JP2005523017A - Candidaalbicans由来の細胞壁マンノプロテイン及び活性エピトープならびにこれらを認識する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国仮出願番号60/446,560(2003年2月12日出願)及び60/373,324(2002年4月18日出願)の利益を主張する。
本発明は、微生物学、分子生物学、及び免疫学の分野に関し、そしてより詳細には、Candida albicans由来の表面及び細胞壁マンノプロテインならびにこれらのエピトープ領域(炭水化物部分のエピトープを含む)、これらのエピトープ及びこれらのタンパク質を認識する抗体のこれらのタンパク質及びこれらのエピトープからの産生、ならびにヒト及び動物の患者における感染(例えば、種々の真菌の株(例えば、Candida種由来の株)により引き起こされるもの)を予防、処置、診断、またはモニタリングするための、これらのタンパク質及び抗体の使用に関する。本発明はまた、これらのタンパク質及び抗体に基づくワクチン、キット、及び治療法にも関し、そしてより詳細には、C.albicans由来のmp58マンノプロテイン及び免疫原性であるC末端領域を含むタンパク質由来の特異的なエピトープを認識することができるモノクローナル抗体に関する。
Candida albicansは、最も一般的なヒトの真菌性病原体であり、そしてアメリカ合衆国において得られる血液培養物から単離される3番目または4番目に一般的な微生物である。C.albicansは、ヒトの共生的及び日和見性病原体の両方である二形性真菌である。潜在する宿主の欠陥に依存して、Candidaは、宿主における実質的に全ての器官に感染する能力を有する、粘膜から生命を危うくする播種性カンジダ症までの範囲の種々の感染を引き起こし得る。カンジダ症についての準備因子としては、免疫抑制療法、大量の抗生物質での治療、細胞毒療法、静脈内カテーテル及び留置デバイス、超低出生体重、AIDS、糖尿病、移植医学、薬物依存などが挙げられる。正常な個体において、この生物は、胃腸管、膣、及びいくつかの皮膚領域にコロニー形成する。日和見性表在性及び全身性のC.albicansの感染は、未熟新生児、AIDS及び衰弱した癌患者において生じ、そして特に、骨髄移植後に頻繁に生じかつ重篤である。これらの日和見性感染は、内因性起源を有すると考えられている。
従って、疾患状態(例えば、Candida微生物によって引き起こされるカンジダ症)の診断、モニタリング、処置または予防に有用な組成物及び方法を提供することは、本発明の目的である。
最後に、本発明はまた、Candida感染の診断、モニタリング、処置、または予防において用いられ得るワクチン、キット、ならびに他の治療方法及び/または免疫原性処置方法も含む。
本発明に従い、C.albicans由来の単離した表面タンパク質及びエピトープ、すなわち、以下にさらに述べるようなCandida albicansの細胞壁58キロダルトン細胞壁マンノプロテイン(mp58)ならびにその中の活性領域及びエピトープが提供される。さらに、本発明者らは、モノクローナル抗体(例えば、1H4、3H3及び3C2と示されるもの)を作製した。mAb 1H4の試験は、それが、C.albicans細胞の表面上のpH感受性炭水化物エピトープを認識することができること、及びこのエピトープがmp58に限定されず、真菌病原体の他の細胞壁マンノプロテインに共有されることを示す。さらなる試験は、mAb3H3及び3C2がmp58のタンパク質部分を認識することを示した。
従って、本発明の1つの特定の実施形態において、C.albicans由来の単離及び/または精製した58キロダルトンの細胞壁マンノプロテイン(mp58として同定されている)が活性領域及び他のエピトープと共に提供され、これらは免疫原性であり、従ってmp58及び/またはその活性領域及びエピトープを認識することができる抗体の産生において用いられ得る。細胞壁マンノプロテインmp58は、以前に同定されており、そして以下のアミノ酸配列(GenBankにおいて示されている)を有する:
MP58アミノ酸配列(配列番号2)
PRA1遺伝子(配列番号1)
例えば、このタンパク質のC末端の最後の10アミノ酸残基に対応する合成ペプチド(290HTHADGEVHC298)(配列番号10)は、担体タンパク質への結合の後に2匹のマウスに注射されたときに、免疫原性であった。さらに、得られる血清は、ELISA及びイムノブロットアッセイにおいて相同のmp58を特異的に認識した。最初の実験は、ヒト血清サンプル中のこのミメティック(mimetic)配列に対する抗体の存在を試験するための合成ペプチドに基づく抗体捕捉アッセイを最適化することに関する。以下の抗体捕捉ELISAのパラメータを評価した:i)ウェルをコーティングするための物質としてのKLH−結合ペプチドの使用と比較した、遊離のペプチドの使用、ii)マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするための種々の量のペプチドの使用、iii)合成ペプチドの最適な吸着のための種々の型のELISAプレート(種々の型のプラスチック及び化学修飾プレートを含む)の使用、iv)種々のコーティングバッファーの使用、v)種々のブロッキング試薬(タンパク質及び界面活性剤を含む)の使用、およびvi)種々に希釈した血清の使用。その最終的なフォーマットにおいて、KLH−結合ペプチドを、炭酸緩衝液(pH9.6)中、1μg/ウェルの濃度で用いて、Immulon2プレートをコーティングし、4℃での一晩のインキュベーション及びPBSでの洗浄の後、カンジダ症を有する患者由来の種々の血清サンプル(0.05%のTween20を有するPBS[PBST]及び1%BSA中1:1000希釈)を、これらのウェルに添加し、そして37℃で1時間インキュベートした。次いで、これらのプレートをPBSTを用いて洗浄しそしてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG(1:2,000希釈)を用いて37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートを発色させ(クエン酸緩衝液中のOPD)そしてマイクロタイタープレートリーダー中、490nmで読み取った。一旦アッセイを最適化した後、播種性カンジダ症を有する患者由来(n=13)及びコントロールの個体(n=22)より多数の血清サンプルを試験した。
従って、本発明に従い、mp58ならびに/またはその中に含まれるその活性領域及びエピトープから産生される抗体が生産され、そしてそのような抗体は、mp58ならびに/またはそのエピトープ及び活性領域を認識及び結合することができ、そして以下により詳細に記載されるもののような多くの診断及び治療用途において使用され得る。
本発明の単離された抗体、または上記のような単離したタンパク質もしくはエピトープは、以下に詳細に記載されるような酵母及び真菌の感染に対する能動及び受動免疫のためのワクチンの開発においても使用され得る。能動ワクチンの場合、これらのワクチンは、免疫原性量のmp58マンノプロテインまたは上記の活性領域もしくはエピトープを提供することによって調製され、従って、本発明に従う能動ワクチンは、免疫原性量のタンパク質またはペプチドを含み、そしてそのようなワクチンを必要とするヒトまたは動物に投与される。このワクチンは、上記のような適切な薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤または担体も含み得る。上で言及されるような、本発明に従い用いられる「免疫原性量」の抗原とは、所望の予防的または治療的効果がもたらされるような免疫原性応答が宿主において誘発されるような、非毒性であるが十分な量の薬剤を意味することが意図される。従って、必要とされる抗原の正確な量は、被験体の種、年齢、及び一般的な状態、処置される状態の重篤度、用いられる特定の担体またはアジュバント及びその投与の様式等に依存して、被験体ごとに変化する。同様に、任意のそのような抗原ワクチン組成物の「免疫原性量」は、特定の環境に基づき変化し、そして適切な免疫原性量は、当業者によって、各々の場合の適用において、慣用の実験のみを用いて決定され得る。用量は、その組成物が投与される個体に適するように調整されるべきであり、そして個体の年齢、体重及び代謝によって変化する。
