且，利用来自至少两类乳房链球菌菌株的免疫原性蛋白或其免疫原性部分降低了形成乳房链球菌生物体的逃逸突变体的机会。细菌生物体的逃逸突变体通常是在环境压力下形成的，例如在有抗生素的情况下，或者存在抗所述生物体的表位的抗体的情况下。比如因为生物体群体中的低突变率导致的天然差异，所述群体中的某些生物体的复制更受所述抗体的抑制，而其他生物体能够逃避所述抗体的抑制效果并不断地增殖，从而在新的群体中占据主导地位。几个不同表位同时产生逃逸突变体的机会比仅有一个表位产生逃逸突变体的机会小。优选免疫原性组合物和/或其免疫原性部分能够引发抗至少两种蛋白质的免疫反应，导致更广泛的抗感染作用并减少乳腺炎的临床症状。因此，本申请提供了能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含来源于至少一种乳房链球菌菌株的至少两种重组和/或分离的表面蛋白，和/或所述蛋白中任一种或者两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。

对细菌生物体的代谢或存活或者增殖重要的蛋白质通常称为生物体的关键蛋白。所述关键蛋白的序列和功能通常在不同类型的乳房链球菌中是较为保守的。在发明的优选实施方案中，所述免疫原性蛋白是乳房链球菌的关键蛋白。这样，免疫反应针对的是关键蛋白或其免疫原性部分，从而形成对抗同源的乳房链球菌生物体的防护作用，但也能交叉反应性对抗不同类型的乳房链球菌，因为所述保守蛋白或关键蛋白也存在于其他类型的乳房链球菌表面上。因此，将乳房链球菌生物体的关键表面蛋白作为发明的免疫原性蛋白提高了抗不同类型乳房链球菌感染的免疫反应的保护效力，减少了所述生物体逃避免疫反应的可能性。

乳房链球菌的荚膜抗原通常是良好的免疫原性表位，因为荚膜抗原很容易用奶牛(忍耐了乳房链球菌乳腺炎)的恢复期血清检测到。所述免疫原性特性能够增强抗相关乳房链球菌免疫原性表位的免疫反应。因此，在另一个实施方案中，免疫原性组合物在免疫原性蛋白之外，包含至少一种荚膜抗原，因为所述荚膜抗原能够提高抗所述免疫原性组合物的免疫反应。

本专利申请在表5和表6中公开了优选的重组和/或分离的表面蛋白，这些蛋白来源于乳房链球菌并因其能够引发抗不同乳房链球菌菌株的免疫反应而被选中。因此，本申请提供了发明的免疫原性组合物，和/或所述蛋白中任一种或者两者的免疫原性部分或类似物或衍生物，其中至少两种蛋白选自表5和/或表6。

在发明的优选实施方案中，从表5和/或表6的蛋白中进行选择，并将两种或多种蛋白质进行组合，象例如乳房链球菌菌株O140J的No.63蛋白质和/或其免疫原性部分，与来自乳房链球菌菌株41-241的No.15或22蛋白质和/或两者和/或其免疫原性部分。这样的选择提供了来自两种不同乳房链球菌菌株的蛋白或其免疫原性部分，从而提供了针对多种乳房链球菌菌株的广泛保护作用。

在优选实施方案中，从表5和/或表6中选择的蛋白质包含选自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105的蛋白质。正如前面提过的，这些蛋白质或者被感染了乳房链球菌的动物的血清中存在的抗体识别，表明这些蛋白在奶牛中是体内表达的并且是免疫原性的；或者如表5所示在至少两种乳房链球菌菌株中是交叉反应的。

实施例11中鉴定的蛋白质尤其适用于引发免疫反应。因此，在更优选的实施方案中，从表5和/或表6中选择的蛋白质包含选自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105的蛋白质。最优选地，从表5和/或表6中选择的蛋白质包含选自P15、P16、P54、P28、P63和P105的蛋白质。正如上文提及的，所有实施例11中导致各自感染的乳房链球菌中都能表达后一组选中的蛋白，这些蛋白是在感染宿主的过程中被表达，并且是高度免疫原性的。在例如表5中进行了表征的上述蛋白的编号参照在例如表1、2和3中描述的蛋白，这几个表显示了乳房链球菌常见表面蛋白的非限制性实例。此外，图4显示了这些选中的推测的乳房链球菌表面蛋白/毒力因子的核酸和氨基酸序列的非限制性实例。

在野外经常会发现牛奶中或牛乳房上或乳房内有少量的细菌，这不一定对动物构成危害。当牛奶或者牛乳房中的细菌，例如乳房链球菌生物体的数量增加时，就可能发生乳腺炎。通过本发明的蛋白或其免疫原性部分引发的免疫反应优选能够有效地抑制牛乳房中至少部分乳房链球菌生物体的细菌生长。减少直接环境中乳房链球菌生物体的数量也有助于预防乳腺炎。本发明公开了如何通过给奶牛接种，从而将乳房链球菌生物体的数量维持在较低来预防和/或减少乳房链球菌乳腺炎。乳房链球菌生物体的所述低水平可以进一步通过在挤奶时采取的卫生措施来保持，例如通过清洁牛乳房、乳头以及会接触到乳房和/或乳头的所有器具。

在一个实施方案中，本发明提供的来源于乳房链球菌的重组和/或分离的表面蛋白是由利用原核细胞或真核细胞的制备系统产生的。用于制备重组蛋白的具备成熟宿主/载体系统的细胞的例子，包括例如细菌：埃希氏菌(Escherichia)，芽孢杆菌(Bacillus)，假单胞菌(Pseudomonas)、沙雷菌(Serratia)、短杆菌(Brevibacterium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、链球菌和乳杆菌；酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、丝孢酵母(Trichosporon)、冬孢酵母(Rhodosporidium)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)和假丝酵母(Candida)；以及对真菌有：脉孢霉(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、头孢霉(Cephalosporium)和木霉(Trichoderma)。

为了制备目的重组蛋白，将编码所述蛋白或其部分的基因通过同源重组或随机地整合到基因组中，或者将所述基因置于质粒载体或噬菌体载体中，在选定的微生物或细胞中稳定地维持所述载体并表达。为了在微生物或细胞中表达选定的DNA构建体，在启动子和终止子的控制下转录和翻译所述基因。优选地，所述启动子和终止子适合所选微生物。“BiseibutsugakuKisokoza(Basic Microbiology)，Vol.8，Genetic Technology，Kyoritsu Shuppan(1990)”中公开了适用于各种微生物的启动子和终止子，“Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)”和“Yeast 8，423-488(1992)”中公开了酵母菌优选的。例如，适合埃希氏菌，更具体说适合大肠埃希氏菌的质粒载体是pBR和pUC系列的质粒，合适的启动子包括lac启动子(β-半乳糖苷酶)、trp操纵子(色氨酸操纵子)以及tac启动子(lac-trp杂合启动子)以及来源于λ-faagPL或PR的启动子。优选的终止子包括trpA-或来源于噬菌体的rrnB核糖体终止子。适用于链球菌中进行的重组制备的质粒载体包括例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))。适用于乳杆菌中进行的重组制备的质粒载体包括例如那些针对链球菌公开的，比如例如pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))。适用于酵母，优选酿酒酵母中进行的重组制备的质粒载体包括例如YRp、Yep、YCp和Yip系列的载体。通过采用核糖体DNA与染色体中多重拷贝的同源重组构建的整合载体(EP5327456)适用于多拷贝的插入和稳定的基因调控。适用于克鲁维酵母，优选乳酸克鲁维酵母中进行的重组制备的质粒载体包括例如来源于酿酒酵母的2μm质粒系列、pKD1系列的质粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))以及参与杀伤活性的pGK11衍生的质粒、带有克鲁维酵母的自主复制基因的KARS系列质粒和整合载体(EP 537456)。适用于毕赤酵母中进行的重组制备的质粒载体包括例如宿主载体系统，该系统是利用参与毕赤酵母中的自主复制的一个基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中建立起来的(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985)。适用于假丝酵母中进行的重组制备的质粒载体包括例如在麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白假丝酵母(Candida albicans)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)中建立的宿主载体系统(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987)。适用于曲霉中进行的重组制备的质粒载体包括例如通过基因整合到质粒或染色体中以及胞外蛋白酶或淀粉酶的启动子构建的载体(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。适用于在木霉中进行的重组制备的质粒载体包括例如在里氏木霉(Trichoderma reesei)中建立的宿主载体系统，以及适合构建所述载体的胞外纤维素酶的启动子(Biotechnology 7，596-603(1989))。

