KR20180064813A

KR20180064813A - 생체분자 결합용 연결펩티드

Info

Publication number: KR20180064813A
Application number: KR1020160165152A
Authority: KR
Inventors: 이준행; 이시은; 정광준; 탄웬지; 김수영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-06
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2018-06-15
Also published as: KR101953003B1; WO2018105858A1

Abstract

본 발명은 생체분자 결합용 연결펩티드에 관한 것으로서, 폐렴구균의 표면단백질인 PspA 단백질의 일부를 이용하여 말단에 생체분자를 결합시킴으로써 융합단백질 제조용으로 이용할 수 있는 연결펩티드를 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 융합단백질을 제조할 경우 상기 연결펩티드의 양 말단에 연결된 항체의 활성이 증진되므로 이를 효과적으로 생체분자의 연결펩티드로서 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

생체분자 결합용 연결펩티드{Linker peptide for binding biomolecule}

본 발명은 생체분자 결합용 연결펩티드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폐렴구균의 표면단백질인 PspA 단백질의 일부를 이용하여 말단에 생체분자를 결합시킴으로써 융합단백질 제조용으로 이용할 수 있는 연결펩티드에 관한 것이다.

백신보조제 플라젤린은 세균의 편모를 구성하는 성분이며, 선천성 면역계의 TLR(Toll-like receptor) 5의 리간드이다. 이러한 이유에서 플라젤린을 면역증강제로 이용하는 노력이 진행되고 있다. FlaB는 패혈증 비브리오균(Vibrio vulnificus) 플라젤린의 주요한 구성성분이다. 본 발명자들은 FlaB의 점막면역 백신보조제로서의 역할을 구명한 바 있다(특허문헌 1).

다른 지질 또는 당 기반의 면역증강제와는 달리, FlaB는 단백질로 구성되어 있다. 이와 같은 까닭에 유전자 클로닝 및 재조합 단백질 발현시스템을 이용하여 항원과 FlaB의 융합단백질의 제조가 용이하다. 본 발명자들은 FlaB-PspA 융합단백질 기반 백신이 FlaB와 PspA 혼합물 백신에 비해 높은 점막면역능 및 방어면역능을 보임을 증명한 바 있다(특허문헌 2).

그러나 PspA(Pneumococcal surface protein A)와 같이 재조합 단백질의 발현이 용이한 경우가 아닐 때(예: 친수성이 극히 낮아 재조합 단백질 발현시, 대부분이 봉입체(inclusion body) 분획으로 분리되거나, 재조합 융합단백질 정제시 단백질의 안정성이 낮아 쉽게 분해가 되는 등으로 인해 재조합 단백질 발현이 어려운 경우), 재조합 FlaB-항원 융합단백질의 수득이 극히 어렵거나 수율이 떨어지는 한계가 있었다.

아직 그 자세한 기전은 밝혀져 있지 않으나, 앞서 언급한 특정 단백질 고유의 성질 때문일 수도 있고, 재조합 단백질 발현 후의 구조적인 취약성으로 인해 쉽게 분해되는 등의 가설들이 제시되어 오고 있다.

한국등록특허 제10-0795839호(2008.01.11) 한국등록특허 제10-1130884호(2012.03.20)

본 발명자들은 융합단백질의 제조에 이용하기 위한 생체분자 결합용 연결펩티드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 표면단백질인 PspA 단백질의 일부를 이용하여 연결펩티드를 제조하였을 때 이에 결합된 생체분자의 활성이 증진됨을 규명하였다.

따라서 본 발명의 목적은, PspA 단백질로부터 유래한 생체분자 결합용 연결펩티드를 제공함에 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4, 10 또는 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 생체분자(biomolecule) 결합용 연결펩티드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연결펩티드의 양쪽 말단에 동일 또는 상이한 생체 분자가 각각 결합될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체분자는 단백질일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 상기 단백질은 항원, 항체, 효소, 기질, 리간드 및 수용체일 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 3, 9 또는 27로 표시될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열은 PspA(Pneumococcal surface protein A) 유전자의 일부일 수 있고, 상기 PspA는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 표면단백질인 PspA 단백질에서 α-helix 구조를 형성하는 N-말단 부위로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 연결펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 작동가능하게 연결된, 표적 생체분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명은 PspA 단백질로부터 유래한 생체분자 결합용 연결펩티드를 제공한다.