当業者に認識されるように、本発明の抗体は、酵母または真菌の感染(例えば、Candida種微生物により引き起こされるもの)を処置または予防するためのヒトまたは動物の患者への投与に適する薬学的組成物に形成され得る。上で規定及び記載される本発明の抗体を含む薬学的組成物、例えば、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、他の治療化合物、及びこれらの組合せを含む、当該分野において一般的に用いられる任意の適切な薬学的ビヒクル、賦形剤または担体と組み合わせて処方され得る。当業者が認識するように、用いられる特定のビヒクル、賦形剤または担体は、患者及び患者の状態に依存して変化し、そして種々の投与の様式が、当業者に認識されるように、本発明の組成物に適する。本願に開示される任意の薬学的組成物の投与の適切な方法としては、局所、経口、肛門、膣、静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内及び皮内投与が挙げられるがこれらに限定されない。
Candida微生物により引き起こされる感染の検出及び診断
本発明に従い、上記のようなmp58マンノプロテイン、エピトープ及びペプチド、ならびにそのようなタンパク質、エピトープ及び/またはペプチドを認識する抗体の使用を介して、Candida微生物(例えば、C.albicans)の感染を同定及び診断するための方法が提供される。本発明に従い、上に示される本発明の抗体は、Candida感染を診断するためのキットにおいて用いられ得、そしてそのようなキットは、当該分野において公知の型のものであり得、そして本発明の抗体に結合する目的の抗原または微生物を検出するために一般的に用いられ得る。これらの診断キットは、一般的に、当業者に容易に理解され得るような抗体による結合を検出するために適する手段と共に本発明の抗体を含む。例えば、抗体の結合を検出するための手段は、この抗体に連結される検出可能な標識を含み得る。次いで、これらのキットは、Candida感染の存在を検出するための診断方法において用いられ得、ここで、1つ以上のCandida微生物に感染されていることが疑われるサンプル(例えば、個体からとったサンプル(例えば、血液、唾液、尿、脳脊髄液、尿生殖器管、組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚))を得、そしてこれらのサンプルに1つ以上の上記の抗体を導入する。抗体の導入の後、次いで、従来の方法を介して(例えば、適切な標識、またはアッセイ(ここで、これらの抗体が固体支持体に結合しており、そしてその結合がサンプル中の標的の抗原または微生物の存在に反映する)を介して)、サンプル中に抗原または微生物による結合が存在しているか否かが決定される。
本発明に従い、本発明の別の使用は、Candida抗原またはこの抗原を認識する抗体を保有することが疑われるヒトもしくは動物の患者におけるこれらの抗原または抗体のレベルのモニタリングにおけるものであることが企図される。好ましいプロセスにおいて、これは、最初にヒトまたは動物の患者から生物学的サンプルを得ることによって実施され得、そしてこれは、感染について慣用的にモニタリングされる任意の適切なサンプル(例えば、血液、血清、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚)を含む。次に、このサンプルに以下のいずれかを導入する:(1)Candida抗体のレベルをモニタリングすることが所望される場合、Candida抗体が結合する測定可能なレベルのCandidaのタンパク質またはペプチド(例えば、本明細書中及び上記のタンパク質及びペプチド(mp58マンノプロテイン(配列番号2)及びその活性領域エピトープ(配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11を含む)を含む));または(2)Candida抗原のレベルをモニタリングすることが所望される場合、このサンプルに、mp58もしくは上記のペプチドもしくはエピトープを認識し得る本発明に従う測定可能なレベルのCandida抗体を導入する。このプロセスにおける次の工程は、サンプル中の抗原及び抗体が結合を達成するような十分な時間及び条件の後、サンプル中に存在するCandida抗原、またはそれに対する抗体の量またはレベルを反映する抗原−抗体結合のレベルを測定することである。所望のプロセスにおいて、レベルは、入院または処置の期間の間、Candida感染の進行/寛解を追跡するために規則的な時間間隔(例えば、時間毎、日毎、等)でモニタリングされ得る。
本発明に従い、生物学的流体(例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、尿生殖器管)または他の生物学的物質(例えば、組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚)中に存在するCandida抗原の検出は、Candida種の微生物により引き起こされる急性または慢性の感染(カンジダ症を含む)の診断法を構成し得る。上記の抗体はいくつかのCandida酵母において見出されるエピトープを認識し得るので、これらの抗体は、カンジダ感染及び疾患状態の診断を可能にするアッセイにおいて用いられ得る。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれもが、このアッセイに用いられ、そしてモノクローナル(例えば、上記のもの)の場合、mp58マンノプロテイン自体に加えて、mp58マンノプロテインの特定のエピトープが検出され得る。本発明のアッセイの使用によって同定される検出される抗原は、ウェスタンイムノブロット及び他の類似の試験を含む多数の従来の方法によって検出され得る。
同時サンドイッチアッセイにおいて、サンプル、複数の固定化抗体を有する免疫吸着剤及び標識化可溶性抗体(単数または複数)が1回のインキュベーション工程で同時にインキュベートされる。この同時アッセイは、一回のインキュベーションを必要とするのみであり、そして洗浄工程を含まない。同時アッセイの使用は、断然好ましいものである。この型のアッセイは、操作の容易さ、均質性、再現性、ならびにアッセイの線形性及び高精度をもたらす。抗原を含むサンプル、固定化抗体を有する固相免疫吸着剤及び標識化可溶性抗体(単数または複数)は、抗原が固定化抗体及び可溶性抗体に結合することを可能にするのに十分な条件及び時間でインキュベートされる。一般的に、可能な限り多くの抗原を結合するのに十分なインキュベーション条件を提供することは、固相への標識化抗体の結合を最大化し、それによりシグナルを増強するので、このことが所望される。時間及び温度の代表的な条件は、45℃で2時間、または37℃で12時間である。標識化抗体は溶液中にあるのに対し、固定化抗体は固相の支持体に結合しているので、代表的に、抗原は、固定化抗体より標識化抗体により迅速に結合する。このことに起因して、標識化抗体は、固定化抗体より低濃度で使用され得、そして標識化抗体について高い比活性を使用することが好ましい。例えば、標識化抗体は、アッセイ毎に約1〜50ngの濃度で用いられ、一方、固定化抗体は、抗体当りアッセイ毎に10〜500ngの濃度を有し得る。標識化抗体は、例えば、1分子当り1つの放射性ヨウ素、または抗体分子当り2つ以上の放射性ヨウ素程度の高さの比活性を有し得る。
多価抗原を含むサンプルに対する同時イムノメトリックアッセイの実施において、このプロセスは、より詳細には:(a)固相結合抗体及び可溶性標識化抗体(単数または複数)と共にサンプルを含む混合物を同時に形成すること;(b)工程(a)で形成された混合物を、サンプル中の抗原が固定化及び標識化抗体の両方に結合することを可能にするのに十分な時間及び条件下でインキュベートすること;(c)インキュベーションの後、インキュベーション混合物から固相免疫吸着剤を分離すること;ならびに(d)固相免疫吸着剤に結合した標識化抗体またはそれに結合していない標識化抗体のいずれかを検出することを含み得る。当然、洗浄、攪拌、振とう、ろ過等のような他の工程が、任意の特定の状況について慣用または必要であるように、これらのアッセイに加えられ得る。
上記のように、本発明に従い、上記のような本発明の抗体は、カンジダ感染を診断するためのキットにおいて用いられ得る。そのような診断キットは、当該分野において周知であり、そして一般的に、本発明の抗体に結合する真菌、エピトープもしくはタンパク質の存在を決定するのに適するように調製される。これらの診断キットは、一般的に、当業者に容易に理解されるような、抗体による結合を検出するのに適する手段と共に本発明の抗体を含む。例えば、抗体の結合を検出するための手段は、この抗体に結合する検出可能な標識を含み得る。次いで、これらのキットは、カンジダの感染の存在を検出するための診断方法において用いられ得、ここで、そのような感染を有することが疑われる生物学的サンプル(例えば、個体からとった(例えば、血液、唾液、尿、脳脊髄液、尿生殖器管、組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚由来の)サンプル)を得、このサンプルに、上記の1つ以上の抗体を導入し、次いで抗体がこのサンプルに結合するか(このことは、サンプル中のそのような微生物の存在を示す)否かを決定する。