优选地，是以编码表5和/或表6中的蛋白质或其免疫原性部分的核酸构建体，优选DNA构建体提供所述制备系统的。

在另一个实施方案中，是以编码表5和/或表6中的两种或三种或四种或更多种蛋白质或其免疫原性部分的DNA构建体提供所述制备系统的。

还有一个实施方案中，是以各自编码表5和/或表6中的至少一种蛋白或其免疫原性部分的至少两个DNA构建体提供所述制备系统的。

在优选实施方案中，所述表5和/或表6中的蛋白选自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105、更优选所述表5和/或表6的蛋白选自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最优选地，所述表5和/或表6中的蛋白选自P15、P16、P54、P28、P63和P105。

在更优选的实施方案中，所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含来源于一种以上乳房链球菌蛋白质的免疫原性表位。更优选地，所述融合蛋白包含来源于来自一种以上乳房链球菌菌株的蛋白质的表位。

在发明的另一个实施方案中，所述核酸构建体编码被修饰过以便增强体液和/或细胞免疫反应的表位。因此，本申请提供了制备免疫原性组合物的方法，所述组合物包含至少两种能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的乳房链球菌蛋白，所述方法包括给细胞提供重组载体，其中所述载体包含的核酸编码至少两种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。为了由核酸重组制备蛋白，优选将所述核酸置于诱导型调控序列的控制下，所述调控序列能够增强所述蛋白的表达，优选导致更高的蛋白产量。优选地，所述重组蛋白或其免疫原性部分累积在细胞质中，例如在那些要从细胞中收集所产生的重组蛋白的情况下，或者蛋白是分泌的，例如产生的蛋白是从培养液中收集的。因此，提供带有正确调控序列和/或功能性连接的启动子的编码所述免疫原性蛋白的重组构建体以便蛋白的胞内或胞外累积。

因此，本发明提供了包含核酸序列的重组分子，所述核酸序列处于功能性连接的启动子的控制下，其编码至少两种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或者两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。

在优选实施方案中，所述表5和/或表6中列举的蛋白选自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105。更优选的所述表5和/或表6中列举的蛋白选自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最优选所述表5和/或表6中列举的蛋白选自P15、P16、P54、P28、P63和P105。

本申请还提供了包含本发明的核酸序列或发明的重组DNA分子的活性重组载体。在优选实施方案中，所述载体是第一乳房链球菌菌株，重组核酸编码另一种乳房链球菌菌株的免疫原性表位。因此，本发明提供了包含核酸序列的活性重组载体，所述核酸序列处于功能性连接的启动子的控制下，其编码表5和/或表6中列举一种或多种蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或者两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。当然，所述活性重组载体在被灭活时也是免疫原性的。因此，本发明还公开了灭活的重组载体。

本申请进一步提供了包含核酸序列的分离的宿主细胞，所述核酸序列处于功能性连接的启动子的控制下，其编码一种或多种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或者两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。分离的宿主细胞包含例如细菌，比如埃希氏菌、芽孢杆菌、假单胞菌、沙雷菌、短杆菌、棒状杆菌、乳房链球菌、猪链球菌和乳杆菌；或者酵母菌，比如例如：酿酒酵母、克鲁维酵母、裂殖酵母、接合酵母、耶氏酵母、丝孢酵母、冬孢酵母、汉逊酵母、毕赤酵母和假丝酵母，或者真菌，比如例如：脉孢霉、曲霉、头孢霉和/或木霉。

基于前述的包含重组分子的分离的宿主细胞，本发明向本领域技术人员公开了如何制备重组蛋白性分子，其中所述重组分子包含的核酸序列处于功能性连接的启动子的调控之下，编码一种或多种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或全部的免疫原性部分或类似物或衍生物。由于不同乳房链球菌菌株之间的差异，来自各种菌株的蛋白质和肽的氨基酸序列可能略有不同，但仍具有相同的功能。因此，来源于一种乳房链球菌菌株的蛋白性分子与另一种乳房链球菌菌株中的功能等同蛋白性分子具有序列同一性。“序列同一性”是指将两个氨基酸序列或核苷酸序列进行比对，并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，两个序列之间的序列同一性百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。可以用于或者改编用于确定候选序列是否落在这个定义范畴内的一个计算机程序是版权属于Genentech，Inc.的“Align 2”，该程序于1991年12月10日与用户文件提交至美国版权局(Washington，D.C.20559)。如果两个氨基酸序列在比对后，序列显示两个分子存在至少约80％、优选至少约90％，最优选至少约95％的序列同一性，它们相互具有高的“序列同一性”。因此，本申请公开了与发明所述核酸编码的蛋白质具有至少80％序列同一性的分离的和/或重组的蛋白性分子。在优选实施方案中，发明公开了与发明所述核酸编码的蛋白质具有至少95％序列同一性的分离的和/或重组的蛋白性分子。

为了在动物中诱发或引发抗本发明的蛋白或免疫原性部分的免疫反应，给所述动物提供所述蛋白和/或包含至少一个免疫原性部位的免疫原性部分。蛋白质的免疫原性部分或部位是由一个或多个表位形成，因此能够引发免疫原性反应。免疫原性部位优选包含至少5个氨基酸，更优选至少10-15个，最优选25个或更多个连续氨基酸。发明在另一个优选实施方案中提供了这样的蛋白或其免疫原性部分，所述蛋白或免疫原性部分包含由发明的核酸编码的蛋白性分子中的至少25个连续氨基酸片段。优选所述至少25个连续氨基酸的片段包含免疫原性部位。在优选实施方案中，重组核酸分子编码至少一个蛋白质或者编码表示至少两个蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白。在优选实施方案中，所述融合蛋白包含至少两种乳房链球菌菌株的蛋白的免疫原性部分。因此，发明公开了编码本发明的蛋白性分子的核酸。

在宿主细胞中表达所述核酸提供了本发明的免疫原性蛋白质。优选将所述免疫原性蛋白并入发明的免疫原性组合物。因此，本发明提供了能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含发明所述分离的和/或重组的蛋白性分子。所述发明的重组蛋白由宿主细胞产生。将比如例如大肠杆菌的细菌和/或酵母菌或真菌或真核细胞作为宿主细胞进行生产。

并入了分离的或重组蛋白的免疫原性组合物，和/或展示所述蛋白的细胞在给予动物(优选奶牛)时，能够引发抗乳房链球菌的免疫反应。优选地，所述包含处于合适的调控序列下的发明所述核酸的细胞将所述蛋白表达于细胞表面。这类细胞称为载体细胞。优选将所述载体细胞并入本发明的免疫原性组合物中。优选地，所述载有所述免疫原性蛋白的细胞是活性重组载体，但在另一个实施方案中，所述载体能够在通过例如福尔马林处理灭活后引发免疫反应。因此，本发明提供了能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含活的或灭活的本发明的重组载体。因为乳房链球菌是导致奶牛乳腺炎的病因，在发明的优选实施方案中，所述活的或者灭活的重组载体是链球菌属的。在发明的一个实施方案中，所述宿主细胞是链球菌属的。然后优选所述蛋白分子在能够增强引发免疫反应的其他链球菌蛋白的背景下存在。而且，能通过在宿主细胞，优选链球菌细胞表面过表达重组蛋白来增强免疫原性。此外，使用不同的链球菌宿主细胞菌株可以提高免疫原性蛋白或其部分的免疫原性。因此，本发明还提供了发明所述免疫原性组合物，其中所述宿主细胞是链球菌属的。有几种链球菌也适合作为宿主细胞，例如猪链球菌或无乳链球菌或停乳链球菌。