본 발명의 연결펩티드를 이용하여 융합단백질을 제조하면 상기 연결펩티드에 연결된 항원으로 인한 점막면역능 또는 방어면역능이 연결펩티드를 사용하지 않았을 경우에 대비하여 증진되므로 이를 효과적으로 생체분자의 연결펩티드로서 이용할 수 있다.

도 1은 FlaB-링커-FomA 융합단백질의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 FlaB-링커-FomA 및 FomA-링커-FlaB 융합단백질을 확인하기 위한 SDS 전기영동 및 웨스턴블로팅 결과이다.
도 3은 FlaB-linker-FomA 융합단백질의 생체활성을 비교한 그래프이다.
도 4는 FlaB-링커-Hgp44 및 Hgp44-링커-FlaB 융합단백질을 확인하기 위한 SDS 전기영동 및 웨스턴블로팅 결과이다.
도 5는 (A) FlaB-linker-Hgp44 및 (B) Hgp44-linker-FlaB 융합단백질의 생체활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 FlaB-linker-Hgp44 융합단백질 백신의 혈청내 항원 특이적 IgG와 IgA 항체 역가를 비교한 그래프이다.
도 7은 FlaB-linker-Hgp44 융합단백질 백신의 타액 내 항원 특이적 분비성 IgA 항체 역가를 비교한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 연결펩티드 선정

실시예 1-1. 12mer 아미노산 연결펩티드의 준비

융합단백질의 안정적인 3차원 구조의 형성을 도모하기 위하여 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 표면단백질인 PspA 단백질(서열번호 2)에서 α-helix 구조를 형성하는 N-말단 부위를 선정하였다. 12개의 아미노산으로 구성된 12mer 아미노산 연결펩티드를 준비하기 위하여 PspA 유전자(서열번호 1)의 5' 1번 내지 36번 뉴클레오티드 부위를 선정하였다(서열번호 3).

상기 12mer 아미노산 연결펩티드에 패혈증 비브리오균(Vibrio vulnificus) 편모의 소단위 단백질인 플라젤린의 주요한 구성성분인 FlaB를 추가적으로 포함하는 FlaB-12mer 연결펩티드의 핵산 절편을 얻기 위하여, 재조합 FlaB-PspA 단백질 발현용 플라스미드인 pCMM8208(특허문헌 2)을 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6로 표시되는 PCR 프라이머를 이용하여 FlaB-12mer 링커(이하 FlaB 12 C-term linker) 절편을 증폭하였다. 또한 12mer 링커-FlaB(이하 FlaB 12 N-term linker) 절편을 획득하기 위해 서열번호 7 및 서열번호 8(FlaB 3' 프라이머)로 표시되는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다(표 1, 도 1A).

대장균(Escherichia coli)에서 용이하게 발현시키기 위하여 상기의 FlaB 12 C-term 링커 PCR 증폭 핵산 절편과 NdeI과 NotI으로 제한효소 처리한 pTYB12 플라스미드(특허문헌 2, IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) 발현 벡터, Amp^R, New England Biolab, Inc.)를 각기 아가로스 전기영동하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. pTYB12 플라스미드는 N-말단 융합 발현 벡터로, 표적 단백질의 N 말단에 인테인(intein) tag:Ap^r가 융합되었다. 획득한 두 핵산 절편에 대해 연결효소(ligase)를 처리하여 연결(ligation)하였다(pCMM11201).

마찬가지로 대장균에서 용이하게 발현시키기 위하여 상기의 FlaB 12 N-term 링커 PCR 증폭 핵산 절편과 SalI과 PstI으로 제한효소 처리한 pTYB12 플라스미드를 각기 아가로스 전기영동하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 핵산 절편에 대해 연결효소를 처리하여 연결하였다(pCMM11202).

