CN103602684A - 提高外源蛋白表达的增强子样基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够在原核细胞提高外源蛋白表达的原核增强子样基因，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或其截短序列；通过构建融合表达报告基因重组载体筛选出该基因，融合报告基因由人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的截短序列L11和氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）组成，将待筛选基因片段和用于筛选的重组载体进行连接、转化并构建基因文库，通过提高氯霉素抗性筛选出含有增强子样基因序列的重组菌株，从而获得增强子样序列，该序列能提高融合报告基因重组菌株的氯霉素抗性及外源蛋白的表达水平。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高外源蛋白表达的增强子样基因序列，用于提高外源蛋白在原核细胞中的表达水平。
背景技术
目前，已经开发出的蛋白表达系统有多种，常用的有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统虽然研究较为成熟，但某些目的蛋白在其中的表达水平仍然很低；酵母表达系统也存在外源基因拷贝数低的问题；哺乳动物细胞表达系统更是存在外源基因不能持久表达、成本高及技术复杂的问题。因此，在这些常用的表达系统中，某些外源基因表达水平低仍然是亟待解决的难题。
增强子（enhancer，ER）是一类包含转录因子结合位点的顺式作用元件，对靶基因表达具有激活及增强作用，它的发现为提高外源基因表达水平提供了一个新的方向。随着对原核生物基因表达调控研究的深入，人们发现原核生物基因组中也存在着一些具有转录增强作用的调控模式，这类序列即称为增强子样序列（enhancer-Like sequence，ERLS）。常用于提高外源蛋白表达水平的方法主要有增加蛋白表达标签、优化外源基因表达所需的密码子以及增加表达系统中外源基因的拷贝数等，采用增强子样基因序列提高外源蛋白表达水平使用的还较少，而且很多未知的增强子样序列尚未被发现。
增强子长度通常为100-200bp，与启动子、绝缘子及沉默子等协同作用调控基因的时空表达。无方向性是它的一个重要作用特点，即无论位于启动子的上游或下游，均能激活其相应的启动子。这种增强活性主要体现在基因表达的水平上，目前已有少数增强子样序列应用于提高蛋白表达水平。
基因陷阱（gene trap）是研究基因调控元件与基因功能的一个有力工具。该方法已成功地应用于果蝇、小鼠、拟南芥等重要模式动植物功能基因组的研究（O’Brochta DA et aL, Proc NatL Acad Sci USA, 2011, 108(39): 16339-16344），并发现了大量新基因。本发明中，增强子样基因序列的筛选即采用了融合报告基因和基因陷阱的方法，将人乳头瘤病毒（Human Papilloma virus, HPV）58型主要衣壳蛋白L1基因的截短序列L11和氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）融合作为增强子样序列诱捕载体的报告基因，当增强子样序列插入后，菌株的氯霉素抗性提高，由此，通过增加氯霉素浓度进行大规模筛选，从而获得相应的能增强基因表达的序列。
现在已发现的增强子样序列主要应用于增强低分子量蛋白的表达上，如干扰素、白细胞介素等。本发明中所使用的融合报告基因可表达出较大的融合蛋白（55KDa），利用该报告基因筛选的序列也可构建出一种高分子量蛋白表达系统，从而解决一些高分子量蛋白在外源表达系统中产率低的难题。大肠杆菌是重要的基因工程菌，遗传背景清楚、操作简便、快速且成本低廉，成为筛选增强子样序列的首选。
发明内容
本发明旨在提供一种能够提高外源蛋白表达水平的原核增强子样基因，主要目的是要改进外源基因的原核表达系统，该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：1中的1~271bp所示的核苷酸序列。
本发明首先对来自于昆明市呈贡区居民生活污水样品和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂污水样品中的细菌进行富集，然后抽提细菌基因组样品并对其进行酶切，获得500bp以下的DNA片段，再将其构建到增强子样序列筛选重组质粒pET21a-CAT-L11的启动子上游，构建基因文库，通过融合的氯霉素抗性报告基因筛选含增强子样序列的菌株，最后对菌株的氯霉素抗性和增强子样序列来源进行分析并对其增强外源蛋白表达的能力进行检测。
本发明通过以下技术方案实现本发明目的：
（1）构建含融合报告基因的重组筛选菌株