因为各种链球菌之间的不同，而且因为天然存在于乳房链球菌的某些蛋白质能够帮助引发抗乳房链球菌的免疫反应，在优选实施方案中，弱化的乳房链球菌被作为本发明的免疫原性组合物中的活性重组载体。优选地，所述乳房链球菌生物体表达另一种乳房链球菌菌株的蛋白，从而公开了区分疫苗，因为通过检测抗这两种菌株的蛋白的抗体，可以将接种了所述疫苗的动物的血清与感染了野外感染的动物辨别开。在另一个实施方案中，用活的或者灭活的猪链球菌或葡萄球菌或者大肠杆菌取代所述乳房链球菌生物体作为宿主细胞，或者作为活的或灭活的载体。

给予本发明的免疫原性蛋白或其部分，或者给予编码所述蛋白的核酸能够引发免疫反应。在给予奶牛后，所述核酸在所述奶牛的细胞内表达，并被所述奶牛的免疫系统识别。核酸以此充当了免疫原性组合物，例如作为抗乳腺炎的DNA疫苗。因此，本发明提供了能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含本发明的核酸。

因为本发明的免疫原性组合物能够在动物，优选奶牛中引发免疫反应，发明所述蛋白质减少与乳腺炎相关的疾病，提高所述奶牛的健康状况，从而使奶牛更能抵抗其他(次级)感染。因此，本发明提供了发明所述免疫原性组合物作为药物。

优选地，本发明的免疫原性组合物被用于制备抗乳房链球菌乳腺炎的药物，所述药物减少因乳房链球菌导致的乳腺炎所造成的特定疾病。因此，本发明提供了发明所述免疫原性组合物用于制备抗乳房链球菌乳腺炎的药物的用途。

本发明的免疫原性组合物还被用于制备或配制抗乳腺炎的疫苗。疫苗通常能够防止动物或人染上某种疾病。优选地，本发明的免疫原性组合物能够预防乳腺炎。因此，本发明在优选实施方案中公开了发明所述免疫原性组合物用于制备疫苗的用途。

在另一个实施方案中，优选将发明的免疫原性组合物用于减少和/或控制牛奶和/或奶牛乳房中的乳房链球菌生物体的数量。在奶场进行的挤奶过程潜在着将乳房链球菌生物体从染病的奶牛传播给另一只奶牛的危险。因此最适合通过乳房链球菌生物体数量的下降来抑制感染从乳头到乳头和/或从动物到动物的传播。

为了给予个体本发明的免疫原性组合物，将蛋白或其免疫原性部分或者宿主细胞与合适的载体混合，从而促进个体对免疫原性组合物的接受并增强所述组合物的免疫原性效果。发明所述合适的载体包含例如合适的佐剂以便提高所述免疫原性组合物的免疫效果。许多油基和水基的合适的佐剂是本领域技术人员知道的，例如Diluvacforte

佐剂或Specol

佐剂。在一个实施方案中，所述合适的载体包含例如溶液，象用于稀释细菌或蛋白或其免疫原性部分的盐水。因此，本发明公开了包含发明所述免疫原性组合物和合适的载体的药物组合物。

在接种了本发明的免疫原性组合物的动物，优选奶牛中，产生了针对乳房链球菌的抗体。免疫接种发明的免疫原性组合物或疫苗后，所述抗体的存在和水平指示着免疫力。优选所述抗体不是针对作为野外的野生型乳房链球菌菌株存在的表位。为了将接种了疫苗的动物与带有野生型感染的动物分辨开，在一个实施方案中优选通过测量针对发明所述免疫原性组合物的抗体来检测所述接种了疫苗的动物的免疫力。还检测了所述接种过疫苗的奶牛的抗血清是否存在免疫原性组合物中没有的抗乳房链球菌抗原的抗体。检测到发明所述免疫原性组合物或疫苗中不存在的抗乳房链球菌抗原的抗体表明有野生型感染。因此，本发明公开了测量动物抗乳房链球菌的免疫力的方法，所述方法包括确定来自所述动物的至少一个样品中是否存在针对选自表5和/或表6的蛋白或其免疫原性部分的抗体。在优选实施方案中，所述选自表5和/或表6的蛋白质选自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105。更优选所述选自表5和/或表6的蛋白质选自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最优选的，所述选自表5和/或表6的蛋白质选自P15、P16、P54、P28、P63和P105。

为了检测与发明所述免疫原性组合物结合的抗体，适合使用包含至少一种表5和/或表6中的蛋白质或其免疫原性部分的诊断试剂盒。通过例如免疫荧光抗体检测或者酶联抗体检测或者任何其他能够检测结合在所述蛋白或其免疫原性部分上的抗体的手段来检测抗体与所述蛋白或其免疫原性部分的结合。

在优选实施方案中，所述至少一种表5和/或表6中的蛋白质选自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105。更优选所述至少一种表5和/或表6中的蛋白质选自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最优选的，所述至少一种表5和/或表6中的蛋白质选自P15、P16、P54、P28、P63和P105。

因此，本发明公开了这样的诊断试剂盒，所述试剂盒包含至少一种选自表5和/或表6的蛋白质或其免疫原性部分，以及检测与所述蛋白或其免疫原性部分结合的抗体的手段。这类诊断试剂盒是例如ELISA检测或者任何其他适用于筛查血清的检测。优选地，所述检测试剂盒适用于筛查大量血清。

在另一个实施方案中，发明的核酸被用于检测接种了本发明的免疫原性组合物或疫苗的动物群体中，感染有野生型乳房链球菌菌株的动物。这项检测是通过利用例如PCR实现的。

本专利申请公开了发明所述成功的免疫原性蛋白是能够接触到细菌表面的抗体，并且是多种乳房链球菌菌株共有的蛋白性分子和/或蛋白质。作为实例，从菌株41-241和O140J的基因组序列中鉴定到的表面蛋白是通过挑选含有一或多个常见于革兰氏阳性细菌表面蛋白的序列，例如将蛋白锚定到细胞壁所需的LPXTG分选酶基元，或者脂蛋白所需的脂类附着基元，或者信号序列或预示着所编码的蛋白将定位到表面的跨膜区。

本申请公开了通过用由以上挑选的基因得到的PCR产物探测多种乳房链球菌菌株的染色体DNA证实选中的蛋白质存在于乳房链球菌菌株中。

以下实施例进一步解释发明。这些实施例不会限制发明的范围，而只是用于阐明发明。可以实施许多替代的实施方案，它们都在本发明的范围内。

附图说明

图1.完整乳房链球菌菌株的FACS分析。将乳房链球菌菌株41-241(A)和O140J(B)与小鼠免疫血清(黑色条带)或相应的免疫前血清(浅色条带)一起温育。利用FITC偶联的二抗检测结合的抗体。数据表达为与细菌细胞相关的荧光强度的中值。荧光强度≥10(2x背景)认为是阳性。所用血清的编号参照表1到4中显示的基因/蛋白编号。

图2.考马斯亮蓝染色的2D蛋白组模式。用得自试验性感染菌株O140J的奶牛的牛血清探测指数生长的乳房链球菌菌株41-241(A)和O140J(B)的裂解物。圈起来的蛋白质鉴定为免疫原性蛋白。表6中显示了通过胶内胰蛋白酶消化、MALDI-TOF质谱分析鉴定到的蛋白质的特性。

图3.用乳房链球菌菌株O140J或菌株41-241感染奶牛

3A.用乳房链球菌菌株O140J经乳腺导管感染奶牛6716和6717。用乳房链球菌41-241经乳腺导管感染奶牛6720和6721。注意奶牛6720是用5000cfu乳房链球菌进行感染，6721是用500cfu乳房链球菌进行感染。

SSC表示牛奶中的体细胞计数。BO意味着细菌研究，显示为以菌落形成单位(cfu)表示的从牛奶中分离的微生物数量。RV表示右前乳区，LA表示左后乳区。

3B.感染乳房链球菌菌株O140J后，奶牛6718和6719的临床症状以及细菌学和细胞学结果。

3C.感染乳房链球菌菌株41-241后，奶牛6722和6723的临床症状以及细菌学和细胞学结果。

图4.表5中的乳房链球菌蛋白的核酸序列和氨基酸序列。

实施例

实施例1

共有表面抗原的选择

DNA序列分析。以2x覆盖度确定了乳房链球菌菌株41-241的DNA序列。将测序数据进行拼接获得含有1815个ORF的572个连续序列。乳房链球菌菌株O140J(Hill，1988)已在Sanger center测序。2002年4月Sanger网站上提供的序列数据也进行了拼接，获得了含有1938个ORF的61个毗连片段(contigs)。