사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

서열 번호	명칭	서열
5	FlaB C-term linker 뉴클레오티드 증폭용 5' 프라이머(FlaB 5' 프라이머) (밑줄: 제한효소 NdeI 인식 부위)	gaattcatggcagtgaatgta aatacaa
6	FlaB 12 mer C-term linker 뉴클레오티드 증폭용 3' 프라이머	ggccgccgtctttctcagctttagactgactggctacgggagagtcgac
7	FlaB 12 mer N-term linker 뉴클레오티드 증폭용 5' 프라이머	tcgactctcccgtagccagtcagtctaaagctgagaaagacggc
8	FlaB N-term linker 뉴클레오티드 증폭용 3' 프라이머 (밑줄: 제한효소 PstI 인식 부위)	ctgcagttagcctagtagacttagcgc
11	FlaB 24 mer C-term linker 뉴클레오티드 증폭용 3' 프라이머	ggccgcctttcgcattcttagcatctttcttcgctgcatcatagtctttctcagctttagactgactggctacgggagag
12	FlaB 24 mer N-term linker 뉴클레오티드 증폭용 5' 프라이머	tcgactctcccgtagccagtcagtctaaagctgagaaagactatgatgcagcgaagaaagatgctaagaatgcgaaaggc
13	FlaB 36 mer C-term linker 뉴클레오티드 증폭용 3' 프라이머 (밑줄: 제한효소 NotI 인식 부위)	atagtttagcggccgccatca tctaaagccttttgagcatcttc
14	FlaB 36 mer N-term linker 뉴클레오티드 증폭용 5' 프라이머 (밑줄: 제한효소 SalI 인식 부위)	acgcgtcgactctcccgtagc cagtcagtctaaag

실시예 1-2. 24mer 아미노산 연결펩티드의 준비

상기 실시예 1-1.과 동일하게 수행하되, 24mer 아미노산 연결펩티드를 준비하기 위하여 pspA유전자의 5' 1번 내지 72번 뉴클레오티드 부위를 선정하였다(서열번호 9).

FlaB-24mer 연결펩티드의 핵산 절편을 얻기 위하여 서열번호 5 및 11로 표시되는 PCR 프라이머를 이용하여 FlaB-24mer 링커(이하 FlaB 24 C-term linker) 절편을 증폭하였다. 또한 24mer 링커-FlaB(이하 FlaB 24 N-term linker) 절편을 획득하기 위해 서열번호 12 및 서열번호 8로 표시되는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다(표 1).

대장균에서 용이하게 발현시키기 위하여 실시예 1-1.과 동일한 방법으로 수행하되, FlaB 12 C-term 링커를 FlaB 24 C-term 링커로 대체하여 연결한 플라스미드 pCMM11203, FlaB 12 N-term 링커를 FlaB 24 N-term 링커로 대체하여 연결한 플라스미드 pCMM11204를 제조하였다.

실시예 1-3. 36mer 아미노산 연결펩티드의 준비

상기 실시예 1-1.과 동일하게 수행하되, 36mer 아미노산 연결펩티드를 준비하기 위하여 pspA유전자의 5' 1번 내지 108번 뉴클레오티드 부위를 선정하였다(서열번호 27).

FlaB-36mer 연결펩티드의 핵산 절편을 얻기 위하여 서열번호 5 및 13으로 표시되는 PCR 프라이머를 이용하여 FlaB-36mer 링커(이하 FlaB 36 C-term linker) 절편을 증폭하였다. 또한 36mer 링커-FlaB(이하 FlaB 36 N-term linker) 절편을 획득하기 위해 서열번호 14 및 서열번호 8로 표시되는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다(표 1).

대장균에서 용이하게 발현시키기 위하여 실시예 1-1.과 동일한 방법으로 수행하되, FlaB 12 C-term 링커를 FlaB 36 C-term 링커로 대체하여 연결한 플라스미드 pCMM11205, FlaB 12 N-term 링커를 FlaB 36 N-term 링커로 대체하여 연결한 플라스미드 pCMM11206을 제조하였다.

실시예 2. FlaB-링커-FomA 융합단백질의 제조

실시예 2-1. FlaB-12mer 링커-FomA 융합단백질의 제조

융합단백질용 FomA 항원의 핵산 절편을 얻기 위하여 서열번호 15의 푸소박테리움 누클리아툼(Fusobacterium nucleatum) 균주의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 통해 fomA 증폭편을 획득하였다. 사용한 프라이머쌍은 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머이다(표 2).

서열 번호	명칭	서열
16	fomA 증폭용 5' 프라이머	catatgatggcagtgaatgtaaatac
17	fomA 증폭용 3' 프라이머	gcggccgcgaaacgtcactttcataccgg

FlaB-12mer 링커-FomA 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11201 플라스미드를 NotI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11207로 명명하였다.

FlaB-12mer 링커-FomA 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11207을 E. coli ER2566(New England Biolabs, Inc.)에 형질전환을 통해 도입하였다(도 1B). 클로닝한 균주를 앰피실린(ampicillin)이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 FlaB-12mer 링커-FomA를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 5 및 17로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11201로 명명하였다.

