JP2018164456A - Gタンパク質共役型受容体変異体及びその選択方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の第一の態様は、増大した安定性を有するGタンパク質共役型受容体(GPCR)変異体を選択するための方法であって、
(a)親GPCRの1つ又は複数の変異体を提供する工程、
(b)親GPCRが特定の立体構造を備えている際に前記GPCRに結合するリガンドを選択する工程、
(c)前記選択したリガンドの結合に関する親GPCRの安定性と比較して、前記GPCR変異体又はその各々が前記リガンド結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、並びに
(d)前記選択したリガンドの結合に関して、親GPCRと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
を含む、方法を提供する。
(a)親GPCRの1つ又は複数の変異体を提供する工程、
(b)親GPCRが特定の立体構造を備えている際に前記GPCRに結合するリガンドを選択する工程、
(c)前記選択したリガンドの結合に関する同じ特定の立体構造を備えた親GPCRの安定性と比較して、前記GPCR変異体又はその各々が、特定の立体構造を備えている際に、前記リガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、並びに
(d)前記選択したリガンドの結合に関して、親GPCRと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
を含む、方法を含む。
1.例えば結合分析、機能分析、又は分光分析によって根拠付けられる共通の薬理学的分類を有する、化学的に異なるリガンドのセット(例えば、n=2から5)を選択する工程(これらのリガンドは、例えば野生型受容体及び/又は変異型受容体を使用する競争結合試験並びに/或いはそれらが共通のファーマコフォアを表わす必要は無いが分子モデリングによって根拠付けられるように、受容体の共通の空間的領域に結合すると解されるべきである);
2.安定性を増大することが意図される1つ又は複数の受容体変異体を作製し、リガンドセットの全てを使用してタイト結合についてアッセイする工程(前記アッセイは、平行、多重、又は連続的に為されてよい);
3.例えば、各リガンドについての結合等温線の測定によって、及びリガンドを用いた安定性のシフトの測定によって(典型的には、野生型と比較してウィンドウが狭い)、安定化された受容体変異体の確実性を確認する工程
を使用して当該リスクを軽減してよい。
(a)本発明の第一の態様に係る方法を実施する工程、
(b)増大した安定性について選択された1つ又は複数のGPCR変異体中の1つ又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定する工程、及び
(c)同定した位置の1つ又は複数に変異を含むGPCR変異体を合成する工程
を含む、方法を提供する。
β−アドレナリン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アドレナリンに結合する。
アデノシン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アデノシンに結合する。
ニューロテンシン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ニューロテンシンに結合する。
ムスカリン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ムスカリンに結合する。
(i)第一の親GPCRと比較して増大した安定性を有する第一の親GPCRの1つ又は複数の変異のアミノ酸配列において、1つ又は複数の変異体が第一の親GPCRと比較して少なくとも1つの異なるアミノ酸残基を有する、1つ又は複数の位置を同定する工程、及び
(ii)対応する1つ又は複数の位置において、第二のGPCRを規定するアミノ酸配列に1つ又は複数の変異を作製し、第二の親GPCRと比較して増大した安定性を有する第二の親GPCRの1つ又は複数の変異体を提供する工程
を含む、方法を提供する。
(i)第一の親GPCRと比較して増大した安定性を有する第一の親GPCRの1つ又は複数の変異体を提供する工程、
(ii)1つ又は複数の変異体が第一の親GPCRと比較して少なくとも1つの異なるアミノ酸残基を有する、1つ又は複数の構造モチーフを構造膜タンパク質モデルにおいて同定する工程、及び
(iii)第二の親GPCRにおける1つ又は複数の対応する構造モチーフを規定するアミノ酸配列における1つ又は複数の変異を作製し、第二の親GPCRと比較して増大した安定性を有する第二の親GPCRの1つ又は複数の変異を提供する工程
を含む、方法を提供する。
(I)特定の立体構造を備えた第二の親GPCRに結合するものであるリガンドを選択する工程、