さらに、上記のように、これらのキットはまた、ヒトまたは動物の患者の血清中のCandida抗体または抗原のレベルをモニタリングする方法において有用であり得る。Candida抗原のレベルをモニタリングすることが所望される場合、このキットは、この抗体への結合のレベルを決定するための手段と共に上記のような本発明に従うCandida抗体を含む。サンプル中のCandida抗体のレベルを測定することが所望される場合、このキットは、好ましくは、上記のような単離したCandidaエピトープ炭水化物部分タンパク質、またはペプチド(例えば、mp58マンノプロテイン(配列番号2)及びその活性領域エピトープ(配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11を含む)からなる群より選択されるタンパク質またはペプチドを、サンプル中のCandida抗体に対するの結合を検出するための手段と共に含む。
本発明に従い、Candida種の微生物(例えば、C.albicans)によって引き起こされる感染を予防または処置するための方法が提供され、この方法は、そのような処置を必要とするヒトまたは動物の患者に、感染を処置または予防するのに有効な量で、有効量の上記の抗体を投与することを含む。従って、本発明に従い、上記の従来法のいずれか(例えば、局所的、非経口、筋肉内等)での本発明の抗体の有効量の投与は、ヒトまたは動物の患者におけるカンジダ感染を処置または予防する非常に有用な方法を提供する。上記のように、有効量とは、酵母または真菌の付着を防ぐため、または宿主細胞へのカンジダ生物の結合及びコロニー形成を阻害するためのいずれかのために十分であり、従ってそのような感染の処置または予防において有用である使用レベル(例えば、抗体力価)を意味する。さらに、これらの抗体は、多数の他の機構(感染性微生物の直接的な殺傷、増加したオプソニン作用、形態学的変化の阻害等)による保護効果も示し、従って、有効量の抗体は、保護効果を達成するための任意の手段が得られる量を含む。当業者により認識されるように、感染の処置または予防において有効であるために必要な抗体力価のレベルは、患者の性質及び状態ならびに/または先在する感染の重篤度に依存して変化する。
本発明に従い、ヒトまたは動物における免疫反応を誘発するための方法が提供され、この方法は、ヒトまたは動物に、免疫応答を誘発するために上記のような免疫有効量の単離したmp58マンノプロテイン、または免疫原性フラグメント、領域またはエピトープを投与することを含む。上記のように、免疫反応を得るために本発明に従い用いられる抗原の「免疫原性量」とは、免疫原性応答が宿主において誘発されて所望の予防または治療効果がもたらされるような非毒性であるが十分な薬剤の量を意味する。従って、そのような応答を誘発するために必要とされる単離したタンパク質の正確な量は、被験体の種、年齢、及び一般的な条件、ならびに処置される状態の重篤度、用いられる特定の担体またはアジュバント及び投与の様式等に依存して、被験体毎に変化する。本発明は、上記のようなmp58マンノプロテイン及びそのエピトープを認識する抗体を産生する方法も企図し、そしてモノクローナル及びポリクローナル抗体を産生する適切な方法は上により詳細に記載される。
本発明に従い、上記のような抗体及び組成物は、特定の医療器具及び他のインプラント材料(例えば、補綴デバイス)上での酵母及び真菌感染の発生に対する処置または保護をするためにも用いられ得る。本明細書中に記載される抗体及び/または組成物で有利にコーティングされ得る医療器具またはポリマー生体物質としては、ステープル、縫合糸、代替心臓弁、心補助装置、ハード及びソフトコンタクトレンズ、眼内レンズ移植物(前眼房または後眼房)、他の移植物(例えば、角膜インレー、ケラトプロテーゼ、血管ステント、エピケラトファリア装置、緑内障シャント、レチナールステープル、強膜バックル、デンタルプロテーゼ、甲状軟骨形成装置、喉頭形成装置、血管移植物、軟及び硬組織補綴物(ポンプ、スティミュレーター及びレコーダーを含む電気装置、聴覚プロテーゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯科インプラント、乳房移植物、陰茎移植物、頭蓋/顔面の腱、人工関節、腱、靱帯、半月および半月板、人工骨、人工組織(人工膵臓、人工心臓、人工四肢、及び心臓弁を含む);ステント、ワイヤ、ガイドワイヤ、静脈内及び中心静脈カテーテル、レーザー及びバルーン血管形成装置、血管及び心臓装置(チューブ、カテーテル、バルーン)、心室補助、血液透析部品、血液酸素供給器、尿道/尿管/尿装置(フォーリーカテーテル、ステント、チューブ及びバルーン)、気道カテーテル(気管内及び気管切開術チューブ及びカフ)、腸内供給チューブ(経鼻胃、胃内及び空腸チューブを含む)、創傷ドレナージ管、体腔(例えば、胸膜、腹膜、頭側、及び心膜の腔)から排水するために用いられるチューブ、血液バッグ、試験管、血液回収チューブ、採血管、シリンジ、針、ピペット、ピペットチップ、及び血液チュービングが挙げられるが、これらに限定されない。
導入
Candida albicansの表面上の58キロダルトンのマンノプロテイン(mp58)は、非常に免疫原性であり、試験される全てのC.albicans分離株によって発現され、そしてカンジダ症の間に強力な抗体応答を誘発する。それは、Aspergillusの種々の種においてもホモログを有する免疫優性真菌抗原のファミリーに属する。mp58のコード遺伝子(FBP1/PRA1)のDNA配列から推定されるそのタンパク質部分のアミノ酸配列を、誘導体化ポリエチレンピンの表面に共有結合したオーバーラッピングドデカペプチド(オーバーラップ、7:オフセット、5)の完全セットを合成するために用いた。このピンに結合したペプチドを、改変酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)において用いて、抗mp58抗体を含む多数の抗血清調製物によって認識される連続するエピトープを同定した。この包括的なエピトープ走査研究によって、このタンパク質配列内に多数の免疫反応性の連続するB細胞エピトープの存在が明らかになった。反応性の増加した領域は、成熟タンパク質のアミノ及びカルボキシ末端の両方(夫々、アミノ酸残基16〜50及び286〜299を含む)、ならびにアミノ酸66〜92位、121〜142位、148〜192位、及び211〜232位にわたる内部領域を含んでいた。エピトープ領域のさらなる描写及び抗原性部位の境界の同定を、mp58のタンパク質部分におけるこれらの反応領域にわたる完全オーバーラッピング8マーペプチドからなる第二のPepsetを用いるELISA試験で実施した。このタンパク質のC末端の高度に反応性のエピトープ領域を、ウインドウネット及びリプレースメントネット分析の両方を用いてさらに評価した。このタンパク質のC末端の最後の10アミノ酸残基に対応する合成ペプチドは、担体タンパク質に結合した後にマウスに注射した場合、免疫原性であった。さらに、得られた血清中の抗体は、ELISA及びイムノブロットアッセイにおいて相同のmp58を認識した。mp58に応答する抗体の描写は、カンジダ症の管理のための新規の免疫に基づく予防、治療、及び診断技術の開発の基礎を提供する。
Candida albicansは、ヒトの共生性及び日和見性病原体の両方である二形性真菌である。宿主の欠損に依存して、Candidaは、粘膜性から命を脅かす播種性のカンジダ症の範囲をとる種々の感染を引き起こすことができ、宿主の実質的に全ての器官に感染する能力を有する(1、2)。カンジダ症の素因となる因子としては、免疫抑制療法、大量の抗生物質療法、細胞毒性療法、静脈内カテーテル及び留置装置、非常に軽い出生時体重、AIDS、糖尿病、移植医療、薬物依存等が挙げられる(1)。初期及び正確な診断手順に欠けること、最も一般的かつ有効な処置により示される高い毒性、及び経験則による予防処置に起因する耐性株の発生は、播種性感染に関連する高い罹患率及び死亡率の原因である(3)。これらの理由に起因して、予防戦略の開発、及びカンジダ症を管理するための多成分のアプローチを促進または補完するための新規または代替的な治療についての研究に非常に興味が持たれている。しかし、多数の研究者のグループの努力にも関わらず、この微生物の病原性機構の我々の現在の理解、及び宿主の感受性を決定する因子の我々の知見は、なお、予備的領域にある。C.albicansの推定毒性因子の提唱されるリストとしては、形態学的変化、抗原変異性、表現型転換、宿主構造に対する付着、細胞表面の疎水性、分子擬態、及び細胞外酵素の産生が挙げられる(4)。細胞の外側のほとんどの部分として、細胞壁は、これらの活性のほとんどが存在する構造である。C.albicansの細胞壁は、グルカン及びキチンが硬い微小繊維ネットワークを形成し、そしてタンパク質及びグリコ(マンノ)プロテインがこの骨格中に包理されておりかつその外側表面にも存在する、複合的な多層構造である(5)。今日、細胞壁は、共生性または病原性の生活形態への適合に有用な可変性構成成分を示差的に発現する能力を有する高度に動的なオルガネラとして認識されている。タンパク質及びマンノプロテインは、構造及び生理学的観点の両方から重要な役割を果たすと考えられており、そして形態形成(6、7)、細胞表面疎水性(8−11)、付着(12−15)、ならびに抗原提示及び免疫調節(5、16)のようなプロセスに関与し得る。