FlaB-12mer 링커-FomA 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11201 대장균에 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5 mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴 비드 칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합 단백질로부터 서열번호 18의 FlaB-12mer 링커-FomA 융합단백질들을 얻었다(도 1C). 분리된 단백질 내에 함유되어 있는 내독소(endotoxin)는 AffinityPak™ Detoxi Gel™ Endotoxin Removing gel(Pierece)을 이용하여 제거하였다.

실시예 2-2. FlaB-24mer 링커-FomA 융합단백질의 제조

실시예 2-1.에 따라 fomA 증폭편을 획득하였다. 또한 FlaB-24mer 링커-FomA 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11203 플라스미드를 NotI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11208로 명명하였다.

FlaB-24mer 링커-FomA 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11208을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 클로닝 결과를 확인하여 2 Kb 크기의 PCR 결과물을 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11202로 명명하였다.

FlaB-24mer 링커-FomA 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11202 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 19의 FlaB-24mer 링커-FomA 융합단백질들을 얻었다.

실시예 2-3. FlaB-36mer 링커-FomA 융합단백질의 제조

실시예 2-1.에 따라 fomA 증폭편을 획득하였다. 또한 FlaB-36mer 링커-FomA 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11205 플라스미드를 NotI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11209로 명명하였다.

FlaB-36mer 링커-FomA 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11209을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 클로닝 결과를 확인하여 2 Kb 크기의 PCR 결과물을 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11203로 명명하였다.

FlaB-36mer linker-FomA 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11203 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 20의 FlaB-36mer 링커-FomA 융합단백질들을 얻었다.

실시예 3. FlaB-링커-Hgp44 융합단백질의 제조

실시예 3-1. FlaB-12mer 링커-Hgp44 융합단백질의 제조

융합단백질용 Hgp44 항원의 핵산 절편을 얻기 위하여 서열번호 21로 표시되는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 균주의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 통해 hgp44 증폭편을 획득하였다. 사용한 프라이머쌍은 서열번호 22 및 서열번호 23과 같다(표 3).

서열 번호	명칭	서열
22	hgp44 증폭용 5' 프라이머	catatgagcggtaggccgaaattgtg
23	hgp44 증폭용 3' 프라이머	gtcgactcttttgccgttagctttgatctcc

FlaB-12mer 링커-Hgp44 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11201 플라스미드를 NotI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11210로 명명하였다.

FlaB-12mer 링커-Hgp44 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11210을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 FlaB-12mer 링커-Hgp44를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 5 및 23으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11204로 명명하였다.

FlaB-12mer 링커-Hgp44 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11204 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 24의 FlaB-12mer 링커-Hgp44 융합단백질들을 얻었다.

실시예 3-2. FlaB-24mer 링커-Hgp44 융합단백질의 제조

실시예 3-1.에 따라 Hgp44 증폭편을 획득하였다. 또한 FlaB-24mer 링커-Hgp44 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11203 플라스미드를 NotI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11211로 명명하였다.

FlaB-24mer 링커-Hgp44 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 pCMM11211을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 실시예 3-1.와 동일한 방법으로 클로닝 결과를 확인하여 2 Kb 크기의 PCR 결과물을 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11205로 명명하였다.

FlaB-24mer 링커-Hgp44 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11205 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 25의 FlaB-24mer 링커-Hgp44 융합단백질들을 얻었다.

실시예 3-3. FlaB-36mer 링커-Hgp44 융합단백질의 제조

실시예 3-1.에 따라 Hgp44 증폭편을 획득하였다. 또한 FlaB-36mer 링커-Hgp44 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11205 플라스미드를 NotI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11212로 명명하였다.

FlaB-36 mer linker-Hgp44 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 pCMM11212을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 실시예 3-1.와 동일한 방법으로 클로닝 결과를 확인하여 2 Kb 크기의 PCR 결과물을 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11206로 명명하였다.

FlaB-36mer 링커-Hgp44 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11206 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 26의 FlaB-36mer 링커-Hgp44 융합단백질들을 얻었다.

실시예 4. FomA-링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 4-1. FomA-12mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 2-1.에 따라 fomA 증폭편을 획득하였다. 또한 FomA-12mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11202 플라스미드를 SalI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11216로 명명하였다.