共有表面抗原的选择。成功的疫苗抗原是细菌表面上能够接触到抗体的并且是多种乳房链球菌菌株共有的蛋白质。通过基因筛选从菌株41-241和O140J的基因组序列中鉴定到表面蛋白，所述基因含有一或多个构成特征基元(参见M&M)的常见于革兰氏阳性细菌表面蛋白的序列。

在所有被分析的ORF中，17个ORF含有将所述蛋白质锚定到细胞壁所需的LPXTG分选酶基元(表1)。17个这样的蛋白质中的4个(P12，P23，P24和P25)仅见于菌株41-241。

31个ORF含有脂蛋白所需的脂质附着基元(表2)。所有这些蛋白均存在于菌株O140J和菌株41-241。

另外，挑选了87个含有信号序列或跨膜区的ORF(表3)，预示着所编码蛋白将定位于细菌表面。

这些蛋白在菌株O140J和菌株41-242中都有发现。

实施例2

所选基因在多种乳房链球菌临床和亚临床分离物中的分布。

为了检验所选基因在各种乳房链球菌菌株中的存在，进行了斑点杂交试验，试验中用从99个所选基因获得的PCR产物探测大量临床乳房链球菌菌株的染色体DNA。数据(表4)显示多数所选基因与大多乳房链球菌菌株发生杂交，表明多数所选基因普遍存在于各种乳房链球菌菌株中。相反，99个被测基因中的4个只与有限量的菌株发生杂交。这些基因全部存在于菌株41-241中，并编码含有将蛋白锚定到细胞壁所需的LPXTG分选酶基元的蛋白质。

实施例3

所选表面蛋白的免疫原性。

为了评价这些蛋白质是否可以作为疫苗候选对象，将115个所选基因编码的蛋白克隆并在大肠杆菌中表达为带有多组氨酸标签。这些基因中的106个的产物被成功克隆并在大肠杆菌中进行了表达。随后，通过Western印迹分析检测得自感染了乳房链球菌的奶牛的血清，以及得自用福尔马林灭活或超声破碎的乳房链球菌细胞免疫的兔的血清中是否存在针对上述表达的蛋白质的特异抗体。结果(表5)显示，表达的蛋白质中的19个被感染了乳房链球菌的动物的血清中存在的抗体所识别，表明这些蛋白在奶牛中体内表达，并且是免疫原性的。此外，表达的蛋白质中的30个被用福尔马林灭活或超声破碎的乳房链球菌细胞免疫过的兔的血清中存在的抗体所识别。表达的蛋白质中的12个被得自感染了乳房链球菌的奶牛的血清，以及得自用福尔马林灭活或超声破碎的乳房链球菌细胞免疫的兔的血清所识别。这些数据表明这些蛋白多数是抗原性的。

表5还显示了某些蛋白质被用菌株41-241和O140J试验性感染后诱发的抗血清所识别。但是，其他蛋白仅与感染菌株O140J后获得的血清，或者仅与感染菌株41-241后获得的血清有阳性反应。这可能显示了这两种菌株在体内蛋白表达或者免疫系统可否接触到这些蛋白质方面的差别。

实施例4

所选蛋白质的纯化。

为了进一步评价蛋白质是否可作为疫苗候选对象，将被来自感染奶牛的血清和/或来自免疫的兔的血清所识别的全部36种蛋白质进行了纯化。此外，含有分选酶基元但与两种血清都未发生反应的4种蛋白质也被纯化。这40种选定的重组蛋白中的31种成功地以可溶性形式过表达，并且可以在天然条件下纯化，而5种蛋白表达为不溶的内含体。这些蛋白质采用变性条件纯化并在纯化后进行重折叠。有4种蛋白，我们未能纯化到足够进行免疫接种的量。所有36种纯化了的蛋白随后用于免疫小鼠。如Western印迹所示，这些蛋白与得自免疫前的小鼠的血清都没有反应。相反地，这些蛋白质与得自小鼠的免疫血清有强反应(表5)，表明这些蛋白在小鼠中是高度免疫原性的。诱导产生的抗体的特异性通过抗乳房链球菌细胞裂解物(或原生质体上清)的免疫印迹得以证实。结果显示多数诱导产生的抗体与预期分子量的乳房链球菌蛋白特异反应，这清楚地表明这些蛋白质代表能够在小鼠中诱发免疫反应的(表面)抗原。

实施例5

诱导抗体的功能特征。

我们在FACS分析中使用小鼠血清来研究抗体与完整微囊化乳房链球菌细胞(生长在Todd-Hewitt中)的结合。如图1所示，从免疫前小鼠获得的血清都不能与完整乳房链球菌细胞结合。相反，免疫血清(诱导抗蛋白P11、P15、P17、P20、P25、P26、P27、P63的血清)中的8个与完整细菌细胞强烈结合，而这些血清中的2个(抗蛋白P17、P18)显示与完整细菌细胞的弱结合。这清楚地表明这些血清所识别的蛋白质在用于培养乳房链球菌细菌细胞的条件下表达，并且能够被抗体接触到进行结合。此外，图1清楚地显示这些蛋白的表达和/或表面可接近性在所用的两种菌株间不同。表达和/或表面可接近性在三种蛋白(P17、P19和P20)中是保守的。相反，P11和P63只在使用菌株O140J时被检测到，而P15、P18、P25和P26只有通过使用菌株41-241被检测到。P27在菌株41-241和O140J中均暴露在表面，但在菌株41-241上仅被抗血清微弱识别。

总的来说，数据清楚地显示所选抗原中的10个表达在体外生长的细菌的表面，并且可以被完整微囊化细胞上的抗体结合。这些蛋白中的3个在所用的两种菌株中是保守的。

实施例6

血清学蛋白质组策略。作为鉴定乳房链球菌疫苗候选对象的替代策略，采用了血清学蛋白质组分析。

通过2D凝胶电泳将生长在TH培养液中的乳房链球菌菌株的蛋白质分开，并用感染乳房链球菌的动物的血清中存在的抗体进行探测。鉴定到多种高度免疫原性的乳房链球菌蛋白(数据未显示)。三个斑点成功地与考马斯亮蓝染色的2D凝胶上的蛋白匹配(图2)。由这些蛋白质，通过Q-TOF分析它们的胰蛋白酶消化产物，将得到的肽质量指纹图谱与由菌株41-241和O140J的基因组序列分析预测到的所有蛋白的计算机模拟(in silico)肽质量指纹图谱进行比较。此外，从每个图谱中挑选的两种主要胰蛋白酶解肽用于串联MS。然后将得到的肽的氨基酸序列与由乳房链球菌基因组序列预测的氨基酸序列进行比较。所有三种蛋白均可用这种方法成功匹配。表6中列出了鉴定到的蛋白质的特性。这些疫苗候选对象中的一个利用基因组策略也鉴定到了(P63)。这突出了该蛋白作为疫苗候选对象的重要性。

实施例7

培养物上清与小鼠免疫血清的ELISA

P93和P105在两种菌株的培养物上清中被强烈识别表明这两种蛋白被这两种菌分泌出来。

实施例8

利用模拟体内条件生长在乳清中的乳房链球菌细胞进行的FACS分析。

按照实施例5的程序测试抗体与生长在类似牛奶的培养基中的乳房链球菌细胞的结合。

实施例9

抗原在不同乳房链球菌菌株中的保守性。

通过FACS分析研究了所选蛋白质在不同乳房链球菌分离物中的表达以及对抗体的可接近性的保守性。这些研究使得能够挑选针对各种乳房链球菌菌株的疫苗候选对象。

实施例10

在牛中进行的接种和攻击。

未接种疫苗的动物的试验性感染。试验性感染后确定了乳房链球菌菌株O140J和41-241的毒力。乳房分为四部分，通常称为乳区。每个乳区包含泌乳细胞、乳导管、乳腔和乳头。在这个试验中，分别通过乳头中的乳导管感染每个乳区的乳腔。接种菌株O140J的8个乳区中的6个被成功感染(图3，表7)。从得自这些乳区的牛奶中分离乳房链球菌O140J的纯培养物，检测到体细胞计数(SCC)水平增加。在两个乳区(两只不同的奶牛的；奶牛6717和6719；图3A和3B)中攻击后未能检测到感染。这两个乳区在试验过程中保持细菌阴性。两个乳区中的一个观察到SCC略有增加。相反，用菌株41-241攻击的全部8个乳区均建立了感染(图3A和3C；表7)。这些乳区(奶牛6721和6723)中的4个接种了5x10²cfu的41-241菌株，而其他4个乳区接种了5x10³cfu(奶牛6720和6722)。接种较高剂量后观察到更严重的效果：奶牛的体温升高更明显，并且观察到更严重的疾病临床症状(牛奶中的凝块，乳房持续硬结)(表7；图3A和3C)。但是，用41-241菌株以5x10²cfu的接种剂量也诱发了乳腺炎的临床症状。以前对菌株O140J观察到类似的数据(Hill，1988)。

