CN104262485B

CN104262485B - 罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN104262485B
Application number: CN201410149405.1A
Authority: CN
Inventors: 汪开毓; 贺扬; 陈德芳; 杨倩; 耿毅; 王二龙
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-04-15
Also published as: CN104262485A

Abstract

本发明公开了罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白氨基酸序列、编码基因、重组表达载体、重组表达载体的工程菌和罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法；本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM），分离纯化方便、操作简单、成本低廉、适合大规模扩大生产；产品经免疫新西兰兔获得了高效价、高特异性、高亲和性抗抗体，可用于ELISA和Western‑Blot的实验要求。本发明兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体的制备与特性分析，为罗非鱼病原菌和病毒的检测、疫苗的研制、免疫水平检测和免疫检测方法的建立都提供了重要的材料，具有重要的生产价值和广阔的应用前景。

Description

罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种通过原核表达来生产罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其该抗体的制备方法。

背景技术

罗非鱼（Tilapia）是一种淡水鱼类，属于丽鱼科（Cichlidae），是非洲和中东特有的鱼种，具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，现已经成为21世纪全球水产养殖业最重要的养殖品种之一。中国的罗非鱼养殖产量占世界的一半以上，每年罗非鱼出口额超过7亿美元，出口量超过20多万吨（折合活鱼60多万吨）。罗非鱼具有极强的抗病能力，曾被认为对细菌性、寄生虫性、真菌性和病毒性疾病都具有比其它鱼类更强的抵抗力。然而近年来，研究发现罗非鱼对某些细菌和寄生虫病原都表现敏感，如链球菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、小瓜虫、车轮虫、三代虫等。

免疫球蛋白是免疫系统中重要的组成成分，是病原诊断和疫苗评价的重要指标。罗非鱼IgM具有分泌型（Secretory form of IgM，sIgM）和膜结合型（Membrance-bound，mIgM）两种形式，其重链（IgH）由相同基因编码但编码的恒定区不完全相同。分泌型IgM具有4个恒定区，而膜结合型IgM则由3个恒定区和一个位于CH3下游的跨膜组成。sIgM由浆细胞产生分泌于血液和体液中，是机体进行体液免疫中的重要组成部分，在研究鱼类病害防治及免疫预防方面具有重要意义。目前，国内外关于抗罗非鱼IgM抗体甚少，虽然国外已有鼠抗罗非鱼IgM的单克隆抗体，但价格十分昂贵且保质期短。此外，自制单克隆抗体不仅技术要求高、实验仪器高而且成本昂贵；而直接从罗非鱼血清中提取IgM，不仅难以保证纯度，而且需要大量的血液，违背了动物福利。

发明内容

本发明的目的是提供一种原核表达罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM）的方法，采用该方法制备的dsIgM产量高、成本低、操作简单、免疫原性好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

1、一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体，该蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2、一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白的编码基因，该编码基因序列如SEQ IDNO.2所示。

3、一种含有编码基因的重组表达载体。

4、一种含有权利要求3中所述的重组表达载体的工程菌。

5、罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）将该截短重链恒定区基因（dsIgM）与pET32a构建为表达载体pET32a-dsIgM；

（2）将pET32a-dsIgM表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3),构建表达工程菌；

（3）发酵培养表达工程菌，进行IPTG诱导表达；

（4）发酵产物经亲和层析得到纯化的截短重链恒定区蛋白（dsIgM）；

（5）该dsIgM免疫新西兰兔，收集血清，用饱和硫酸铵法纯化兔抗dsIgM抗体；

（6）该兔抗dsIgM抗体作为Western-Blot一抗结合鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血清，测定其特异性；

（7）该兔抗dsIgM抗体用于非竞争ELISA，检测其亲和常数。

进一步的，所述步骤（1）包括：以罗非鱼血液为材料提取总RNA，以mRNA为模版合成第一条cDNA；

设计两条引物：

P1：5′-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3′

P2：5′-CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3′

其中下划线为BamHⅠ和xholⅠ酶切位点，以该cDNA为模版，通过PCR扩增得到编码sIgM的截短重链恒定区蛋白（dsIgM）的DNA片段，测序确认后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建表达载体pET32a-dsIgM。