FomA-12mer 링커-FlaB 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11216을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 FomA-12mer 링커-FlaB를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 8 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11210로 명명하였다.

FomA-12mer 링커-FlaB 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11210 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 29의 FomA-12mer 링커-FlaB 융합단백질들을 얻었다.

실시예 4-2. FomA-24mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 2-1.에 따라 fomA 증폭편을 획득하였다. 또한 FomA-24mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11204 플라스미드를 SalI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11217로 명명하였다.

FomA-24mer 링커-FlaB 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11217을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 FomA-24mer 링커-FlaB를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 8 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11211로 명명하였다.

FomA-24mer 링커-FlaB 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11211 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 30의 FomA-24mer 링커-FlaB 융합단백질들을 얻었다.

실시예 4-3. FomA-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 2-1.에 따라 fomA 증폭편을 획득하였다. 또한 FomA-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11206 플라스미드를 SalI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11218로 명명하였다.

FomA-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11218을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 FomA-36mer 링커-FlaB 를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 8 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11212로 명명하였다.

FomA-36mer 링커-FlaB 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11212 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 31의 FomA-36mer 링커-FlaB 융합단백질들을 얻었다.

실시예 5. Hgp44-링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 5-1. Hgp44-12mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 3-1.에 따라 Hgp44 증폭편을 획득하였다. 또한 Hgp44-12mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11202 플라스미드를 SalI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11219로 명명하였다.

Hgp44-12mer 링커-FlaB 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11219을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 FomA-12mer 링커-FlaB 를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 8 및 22로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11213으로 명명하였다.

Hgp44-12mer 링커-FlaB 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11213 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 32의 Hgp44-12mer 링커-FlaB 융합단백질들을 얻었다.

실시예 5-2. Hgp44-24mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 3-1.에 따라 Hgp44 증폭편을 획득하였다. 또한 Hgp44-24mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11204 플라스미드를 SalI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11220로 명명하였다.

Hgp44-24mer 링커-FlaB 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11220을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 Hgp44-24mer 링커-FlaB 를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 8 및 22로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11214으로 명명하였다.

Hgp44-24mer 링커-FlaB 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11214 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 33의 Hgp44-24mer 링커-FlaB 융합단백질들을 얻었다.

실시예 5-3. Hgp44-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조

실시예 3-1.에 따라 Hgp44 증폭편을 획득하였다. 또한 Hgp44-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 제조를 위해 pCMM11206 플라스미드를 SalI으로 제한효소 처리하고 상기의 PCR 증폭편과 각기 아가로스 겔 전기영동 및 겔 회수법을 이용하여 각각의 핵산 절편을 획득하였다. 획득한 두 종류의 핵산 절편에 연결효소를 처리하여 연결을 수행하였으며, 획득한 재조합 플라스미드를 pCMM11221로 명명하였다.

Hgp44-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 발현균주 클로닝을 위해 상기 플라스미드 pCMM11221을 E. coli ER2566에 형질전환을 통해 도입하였다. 클로닝한 균주를 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말한 후, 생존한 균주를 클로닝된 균주로 선정하였다. 선정한 균주가 Hgp44-36mer 링커-FlaB 를 암호화하는 플라스미드를 갖고 있는지 확인하기 위하여 서열번호 8 및 22로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물이 2 Kb의 크기를 갖고 있는지 확인하고, 갖고 있는 것으로 확인된 클론에 대해 CMM11215으로 명명하였다.

Hgp44-36mer 링커-FlaB 재조합 융합단백질의 발현을 위해, CMM11215 대장균에 대하여 실시예 2-1.와 동일한 방법으로 서열번호 34의 Hgp44-36mer 링커-FlaB 융합단백질들을 얻었다.

시험예 1. FlaB-링커-FomA 융합단백질의 비교

시험예 1-1. FlaB-링커-FomA 융합단백질의 안정성 및 수율 비교

FlaB-링커-FomA 융합단백질을 항FlaB 혈청을 이용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)한 결과, FlaB 단독 대비 FomA-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 경우 훨씬 낮은 단백질 분해(degradation) 패턴을 보였다. 이는 해당 융합단백질이 FlaB 단독 대비 더 높은 안정성을 가짐을 의미한다(도 2).

FlaB-링커-FomA 융합 단백질의 1 L 배양 시 단백질 회수율은 하기의 표 4와 같다. FomA 단독 발현의 경우, 1 L 배양 시 0.6 mg을 회수한 반면, 연결펩티드의 삽입에 따라 그 수율이 1.12 내지 1.81 mg으로 2 내지 3배 증가함을 보였다.