(II)第二の親GPCRの変異体又はその各々が、特定の立体構造を備える際に、同じ特定の立体構造を備えている第二の親GPCRのリガンド結合についての安定性と比較して、選択したリガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、及び
(III)選択したリガンドの結合に関して第二の親GPCRと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
をさらに含む。
u 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 及びMet 384の任意の1つ又は複数に対応する位置に少なくとも1つの異なるアミノ酸を有するGPCR変異体である。
(実施例1)
界面活性剤耐性形態におけるβ−アドレナリン受容体の立体構造安定化
要約
ヒトゲノムによってコードされる500超の非嗅覚Gタンパク質共役型受容体(GPCR)が存在し、その多くが潜在的な治療標的であると予測されているが、ファミリーの全てを代表するものとしてウシロドプシンのみの構造が利用可能である。GPCR構造決定における進歩の欠落には多数の理由が存在するが、本発明者は、これらの受容体の界面活性剤安定性を改善すること、及び同時にそれらを1つの好ましい立体構造に固定化することが、結晶化の可能性を大幅に改善するであろうと仮説を立てた。GPCR、すなわちβ−アドレアンリン受容体の界面活性剤可溶化熱安定化変異体の単離のための一般的な戦略は、アラニンスキャニング変異誘発、それに続く受容体安定性のアッセイに基づいて開発した。試験した318の変異体のうち、15が安定性における測定可能な増大を示した。最初の変異部位の各々におけるアミノ酸の最適化の後に、最適に安定化した受容体を特定の変異を組み合わせることによって構築した。最も安定な受容体変異体であるβAR−m23は、6つの点変異を有し、天然のタンパク質よりも結合したアンタゴニストの存在下で21℃高いTmを生じさせ、βARm23はウシロドプシンと同程度に安定であった。加えて、βAR−m23は広範な界面活性剤において顕著により安定で、結晶化に理想的であり、リガンドの不在下においてアンタゴニスト立体構造で好適に存在した。
β1アドレナリン受容体の熱安定性を増大する単一変異の選択
シチメンチョウ赤血球由来のβARはよく特性決定されており、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞において高レベルで発現されるため、構造研究に理想的な対象である(非特許文献10、11)。βARの最も良好な過剰発現は、残基34−424を含有する受容体の切断型を使用して得られ(βAR34−424)(非特許文献9)、これが本研究の出発点として使用された。アラニンスキャニング変異誘発を使用して、変異した際に、受容体の熱安定性を変化させるβAR34−424におけるアミノ酸を規定した;アラニンが配列中に存在する場合には、ロイシン残基に変異させた。全部で318の変異をアミノ酸残基37−369、7つの膜貫通ドメインを含む領域、及びC末端の23アミノ酸残基に作製した;15アミノ酸残基における変異は、DNA鋳型における強力な二次構造によって得られなかった。各変異体の配列決定をして所望の変異のみが存在することを確認した後に、受容体を大腸菌において機能的に発現させ、安定性についてアッセイした。
最初に、βARの一次アミノ酸配列において互いに隣接する、熱安定性を改善した変異を組み合わせた。G67A及びR68Sという変異又はヘリックス5の末端の変異の異なる組み合わせ(Y227A、R229Q、V230A、及びA234L)を含有する構築物を発現させて、アッセイした;Tm値(結果示さず)は、βAR34−424のTmよりも1から3℃のみ高く、1つの変異は実際には僅かにより安定でないものであり、一次アミノ酸配列において互いに隣接する変異の組み合わせは大きく熱安定性を改善するものではないことが示唆された。続いて、構造において互いに離れていると予測された変異を組み合わせた。各種のプライマー混合物を使用してPCR反応を実施し、無作為な様式で5つの異なる変異を組み合わせ、次いで、熱安定性について試験した(表1)。これらの組み合わせの最も良好なものは、βAR34−424のTmと比較して10℃より大きくTmを増大させた。幾つかの場合では、個々の変異の連続的な包含でTmに対しては相加的な効果が明らかに存在した。これは一連の3つの変異体、m4−1、m4−7、及びm4−2において認められ、m4−1に対するV230Aの付加はTmを2℃増大させ、m4−7におけるD332Aという付加的な変異はTmをさらに3℃増大させる。Y227A及びM90Aを含有する変異体の全ては、10℃以上のTmの増大を示した。これらの2つの変異が共に、βAR34−424のTmを13℃まで増大させたが(m7−5)、アンタゴニスト結合全体はβAR34−424の50%であり、これらの変異体の発現低下が示唆された。m7−5に対するF338Mの添加は熱安定性を増大しなかったが、大腸菌における機能的な発現のレベルを増大させた。