较之菌株41-241，用菌株O140J(接种剂量5x10²cfu，研究进行16天)观察到的乳腺炎临床症状似乎更严重(图3B和3C)。4个乳区中的3个成功感染菌株O140J，并且全部3个都在感染后表现出至少16天的乳腺炎的临床症状。这些乳区中的2个在感染后的16天内维持细菌阳性(图3B)，一个乳区中35天内均检测到SCC水平上升(数据未显示)。感染菌株41-241的全部4个乳区在感染后的10-13天显示乳腺炎临床症状，但是在第13天之后临床症状阴性(图3C)。这些乳区中的2个(奶牛6723)在试验过程(16天)中保持细菌阳性，表明乳房链球菌持续存在于乳腺中(图3C)。

感染后3-5天采集的乳房物质的组织学检验一般与临床观察对应。感染菌株41-241的两只奶牛和感染菌株O140J的一只奶牛表现出整个腺体的中度到严重的乳腺炎，有多形核粒细胞的多病灶泡内积聚、泡内上皮层的局灶性瓦解以及单核细胞的中度间质性浸润(数据未显示)。感染菌株O140J的第二只奶牛发生了温和的多灶性卡他性(multifocal catarrhal)乳腺炎。

总的来说，这些数据显示菌株O140J和41-241对奶牛是病原性的。

奶牛的免疫

在奶牛中激发抗乳房链球菌蛋白的多克隆抗体。利用皮下接种和/或肌内和/或乳房内接种，通过多种免疫方案给奶牛免疫。

免疫原性组合物用溶剂(例如磷酸盐缓冲盐水)和佐剂(例如油包水佐剂或者无油佐剂)配制。免疫后，采集血样，测试血清中抗乳房链球菌的抗体。

免疫接种动物的试验性感染

用500cfu乳房链球菌菌株O140J攻击感染接种和未接种的奶牛。每个乳区经乳头中的乳导管分别感染。

攻击后，接种了本发明的免疫原性组合物的奶牛表现出较少的乳腺炎临床症状，牛奶的变化较小，SCC水平较低，临床乳腺炎时间短，热度低。乳房的临床评分和组织学证据清楚显示根据本发明进行的免疫能够有效抵抗乳房链球菌导致的乳腺炎。

实施例11

抗原与恢复期血清的反应性。利用从14只近期感染了乳房链球菌恢复过来的奶牛获得的野生血清(field serum)，通过Western印迹分析来检测选定的一些蛋白质(P15、P16、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P68、P75、P93和P105)诱发恢复期抗体的能力。12个选定抗原中的6个(P15、P16、P54、P28、P63、P105)被所有14种使用的恢复期血清所识别。这些数据表明这些抗原在导致各自相应感染的所有乳房链球菌菌株中都表达，这些抗原在感染宿主的过程中表达，并且这些抗原是高度免疫原性的。这些抗原中的5种(P68、P27、P20、P93和P22)分别被恢复期血清中的8、9、10、11或12种识别。有一种抗原没有检测到与任何恢复期血清反应(P75)。

实施例12

抗原在不同乳房链球菌菌株中的保守性。为了表明这些抗原适用于提供抗多种乳房链球菌菌株的保护作用，确定了12种选定抗原(P15、P16、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P68、P75、P93和P105)在一组近期采集的野外菌株(35株)中的保守性和表达情况。抗原的表达通过用抗纯化的抗原的小鼠免疫血清筛选Western印迹来证实。12种抗原中的5种(P15、P16、P28、P75和P105)在97％以上的测试菌株中表达；2种(P27和P63)在94％的菌株中表达；4种(P20、P22、P54和P93)在81-92％的菌株中表达。这些数据清楚地显示多数抗原的表达在各种乳房链球菌菌株中是高度保守的。

材料与方法

细菌菌株及生长条件

乳房链球菌菌株41-241于1998年分离自荷兰一个爆发了乳房链球菌乳腺炎的商业奶场(Hill，1988)。菌株41-241显示了爆发期间在该特定畜群中发现的主要RAPD指纹图谱类型B(Zadoks et al.，2003)。该菌株分离自感染了乳房链球菌至少两个月的奶牛。感染开始是亚临床性的，之后发生多次临床急性发作。

乳房链球菌菌株O140J和EF20由J.Leigh博士(Institute for AnimalHealth，Compton，England)惠赠。其他分离自不同荷兰奶场上乳腺炎临床病例的乳房链球菌和副乳房链球菌(S.parauberis)菌株由D.Mevius博士(CIDC，Lelystad，The Netherlands)、O.Sampimon博士(Animal Health Service，Deventer，The Netherlands)或者Dierenartsen Praktijk(Diessen，The Netherlands)提供。其他所有链球菌来自ASG(Lelystad，The Netherlands)的实验室收藏。除非另有说明，链球菌菌株生长在Todd-Hewitt培养液(code CM189，Oxoid)中，并铺在含有6％(v/v)马血和0.1％七叶苷(aesculin)(w/v)的哥伦比亚血琼脂基础培养基(Columbia agar blood base，代码CM331，Oxoid)中。大肠杆菌菌株生长在Luria培养液(18)中，铺在含有1.5％(w/v)琼脂的Luria培养液中。如果需要，加入50μg/ml卡那霉素。

乳清蛋白的制备。从一个历史上未发生过乳房链球菌感染的奶场(Waiboerhoeve，Lelystad，The Netherlands)获得大量牛奶。将牛奶于12,800xg离心30分钟，除去脂肪。随后加入40μl/ml的凝乳酶(Lactoferm，Brouwland，Belgium)，牛奶于37℃温育2小时，规律地搅拌。过筛除去凝结的牛奶，剩下的上清于12,800xg离心30分钟。通过在0.2um Sartobran P滤膜(Sartonus，Goettingen，Germany)上过滤将澄清的上清灭菌。

奶样品和血清。牛奶样品和血清得自多个荷兰奶场的临床乳房链球菌乳腺炎病例(Drs.O.Sampimon，Animal Health Service，Deventer，TheNetherlands)。在采集样品前，动物均未用抗生素治疗。另外，在用乳房链球菌菌株O140J和41-241试验性感染后，在不同时间点采集牛奶和血清。

兔抗血清。在兔中激发针对福尔马林灭活的完整乳房链球菌细胞的多克隆抗体和抗超声破碎的乳房链球菌细胞的多克隆抗体。用油包水佐剂中的2-4x10⁹灭活细胞将兔皮下免疫。2、3和4周后重复接种。6周后，杀死兔并采集血清。

为了制备抗原，将乳房链球菌菌株在Todd-Hewitt培养液中生长16小时。将培养物10倍稀释于1L个预热的Todd-Hewitt培养液中，培养细胞至光密度(600nm)达到0.5。将培养液于10,000xg离心15分钟，沉淀溶解在100mlPBS(136.89mM NaCl、2.68mM KCl、8.1mM Na₂HPO₄、2.79mM KH₂PO₄pH7.2)中。随后，用PBS将光密度(600nm)调节到1.0。为了制备福尔马林固定的细胞，10ml一份的上述细胞于10,000xg离心20分钟，沉淀重悬于2.5ml PBS中。向该悬浮液加入250μl 3％福尔马林，保持在室温下16小时。将悬浮液铺在哥伦比亚琼脂板上确认没有活细菌。细胞用PBS洗两次以除去福尔马林。为了制备超声破碎的细胞，10ml一份的上述细胞于10,000xg离心20分钟，沉淀重悬于250μl PBS中。细胞用尖顶超声破碎仪(tip sonifier)以100％输出，50％有荷因数(duty cycle)超声破碎15分钟。超声破碎后，将细胞在PBS中稀释10倍。两种抗原均与Specol 1∶1混合从而产生油包水乳剂。