FomA	Yield (mg/L)
FlaB-FomA	0.6
FlaB-12-FomA	1.82
FlaB-24-FomA	1.12
FlaB-36-FomA	1.2

시험예 1-2. FlaB-링커-FomA 융합단백질의 생체활성 비교

FlaB-링커-FomA 융합단백질이 플라젤린의 작용점인 TLR5에 대해 자극능을 보유하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 웰 평판 배양기에 293-T 세포를 1×10⁵ 세포씩 분주하여 하룻 저녁 배양한 후 이펙틴(Effectene, QIAGEN)을 이용하여 NF-κ-Luc 플라스미드(한양대학교 의과대학 미생물학교실의 김정목 교수로부터 획득), 패혈증 비브리오균 유래의 TLR-5 유전자가 클로닝된 p3xFlag-hTLR-5 플라스미드(미국 Wake Forest University School of Medicine, Department of Microbiology and Immunology의 Steven B. Mizel로부터 획득) 및 β-갈락토사다아제(β-galactosidase) 발현대조군 플라스미드(Clontech)를 동시에 세포 내로 도입시켰다.

24시간 추가 배양 후 새로운 배지로 교체하고 IMPACT-CN 시스템(NEB)으로 분리한 FlaB-링커-FomA 융합단백질 100 또는 250 ng을 일정시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 발광분석기(Luminometer, Berthold)를 이용, 측정하여 NF-κB의 전사정도를 확인하였다.

FlaB-링커-FomA 융합단백질의 경우 동일 용량 처리 FlaB 대비 유사하거나 2배까지 높은 TLR5 자극능을 보였다(도 3). 이는 FlaB-링커-FomA 융합단백질이 FlaB 단독 대비 유사하거나 더 높은 생체활성을 보유하고 있음을 시사한다.

시험예 2. FlaB-링커-Hgp44 융합단백질의 비교

시험예 2-1. FlaB-링커-Hgp44 융합단백질의 안정성 및 수율 비교

FlaB-링커-Hgp44 융합단백질을 항FlaB 혈청을 이용하여 웨스턴 블로팅 한 결과, FlaB 단독 대비 Hgp44-36mer 링커-FlaB 융합단백질의 경우 훨씬 낮은 단백질 분해 패턴을 보였다. 이는 해당 융합단백질이 FlaB 단독 대비 더 높은 안정성을 가짐을 시사한다(도 4).

FlaB-링커-Hgp44 융합 단백질의 1 L 배양 시 단백질 회수율은 하기의 표 5와 같다. Hgp44 단독 발현의 경우 1 L 배양 시 0.633 mg을 회수한 반면, FlaB를 포함하는 융합단백질을 발현시킨 경우, FlaB-Hgp44는 2 mg, Hgp44-FlaB는 1 mg으로 1.5 내지 3배의 수율 향상을 보였다. 또한, 연결펩티드의 삽입에 따라 FlaB-링커-Hgp44는 그 수율이 2 내지 2.5 mg으로 3 내지 4배로 증가함을 보였으며, Hgp44-링커-FlaB의 경우에도 수율이 1.5 내지 2 mg으로 2.5 내지 3배의 수율 향상을 보였다.

Hgp44	Yield (mg/L)
Hgp44	0.633
FlaB-Hgp44	2
FlaB-12-Hgp44	2
FlaB-24-Hgp44	2.5
FlaB-36-Hgp44	2.5
Hgp44-FlaB	1
Hgp44-FlaB	2
Hgp44-FlaB	1.5
Hgp44-FlaB	1.5

시험예 2-2. FlaB-링커-Hgp44 융합단백질의 생체활성 비교

시험예 2-1.과 동일한 방법으로 TLR5 자극능을 측정하였다. FlaB-링커-Hgp44 및 Hgp44-링커-FlaB 융합단백질의 경우 동일 용량을 각각 100, 250 ng씩 처리한 단독 FlaB 대비 2배 가량 높은 TLR5 자극능을 보였다(도 5). Y축은 대조군의 수치를 1로 두고 상대적인 발현 증가의 정도로서 표시하였다. 이는 FlaB-링커-Hgp44 및 Hgp44-링커-FlaB 융합단백질이 FlaB 단독 대비 유사하거나 더 높은 생체활성을 보유하고 있음을 시사한다.