对云南省第一人民医院（云南省昆华医院）宫颈癌患者的肿瘤组织样品进行处理后，抽提DNA，通过PCR方法获得人乳头瘤病毒HPV58型L1基因的截短序列L11，并构建成重组质粒pMD18T-L11，将L11片段从pMD18T-L11上酶切下来并通过胶回收纯化后，连接至含有报告基因CAT的重组质粒pET21a-CAT上，经酶切鉴定及测序验证，重组质粒pET21a-CAT-L11构建正确。然后采用热休克法将重组质粒pET21a-CAT-L11转化至大肠杆菌表达菌株中，获得重组筛选菌株pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）。
大肠杆菌表达菌株可选用E.coli BL21(DE3)、E.coLiBL21（DE3）pLys、Origami、Rosetta以及其它可用于表达外源蛋白的原核菌株；
（2）重组菌株抗氯霉素阈值和CAT- L11融合蛋白表达水平检测
在一定氯霉素浓度梯度的固体Amp+-LB培养基中，使用IPTG诱导重组筛选菌株pET21a-CAT-L11/BL21（DE3），通过记录生长的菌落数测定菌株的抗氯霉素阈值。同时也使用IPTG诱导液体培养的重组筛选菌pET21a-CAT-L11/BL21（DE3），通过SDS-PAGE检测融合蛋白CAT-L11的表达。
（3）基因文库构建与含增强子样基因序列菌株的筛选
对待筛选的各污水样品进行细菌富集后，获得菌体，按照《精编分子生物学实验指南》（科学出版社）中的细菌基因组DNA提取方法得到细菌基因组。利用限制性内切酶Sau3A
将得到的细菌基因组酶切至500bp以下的DNA片段，经胶回收后，将所得片段与重组质粒pET21a-CAT-L11（Bgl酶切后再去磷酸化）连接，即利用同尾酶互补连接，将待筛选序列构建到重组质粒的启动子上游，然后将其电转化到E.coli BL21（DE3）感受态，构建细菌基因组文库。之后，使用含高于抗氯霉素阈值的氯霉素选择性LB培养基筛选出含增强子样基因序列的重组菌株，对所得菌株进行提质粒并酶切鉴定，再使用氯霉素浓度梯度测定菌株的抗氯霉素阈值，含增强子样基因序列菌株的筛选即完成。
发明中所使用的表达载体可以是pET系列、pQE系列、pGEX系列、pMAL系列，以及其他原核表达载体。
（4）序列测定，同源性分析序列来源及其诱导蛋白表达增强活性分析
在增强子样基因插入位点的下游设计引物ENHP2，并将质粒和引物送至测序公司测序。利用DNAMAN（5.2.2版）对所测序列和原始载体序列进行比对，以确定插入序列。此外，再将所测序列在NCBI BlastN中进行同源性序列检索，分析序列来源。
使用IPTG诱导构建好的重组菌pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）和pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）表达蛋白，经SDS-PAGE再次检测ER3序列是否能够提高融合蛋白CAT-L11的表达水平。
本发明另一目的是将增强外源蛋白表达的原核增强子样基因应用在增强外源蛋白表达中，将所述增强子样基因插入到表达载体启动子的上游或下游的邻近位置，使其作用于该表达载体启动子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、在目前的表达系统中，经常会出现某些外源基因表达水平低的问题，使得这些基因工程产品的进一步开发受到限制，本发明ER3序列能够明显提高重组筛选菌株pET21a-CAT-L11对氯霉素的抗性，且能够显著增加人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因截短序列L11蛋白的表达。该序列具有增加较大外源基因在原核表达系统中蛋白表达水平的特性。
2、所用表达载体来自pET系列，ER3序列可用于原核表达系统的所有表达载体，提高了这一序列在各原核表达系统中应用的可能性，这对提高ER3序列的实用性具有重要意义。
附图说明
图1是本发明中重组质粒pET21a-CAT酶切鉴定电泳示意图，其中，泳道1：DNA Marker DL5000；泳道2：BamH
、Xho
双酶切1号菌落质粒pET21a-CAT ；泳道3：BamH
、Xho
双酶切2号菌落质粒pET21a-CAT。
图2是本发明中重组质粒pET21a-CAT-L11酶切鉴定电泳示意图，其中，泳道1：DNA Marker DL5000；泳道2-5：Nde
和Xho
双酶切1-4号菌落质粒pET21a-CAT-L11；泳道6：Nde和Xho
双酶切pET21a-CAT。
图3是本发明中诱导重组菌pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）表达CAT-L11融合蛋白的SDS-PAGE示意图，其中，泳道1：Protein Marker；泳道2：诱导前的pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）；泳道3：诱导后的pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）；泳道4：诱导前的BL21（DE3）；泳道5：诱导后的BL21（DE3）。