基因组测序。如Sambrook et al.(1989)所述从乳房链球菌菌株41-241分离基因组DNA。将DNA剪切，用于构建质粒文库。利用染料终止物化学法对随机克隆测序，并用ABI PRISM 3700 DNA分析仪(AppliedBiosystems，Warrington，GB)分析。将测序数据拼接得到572个毗连序列(contiguous sequence)。用GLIMMER和GENEMARK软件鉴定到开始的一组开放读框(ORFs)。利用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM提供的称为TMHMM的计算机程序预测基因中的跨膜螺旋和亚细胞定位。为了搜索每个ORF中是否存在信号肽，使用了SignalP程序(Nielsen et al.，1999)。替代地，信号肽预测可以利用http://psort.nibb.ac.jp提供的PSORT程序和http://www.biology.wustl.edu/gcg/spscan.html提供的称为GCG-SPScan的程序进行。利用GCG-Findpatterns程序，以下列expressions：PS00013：～(D，E，R，K)6(L，I，V，M，F，W，S，T，A，G)2(L，I，V，M，F，Y，S，T，A，G，C，Q)(A，G，S)C；g-lpp：＜(M，V)X{0，13}(R，K)～(D，E，R，K，Q){6，20}(L，I，V，M，F，E，S，T，A，G)(L，V，I，A，M)(I，V，M，S，T，A，F，G)(A，G)C和g-lpp_rvh：(M，V，L)X{0，13}(R，K)～(D，E，R，K，Q){6，20}(L，I，V，M，F，E，S，T，A，G)(L，V，I，A，M)(I，V，M，S，T，A，F，G)(A，G)C寻找到脂蛋白。含有细胞壁锚定结构域的蛋白利用InterPro accessionIPR001899鉴定。使用BLAST程序搜索与推测的氨基酸序列有序列同一性的蛋白序列。

斑点印迹、Southern印迹和杂交。如Sambrook et al.(1989)所述分离染色体DNA。对于斑点印迹，将1μg染色体DNA点在Genescreen Plus膜上。将膜在0.4M NaOH-1M NaCl中于室温温育10分钟以便使DNA变性，在0.6M NaCl，0.06M柠檬酸钠(pH 7.0)中中和10分钟。对于Southern印迹，如Sambrook et al.(1989)所述在0.8％琼脂糖凝胶上分离DNA片段，并转移到Gene-Screen Plus膜(NEN)上。使用随机引物标记试剂盒(Boehringer)给DNA探针标记上[(α-³²P]dCTP(3000Ci mmol^-1；Amersham)。印迹膜上的DNA于65℃在含有0.5M磷酸钠、1mM EDTA和7％十二烷基硫酸钠的缓冲液(pH7.2)中与Gene Screen Plus膜供应商推荐的合适的DNA探针杂交。杂交后，膜用含有40mM磷酸钠(pH 7.2)、1mM EDTA、5％SDS的溶液于65℃洗30分钟两次，用含有40mM磷酸钠(pH 7.2)、1mM EDTA、1％SDS的溶液于65℃洗30分钟两次。在磷屏(Storm；Molecular Dynamics)上检测信号。

选定蛋白的克隆和表达。用特异寡核苷酸引物经PCR扩增选中的ORF以便克隆到pET200/D-TOPO(Invitrogen)中。克隆的蛋白不带有推测的信号序列或预测的跨膜区。构建物转化到大肠杆菌BL21 Star(DE3)(Invitrogen)中进行重组蛋白的表达。

对于PCR反应(25μl)，按照供应商的描述使用Platinum PfxDNA聚合酶(Invitrogen)。在Perkin Elmer 9700扩增仪中进行DNA扩增，程序是：94℃温育5分钟；35个循环的94℃15秒、57℃30秒和68℃2分钟；以及68℃5分钟。

被表达抗原的免疫检测。蛋白质用XCell SureLock mini-cell系统(Invitrogen)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶中的蛋白质按照制造商的推荐用SYPRO-orange(Molecular Probes，Sunnyvale，Calif.)染色显像。在磷屏(Storm；Molecular Dynamics)上检测信号。

蛋白质通过标准程序(19)转移到硝酸纤维素膜上。膜在含有4％脱脂牛奶、5％胎牛血清和0.05％Tween 20的Blotto：Tris缓冲盐水(TBS)(50mMTris-HCl[pH 7.5]，150mM NaCl)中，室温(RT)下封闭16小时。为了检测重组抗原，将膜与抗6xHIS tag(Clontech，Palo Alto，CA.)的单克隆抗体一起温育。按照Sambrook et al.(1989)的描述，用偶联碱性磷酸酶的抗小鼠抗体和氯化硝基四氮唑兰/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(nitro-blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)检测并显现结合的抗体。所表达的抗原的免疫原性用来自临床或亚临床感染乳房链球菌的奶牛的血清样品，或者用兔抗乳房链球菌抗血清来测试。结合抗体按照Sambrook et al.(1989)的描述，用偶联碱性磷酸酶的兔抗奶牛-或羊抗兔-免疫球蛋白(Jackson Immunoresearch检测，并用氯化硝基四氮唑兰/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸显像。

蛋白纯化。蛋白质利用Ni-次氮基三乙酸(Ni²⁺-NTA)柱层析按照制造商(Qiagen)的描述从溶解了的细胞沉淀中亲和纯化。简而言之，细胞生长至指数期；加入1mM IPTG，让细胞在37℃再生长4小时。随后，收集细胞并裂解。将澄清的上清上样到Ni²⁺-NTA琼脂糖柱子中。洗柱子并将蛋白洗脱。对天然和变性纯化，使用不同的缓冲液。变性条件下纯化的蛋白通过用溶于286.89mM NaCl、2.68mM KCl、8.1mM Na₂HPO₄、2.79mM KH₂PO₄(pH7.2)的6M-0M尿素线性梯度进行透析来复性。纯化得到的蛋白进一步用Amicon Ultra-45000 MWCO filters(Millipore)浓缩。

蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后确定样品中的蛋白质浓度。凝胶中的蛋白质按照制造商的推荐，用SYPRO-orange(Molecular Probes，Sunnyvale，Calif.)染色来显现。在磷屏(Storm；Molecular Dynamics)上检测信号。浓度范围已知的牛血清清蛋白作为标准来计算凝胶中存在的蛋白质的量。计算使用Molecular Dynamics程序。

纯化蛋白的免疫原性。OF1小鼠用福氏完全佐剂中的20μg纯化蛋白皮下免疫。三周后，用福氏不完全佐剂中的20μg纯化蛋白重复接种。第二次接种的三周后，将小鼠杀死，收集血清。

FACS分析。乳房链球菌细胞在Todd-Hewitt培养液中生长至OD₆₀₀达到0.5。通过离心收集细胞，在FACS缓冲液(PBS-13，pH7,2[137mM NaCl、2.68mM KCl、8.1mM Na₂HPO₄、2.8mM KH₂PO₄]-0,5％BSA)中洗一次，在FACS缓冲液中将细胞浓度调节到约OD₆₀₀1.0。细胞(250μl)通过离心收集，重悬于50μl含有小鼠抗血清(1∶50稀释度)的FACS缓冲液中。样品在冰上保持45分钟。将细胞用250μl FACS缓冲液漂洗两次以除去未结合的抗体。随后，细胞与含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗小鼠二抗(1∶100稀释度；DAKO A/S，Glostrup，Denmark)的50μl FACS缓冲液在冰上保持30分钟。细胞用250μl FACS缓冲液漂洗两次，重悬于100μl FACS缓冲液中，在荧光激活的细胞分选仪(FACS Calibur，Benton Dickinson，Franklin Lakes，USA)中检测结合抗体。