6種の変異の効果を同定するためにβAR−m23及びβAR34−424について測定した3種の特徴的な活性は、アンタゴニスト結合の親和性、アゴニスト結合の相対的な効果、βAR−m23のGタンパク質への結合能であった。アンタゴニストである[3H]−ジヒドロアルプレノロール(図8)を使用した膜への飽和結合実験は、βAR−m23に対する結合の親和性(KD6.5±0.2nM,n=2)がβAR34−424(KD2.8±0.1nM,n=2)よりも僅かに低いことを示し、アンタゴニスト結合立体構造ではβARm23の構造に大きなゆらぎが存在することを示唆している。このことは、βAR−m23における変異のいずれも、リガンド結合に関与すると解されているアミノ酸に相当するものではないことと一致する。アンタゴニスト結合と対照的に、βAR−m23によるアゴニスト結合の効果は、βAR34−424よりも3桁弱いものである(図5)。アゴニストであるイソプレナリンの有効性は、天然のアゴニストであるノルエピネフリンよりも、βAR−m23及びβAR34−424において一貫して低く、当該2つの受容体のアゴニスト結合立体構造は類似している可能性を示唆する。しかしながら、βAR34−424と比較した際のβAR−m23におけるアゴニストの効力における大きな低減は、βAR−m23における6種の変異が、アンタゴニストが結合した立体構造に選択的に固定化されていることを示唆する。立体構造の予測からすると、このことは、回折に使用し得る品質の結晶の生産のために立体構造が均一なタンパク質集団を有することが重要であるため、熱安定性に予期せぬ利点を加える。
シチメンチョウβ−アドレナリン受容体の幾つかの異なる構築物を結晶化する以前の試みは失敗した。各種の条件で実験したにもかかわらず、天然の配列並びに幾つかの切断型及びループ欠失構築物の双方の使用によっては、長年に亘って、結晶が得られなかった。
材料
シチメンチョウ由来の切断型のβ1アドレナリン受容体(βAR34−424)(非特許文献9)は、Dr Tony Warne(MRC Laboratory of Molecular Biology,Cambridge,UK)によって快く提供された。34−424残基をコードするβAR構築物は、C116L変異を含有して発現を改善し(非特許文献11)、精製のために10ヒスチジンのC末端タグを含有している。1−[4,6−プロピル−3H]−ジヒドロアルプレノロール([3H]−DHA)はAmersham Bioscienceによって提供され、(+)L−ノルエピネフリン酒石酸水素塩、(−)イソプレナリン塩酸、(−)アルプレノロール酒石酸塩、及びs−プロプラノロール塩酸はSigmaからのものである。
βAR cDNAは、pRGIIIにライゲートし、MalE融合タンパク質としての大腸菌におけるβARの機能的な発現を可能にした(非特許文献16)。変異体は、QuikChange II方法(Stratagene)を用いて、発現プラスミドを鋳型として使用してPCRによって産生した。PCR反応物は、XL10−Gold ultracompetent cell(Stratagene)に形質転換し、個々のクローンを完全に配列決定して、所望の変異のみが存在していることを調べた。異なる変異は、以下の変異:Mut4、G67A、G068A、V230A、D322A、及びF327A;Mut6、R068S、Y227A、A234L、A282L、及びA334L;Mut7、M90V、I129V、Y227A、A282L、及びF338M;Mut10、R68S、M90V、V230A、F327A、及びA334Lを導入する全てのペアのプライマーを含めることによって、PCRによって無作為に組み合わせた。PCR混合物を形質転換して、クローンは配列決定して変異が確かに導入されていることを測定した。
βAR及び変異体の発現は、XL10細胞(Stratagene)において実施した。50mlのアンピシリン含有(100μg/ml)2×TY培地の培養物を、OD600=3まで浸透しながら37℃で増殖させ、次いで、0.4mM IPTGを用いて誘導した。誘導した培養物は、4時間に亘って25℃でインキュベートし、次いで、細胞を13,000×gで1分に亘って遠心分離することによって回収し(2mlの一定分量)、−20℃で保存した。アッセイに関しては、細胞を凍結融解(5サイクル)によって破砕し、500μlの緩衝液[20mM Tris pH8、0.4M NaCl、1mM EDTA、及びプロテアーゼインヒビター(Complete(商標)、Roche)]に再懸濁した。100μg/mlリソザイム及びDNアーゼ I(Sigma)を用いて4℃で1時間に亘ってインキュベートした後に、氷上で30分に亘ってサンプルを2%DDMに可溶化した。不溶性物質を遠心分離(15,000×g、2分、4℃)によって除去し、上清を放射リガンド結合アッセイに直接使用した。