图4是本发明中Sau3A
酶切基因组并胶回收后的电泳示意图，其中，泳道1：DNA Marker DL2000；泳道2：回收的500bp以下DNA片段。
图5是本发明中重组质粒pET21a-CAT-L11-ER3的酶切鉴定图，图5A中，泳道1：DNA Marker DL5000；泳道2：EcoR
和Nde
双酶切pET21a-CAT-L11；图5B中，泳道1：DNA Marker DL5000；泳道2-4：EcoR
和Nde
分别双切1、2和3号单菌的pET21a-CAT-L11-ER3重组质粒。
图6是本发明中ER3增强CAT-L11融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1：Protein Marker；泳道2：诱导前的pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）；泳道3：诱导4h后的pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）；泳道4：诱导前的pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）；泳道5：诱导4h后的pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）；泳道6：诱导前的BL21（DE3）；泳道7：诱导4h后的BL21（DE3）。
图7是本发明中重组质粒pET21a-L11-ER34的酶切鉴定图，其中，泳道1：DNA Marker DL5000；泳道2-3：EcoR
和Nde
双酶切1号和2号菌的pET21a-L11-ER34重组质粒；泳道4：EcoR
和Nde
双酶切pET21a-L11重组质粒。
图8是本发明中诱导重组菌pET21a-L11-ER34/BL21（DE3）表达L11蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1：诱导前的pET21a-L11-ER34/BL21（DE3）；泳道2：诱导后的pET21a-L11-ER34/BL21（DE3）；泳道3：诱导前的pET21a-L11/BL21（DE3）；泳道4：诱导后的pET21a-L11/BL21（DE3）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述的内容；实施例中主要采用常规的基因工程分子克隆的生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略做修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1：构建pET21a- CAT-L11增强子样序列检测载体
取云南省第一人民医院宫颈癌患者的肿瘤组织，按《精编分子生物学实验指南》（科学出版社）动物组织基因组DNA提取方法提取样品基因组，经鉴定，该样品为人乳头瘤病毒HPV58型感染，使用引物L11P1：5’-GGA ATT CCA TAT GTC TGT TTG GAG ACC TTC-3’；L11P2：5’-CCG CTC AGA CAG TGA GTC TCC ATA AGG TTC-3’，通过PCR扩增获得HPV58型L1基因的截短序列L11，构建成pMD18T-L11重组质粒（pMD18T载体购买于TAKARA公司，CK5601C），将该质粒转化至大肠杆菌DH5α（DH5α购买于TAKARA公司，D9057），并于37℃振荡培养重组菌pMD18T-L11/DH5α，16h后使用质粒小量提取试剂盒（购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP101-2），按照质粒抽提说明抽提质粒。
氯霉素抗性基因CAT来自pACYC184载体（购买于New England BioLabs公司，VKN0287），通过PCR扩增获得，其上游引物为CAT P1：5’-TAG CGC GGC CGC AGA GCT CAT GGA GAA AAA AAT CAC TG- 3’，其下游引物为CAT P2：5’-CCG CTC GAG TTA CGC CCC GCC CTG CCA CTC- 3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将所获得的PCR产物纯化后回收，取1μg于37℃利用限制性内切酶BamH
（购买于TAKARA，CKB701A）和Xho
（购买于TAKARA，CK2401B）各10U进行双酶切，酶切过夜后，通过琼脂糖胶回收试剂盒（购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP202-02）回收CAT基因，然后利用相同的酶切位点将回收的CAT基因连接至pET21a（购买于Novagen，69740-3），经酶切鉴定及测序验证，重组载体pET21a-CAT构建正确（见图1）。