多数の研究が、細胞壁のタンパク質組成に関連する高い程度の複雑性を示している。一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)及びウエスタンブロット技術が、カンジダ細胞壁のタンパク質及びマンノプロテインを研究及び分析するために用いられてきた(61〜65)。本発明者らは、C.albicansのインタクトの細胞からの真性の細胞壁成分の放出をもたらすために化学的(β−ME)及び酵素的(ザイモリアーゼ)可溶化技術の組み合わせを記載した(61、62)。β−MEを用いるC.albicansの酵母細胞及び発芽管の両方の処理は、タンパク質及びマンノプロテインの複雑なアレイの可溶化をもたらした。フィブリノーゲン及び抗フィブリノーゲン抗体の組み合わせを用いるリガンド親和性ブロッティングは、ヒトフィブリノーゲンと特異的に相互作用する両方の真菌形態由来の抽出物中の58kDa成分(mp58)の検出を可能にした(39)。mp58はコンカナバリン(ConA)に対するその反応性によって示されるマンノプロテインである。また、それは、ポリスチレン−ラテックスマイクロビーズを結合するその能力について測定されるように、非常に疎水性である(11、60)。C.albicans発芽管が間接的免疫蛍光実験においてフィブリノーゲンの存在下でインキュベートされた場合、強力な蛍光が観察された。発芽管の起源である母出芽型胞子のほとんど、及び発芽していない酵母細胞は、かすかな蛍光を示したが;しかし、比較的低いパーセンテージの発芽していない出芽型胞子は、強力な蛍光を示した。mp58を精製し、そして精製した調製物をウサギに注射して、この成分に対するポリクローナル抗血清(PAb抗mp58)を産生させた。このポリクローナル抗体をイムノブロット及びIIF技術に用いた場合、認識パターンは、基本的に、フィブリノーゲン結合について検出されたものと同一であった。図1を参照のこと。
以前の研究において報告される、これらの2つのレセプター様分子の間のいくつかの類似点としては:1)両方の分子がグリコ(マンノプロテイン)であること、ii)これらのいずれも完全な形態学的特異性を示さないこと、iii)両方が同様の見かけの分子量(約60kDa)を有すること、iv)同様の技術を用いて抽出された細胞壁物質中に見出されたこと、v)感染された組織においてインビボで発現されること、及びvi)両方とも液体培地に分泌された物質中に見出されたことが挙げられる(34、37、39、60、67、68)。しかし、両方の分子の間にはいくつかの相違点も存在する;おそらく、最も重要であるのは、種々のリガンドの結合が同じ分子の異なるドメインを介して生じる可能性はあるが、C3dレセプターの場合、タンパク質部分がリガンド結合に関与する構造であり(13)、一方で、58kDaマンノプロテインの場合、フィブリノーゲン結合がこの分子の糖部分によって媒介されるようであること(39)である。また、これらの差異はこれらの研究において用いられる異なる成長条件に起因し得るが、顕微鏡技術を用いて、両方の抗血清についての認識パターンが異なることが記載されている(39、69)。
本発明者らは、C.albicans C3dレセプター(CR2、PAb抗CR2)及びmp58(PAb抗mp58)に対して惹起された抗体、ならびにリガンド相互作用を、これらの2つの分子の間の関係及びこれらの可能性のあるホモロジーを研究するために用いた(59)。間接的免疫蛍光アッセイにおいて、PAb抗CR2を用いた場合に母(mother)出芽型胞子においてより高い認識が生じ;一方で、プローブとしてPAb抗mp58または可溶性フィブリノーゲンの結合を用いた場合、菌糸の伸長においてより高い蛍光のレベルを観察した。PAb抗CR2レセプター及びフィブリノーゲンまたはPAb抗mp58のいずれかを用いるデュアル標識実験(dual label experiment)において、蛍光パターンにおける競合も変化も観察されなかった。イムノブロットにおいて、PAb抗CR2は、細胞壁由来のβ−ME抽出物において3つの異なる別々のバンドを認識し、一方で、PAb抗mp58の場合、異なる、1つのより広いバンドが検出された。しかし、細胞壁抽出物中に存在する物質を分離するために非変性条件が用いられた場合、ウエスタンブロットにおいてPAb抗mp58では、反応性は検出されなかった。PAb抗CR2をプローブとして用いた場合、約40kDaに対応する領域に泳動する1つのバンドが検出された。これらの観察は、ネイティブの状態における、これらの分子のより高い分子量を示唆し、従ってこれらの分子が、細胞壁構造の一部としてこれら自体または他の細胞壁部分のいずれかと相互作用していることを示す。これらのレセプター様分子と他の細胞壁部分(より具体的にはMab DC3H10により認識されるエピトープを保有する分子(70))との間の関係及び可能性のある相互作用の説明において、全体的な細胞壁機構におけるこれらの分子の間の複雑な相互作用が示唆された(71)。
ラミニンは、基底膜の主要成分(細胞外マトリクス、ECMから特殊化する)であり、ここで、それは、IV型コラーゲン及びエンタクチンのような他の成分と相互作用する。それは、正常な細胞接着の間だけでなく、腫瘍細胞及び微生物による組織浸潤及び転移の間にも重要な役割を果たすようである大きいマルチドメイングリコプロテインである。約68〜70kDaの分子量でありC.albicansの菌糸状細胞に特異的なラミニンレセプターが記載されている(41)。しかし、本発明者らの実験条件下及びアフィニティブロッティング実験(上記を参照のこと)を用いると、mp58部分が特異的にフィブリノーゲンと相互作用し、そしてそれは、ラミニンまたはフィブロネクチンと結合することができなかった。さらに、ラミニンの場合、本発明者らは、同じリガンドアフィニティブロッティング技術を用いてラミニンと相互作用する能力を有する、C.albicansの出芽型胞子由来のβ−ME抽出物中に排他的に存在する37及び67kDaの2つのポリペプチドを検出した(42)。37kDa部分(p37)は、ヒト高親和性ラミニンレセプターと抗原性ホモロジーを示し、そしてそれは、IIFによって示されるように、C.albicansの出芽型胞子の表面上に不均一に分布しており、mp58について検出された蛍光パターンと同様の蛍光パターンを有していた。しかし、デュアル蛍光標識実験(dual fluorescence label experiment)において、mp58についてプローブとしてフィブリノーゲン結合を用い、そしてp37についてのプローブとして精製p37に対して産生したポリクローナル抗体(PAb抗p37)の結合を用いて、本発明者らは、各々のレセプターの濃縮領域が異なることを観察し、これは、これらの成分が、潜在的なレセプター複合体として、同じ場所に局在化しなかったことを明らかにした。
