ES2381780T3

ES2381780T3 - Receptores acoplados a proteínas G mutantes y métodos para seleccionarlos

Info

Publication number: ES2381780T3
Application number: ES08718823T
Authority: ES
Inventors: Richard Henderson; Christopher Gordon Tate; Francesca Magnani; Maria Josefa Serrano-Vega; Yoko Shibata; Anthony Johannes Warne; Malcolm Peter Weir
Original assignee: Heptares Therapeutics Ltd
Current assignee: Nxera Pharma UK Ltd
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2012-05-31
Anticipated expiration: 2028-03-20
Also published as: GB2456236B8; HRP20120336T1; JP2010521983A; WO2008114020A9; GB0805267D0; JP4842400B2; US20210061882A1; GB2456236B; GB2456237B; GB0901111D0; EP2121919A2; CA2681415A1; PL2121919T3; GB2447786C; GB2447786A; AU2008228085A1; PT2121919E; CA2681415C; EP2386635A2; CN101688203A

Abstract

Método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) con estabilidad conformacional aumentada, comprendiendo el método (a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original, (b) seleccionar un ligando de una clase particular, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular, (c) determinar si el GPCR o cada GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad conformacional del GPCR original con respecto a la unión a ese ligando, midiendo la desnaturalización manifestada por la pérdida de capacidad de unión al ligando, en condiciones de desnaturalización tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un extremo de pH, y (d) seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado; en el que la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) corresponde a la misma clase de ligando que el ligando seleccionado en la etapa (b) .

Description

Receptores acoplados a proteínas G mutantes y métodos para seleccionarlos

La presente invención se refiere a receptores acoplados a proteínas G mutantes (GPCR) y métodos para seleccionar aquéllos con estabilidad aumentada. En particular, se refiere a la selección y preparación de GPCR mutantes que tienen estabilidad aumentada en una condición particular en comparación con sus proteínas originales respectivas. Es más probable que las proteínas de este tipo sean cristalizables, y por tanto susceptibles de determinación estructural, que las proteínas originales. También son útiles para estudios de desarrollo y descubrimiento de fármacos.

A lo largo de los últimos 20 años la tasa de determinación de estructuras de proteína de membrana ha aumentado gradualmente, pero el mayor éxito se ha conseguido en la cristalización de proteínas de membrana de bacterias más que de eucariotas [1]. Han sido más fácil sobreexpresar las proteínas de membrana bacterianas usando técnicas convencionales en Escherichia coli que las proteínas de membrana eucariotas [2,3] y las proteínas bacterianas son a veces mucho más estables en detergente, siendo la estabilidad en detergente un requisito previo esencial para la purificación y cristalización. Proyectos de secuenciación de genoma también han permitido la clonación y expresión de muchos homólogos de un canal iónico o transportador específico, lo que también mejora mucho las posibilidades de éxito durante la cristalización. Sin embargo, de las 120 estructuras de proteína de membrana diferentes que se han resuelto a la fecha, sólo hay siete estructuras de proteínas integrales de membrana de mamífero (http://blanco.biomol.uci.edu/); cinco de estas proteínas de membrana se purificaron a partir de fuentes naturales y son estables en disoluciones de detergente. Aparte de las dificultades en la sobreexpresión de proteínas de membrana eucariotas, a menudo tienen poca estabilidad en disoluciones de detergente, lo que restringe gravemente el intervalo de condiciones de cristalización que pueden explorarse sin su precipitación o desnaturalización inmediata. De manera ideal, las proteínas de membrana deben ser estables durante muchos días en cualquier disolución de detergente dada, pero los detergentes que son los más adecuados para hacer crecer cristales con calidad de difracción tienden a ser los detergentes más desestabilizantes, es decir, aquéllos con cadenas alifáticas cortas y grupos de cabeza cargados o pequeños. También nos gustaría resolver las estructuras de proteínas de membrana humanas, debido a que éstas se requieren por la industria farmacéutica para ayudar el desarrollo de agentes terapéuticos; a menudo hay diferencias sustanciales en la farmacología de receptores, canales y transportadores de diferentes mamíferos, mientras que los genomas de levaduras y bacterias pueden no incluir ninguna proteína homóloga. Existe por tanto la necesidad abrumadora de desarrollar una estrategia genérica que permita la producción de proteínas integrales de membrana eucariotas estables en detergente para la cristalización y determinación estructural y potencialmente para otros fines tales como aplicaciones de selección de fármacos, bioensayos y biosensores.