进一步的，所述步骤（3）包括：采用LB培养基，37℃发酵培养表达工程菌至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h。

进一步的，所述步骤（6）包括：采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血液进行SDS-PAGE，运用Western-Blot检测兔抗dsIgM抗体的特异性。

进一步的，所述步骤（7）包括：用纯化罗非鱼血清作为抗原，按50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml和0.78μg/ml包被ELISA板，将步骤（5）中的兔抗dsIgM抗体按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800的比例倍比稀释作为一抗，羊抗兔IgG-HRP作为二抗，进行亲和常数测定。

本发明的有益技术效果是：本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM），分离纯化方便、操作简单、成本低廉、适合大规模扩大生产。产品经免疫新西兰兔获得了高效价、高特异性、高亲和性抗抗体，可用于ELISA和Western-Blot的实验要求。本发明兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体的制备与特性分析，为罗非鱼病原菌和病毒的检测、疫苗的研制、免疫水平检测和免疫检测方法的建立都提供了重要的材料，具有重要的生产价值和广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM）表达载体重组质粒pET32a-dsIgM的构建示意图；

图2是表达蛋白的SDS-PAGE图，其中蛋白MarkerIII的分子量大小为94KDa，（由上至下依次为94、60、45、27、18、）；1：纯化的dsIgM；2：pET32a诱导前对照；3：pET32a诱导后对照；4：pET32a-dsIgM诱导前对照；5：pET32a-dsIgM诱导后对照；

图3是免疫印迹分析兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体特异性，1：Marker；2：鲤鱼血清；3：鲫鱼血清；4：斑点叉尾鮰血清；5：罗非鱼血清；

图4是兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体亲和常数的测定，C=1800/(100×log₂X)，Y轴为OD值。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施实例1

本实施提供原核表达罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM）的方法，步骤如下所示：

（1）采集罗非鱼血液，采用总RNA提取试剂盒提取罗非鱼RNA。使用PrimeScript RTreagent Kit反转录试剂盒合成cDNA；

（2）选择sIgM重链区域CH1-4核酸序列，利用Primer5.0设计一对特异性引物，P1：5′-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3′，P2：5′-CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3′，上游引物包含BamHⅠ酶切位点，下游引物包含xholⅠ酶切位点，该引物可扩增出sIgM基因截短重链基因（dsIgM），片段大小为1338bp（序列如SEQ ID NO.2所示）；

（3）回收dsIgM基因的PCR产物，构建pMD19-T-dsIgM载体，克隆dsIgM基因后构建pET32a-dsIgM，转化入大肠杆菌BL21（DE3）(载体构建见图1)；

（4）含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养BL21-pET32a-dsIgM培养约3-4h至菌液OD₆₀₀值达到0.6，加入IPTG=1.0mM，进行诱导表达，4h后离心收集菌体，取表达产物加入5μL5×LoadingBuffer煮沸后取10μL进行SDS-PAGE电泳检测（蛋白表达见图2）；

（5）菌体超声破碎后，4℃，12000r/min离心10min，分别将表达蛋白可溶部分和包涵体溶解液溶解部分用镍离子柱亲和层析纯化，透析复性后，用核酸蛋白仪测定蛋白的浓度为2.19mg/ml，并将重组蛋白置-70℃保存备用。

实施例2

本实施提供兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体的制备方法，步骤如下所示：

（1）第一次免疫时，按lmg/只SPF新西兰兔的免疫剂量，取步骤（4）纯化的罗非鱼dsIgM与弗式完全佐剂混合，充分乳化后在新西兰兔足趾、脊部皮下进行多点注射免疫，10-14天后进行第二次、第三次免疫，第二、三次免疫是将纯化的dsIgM按2mg/只与等体积不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，在新西兰兔背部皮下多点注射，每次注射间隔7天。第四次是将纯化的dsIgM按2mg/只直接耳缘静脉注射；

（2）第四次免疫后3-4天，对免疫的新西兰兔进行心脏采血，收集、纯化得到兔抗罗非鱼dsIgM的多克隆抗体，浓度为1.800mg/ml。

实施例3

本实施提供Western-Blot检测兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体特异性的方法，步骤如下所示：