エンタクチン(ニドジェンとしても知られている)は、硫酸化グリコプロテインであり、基底膜の成分であり、ここで、それは、ラミニンとタイトな化学量論的複合体を形成し、そしてIV型コラーゲンと相互作用する。本発明者らは、C.albicansとこの最近特徴付けられたECM成分との間の相互作用を調査した(19)。真菌、出芽型胞子、及び出芽型胞子保有発芽管の両方の形態は、間接免疫蛍光アッセイにより検出される場合に、組換えエンタクチンと結合する能力を有していた。C.albicansの両方の成長形態由来のβ−ME細胞壁抽出物中に存在する物質は、用量依存の様式で、固定化組換えエンタクチンと結合することができ、そしてエンタクチンへの結合は、ラミニンについて観察される結合の約2倍であった。エンタクチンとC.albicansとの間の相互作用は、Arg−Gly−Asp−Ser(RGDS)(配列番号12)ペプチドによって部分的に阻害された。C.albicansのエンタクチンレセプターが哺乳動物細胞のエンタクチンレセプターとして報告されているので(72)、このことは、それが、インテグリンファミリーのレセプターに属することを示し得る。種々のC.albicans細胞壁抽出物中に存在する成分に対して惹起されたポリクローナル抗エンタクチン抗血清、及びプールされた抗血清調製物は、完全またはほぼ完全に、結合を破壊した。エンタクチン分子の種々のドメインに結合する形態特異的レセプター様分子の存在が、競合結合アッセイにおいて除外された。細胞壁中のエンタクチン結合物質はラミニン及びフィブロネクチンに結合する幾分かの能力を示したので、これらは、特定の程度の混乱を示した。出芽型胞子及び発芽管の両方由来のβ−ME細胞壁抽出物中に存在する約25、44、及び65kDaの分子量を有する部分が、リガンドアフィニティブロッティング実験において、エンタクチンを結合する能力を有するものとして検出された。これらの部分は、同じ抽出物中に存在するmp58とは明らかに異なっていた。本発明者らの知る限り、これは、エンタクチンについて非宿主部分との相互作用における(より具体的には、病原性微生物の結合における)役割を示唆する最初の文書による報告であり、病原性における重要な意味を有し得る観察である。
本発明者らは、出芽型分生子及び出芽型分生子保有発芽管として成長させる条件下で増殖した種々のC.albicansの臨床分離株の細胞壁中のmp58の存在を調査した。種々の株由来のβ−ME細胞壁抽出物に関連するタンパク質組成全体の分析は、高い程度の複雑性及び特定の程度の変動を示し、定性的及び定量的差異の両方が検出された。しかし、技術の組合せを用いて、約58kDaの電気泳動移動度を有し、そしてこの抽出物中の主要な成分であるような部分が、全ての試験された株から検出された。mp58に対して産生された一価ポリクローナル抗体を用いるイムノブロット分析により、株及び培養条件に依存する認識パターンの差異が明らかになった。主要な株は、明らかにリガンドアフィニティ実験においてフィブリノーゲンに結合する能力によって検出されるような、機能的mp58を有する。これらの結果は、mp58が試験した全ての株において一貫して存在し、そして播種性カンジダ症についての潜在的な抗原性マーカーであることを示唆する。図2を参照のこと。
本発明者らの以前の研究を通して、mp58のタンパク質部分のアミノ酸配列は知られている。mp58の299アミノ酸残基を合成し、そして配列に沿って5残基ずつずれている完全なセットのオーバーラッピングドデカペプチド(12マー)としてピンに結合した。そのようにすることで、このタンパク質からの全ての配列の8残基が少なくとも1つのぺプチド中に表される。これらのオーバーラッピングペプチドは、このタンパク質の全配列(15アミノ酸シグナルペプチド及び284アミノ酸を含む成熟タンパク質を含む)をカバーした。最終的なPepsetは、合計59ペプチド、及び2つのコントロールペプチドからなった。得られたピン−セットは、8×12のマイクロプレートフォーマットに適合し、そして改変ELISA手順を用いてB細胞エピトープについてのサーチにおいて走査され得る。第一のシリーズの実験において、ピンに結合したペプチドを、全身性カンジダ症を有する患者由来の血清サンプル中に存在するIgG抗体により認識される連続するエピトープを同定するための改変酵素結合イムノソルベント検定法に用いた。同定されたIgG反応性ドメインは、C.albicans mp58で免疫した動物由来の血清を用いて同定されたドメインと類似していた(Viudesら、I&I、2001)。タンパク質配列中の2つのドデカペプチドは、コントロール(感染していない)個体由来の血清サンプルを用いた反応と比較して、播種性カンジダ症を有する患者由来の血清と高い反応性を示した(図3を参照のこと)。
カンジダ症の患者由来の血清サンプルを、ELISAによって試験して、C末端ペプチドに指向されるIgGサブクラスの分布を評価した。これらの実験の性質は、種々の免疫グロブリンサブクラスの正確な定量をもたらさなかったが、結果は、免疫グロブリンG(IgG)抗体サブクラスがIgG2>IgG1>IgG3>IgG4であることを示した。結果は、全体としてTh1の優勢である、混合Th1/Th2応答(これは、カンジダ症に対する保護に対応していた)を示す(Romani,L.1999.Immunity to Candida albicans:Th1、Th2 cells and beyond.Curr.Opin.Microbiol.2:363−7)。図5を参照のこと。
mp58の精製のために、βME中の成分を、Laemmliにより記載されるような変性条件下で分取ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離した。mp58に対応するゲルの横断セクション(クマシー染色により識別される)を、切り出し、砕き、そしてポリペプチド部分を電気溶出(electroelute)した。純粋なmp58をアジュバントと混合し、そしてBALB/cマウスに注射した。免疫プロトコルは、第一の注射(完全Freund’アジュバントを用いる)、引き続く3週間間隔での2回のブースター注射(不完全Freund’アジュバントを用いる)、及び融合の3日前のアジュバントを用いない1回の最後のブースター注射から構成されていた(全ての注射は皮下であった)。ハイブリドーマ産生のために、マウスを犠牲にし、それらの脾臓を無菌的に除去した。抗体分泌細胞を単離し、そしてポリエチレングリコールの滴下を用いてミエローマ細胞(NS1)と混合した。融合の後、細胞を選択培地(ビタミン補充したDMEM/HAT)中に希釈し、そしてマルチウェル組織培養ディッシュ中に低密度でプレートした。得られた融合物由来の組織上清をELISA(マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするためにトータル2−ME抽出物を用いる)及びイムノブロット技術の両方によってスクリーニングした。これらの陽性ウェルからの細胞を増殖させ、1つ細胞を限界希釈によりクローニングし、そして上清をELISA及びイムノブロットの両方によるさらに1回のスクリーニングに供した。陽性クローンを同定し、そしてモノクローナル抗体をハイブリドーマ上清(3H3を含む)として収集した(これは、IgG1である)。
mp58のC末端デカペプチドに対応する合成ペプチド(HTHADGEVHC、同定されたノナペプチドエピトープ及びネイティブの末端システイン)は、担体タンパク質(KLH)に結合し、そしてマウスに注射されたときに、免疫原性であった。得られた血清を、種々の免疫学的手順によって特徴付けした。過免疫血清は、マイクロタイタープレートのウェルに結合した遊離のペプチドを、用量依存及び飽和様式で認識した。産生された両方の抗血清は、エンドポイントELISAによって決定される場合の高い力価の抗ぺプチド抗体を保有していた。遊離の可溶性ペプチドは、ペプチド及びmp58への抗体の結合の有効なコンペティター(competitor)であり、この反応の特異性を示した。抗ペプチド抗血清は、相同のC.albicans mp58を認識し、そして細胞壁抽出物中に存在する他の抗原との交差反応性は検出されなかった。この結果は、単一のペプチドモチーフでの免疫が高度に特異的な抗体応答をもたらすこと及びこのデカペプチドが他のカンジダ抗原との有意な配列相同性を欠損していることを示唆する。
Mab 3H3の保護効果を、血行中を伝播するカンジダ症のマウスモデルにおいて評価した。簡単には、Mab 3H3腹水(ascitis)を2つの異なる濃度(高用量[約1.8mgのIgG]及び低用量[約0.3mgのIgG]、コントロール群には生理食塩水注射を受けた)を、1×106細胞のC.albicansを用いる致死量の静脈内チャレンジでの感染の2時間前に、静脈注射を介してマウスの群に受動的に投与した。感染接種中に存在する細胞の数及び生存力の確認を、プレートカウントにより実施した。保護効果の試験を、感染後、毎日の生存をモニタリングすることによって実施した。生存データ及びグループ間での差異を、カプラン−マイヤーテストを用いて解析した。結果は、高用量の3H3が、コントロールグループと比較して生存を有意に増加させ(p=0.015)、(コントロールの6匹中0匹と比較して)6匹中4匹の処置した動物が15日間より長く生存した。