시험예 2-3. FlaB-링커-Hgp44 융합단백질 기반 백신의 항체역가 비교

본 발명을 통한 FlaB-링커-Hgp44 융합단백질 기반 백신을 6주령 암컷 Balb/c 마우스(오리엔트바이오, 한국)의 비강 내로 1주 간격으로 3회, 5회 및 6회 면역한 후 혈청을 얻어 FlaB-링커-Hgp44 융합단백질 특이적인 항체의 형성을 비교하였다.

FlaB-링커-Hgp44 융합단백질 기반 백신 투여시, Hgp44 기반 백신에 비해 통계적으로 유의하게 높은 항원(Hgp44) 특이적 혈청 내 IgG 및 IgA의 역가상승(도 6) 및 항원 특이적 타액 내 분비성 IgA의 역가상승(도 7)을 보였다. 이는 FlaB-링커-Hgp44 융합단백질 기반 백신이 연결펩티드를 포함하지 않은 백신에 비하여 더 높은 효능을 갖는 것을 나타낸다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Linker peptide for binding biomolecule <130> PN160263 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 699 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 tctcccgtag ccagtcagtc taaagctgag aaagactatg atgcagcgaa gaaagatgct 60 aagaatgcga aaaaagcagt agaagatgct caaaaggctt tagatgatgc aaaagctgct 120 cagaaaaaat atgacgagga tcagaagaaa actgaggaga aagccgcgct agaaaaagca 180 gcgtctgaag agatggataa ggcagtggca gcagttcaac aagcgtatct agcctatcaa 240 caagctacag acaaagccgc aaaagacgca gcagataaga tgatagatga agctaagaaa 300 cgcgaagaag aggcaaaaac taaatttaat actgttcgag caatggtagt tcctgagcca 360 gagcagttgg ctgagactaa gaaaaaatca gaagaagcta aacaaaaagc accagaactt 420 actaaaaaac tagaagaagc taaagcaaaa ttagaagagg ctgagaaaaa agctactgaa 480 gccaaacaaa aagtggatgc tgaagaagtc gctcctcaag ctaaaatcgc tgaattggaa 540 aatcaagttc atagactaga acaagagctc aaagagattg atgagtctga atcagaagat 600 tatgctaaag aaggtttccg tgctcctctt caatctaaat tggatgccaa aaaagctaaa 660 ctatcaaaac ttgaagagtt aagtgataag attgatgag 699 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp Ala Ala 1 5 10 15 Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala Gln Lys 20 25 30 Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln 35 40 45 Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu 50 55 60 Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala Tyr Gln 65 70 75 80 Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met Ile Asp 85 90 95 Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn Thr Val 100 105 110 Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr Lys Lys 115 120 125 Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys Lys Leu 130 135 140 Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Thr Glu 145 150 155 160 Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala Lys Ile 165 170 175 Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu Lys Glu 180 185 190 Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe Arg Ala 195 200 205 Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser Lys Leu 210 215 220 Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu 225 230 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 tctcccgtag ccagtcagtc taaagctgag aaagac 36 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 5 gaattcatgg cagtgaatgt aaatacaa 28 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 6 ggccgccgtc tttctcagct ttagactgac tggctacggg agagtcgac 49 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 7 tcgactctcc cgtagccagt cagtctaaag ctgagaaaga cggc 44 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 8 ctgcagttag cctagtagac ttagcgc 27 <210> 9 <211> 72 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 9 tctcccgtag ccagtcagtc taaagctgag aaagactatg atgcagcgaa gaaagatgct 60 aagaatgcga aa 72 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 10 Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp Ala Ala 1 5 10 15 Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys 20 <210> 11 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 11 ggccgccttt cgcattctta gcatctttct tcgctgcatc atagtctttc tcagctttag 60 actgactggc tacgggagag 80 <210> 12 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 12 tcgactctcc cgtagccagt cagtctaaag ctgagaaaga ctatgatgca gcgaagaaag 60 atgctaagaa tgcgaaaggc 80 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 13 atagtttagc ggccgccatc atctaaagcc ttttgagcat cttc 44 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 14 acgcgtcgac tctcccgtag ccagtcagtc taaag 35 <210> 15 <211> 1053 