単独の点の結合アッセイは、120μlの終濃度において、20mM Tris pH8、0.4M NaCl、1mM EDTA、0.1%DDM(又は対応する界面活性剤)を50nM[3H]−DHA及び20から100μgの膜タンパク質と共に含有した;平衡化は1時間、4℃であった。30分間に亘って特定の温度で[3H]−DHAを使用して又は使用せずに、結合アッセイ混合物をインキュベートすることによって、熱安定性を評価した;反応は氷上で実施し、必要であれば[3H]−DHAを添加して、さらに1時間平衡化した。受容体結合放射リガンド及び遊離の放射リガンドは、以前に開示されているようにゲル濾過によって分離した(非特許文献18)。非特異的結合は、1μMのs−プロプラノロールの存在下で測定した。飽和曲線は、0.4nMから100nMの広範な[3H]−DHA濃度を使用して得られた。競争アッセイは、βAR34−424については12nMの濃度の[3H]−DHAを使用して実施し、βAR−m23については40nMの濃度の[3H]−DHAを使用して実施し(すなわち、3倍のKD)、各種の濃度の未標識のリガンド(0から100mM)を用いて実施した。放射活性はBeckman LS6000液体シンチレーションカウンターで計測し、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して非線形回帰によってデータを分析した。
登録コードが1GZM[14]であるロドプシン構造のpdbファイルは、Protein Date Bankウェブサイト(www.pdb.org)からダウンロードし、PyMOLX11Hybrid(DeLano Scientific)プログラムに表示した。βARにおける熱安定変異についての、ロドプシンの対応するアミノ酸残基は、本発明者のよく知っている4つのGPCR、すなわち、ロドプシン、β1アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、及びアデノシンA2a受容体の間のアラインメントに基づいてロドプシン構造に配置した(非特許文献19)。
増大した熱安定性を有するアデノシンA2a受容体(A2aR)の変異体
1.315の部位特異的変異体を、A2aRの2から316残基の間に作製した。
2.これらの変異体の全てを、加熱工程後のアゴニスト及びアンタゴニスト結合測定アッセイを使用して熱安定性についてアッセイした(図12に記載のリガンド(−)フォーマット)。
a.3H−NECA(アゴニスト)と共に測定した際に、26の変異体が改善された熱安定性を示した:G114 A, G118A, L167A, A184L, R199A, A203L, L208A, Q210A, S213A, E219A, R220A, S223A, T224A, Q226A, K227A, H230A, L241A, P260A, S263A, L267A, L272A, T279A, N284A, Q311A, P313A, K315A。
b.3H−ZM241385(アンタゴニスト)と共にアッセイした際に、18の変異体が改善された熱安定性を示した:A54L, V57A, H75A, T88A, G114A, G118A, T119A, K122A, G123A, P149A, E151A, G152A, A203L, A204L, A231L, L235A, V239A。
3.変異を組み合わせて、推定上のアンタゴニストの立体構造において変異体を産生した。野生型A2aRはZM241385が結合した状態で31℃のTmを有する。
a.Rant17 A54L+K122A+L235A Tm 48°C (ZM241385 bound)
b.Rant19 A54L,T88A,V239A+A204L Tm 47°C (ZM241385 bound)
c.Rant21 A54L,T88A,V239A+K122A Tm 49°C (ZM241385 bound)
4.アゴニストスクリーニングよる変異を組み合わせたが、+2℃のTmという非常に低レベルの改善のみをもたらした。
増大した熱安定性を有するニューロテンシン受容体(NTR)の変異体
1.340部位特異的変異体を、NTRの61から400残基の間に作製した。
2.まず、これらの変異体の全てを、加熱工程後に3H−ニューロテンシン(アゴニスト)結合を測定するアッセイを使用して熱安定性についてアッセイした。24の変異体は、熱安定性おける小さいが顕著な増大をもたらした:A356L, H103A, D345A, A86L, A385L, Y349A, C386A, K397A, H393A, I116A, F358A, S108A, M181A, R392A, D113A, G209A, L205A, L72A, A120L, P399A, Y351A, V268A, T207A, A155L, S362A, F189A, N262A, L109A, W391A, T179A, S182A, M293A, L256A, F147A, D139A, S100A, K176A, L111A, A90L, N270A。
3.アゴニストの非存在下における加熱によって熱安定性について試験した変異体を、変異体を3H−ニューロテンシンの存在下で加熱する僅かに異なるアッセイを使用して再試験した(図12におけるリガンド(+)フォーマット)。改善された熱安定性を有する変異体は:A69L, A73L, A86L, A90L, H103A, V165A, E166A, G215A, V229A, M250A, I253A, A177L, R183A, I260A, T279A, T294A, G306A, L308A, V309A, L310A, V313A, F342A, F358A, V360A, S362A, N370A, S373A, F380A, A385L, P389A, G390A, R395A。