（1）采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰和罗非鱼血液，血液于37℃静置4h后凝固，5000r/min离心15min收集血清；

（2）上述血清运用12%浓度的凝胶进行SDS-PAGE，电泳分离后，转移至PVDF膜上，用3%BSA/TBST封闭，以本发明步骤（5）中兔抗dsIgM抗体为一抗1：1000稀释后，4℃孵育过夜；洗膜后，以羊抗兔IgG-HRP为二抗，37℃孵育1h；用DAB进行显色10min，ddH₂O终止显示反应。观察Western-blot结果，判断兔抗dsIgM多克隆抗体具有良好的特异性（Western-Blot见图3）。

实施例4

本实施提供兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体亲和常数的测定方法，步骤如下所示：

（1）收集罗非鱼血清，用亲硫树脂纯化罗非鱼IgM，用核酸蛋白仪测定IgM浓度；

（2）将纯化的罗非鱼血清用碳酸盐缓冲液稀释至50μg/ml、25ug/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml和0.78μg/ml，100μL/孔加入到96孔聚苯乙烯酶联反应板中，4℃包被过夜；

（3）用PBST洗涤包被板后，分别按1：100、1：200、1：400…1：6400…1：28400的比例倍比稀释本发明步骤（5）中兔抗dsIgM多克隆抗体，按100μL/孔加入上述96孔板；

（4）用PBST洗涤包被板后，加入1：2000稀释的羊抗兔IgG-HRP，100μL/孔，37℃作用30min；

（5）用PBST洗涤包被板后，加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应15min。加入2MH₂SO₄终止反应，100μL/孔，置酶标仪上测定每孔的OD_450nm值。

（6）运用EXCEL软件，以log₂（0.18/C）为X轴，OD_450nm值为Y轴，拟合结合反应曲线模型（拟合曲线见图4）。

（7）按照亲和常数Kaff=（n-1）/2(n[Ab’]t-[Ab]t)计算抗体相对亲和常数。式中，n=[Ag]_t/[Ag’]_t，其中[Ag]_t和[Ag’]_t为酶标板上每孔的固定化抗原浓度，[Ab]_t和[Ab’]_t为相应固化抗原浓度时最大吸光值一半（OD50和OD50’）时所对应的可测量抗体浓度。得出亲和常数kaff=1.179×10⁸L/mol。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体，其特征在于，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白的编码基因，其特征在于，该编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。

4.一种含有权利要求3中所述的重组表达载体的工程菌。

5.根据权利要求1所述罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将该截短重链恒定区基因与pET32a构建为表达载体pET32a-dsIgM；

(2)将pET32a-dsIgM表达载体转化入大肠杆菌BL21，构建表达工程菌；

(3)发酵培养表达工程菌，进行IPTG诱导表达；

(4)发酵产物经亲和层析得到纯化的截短重链恒定区蛋白；

(5)该dsIgM免疫新西兰兔，收集血清，用饱和硫酸铵法纯化兔抗dsIgM抗体；

(6)该兔抗dsIgM抗体作为Western-Blot一抗结合鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血清，测定其特异性；

(7)该兔抗dsIgM抗体用于非竞争ELISA，检测其亲和常数。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：以罗非鱼血液为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一条cDNA；

设计两条引物：

P1：5′-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3′

P2：5′-CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3′

其中下划线为BamHⅠ和xholⅠ酶切位点，以该cDNA为模板，通过PCR 扩增得到编码sIgM的截短重链恒定区蛋白的DNA片段，测序确认后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建表达载体pET32a-dsIgM。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：采用LB培养基，37℃发酵培养表达工程菌至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)包括：采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血液进行SDS-PAGE，运用Western-Blot检测兔抗dsIgM抗体的特异性。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)包括：用纯化罗非鱼血清作为抗原，按50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml和0.78μg/ml包被ELISA板，将步骤(5)中的兔抗dsIgM抗体按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800的比例倍比稀释作为一抗，羊抗兔IgG-HRP作为二抗，进行亲和常数测定。