分别用10U BamH
（来源于TAKARA，CKB701A）和10U Nde（来源于TAKARA公司，CKB701A）于37℃酶切质粒pMD18T-L11和pET21a-CAT，酶切4h后，分别进行胶回收；取L11和pET21a-CAT酶切纯化片段各100ng以及1μL T4 DNA连接酶（来源于TAKARA，CK5021B）于20μL体系中，16℃连接过夜；通过热休克法将连接产物转化至CaCl2法制备的E.coliDH5α，转化产物涂布于Amp+-LB选择性平板上，37℃培养16h，挑取单菌落并接种于Amp+-LB抗性培养液中增菌，使用质粒抽提试剂盒提取质粒，最后使用Nde
和Xho
（来源于TAKARA，1094A）双酶切鉴定重组质粒，琼脂糖凝胶电泳观察，获得了预期大小的片段（见图2），同时，测序结果也表明重组质粒pET21a-CAT-L11构建成功。
实施例2：重组菌抗氯霉素阈值和L11-CAT融合蛋白表达水平检测
取10ng增强子样序列检测质粒pET21a-CAT-L11与100μL E.coli BL21（DE3）（购买于Novagen公司，69450-3）感受态混匀，冰水浴30min，42℃温水浴2min进行热休克，然后加入1ml LB培养液，37℃振荡培养45min，离心后弃掉大部分上清并重悬菌体，涂布于Amp+-LB固体培养皿中，于37℃培养12-16h，获得重组筛选菌株pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）；挑取该单菌落接种到Amp+-LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，再按1％的比例接种到Amp+-LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.5，对菌液进行105倍和106倍稀释后，取100μL直接涂布在含有1mM IPTG、50μg/ml Amp+以及不同氯霉素（Cam+）浓度梯度的双抗性固体培养基上，经三次以上重复测定pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）重组菌株的抗氯霉素阈值在34μg/ml（见表1重组菌氯霉素抗性生长终浓度检测结果）。
另外再挑取上述单菌落，将其接种到Amp+-LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，再按1％的比例接种到Amp+-LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.5，取适量菌液作为诱导前样品，之后，在剩余的菌液中加入1M IPTG至终浓度为1mM，37℃继续培养，诱导蛋白表达，诱导4h后取出适量样品进行SDS-PAGE检测融合蛋白CAT-L11的表达水平，结果显示该蛋白有明显的表达（见图3）。
实施例3：基因组提取、酶切及文库构建
来自于昆明市呈贡区居民生活污水和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂的污水样品经振荡混匀后，取150μL加入15ml牛肉膏蛋白胨液体培养基内，于37℃振荡培养16h，培养液分装至10ml离心管，12000g×2min离心，弃上清，并用2ml TE缓冲液将菌体重悬，加入10％的SDS 180μL以及20mg/ml的蛋白酶K 12μL，混匀后于37℃孵育1h，再加入5M的NaCl 600μL并充分混匀，加入CTAB/NaCl溶液400μL，于65℃孵育10min；加入等体积的氯仿，充分混匀后，12000g×5min离心，取上清，加入等体积的酚/氯仿混合液混匀，12000g×5min离心，取上清并分装至1.5ml的离心管中，700μL/管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，于-40℃静置30min，12000g×10min离心，弃上清，然后依次用70％和100％的冰乙醇各1ml漂洗所得沉淀，在室温条件下，乙醇挥发完全后，再加入50μL TE缓冲液将沉淀溶解，最后加入2μL RNase(5mg/ml)消化20min，基因组制备完成。
取上述制备的基因组DNA 1μg，用限制性内切酶Sau3A
(购买于TAKARA，CKA1018) 0.5U于37℃部分酶切1h，回收500bp以下DNA片段（见图4）；取10μL酶切并回收的基因组片段，以及300ng经Bgl
酶切、FastAP（来源于Fermentas，00087733）去磷酸化后回收的pET21a-CAT-L11片段，用1μL T4 DNA连接酶于16℃连接过夜；连接产物经乙醇沉淀纯化后，通过电穿孔法将其转化至E.coliBL21（DE3）感受态，电穿孔条件如下：电压1.8KV，电极杯1mm，电容2.5μF、电阻200Ω，电转化后立即加入900μL冰冷的SOC培养基，混匀，于37℃振荡培养30min，将转化产物涂布于6个Amp+-LB抗性平板上，37℃培养16h后记录菌落生长数目，再利用10ml Amp+-LB液体培养基将平板上菌落洗脱下来并装入15ml离心管，即文库细菌，于-40℃保存。