4.野生型の受容体と比較して顕著に向上した発現レベルを有する変異体も存在し、結晶化のための受容体生産レベルを促進するために使用し得る:A86L, H103A, F358A, S362A, N370A, A385L, G390A。これら全てが熱安定性を増大させた。
5.好ましい組み合わせは、
a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A Tm 51°C (ニューロテンシン結合)
b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A Tm 51°C (ニューロテンシン結合)
野生型のNTRは、ニューロテンシンが結合した状態で35℃のTmを有する。
安定化GPCR変異が存在する構造モチーフの同定
β2アドレナリン受容体の構造を決定した(非特許文献20及び21)。それはシチメンチョウβ1受容体と59%同一であったが、はっきりと異なる薬理学的プロフィールを有していた(非特許文献22及び23)。シチメンチョウβ1受容体の安定化変異が存在する構造モチーフを決定するために、本発明者は、ヒトβ2構造に変異をマッピングした(非特許文献21)。
[参考文献]
Claims (22)
- 親Gタンパク質共役型受容体(GPCR)と比較して、結晶化しやすく、したがって、構造決定に適している、GPCR変異体。
- 親GPCRと比較して増大した立体構造の安定性を有するGPCR変異体であって、変性条件下において、親GPCRの特定の立体構造と同じ特定の立体構造の寿命が延長している、GPCR変異体。
- (a)親GPCRの1つ又は複数の変異体を提供する工程、
(b)親GPCRが特定の立体構造にある際に前記親GPCRに結合するリガンドを選択する工程、
(c)変性条件下におけるリガンド結合能の損失によって表わされるものとして変性を測定することによって、各GPCR変異体が、選択したリガンドの結合について親GPCRの立体構造の安定性と比較して、前記リガンドの結合について増大した立体構造の安定性を有するか否かを測定する工程、及び
(d)選択したリガンドの結合について親GPCRと比較して増大した立体構造の安定性を有する変異体を選択する工程
を含み、
工程(c)においてGPCRが備える前記特定の立体構造が、工程(b)において選択されるリガンドの分類に対応する、
方法によって製造される親GPCRと比較して増大した立体構造の安定性を有するGPCR変異体。 - 前記1つ又は複数の変異体が、製造の方法の工程(c)の前に前記選択したリガンドに接触させられる、請求項3に記載のGPCR変異体。
- 変性条件下において、親GPCRの特定の立体構造と比較して同じ特定の立体構造の寿命が延長している、請求項3又は4に記載のGPCR変異体。
- 親GPCRと比較して、1個から10個の置換されたアミノ酸を含む、請求項3から5のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- 熱、界面活性剤、カオトロピック剤、及び極端なpHのいずれか1つ又は複数から選択される変性条件下において増大した立体構造の安定性を有する、請求項3から6のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- その親よりも少なくとも1℃安定であるような増大した立体構造の熱安定性を有する、請求項3から7のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- アゴニスト又はアンタゴニスト立体構造の立体構造の安定性が増大している、請求項3から8のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- 完全なアゴニスト、部分的なアゴニスト、逆アゴニスト、及びアンタゴニストから選択されるリガンドであって、任意選択で蛍光標識又は放射標識されたリガンドの存在下で、親GPCRと比較して増大した立体構造の安定性を有する、請求項3から9のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- 