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum <400> 15 aaagaggtta tgcctgcccc cactccggcg ccggagaaag tggtggaata cgttgaaaaa 60 ccagttatag tttaccgtga ccgcgaagta gcaccagcgt ggcgcccgaa tggttcagtg 120 gatgtacagt acagatggta tggagaagtg gagaagaaga acccgaaaga tgataaagat 180 gagaactggg ccacgggcaa agtgaatgcc ggtcgcctgc agaccttaac gaaggtaaac 240 tttactgaga aacaaacgtt agaagtgaga accagaaatc atcatacttt aaatgacacc 300 gatgcaaata acaaaaaatc aaatggcgcg gctgatgagt atcgcctgcg tcacttttac 360 aactttggta agctcggttc gtcaaaagtg aatgccacga gtcgggtaga gtttaagcag 420 aaaacgaatg acggcgaaaa aagcttggga gcaagcgtct tgtttgactt tgcagattat 480 atctattcta acaatttctt taaagtggat aaattgggcc tccgcccagg atataaatat 540 gtctggaaag ggcatggaaa tggtgaggag ggcaccccta ccgttcacaa cgagtatcat 600 ttagcatttg agtccgattt caccttaccg tttaacttcg ctctgaacct ggaatacgac 660 ctcagttata accggtaccg ggaaaagttt gagacaacag atgggctgaa gaaagctgaa 720 tggtacggcg agctgacagc ggtcctgtcg aactacacac ccctctataa agcaggggcc 780 ttcgaacttg gcttcaatgc tgagggtggc tacgacactt acaatatgca ccagtataag 840 aggattggtg gcgaggacgg aacttctgtc gaccgtcgtg actacgaact atatttagaa 900 cctacccttc aagtttccta taaaccaaca gatttcgtaa agctgtatgc ggcggcaggg 960 gctgactacc gtaatcgcat tactggcgaa agcgaagtta agcgctggcg atggcagcca 1020 acagcttggg ccggtatgaa agtgacgttt taa 1053 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 16 catatgatgg cagtgaatgt aaatac 26 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 17 gcggccgcga aacgtcactt tcataccgg 29 <210> 18 <211> 739 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 18 Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg 1 5 10 15 Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu 35 40 45 Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala 50 55 60 Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 34 His Ser Gly Gln Ala Glu Ile Val Leu Glu Ala His Asp Val Trp Asn 1 5 10 15 Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Ile Leu Leu Asp Ala Asp His Asp Gln Tyr 20 25 30 Gly Gln Val Ile Pro Ser Asp Thr His Thr Leu Trp Pro Asn Cys Ser 35 40 45 Val Pro Ala Asn Leu Phe Ala Pro Phe Glu Tyr Thr Val Pro Glu Asn 50 55 60 Ala Asp Pro Ser Cys Ser Pro Thr Asn Met Ile Met Asp Gly Thr Ala 65 70 75 80 Ser Val Asn Ile Pro Ala Gly Thr Tyr Asp Phe Ala Ile Ala Ala Pro 85 90 95 Gln Ala Asn Ala Lys Ile Trp Ile Ala Gly Gln Gly Pro Thr Lys Glu 100 105 110 Asp Asp Tyr Val Phe Glu Ala Gly Lys Lys Tyr His Phe Leu Met Lys 115 120 125 Lys Met Gly Ser Gly Asp Gly Thr Glu Leu Thr Ile Ser Glu Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Asp Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Gly Thr Lys Ile Lys 145 150 155 160 Glu Gly Leu Thr Ala Thr Thr Phe Glu Glu Asp Gly Val Ala Thr Gly 165 170 175 Asn His Glu Tyr Cys Val Glu Val Lys Tyr Thr Ala Gly Val Ser Pro 180 185 190 Lys Val Cys Lys Asp Val Thr 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Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser 820 825 830 Leu Leu Gly 835

Claims

서열번호 4, 10 또는 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 생체분자(biomolecule) 결합용 연결펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 연결펩티드의 양쪽 말단에 동일 또는 상이한 생체 분자가 각각 결합되는 것을 특징으로 하는 생체분자 결합용 연결펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질인 것을 특징으로 하는 생체분자 결합용 연결펩티드.
제 1 항의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
제 4 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 3, 9 또는 27로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
제 4 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 PspA(Pneumococcal surface protein A) 유전자의 일부인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
제 6 항에 있어서, 상기 PspA는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
제 4 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
제 8 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 연결펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 작동가능하게 연결된, 표적 생체분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 8 항 또는 제 9 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.