实施例4：含增强子样序列的菌株筛选及其抗抗生素活性增强测定
取保存的文库细菌10μL，利用LB液体培养基进行10倍梯度稀释，取稀释了1000倍的菌液100μL涂布于含有1mM IPTG、50μg/ml Amp+和102μg/ml Cam+的LB固体选择性培养基进行筛选，同时涂布新鲜培养的pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）作为阴性对照；37℃培养过夜后，获得能够在高于抗氯霉素阈值条件下生长的单菌落，命名为pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）。 挑取该单菌落并接种于Amp+-LB培养基中，于37℃振荡培养过夜，保存菌株。
采用与实施例2检测抗氯霉素阈值相同的方法测定通过氯霉素抗性筛选出的菌株pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）的抗氯霉素阈值，结果测出pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）的抗氯霉素阈值为374μg/ml，对氯霉素的抗性提高了10倍（见表1）。提取该菌株的质粒pET21a-CAT-L11-ER3，使用EcoR
（购买于TAKARA，1042A）和Nde双酶切鉴定重组质粒是否已插入基因序列，琼脂糖凝胶电泳观察表明，重组质粒中含有ER3插入序列（见图5）。
表1：重组菌氯霉素抗性生长终浓度检测结果
注：每个培养平板的氨苄青霉素浓度固定为50μg/ml。
实施例5：序列测定及同源性分析序列来源
设计一条测序引物ENHP2，引物序列为：5’-GAG GGG AAT TGT TAT CCG CTC AC-3’，该引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，用于检测插入的增强子样序列。重组质粒pET21a-CAT-L11-ER3的测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。使用DNAMAN（5.2.2版）对所测序列进行比对，确定ER3的基因序列为SEQ ID NO：1，然后将该序列在NCBI BLastN上进行同源性序列检索分析，结果表明所得ER3序列与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）NC7401的序列同源性最高，达到71％。
实施例6：原核增强子样基因序列ER3增强蛋白表达能力检测
将实施例4筛选到的重组菌pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）单菌落接种于Amp+-LB培养基中，于37℃培养过夜，然后按1％的比例转接到Amp+-LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.5，取适量菌液作为诱导前样品，在剩余的菌液中加入1M IPTG至终浓度为1mM，37℃继续培养，诱导蛋白表达，诱导4h后取出适量样品进行SDS-PAGE检测融合蛋白CAT-L11的表达水平，以重组菌pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）作为阴性对照，结果显示该蛋白表达水平明显增加（见图6）。在进行3次独立重复试验后，利用imageJ软件分析融合蛋白占全菌蛋白的百分含量，结果表明重组菌pET21a-CAT-L11-ER3/BL21（DE3）和pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）被诱导4h后，融合蛋白CAT-L11占全菌蛋白的百分含量分别为13.07％和5.77％，即融合蛋白的表达水平提高了2.26倍（见表2，重组菌表达CAT-L11蛋白占全菌蛋白百分含量）。
表2：重组菌表达CAT-L11蛋白占全菌蛋白百分含量
实施例7：ER3基因的截短序列能够增强蛋白的表达
通过PCR方法对ER3基因进行不同程度的截短。将其中1-271bp的截短序列命名为ER34，使用PCR方法获得该截短序列，扩增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上游引物为ER34P1：5’- GAA GAT CTG ATC CAT TTA TTT GAA CCA T-3’，下游引物为ER34P2：5’-GA A GAT CTG CTG CTG GAT CAG CTT GG-3’，引物两端均设计了Bgl
酶切位点（画横线部分）。使用10U的Bgl于37℃酶切1μg PCR产物，酶切3h后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收ER34片段，再取经相同酶切，并被去磷酸化的pET21a-L11片段100ng，于16℃连接过夜，热休克法转化至E.coliDH5α感受态，获得pET21a-L11-ER34/DH5α重组菌，增菌后提取质粒，经酶切鉴定（见图7）及测序表明该载体构建成功。