全细胞ELISA.通过离心收集指数生长的乳房链球菌细胞，重悬于包被缓冲液(pH 9.6，0.05M NaHCO₃，0.05M Na₂CO₃)中，将细胞密度调节至OD₆₀₀ 1.0。高结合96孔板用每孔100μl该悬浮液在4℃包被16小时。小孔用ELISA缓冲液(5％Tween-80，0,02％叠氮钠)漂洗4次，加入血清(在含有0.05％Tween-80，2％NaCl和5％胎牛血清的PBS-13中1∶20稀释)，板在37℃保温1小时。板孔用ELISA缓冲液洗4次以除去未结合的抗体。随后，加入二抗(在含有0.05％Tween-80，2％NaCl和5％胎牛血清的PBS-13中1∶250稀释的100μl偶联了辣根过氧化物酶的兔抗小鼠(DAKO))，板在37℃保温1小时。小孔再用ELISA缓冲液洗4次，用100μl四甲基联苯胺(TMB)(CeDi-Diagnostics，Lelystad，The Netherlands)在室温下检测结合的抗体。15分钟后每孔加入100μl 0.5M H₂SO₄终止反应。用ELISA检测仪(ThermoLabsystems，Franklin，USA)读取450nm的光吸收。

双向凝胶电泳的样品制备。乳房链球菌菌株在100ml Todd-Hewitt培养液中生长16小时。培养物在1L预热好的Todd-Hewitt培养液中稀释20倍，细胞生长至光密度(600nm)达到0.5。培养物在10,000xg离心20分钟，沉淀用等体积的250mM蔗糖/25mM Tris(pH 8.0)洗一次，用等体积的superQ洗一次。将得到的沉淀溶解在5ml superQ中。从该悬浮液取1.5ml用尖顶超声破碎仪(Branson超声细胞破碎仪250，50％时延，振幅3)超声破碎15分钟。随后，悬浮液用DNAse I和MgCl₂(终浓度分别为6.5μg/ml和10mM)在37℃处理10分钟。加入蛋白酶抑制剂：胃酶抑制剂(pepstatin)、亮抑酶肽(leupeptin)、pefabloc和牛胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)至终浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、25μg/ml和1μg/ml。加入尿素、二硫苏糖醇和Triton-X100至终浓度分别为9M、70mM和2％。将样品在10,000xg离心30分钟，收集上清，在100,000xg再离心30分钟。收集上清，利用RC DC Protein Assay(BioRad)按照制造商的说明确定样品中的蛋白浓度。

双向凝胶电泳。将含有50-100μg蛋白质的样品溶解于450ul样品缓冲液(8M尿素、2％CHAPS、0.5％IPG缓冲液3-10、70mM二硫苏糖醇和痕量的溴酚蓝)。按照制造商的说明将Immobiline 18cm DryStrips(3-10NLAmershan Pharmacia Biotech)再水化后，用该条带在IPGphor(AmershanPharmacia Biotech)通过等电点聚焦将蛋白质在第一维分离。聚焦后，立即将条带随后在含有10mg/ml二硫苏糖醇的平衡缓冲液(6M尿素、30％甘油、2％SDS、50mM Tris-HCL-pH 8.8、痕量的溴酚蓝)中平衡15分钟，在含有25mg/ml碘乙酰胺的平衡缓冲液中平衡15分钟。按照制造商的说明，将蛋白质在Ettan DALT twelve系统(Amersham Pharmacia Biotech)中在12.5％预灌的Ettan DALT胶(Amershan Pharmacia Biotech)上通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二维分离。

染色。凝胶中的蛋白质用PlusOne^TM Silver Staining Kit(AmershanPharmacia Biotech)按照制造商的说明用银染色，或者如Sambrook et al.(1989)所述，以延长的温育时间(因为凝胶的塑料衬底)用考马斯亮蓝染色。

消化来自2D凝胶的蛋白质。将在考马斯染色的凝胶上鉴定到的蛋白斑点人工切下。胶条在0.1％乙酸中冷冻于-80℃直至使用。凝胶中的蛋白如Li et al.(2003)所述用胰蛋白酶消化。

胰蛋白酶消化的来自2D凝胶的蛋白斑点的质谱。如Li et al.(2004)所述，用Micromass Q-TOF质谱仪分析胰蛋白酶消化的蛋白斑点。

实验室感染实验

动物。临床健康的Holstein-Friesian奶牛，在第一次产奶期的2-4周时用于感染。每天7.00a.m.和4.00p.m给奶牛挤奶两次。所有奶牛的体细胞计数(SCC)低于2.0x10⁵细胞/ml，基于在感染前最后14天对牛奶反复进行微生物评价，是乳腺炎病原菌阴性的，并且没有乳腺炎发病史。

接种物的制备和接种。乳房链球菌菌株O140J和41-241用作接种物。将长在含有6％马血(v/v)和0.1％七叶苷(w/v)的哥伦比亚琼脂板上的单菌落转移到90ml Todd-Hewitt培养液(Oxoid)中，在37℃过夜培养。将过夜培养物1比10稀释在相同的培养基中，细菌生长至浓度约3x10⁸cfu/ml(对数生长期)。然后通过离心收集细胞，重悬并稀释于PBS。

每只奶牛的两个乳区通过池内(intracisternally)接种5x10²(菌株O140J或菌株41-241)或者5x10³(菌株41-241)cfu/5ml PBS。对照乳区接种5mlPBS。注射用一次性乳头针头在下午挤奶后进行。接种前，用酒精清洁乳头。向上按摩接种物使之进入乳腺池。

用5x10²cfu的菌株O140J攻击一组四只奶牛。另一组四只奶牛用菌株41-241攻击。这些奶牛中两只用5x10²cfu攻击，两只用5x10³cfu攻击。奶牛用于两个连续的试验中，其中一个试验在45到80小时后结束，第二个在16天后结束。

取样和临床打分。每次挤奶时，从所有乳区无菌采集奶样。样品在含有6％马血(v/v)和0.1％七叶苷(w/v)的血琼脂板上进行细菌学检验，采用标准程序(International Dairy Federation，1981)确定SCC。此外，奶样保持在-20℃直至分析抗体反应。每次挤奶时，确定奶牛的体温和牛奶产量，监控奶牛是否有乳腺炎的临床症状(乳房的硬结和牛奶中的凝块)。每周一次取血样分析血清中的抗体反应。

病理学。对于组织学检验，从三个不同水平剖面切片(即在乳腺底部、底部和乳池之间以及乳腺池)的不同位置采集来自各个乳区的乳腺组织。将组织样品在4％缓冲的福尔马林中固定，并包埋在石蜡中。对于组织学检验，将组织切片切开并用苏木精/伊红染色。

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表4 菌株

表5

Claims

1.鉴定能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的链球菌蛋白质的方法，所述方法包括：

b)挑选步骤a)中鉴定到的在至少两种链球菌菌株和/或血清型中保守的至少一种蛋白；和

c)确定步骤b)中挑选的至少一种蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物是否能够特异结合感染了第一链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中所述分泌蛋白和/或表面相关蛋白是通过在链球菌基因组至少部分序列中鉴定包含分泌蛋白基元和/或表面相关蛋白基元的基因鉴定到的。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述与细胞毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白是通过在链球菌基因组至少部分序列中鉴定与细菌毒力因子基因具有至少50％序列同一性的基因鉴定到的。

4.权利要求1或2或3所述的方法，其中所述与细菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的鉴定是通过在链球菌基因组至少部分序列中鉴定能够与图4列出的任何核酸序列的全长核苷酸序列在含有0.5M磷酸钠、1mM EDTA和7％十二烷基硫酸钠的缓冲液中，在pH7.2杂交的基因，其中所述核酸分子在用含有40mM磷酸钠(pH 7.2)、1mM EDTA和5％十二烷基硫酸钠的缓冲液在65℃30分钟洗两次；且用含有40mM磷酸钠(pH 7.2)、1mM EDTA和1％十二烷基硫酸钠的缓冲液在65℃30分钟洗两次后仍然保持杂交。

5.权利要求2、3或4所述的方法，进一步包括挑选在至少两种链球菌菌株和/或血清型中保守的基因。

6.权利要求5所述的方法，进一步包括获得由所述基因编码的蛋白、或所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

7.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述基因在原核表达系统中表达。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，包括：