前記GPCR変異体が、アデノシン受容体変異体、β−アドレナリン受容体変異体、ニューロテンシン受容体変異体、ムスカリン酸受容体変異体、5−ヒドロキシトリプタミン受容体変異体、アドレナリン受容体変異体、アナフィラトキシン受容体変異体、アンジオテンシン受容体変異体、アペリン受容体変異体、ボンベシン受容体変異体、ブラディキニン受容体変異体、カンナビノイド受容体変異体、ケモカイン受容体変異体、コレシストキニン受容体変異体、ドーパミン受容体変異体、エンドセリン受容体変異体、遊離脂肪酸受容体変異体、胆汁酸受容体変異体、ガラニン受容体変異体、モチリン受容体変異体、グレリン受容体変異体、糖タンパク質ホルモン受容体変異体、GnRH受容体変異体、ヒスタミン受容体変異体、KiSS1−由来ペプチド受容体変異体、ロイコトリエン及びリポキシン受容体変異体、リゾリン脂質受容体変異体、メラニン濃縮ホルモン受容体変異体、メラノコルチン受容体変異体、メラトニン受容体変異体、ニューロメジンU受容体変異体、神経ペプチド受容体変異体、N−ホルミルペプチドファミリー受容体変異体、ニコチン酸受容体変異体、オピオイド受容体変異体、オプシン様受容体変異体、オレキシン受容体変異体、P2Y受容体変異体、ペプチドP518受容体変異体、血小板活性化因子受容体変異体、プロキネチシン受容体変異体、プロラクチン放出ペプチド受容体変異体、プロスタノイド受容体変異体、プロテアーゼ活性化受容体変異体、リラキシン受容体変異体、ソマトスタチン受容体変異体、SPC/LPC受容体変異体、タチキニン受容体変異体、トレースアミノ受容体変異体、チロトロピン放出ホルモン受容体変異体、ユーロテンシン受容体変異体、バソプレッシン/オキシトシン受容体変異体、オーファンGPCR変異体、カルシトニン受容体変異体、コルチコトロピン放出因子受容体変異体、グルカゴン受容体変異体、パラチロイド受容体変異体、VIP/PACAP受容体変異体、LNB7TM受容体変異体、GABA受容体変異体、メタボトロピックグルタミン酸受容体変異体、及びカルシウムセンサー受容体変異体のいずれかである、請求項3から10のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- 前記GPCR変異体が、その親受容体と比較して、以下の(i)配列番号1に定義されたシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした位置:Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, 及びPhe 338、(ii)配列番号5に定義されたヒトアデノシンA2a受容体の番号付けした位置:Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, 及びLys 315、(iii)配列番号9に定義されたラットニューロテンシン受容体の番号付けした位置:Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351
, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, 及びPro 399、並びに(iv)配列番号12に定義されたムスカリン受容体の番号付けした位置:Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383, 及びMet 384のいずれか1つ又は複数と対応する位置に少なくとも1つの異なるアミノ酸を有する、請求項3から10のいずれか一項に記載のGPCR変異体。 - (i)対応する野生型アドレナリン受容体と比較して、配列番号1に定義されたシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした以下の位置:Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, 及びPhe 338のいずれか1つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するβ−アドレナリン受容体変異体であるか;
(ii)対応する野生型アデノシン受容体と比較して、配列番号5に定義されたヒトアデノシンA2a受容体の番号付けした以下の位置:Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, 及びLys 315のいずれか1つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するアデノシン受容体変異体であるか;
(iii)対応する野生型ニューロテンシン受容体と比較して、配列番号9に定義されたラットニューロテンシン受容体の番号付けした以下の位置:Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, 及びPro 399のいずれか1つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体変異体であるか;
(iv)対応する野生型ムスカリン受容体と比較して、配列番号12に定義されたヒトムスカリン受容体の番号付けした以下の位置:Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383、及びMet 384のいずれか1つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体変異体である、請求項3から10のいずれか一項に記載のGPCR変異体。 - 請求項3から13のいずれか一項に記載のGPCR変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 可溶化された形態であるか、他のタンパク質を実質的に含まないか、又は固体支持体に固定化されている、請求項3から13のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- 結晶化のための、リガンド結合スクリーニング又はアッセイ開発のような創薬のための、あるいはバイオセンサーとしての請求項3から13のいずれか一項に記載のGPCR変異体の使用。