C.albicans 3153A株をこの研究において用いた。それを2%(W/V)寒天を含むSabouraud培地上で維持した。酵母細胞を22℃で、Leeらの培地中での懸濁培養で増殖させた(9)。発芽管を、同じ培地中で37℃で4〜6時間、インキュベートすることによって定常期の酵母細胞から誘導した。細胞壁抽出物を、既述のようにβ−メルカプトエタノール(β−ME)での処理によってインタクトの細胞(発芽管)から調製した(10)。簡単には、発芽管を、1%(v/v)のβ−MEを含むアルカリ緩衝液中に再懸濁し、そして穏やかに攪拌しながら37℃で45分間インキュベートした。処理後、これらの細胞を沈殿させ、そして上清流体を回収し、透析し、そして凍結乾燥した(β−ME抽出物)。この抽出物中の総糖分量を、標準法によりマンノースを用いて比色測定した。
mp58の精製のために、β−ME中の成分を、変性条件下でのプレパラティブドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離した。簡単には、約10mg(総糖含量に基づく)の対応するβ−ME抽出物を、幅13cm×高さ20cmの5〜15%のポリアクリルアミドスラブグラジエントゲルに添加した。予め染色した分子量標準(Gibco−BRL、Life Technologies Inc.、Gaitherburg、Md)を、分離ゲルスラブの一方の端に形成される1つの参照ウェルにおいて平行して展開させた。mp58に対応するゲルの横断セクション(クマシー染色によって識別される)を、切り出し、砕き、そしてポリペプチド部分を電気溶出(electroelute)した(12)。
二匹の(BALB/c)マウスを、プレパラティブ電気泳動により精製した25μgのmp58で免疫し、引き続きゲルスライスから電気溶出した(上記を参照のこと)。免疫プロトコルは、第一の注射(完全Freund’アジュバントを用いる)、引き続く3週間間隔での2回のブースター注射(不完全Freund’アジュバントを用いる)、及び融合の3日前のアジュバントを用いない1回の最後のブースター注射から構成されていた(全ての注射は皮下であった)。ハイブリドーマ産生のために、マウスを犠牲にし、それらの脾臓を無菌的に除去した。抗体分泌細胞を単離し、そしてポリエチレングリコールの滴下を用いてミエローマ細胞(NS1)と混合した。融合の後、細胞を選択培地中に希釈し、そしてマルチウェル組織培養ディッシュ中に低密度でプレートした。C.albicans mp58に対する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株をELISA及びイムノブロット手順の両方によってスクリーニングし、そして1つの細胞を限界希釈法によってサブクローニングした。1H4と示されるMab(アイソタイピングキット(Zymed)によって決定されたIgG1)を産生するハイブリドーマ細胞株を確立した。この細胞株1H4についての腹水を、プリスタンでプライムされた(pristan−primed)マウスにおいて対応するハイブリドーマを用いて調製した。
イムノブロットのために、C.albicans 3153A β−ME抽出物中に存在する物質をプレキャスト4%〜15%グラジエントミニゲル(Bio−Rad)を用いるSDS−PAGEによって分離し、そしてニトロセルロース膜に移した。3%のBSA(w/v)を含む、0.9%(w/v)NaClを補充したTris−HCl緩衝液(TBS)中で膜をブロッキングした後、これらを、Mab 1H4(0.05% Tween20及び1% BSAを有するTBS中に1:1,000希釈)の存在下またはC.albicans細胞壁抽出物に対して産生したウサギポリクローナル抗血清と共にインキュベートした(13)。ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリン(Bio−Rad)を、二次抗体として用いた。発色試薬としてH2O2及び4−クロロ−1−ナプトール(4-chloro-1-napthol)を用いて有色反応性バンドを発色させた。
1H4 Mabにより認識されるエピトープの性質を特徴付けるために、1H4 Mabと最初に反応する抗原性調製物の過ヨウ素酸塩処理を、改変ELISAアッセイを用いて実施した(14)。簡単には、β−ME抽出物または精製mp58を用いて、マイクロタイタープレート(Immulon2)の選択されたウェルをコーティングした。一晩のインキュベーションの後、ウェルを、0.05%Tween 20を添加したリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)(PBS)(PBST)で4回洗浄した。次いで、プレートを、50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)でリンスし、そして過ヨウ素酸塩に曝した。次いで、ウェルのセットを暗所中室温で10mMのm−過ヨウ素酸ナトリウム(Sigma)に、1時間曝した。次いで、これらのプレートを、酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、そしてアルデヒド基を1%グリシン溶液を用いてブロックした。次いで、これらのプレートをPBSTを用いて4回洗浄し、そして200μlの1:1,000希釈のMab 1H4 1%BSA含有PBSTと共に1時間インキュベートした。このプレートを洗浄し、そして1%BSA添加PBST中に1:2,000希釈でヤギ抗マウスIgG(Bio−Rad)をマイクロタイタープレートのウェルに添加し、そして1時間インキュベートした。前記のように洗浄した後、200μl/ウェルのo−フェニレンジアミン基質を、添加し、暗所中で穏やかに攪拌しながら、10分間発色させた。100μl/ウェルの1M H2SO4を添加することによって発色を止め、そしてプレートを、Benchmark microplate reader(Bio−Rad、Hercules、Calif.)において490nmで読み取った。
スライド凝集試験を、Mab 1H4を分泌するハイブリドーマ由来の過剰増殖した(overgrown)組織培養物上清15μlと酵母細胞懸濁液(約2×108細胞/ml)30μlとを直接混合することによって実施した。これらの調製物を、室温で1分間混合し、そして裸眼及び低出力明視野顕微鏡法による凝集の観察によって凝集を測定した。凝集反応を、非常に強い(+++)、強い(++)、中間(+)、弱い(+/−)、または凝集なし(−)として記録した。
粘膜皮膚及び全身性カンジダ症の患者由来の24のヒト組織サンプルを、Department of Pathology、Hospital Clinico Universitario、Valenciaのファイルから取り出した。14のサンプルを、検死試験の間に得、そして9つは、切開または内視鏡生検に対応した。これらのケースは広範囲に特徴付けされている(15、16)。
免疫組織化学的研究を、4μmのパラフィンに包埋した組織切片に対して、以前に記載されているようにアビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ技術によって実施した(15)。これらの組織切片を無水メタノール中0.3%のH2O2に30分間曝すことによって内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。インキュベーションのシークエンスは、以下の通りであった:2%正常なウマ血清(20分間)、1H4培養物上清(45分間)、ビオチン化ウマ抗マウスIgG(Vector、Burligame、CA)(30分間)、及びアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体(Vector)(45分間)。反応物を、0.5mg/mlの3−3’ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(Sigma、St.Louis、MO)及び50mmol TRIS中3μl/mlの3%H2O2(pH7.6)中で発色させた。これらのスライドを、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。全てのインキュベーションを、室温で実施した。いずれの場合も抗原回収技術を適用しなかった。
本発明者らは、1H4として示される、Mabを産生するハイブリドーマ細胞株を確立した。Mab 1H4は、ELISA実験において、C.albicans細胞壁抽出物および精製したmp58に反応性であったIgG1であった。イムノブロッティング実験は、Mab 1H4がmp58(マウスを免疫するために用いられる)を認識したが、C.albicansの細胞壁抽出物中に存在する、より高い分子量の多分散系の物質も認識することを示した(図6)。