-获得分离的和/或重组的链球菌蛋白；

-将所述蛋白与感染了第一链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞一起温育；和

-确定蛋白是否能够结合感染了第一链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞，以及感染了第二链球菌菌株和/或血清型的动物的抗体和/或免疫细胞。

9.权利要求8所述的方法，进一步包括用编码所述蛋白的核酸序列表达所述蛋白。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述抗体和/或免疫细胞来源于恢复期血清。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述链球菌蛋白能够引发调理吞噬诱导性抗体。

12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中鉴定了能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的至少两种链球菌蛋白。

13.通过权利要求1-12中任一项所述的方法鉴定到的至少一种蛋白的制备方法。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述链球菌是乳房链球菌。

15.能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的链球菌蛋白，所述蛋白能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得。

16.能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的蛋白、或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物在制备免疫原性组合物中的用途，所述组合物能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应。

17.权利要求16所述的用途，其中所述蛋白选自表5和/或表6。

18.能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含至少一种能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的分离的和/或重组的蛋白，或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

19.权利要求18所述的免疫原性组合物，所述组合物包含至少两种能通过权利要求1-12中任一项所述的方法获得的分离的和/或重组的蛋白，或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

20.能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含至少一种核酸分子，所述核酸分子编码至少一种能通过权利要求1-12中任一项所述的方法获得的蛋白，或所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

21.权利要求18-20中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述链球菌是乳房链球菌。

22.权利要求18-20中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种，优选至少两种所述蛋白选自表5和/或表6。

23.免疫原性组合物的制备方法，其中所述组合物能够引发抗至少两种链球菌菌株和/或血清型的免疫反应，所述方法包括给细胞提供至少一种重组载体，所述至少一种载体包含的核酸序列编码至少一种能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的蛋白质和/或至少一种选自表5和/或表6的蛋白质，和/或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。

24.重组核酸分子，其包含的核酸序列处于功能性连接的启动子的控制下，编码至少两种能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的蛋白质和/或至少两种选自表5和/或表6的蛋白质，和/或所述蛋白中至少一种的免疫原性部分。

25.重组载体，其包含编码至少两种能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的蛋白质和/或选自表5和/或表6的蛋白质，和/或所述蛋白中至少一种的免疫原性部分的核酸，或者包含权利要求24所述的重组核酸分子。

26.权利要求25所述的重组载体，所述载体是活载体。

27.权利要求25或26所述的重组载体，所述载体是链球菌。

28.权利要求27所述的重组载体，其中所述链球菌是乳房链球菌。

29.权利要求27或28所述的重组载体，其中所述链球菌缺少荚膜基因表达产物的至少一部分。

30.权利要求27-29中任一项所述的重组载体，其中所述链球菌是无荚膜链球菌。

31.权利要求25-30中任一项所述的重组载体，其包含编码来源于第一链球菌菌株和/或血清型的至少一种蛋白和/或其免疫原性部分的核酸，以及编码来源于第二链球菌菌株和/或血清型的至少一种蛋白和/或其免疫原性部分的核酸。

32.分离的宿主细胞，其包含编码至少两种能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的和/或选自表5和/或表6的蛋白质，和/或所述蛋白中至少一种的免疫原性部分的核酸序列，或者包含权利要求24所述的重组核酸分子，或者包含权利要求25-31中任一项所述的重组载体。

33.能够引发抗链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含权利要求25-31中任一项所述的重组载体。

34.权利要求18-22和/或33中任一项所述的免疫原性组合物作为药物的用途。

35.权利要求18-22和/或33中任一项中所述的免疫原性组合物在制备抗乳房链球菌乳腺炎的药物中的用途。

36.权利要求18-22和/或33中任一项中所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。

37.减少和/或控制个体和/或非人动物中的链球菌生物体的数量的方法，所述方法包括给所述个体和/或非人动物提供权利要求18-22和/或33中任一项所述的免疫原性组合物。

38.药物组合物，其包含权利要求18-22和/或33中任一项所述的免疫原性组合物以及合适的载体、稀释剂和/或赋形剂。

39.测量个体和/或非人动物抗链球菌的免疫力的方法，所述方法包括确定来自所述个体和/或动物的至少一个样品中是否存在抗这样的蛋白质或其免疫原性部分的抗体，所述蛋白质能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得和/或选自表5和/或表6。

40.诊断试剂盒，其包含至少一种能通过权利要求1-14中任一项所述的方法获得的和/或选自表5和/或表6的蛋白质，或者其免疫原性部分，以及检测与所述蛋白或其免疫原性部分结合的抗体的工具(means)。

41.能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，其包含至少两种来源于至少一种乳房链球菌菌株的重组和/或分离的表面蛋白，和/或所述蛋白中的一种或两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。

42.权利要求41所述的免疫原性组合物，其中所述至少两种蛋白选自表5和/或表6。

43.制备权利要求41或42所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括给细胞提供重组载体，其中所述载体包含的核酸编码至少两种表5和/或表6中列举的蛋白质，和/或所述蛋白中的一种或两者的免疫原性部分或类似物或衍生物。

44.权利要求43所述的方法，其包括给至少两种细胞提供权利要求43所述的重组载体，和/或提供包含编码表5和/或表6中列举的蛋白质、和/或所述蛋白中的一种或两者的免疫原性部分或类似物或衍生物的核酸的重组载体。

45.重组分子，其包含处于功能性连接的启动子的调控下，编码表5和/或表6中列举的蛋白质、和/或所述蛋白的免疫原性部分或类似物或衍生物的核酸序列。

46.重组分子，其包含处于功能性连接的启动子的调控下，编码至少两种表5和/或表6中列举的蛋白质、和/或所述蛋白中的一种或两者的免疫原性部分或类似物或衍生物的核酸序列。

47.活的重组载体，其包含权利要求45或46所述的核酸序列。

48.分离的宿主细胞，其包含权利要求45或46所述的核酸序列。

49.分离的和/或重组的蛋白性分子，其与权利要求45或46所述的核酸编码的蛋白具有至少80％的序列同一性。

50.分离的和/或重组的蛋白性分子，其与权利要求45或46所述的核酸编码的蛋白性分子具有至少95％的序列同一性。

51.分离的和/或重组的蛋白性分子，其包含权利要求45或46所述的核酸编码的蛋白性分子中至少25个连续氨基酸的一段。

52.编码权利要求49-51中任一项所述的蛋白性分子的核酸。

53.权利要求40或41所述的免疫原性组合物，所述组合物包含权利要求49-51中任一项所述的分离的和/或重组的蛋白性分子。

54.能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含活的或灭活的权利要求47所述的重组载体。

55.权利要求54所述的免疫原性组合物，其中所述活的或灭活的重组载体是链球菌。

56.权利要求54或55所述的免疫原性组合物，其中所述活的或灭活的重组载体是乳房链球菌。

57.能够引发抗乳房链球菌的免疫反应的免疫原性组合物，所述组合物包含权利要求45或55所述的核酸。

58.作为药物的权利要求41或42和/或权利要求53-57所述的免疫原性组合物。

59.权利要求41或42和/或权利要求53-57所述的免疫原性组合物在制备抗乳房链球菌乳腺炎的药物中的用途。

60.权利要求41或42和/或权利要求53-57所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。

61.权利要求41或42和/或权利要求53-57所述的免疫原性组合物在减少和/或控制牛奶和/或奶牛乳房中的乳房链球菌生物体的数量的用途。

62.药物组合物，其包含权利要求41或42和/或权利要求53-57所述的免疫原性组合物以及合适的载体。

63.测量动物抗乳房链球菌的免疫力的方法，所述方法包括确定来自所述动物的至少一个样品中是否存在抗这样的蛋白质或其免疫原性部分的抗体，所述蛋白选自表5和/或表6，或者是权利要求49-51中任一项所述的蛋白。

64.诊断试剂盒，其包含至少一种选自表5和/或表6的蛋白质、或者权利要求49-51中任一项所述的蛋白质、或所述蛋白的免疫原性部分，以及检测与所述蛋白或其免疫原性部分结合的抗体的工具。

65.检测乳房链球菌免疫原性菌株的方法，所述方法包括由来自乳腺炎病例的乳房链球菌生物体分离核酸，将所述核酸进行PCR，所述PCR包含权利要求45、46或52所述的核酸或其引物。