- 前記GPCR変異体がヒトカンナビノイド受容体でない、請求項3から13および16のいずれか一項に記載のGPCR変異体、請求項14に記載のポリヌクレオチド、請求項15に記載の宿主細胞、請求項17に記載の使用。
- 請求項3から13、16および18のいずれか一項に記載のGPCR変異体の結晶化形態。
- 前記親GPCRが、天然のタンパク質を有するGPCR、天然のタンパク質の切断型、又は天然のタンパク質又はその断片に対する融合体、あるいは天然のタンパク質と比較して改変を含むGPCRであり、前記親GPCRが、リガンド結合能を保持する、請求項1から3のいずれか一項に記載のGPCR変異体。
- 親野生型ヒトGタンパク質共役型受容体(GPCR)と比較して少なくとも一つの置換されたアミノ酸を有する、親野生型ヒトGPCRの変異体であって、
GPCR変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトGPCRのアゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアゴニスト立体構造を有し、GPCR変異体が加熱される前にアゴニストと接触させられる場合、又は、GPCR変異体がアゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、あるいは、
GPCR変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトGPCRのアンタゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアンタゴニスト立体構造を有し、GPCR変異体が加熱される前にアンタゴニストと接触させられる場合、又は、GPCR変異体がアンタゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアンタゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、
親野生型ヒトGPCRと比較して前記GPCR変異体が、増大した立体構造の熱安定性を有する、親野生型ヒトGPCRの変異体。 - 親野生型ヒトGタンパク質共役型受容体(GPCR)と比較して少なくとも一つの置換されたアミノ酸を有する、親野生型ヒトGPCRの変異体であって、
GPCR変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトGPCRのアゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアゴニスト立体構造を有し、GPCR変異体が加熱される前にアゴニストと接触させられる場合、又は、GPCR変異体がアゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、あるいは、
GPCR変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトGPCRのアンタゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアンタゴニスト立体構造を有し、GPCR変異体が加熱される前にアンタゴニストと接触させられる場合、又は、GPCR変異体がアンタゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアンタゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、
親野生型ヒトGPCRと比較して前記GPCR変異体が、増大した立体構造の熱安定性を有し、
さらに、以下の工程:
(a)親GPCRの1つ又は複数の変異体を提供する工程、
(b)親GPCRが特定の立体構造にある際に前記親GPCRに結合する特定の分類のリガンドを選択する工程、
(c)熱変性条件下におけるリガンド結合能の損失によって表わされるものとして変性を測定することによって、各GPCR変異体が、選択したリガンドの結合について親GPCRの立体構造の熱安定性と比較して、前記リガンドの結合について増大した立体構造の熱安定性を有するか否かを測定する工程、及び
(d)選択したリガンドの結合について親GPCRと比較して増大した立体構造の熱安定性を有する変異体を選択する工程、
を含む方法であって、
工程(c)においてGPCRが備える前記特定の立体構造が、工程(b)において選択されるリガンドの分類に対応する方法によって得られうることによって特徴付けられる、GPCR変異体。
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