C.albicans mp58は、細胞表面マンノプロテインである。2つの初期の観察から、本発明者らは、Mab 1H4により認識されるエピトープが炭水化物の性質をもつものであり得ると考えるにいたった。第一に、エピトープマッピング実験において、この抗体がC.albicans mp58のタンパク質部分の全配列を包含するオーバーラップペプチドのいずれも認識しなかった(示さず)。第二に、図6に示されるように、Mab 1H4を用いるイムノブロット分析は、高分子量の、主に炭水化物を表す高度多分散系物質とのその交差反応性を示した。図7に示されるように、Mabと反応した抗原決定基は、過ヨウ素酸塩処理に対して感受性であり、そして10mMのm−過ヨウ素酸ナトリウム処理によって、mp58及び細胞壁抽出物の両方へのMab 1H4の結合がほとんど完全に破壊された。これらの結果は、Mab 1H4により認識されるエピトープが炭水化物の性質をもつものであることを示す。
最初の観察により、C.albicans酵母細胞がMab 1H4の存在下でインキュベートされる場合に、Mab 1H4が凝集抗体を構成することを確立した。本発明者らは、種々の環境条件(増殖培地及びpH)の下で増殖したC.albicans細胞の表面上での、このMabにより認識されるエピトープの発現をさらに調査するために、この特性を利用した。第1表は、異なる温度及びpHのYPDで酵母細胞として増殖させた3つの異なるC.albicans株を用いたこれらの凝集実験からの結果を概説する。表に示されるように、Mab 1H4は、中性pH、種々の温度のYPDで増殖した全ての株由来の酵母細胞を凝集したが、酸性pH下で増殖させたものを凝集しなかった。これらの観察は、このMabにより認識されるエピトープの発現のpH依存性を示していた。しかし、この抗体は、異なる培地(Lee及びRPMI)において酵母細胞として増殖させた場合、同じC.albicans株を(非常に少ない程度であるが)凝集させたので、このpH依存性は、完全ではない。
免疫組織化学の結果を、第2表に示す。非酸性pHの粘膜表面(例えば、舌、食道、小腸、及びほとんどの皮膚領域)由来の組織サンプルにおいて、繊維状の形態のC.albicansが優勢であり、そしてこれらのほとんどが、1H4免疫染色及び侵襲性表現型の両方を示した(図8)。全身性カンジダ症の患者由来の非酸性pHを有する内部器官(肝臓、肺、心臓、甲状腺)において、実質的に全ての場合において、菌糸または偽菌糸と共に、変動する数の酵母細胞が見出された。これらの組織において、酵母及び繊維状形態の両方が、強い1H4免疫反応性を示した(図9、10)。
酵母から菌糸への変化をさせる能力は、明らかに、侵襲性カンジダ症の病原性において決定的に重要である(4、5、6)。酵母細胞及び菌糸の両方が、感染された組織において見出され、そして病原性に寄与している。酵母細胞は、迅速な血行での伝播により適しているが菌糸要素を伴っても、これらは、上皮及び内皮の障壁を破って広範な器官に損傷を与えることができる(4)。感染プロセスの間、酵母細胞及び菌糸は、宿主内の種々の微小環境に遭遇し得る。酸性pHにおいて、Candida albicansは、ほとんどが酵母形態で増殖し;アルカリ性pHにおいて、それは、主として繊維状の形態で増殖する(2、6、7)。胃酸は、ほとんどの微生物に対して有効な障壁を提供する(正常な胃のpH値は、1〜3.5である)。対照的に、無塩酸症及びH2−アンタゴニストの使用(これらは、胃のpHを上昇させる)が、非常に高いパーセンテージの侵襲性の胃のカンジダ症に関連することが見出された(17)。同様に、皮膚は真菌の増殖が比較的生じにくいが(18)、皮膚表面のpHの実験的な増加は、ヒト志願者における明白な皮膚のカンジダ症をもたらした(19)。
雌のBALB/cマウス(6〜7週齢)をバイオクリーンフード中にグループで収容し、適宜、水及び食糧を与えた。6〜8匹のマウスを、各々の実験群として用いた。Mab 1H4(約0.6mgのIgG)を、感染の2時間前に腹水として腹腔内に投与した。コントロール動物に同じ容量の生理食塩水を与えた。全てのマウスに、YEPD中、37℃(図13、パネルA)またはLee培地中、24℃(図13、パネルB)で一晩増殖した1×106細胞のC.albicans臨床株412で静脈内チャレンジを受けた。Mab 1H4の保護効果の実験を、感染後毎日生存を(30日まで)モニタリングすることによって実施した。生存データ及びグループ間の差異を、カプラン−マイヤー及びログランク試験を用いて解析した。P<0.05を統計的に有意であると考えた。
mp58タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を、酵母細胞壁抽出物に対するELISAによってさらに特徴付けした。
Immulon 2−HB high−binding 96ウェルマイクロタイタープレート(Dynex)を、1μg/ウェルの1×PBS(pH7.4)中のC.albicans 10261株、26555株のBME細胞壁抽出物またはmp58C末端ペプチド(HTHADGEVH)でコーティングし、そして室温で2時間インキュベートした。ELISAにおける全ての洗浄工程を1×PBS、0.05% Tween−20洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。プレートを洗浄し、そしてハイブリドーマ上清サンプルをウェルに添加する1時間前に1% BSA溶液を用いて室温でブロッキングした。プレートをサンプル及び適切なコントロール(例えば、培地単独)と共に、室温で、1時間インキュベートし、洗浄し、そして1×PBS、0.05% Tween−20、0.1% BSA中に1:5000に希釈したヤギ抗マウスIgG−AP(Sigma)を二次試薬として用いた。4−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)(Sigma)の1mg/ml溶液を添加し、37℃で30分間インキュベートすることによってプレートを発色させた。SpectraMax 190 Plate Reader(Molecular Devices Corp.)を用いて405nmで吸光度を読み取った。バックグラウンド(培地単独、約0.1OD)の3倍以上のOD405を有する抗体上清を陽性と考えた。
これらの実験を、抗mp58 mAbの、Candida sp.の表面上で発現されるネイティブmp58との反応性を決定するために実施した。
酵母細胞(C.albicans SC5314株及びC.albicans 3153株、C.glabrata、C.guillermondi、C.parpsilosis、C.tropicalisならびに、mp58発現ベクターでトランスフェクトしたS.cerevisae X−33)を回収し、洗浄し、そしてウサギIgG(50μg/ml)でブロックした後、2μg/mlの濃度の抗体またはPBS単独(コントロール)と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーションの後、検出抗体としての役割を果たすヤギ−F(ab')2−抗マウス−F(ab')2−FITCと共に酵母細胞をインキュベートした。抗体標識の後、FACScaliberフローサイトメーターを通して酵母細胞を吸引し、蛍光発光を分析した(励起:483、発光:570)。各々の酵母株について、10,000イベントを回収及び測定した。PBSコントロールと比較することによって、ゲートされたポジティブイベント(gated positive event)のパーセントとしての単位を測定した。
これらのデータは、mAb 3H3及び3C2が、C.albicansに加えて、C.glabrata、C.guillermondii、C.parapsilosis、及びC.tropicalsを含む多数のCandida種により発現されるmp58に対して広範に反応性であることを示す。
追加の実施例に関連して引用される以下の文献及び引用文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される:
Claims (43)
- pH感受性炭水化物部分、ならびに配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11により示されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される、C.albicansのMp58マンノプロテイン由来の免疫原性ペプチドまたはエピトープを認識し得る単離した抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- ポリクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がキメラモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体からなる群より選択されるタイプのものである、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が単鎖モノクローナル抗体である、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体がヒトまたは動物におけるCandida感染を予防する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が細胞外マトリクスアドヘシンへのCandida微生物の結合を阻害する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトまたは動物における非経口、経口、鼻内、皮下、エアロゾルまたは静脈内投与に適する、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体を含む、単離した抗血清。