将重组质粒pET21a-L11-ER34和pET21a-L11分别转化至E.coli BL21（DE3），挑取pET21a-L11-ER34/BL21（DE3）和pET21a-L11/BL21（DE3）单菌落，分别接种到Amp+-LB培养液中，于37℃振荡培养过夜，第二天按照1％的比例将过夜培养物分别接种到5ml新鲜的Amp+-LB中，37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取出适量菌液作为诱导前样品，之后再加入1M的IPTG至终浓度为1mM，在37℃下诱导蛋白表达，4h后取出适量菌液作为诱导后样品进行SDS-PAGE检测，结果发现菌株pET21a-L11-ER34/BL21（DE3）较pET21a-L11/BL21（DE3）诱导表达的L11蛋白增多（见图8），并且通过三次重复试验结果表明pET21a-L11-ER34/BL21（DE3）和pET21a-L11/BL21（DE3）诱导表达的L11蛋白分别占全菌的15％和6.5％，即蛋白表达提高了1.3倍，所以ER3基因的截短序列ER34同样能够增强L11蛋白的表达。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 提高外源蛋白表达的增强子样基因及其应用
<160> 8
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 317
<212> DNA
<213> 污水混合细菌
<400> 1
gatccattta tttgaaccat ttcagccgtt tgctgttttt ttacaaacgg atttttttct 60
acaaaggaat caattgactt ttgatttact tctcctgcat gcatttgtac gaagtgcggt 120
gcgtttgata ctttaaccaa ttgatccaac atgctaccgc cgcatttaat tacgatataa 180
tcactcatct tctctctcct tatgtacgat aacaagcgtt tatttttaca taatcataac 240
ttaagtcgca tccccaagct gatccagcag catgagacca gcctgagctg gatgtttgcc 300
tggcacatca ttcagcagtt tggcctgggg attatcattg gcctggctgg cggttatctg 360
ctgcaacaga t 371
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaattccat atgtctgttt ggagaccttc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgctcagac agtgagtctc cataaggttc 30
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagcgcggcc gcagagctca tggagaaaaa aatcactg 38
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgctcgagt tacgccccgc cctgccactc 30
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaggggaatt gttatccgct cac 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaagatctga tccatttatt tgaaccat 28
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaagatctgc tgctggatca gcttgg 26
Claims (2)
1.一种提高外源蛋白表达的增强子样基因，其核苷酸序列选自：
（1）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
或者（2）如SEQ ID NO：1中的1~271bp所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的提高外源蛋白表达的增强子样基因在增强外源蛋白表达中的应用，其特征在于：将所述增强子样基因插入到表达载体启动子的上游或下游的邻近位置，使其作用于该表达载体启动子。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20150520 Termination date: 20201122 |