- 請求項1に記載の抗体及び該抗体による結合を検出するための手段を含む、診断キット。
- 前記結合を検出するための手段が、前記抗体に結合する検出可能な標識を含む、請求項10に記載の診断キット。
- ヒトまたは動物の患者に、有効量の請求項1に記載の抗体を投与することを含む、Candida属の微生物の感染を処置または予防する方法。
- 有効量の請求項1に記載の抗体及び薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、カンジダ感染を処置または予防するための薬学的組成物。
- C.albicansのmp58マンノプロテイン、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11からなる群より選択される、mp58由来の炭水化物エピトープまたはmp58由来のペプチドエピトープを認識し得るモノクローナル抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体1H4、3H3、及び3C2からなる群より選択される、請求項14に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体がヒトまたは動物においてCandida属のメンバーにより引き起こされる感染を処置または予防し得る、請求項14に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項14に記載の抗体を含む単離した抗血清。
- 請求項14に記載の抗体及び該抗体による結合を検出するための手段を含む診断キット。
- 前記結合を検出するための手段が、前記抗体に結合する検出可能な標識を含む、請求項18に記載の診断キット。
- ヒトまたは動物の患者に、有効量の請求項14に記載の抗体を投与することを含む、Candida属の微生物の感染を処置または予防する方法。
- 有効量の請求項14に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、カンジダ感染を処置または予防するための薬学的組成物。
- カンジダ感染を有することが疑われる生物学的物質のサンプル中に請求項14に記載の抗体を導入すること、及び該抗体が該サンプル中の抗原と結合するか否かを決定することを含む、Candida属の微生物により引き起こされる感染を診断する方法。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11からなる群より選択される、タンパク質またはペプチドを含む、C.albicansから単離した免疫原性タンパク質またはペプチド。
- ヒトまたは動物に免疫学的有効量の請求項23に記載の単離したタンパク質またはペプチドを投与することを含む、ヒトまたは動物における免疫原性反応を誘発する方法。
- 免疫原性量の請求項23に記載の単離したタンパク質またはペプチド及び薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、ワクチン。
- 請求項23に記載の単離したタンパク質またはペプチド及び適切なビヒクル、担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項23に記載のタンパク質またはペプチドをコードする単離した核酸配列。
- Candida微生物由来の抗原を保有することが疑われる生物学的サンプル中の該抗原の存在をアッセイする方法であって、該方法は、(a)固相免疫吸着剤に結合した固相固定化抗体または可溶性標識抗体のいずれかの形態の請求項14に記載の抗体と共に、該サンプルを含む混合物を同時に形成すること、(b)工程(a)において形成された混合物を、該サンプル中の抗原が該固定化または標識化抗体に結合することを可能にするのに十分な時間及び条件下でインキュベートすること;及び(c)該固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出することまたは該標識化可溶性抗体を検出することを含む。
- 洗浄、攪拌、振とうまたはろ過工程をさらに含む、請求項28に記載の方法。
- Candida抗原または該抗原を認識する抗体を保有することが疑われるヒトまたは動物の患者における該抗原または抗体のレベルをモニタリングする方法であって、該方法は、(a)該ヒトまたは動物の患者から生物学的サンプルを得ること;(b)該サンプル中に、Candida抗原のレベルをモニタリングすることが所望される場合、決定可能なレベルの請求項14に記載の抗体を導入すること、或いは該抗原を認識する抗体のレベルをモニタリングすることが所望される場合、決定可能なレベルの配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11からなる群より選択されるCandidaタンパク質もしくはペプチドを導入すること、(c)該抗原または抗体と合わせた場合、該サンプルを、該抗原及び抗体が結合することを可能にするのに十分な時間及び条件下でインキュベーションすること;ならびに(d)サンプル中に存在するCandida抗原またはそれに対する抗体のいずれかのレベルを反映する抗原−抗体結合のレベルを測定することによって該サンプル中の抗原または抗体のレベルをモニタリングすることを含む。
- mp58マンノプロテイン由来のpH感受性炭水化物エピトープを認識し得るモノクローナル抗体。
- 前記抗体がキメラモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、及び単鎖モノクローナル抗体からなる群より選択されるタイプのものである、請求項31に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体がmAb 1H4である、請求項31に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が、ヒトまたは動物におけるCandida属のメンバーにより引き起こされる感染を処置または予防し得る、請求項31に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項31に記載の抗体を含む、単離した抗血清。
- 請求項31に記載の抗体及び該抗体による結合を検出するための手段を含む診断キット。
- 前記結合を検出するための手段が、前記抗体に結合する検出可能な標識を含む、請求項36に記載の診断キット。
- ヒトまたは動物の患者に、有効量の請求項31に記載の抗体を投与することを含む、Candida属の微生物の感染を処置または予防する方法。
- 有効量の請求項31に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、カンジダ感染を処置または予防するための薬学的組成物。
- カンジダ感染を有することが疑われる生物学的物質のサンプル中に請求項31に記載の抗体を導入すること、及び該抗体が該サンプル中の抗原と結合するか否かを決定することを含む、Candida属の微生物により引き起こされる感染を診断する方法。
- モノクローナル抗体mp58により認識されるC.albicans mp58マンノプロテイン由来のpH感受性炭水化物エピトープを含む、単離した免疫原性炭水化物部分。
- mp58に対する抗体を有することが疑われる生物学的物質のサンプル中に請求項41に記載の単離した炭水化物部分を導入して該炭水化物部分が該サンプル中の抗体と結合するか否かを決定することを含む、Candida albicansのmp58マンノプロテインに対する抗体の存在を検出する方法。
- 請求項41に記載の単離した炭水化物部分及び該部分への抗体による結合を検出するための手段を含む、診断キット。
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