Las proteínas de membrana han evolucionado hasta ser suficientemente estables en la membrana para asegurar la viabilidad celular, pero no han evolucionado hasta ser estables en disolución de detergente, sugiriendo que las proteínas de membrana podrían ser mutantes estables al detergente y desarrollados artificialmente aislados [4]. Esto se demostró posteriormente para dos proteínas bacterianas, diacilglicerol cinasa (DGK) [5,6] y bacteriorrodopsina [7]. La mutagénesis al azar de DGK identificó mutaciones puntuales específicas que aumentaban la termoestabilidad y, cuando se combinaban, el efecto era aditivo de modo que el mutante estable de manera óptima tenía una semivida de 35 minutos a 80ºC en comparación con una semivida de 6 minutos a 55ºC para la proteína nativa [6]. Se demostró que el trímero del mutante DGK resistente al detergente se había vuelto estable en SDS y, por tanto, es probable que la estabilización del estado oligomérico desempeñara un papel significativo en la termoestabilización. Aunque el objetivo de la mutagénesis era producir una proteína de membrana adecuada para la cristalización, la estructura de DGK aún tiene que determinarse y no ha habido notificaciones de cristalización satisfactoria. Un estudio adicional sobre la bacteriorrodopsina mediante mutagénesis de exploración de cisteína a lo largo de la hélice B demostró que no era posible predecir qué residuos de aminoácido conducirían a la termoestabilidad tras la mutación ni, cuando se estudió en el contexto de la estructura, estaba claro por qué se había producido la termoestabilización [7].

Los GPCR constituyen una familia muy grande de proteínas que controlan muchos procesos fisiológicos y son las dianas de muchos fármacos eficaces. Por tanto, son de considerable importancia farmacológica. Una lista de GPCR se proporciona en Foord et al. (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288. Los GPCR son generalmente inestables cuando se aíslan, y a pesar de esfuerzos considerables, no ha sido posible cristalizar ninguno excepto la rodopsina bovina, que naturalmente es excepcionalmente estable.

Los GPCR son posibles dianas farmacológicas, y se hace referencia particularmente a Overington et al. (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996 que indica que más de un cuarto de los fármacos presentes tienen un GPCR como diana.

Se cree que los GPCR existen en múltiples conformaciones distintas que están asociadas con diferentes clases farmacológicas del ligando tales como agonistas y antagonistas, y que fluctúan de manera cíclica entre estas conformaciones con el fin de funcionar (Kenakin T. (1997) Ann NY Acad Sci 812, 116-125).

Se apreciará que los métodos de la invención no incluyen un método tal como se describió en D’Antona et al., que incluye la unión de [3H]CP55940 a un receptor 1 cannabinoide humano mutante constitutivamente inactivo (T210A) en el que el residuo Thr en la posición 210 se sustituye por un residuo Ala.

La enumeración o discusión de un documento aparentemente publicado anteriormente en esta memoria descriptiva no debe necesariamente tomarse como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es conocimiento común general.

Se ha comprendido que existen dos problemas serios asociados con tratar de cristalizar los GPCR, concretamente su falta de estabilidad en detergente y el hecho de que existen en múltiples conformaciones. Con el fin de funcionar, los GPCR han evolucionado para fluctuar de manera cíclica por al menos dos conformaciones distintas, la forma unida al agonista y la forma unida al antagonista, y en ausencia de ligando pueden producirse espontáneamente cambios entre estas dos conformaciones. Es por tanto probable que cualquier receptor purificado presente una mezcla de conformaciones. La adición simplemente de ligandos a los GPCR durante ensayos de cristalización no ha dado como resultado la determinación de su estructura. Para mejorar la probabilidad de cristalización, se seleccionaron por tanto mutaciones que mejoraron la estabilidad del GPCR y, además, bloquearon preferentemente el receptor en una conformación biológicamente relevante específica.

Se decidió ver si era posible la estabilización de un GPCR en una conformación biológicamente relevante particular y si el efecto era suficientemente grande como para mejorar significativamente las probabilidades de obtener cristales con calidad de difracción. En el ejemplo 1, se eligió el receptor β1-adrenérgico (βAR) de eritrocitos de pavo

[8] como sujeto de prueba para este estudio por varios motivos. El βAR es un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) que tiene una farmacología bien desarrollada con muchos ligandos disponibles comercialmente y en una forma radiomarcada. Además, la sobreexpresión de βAR ha sido particularmente satisfactoria usando el sistema de expresión de baculovirus y puede purificarse en cantidades de miligramos en una forma funcional [9]. En el ejemplo 2, se usó un receptor de adenosina humano, y en el ejemplo 3, se usó un receptor de neurotensina de rata.

Método para seleccionar GPCR mutantes con estabilidad aumentada

Un primer aspecto de la invención proporciona un método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) mutante con estabilidad conformacional aumentada, comprendiendo el método

(a): proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(b): seleccionar un ligando de una clase particular, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular,

(c): determinar si el o cada GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad conformacional del GPCR original con respecto a la unión a ese ligando, midiendo la desnaturalización manifestada por la pérdida de capacidad de unión al ligando, en condiciones de desnaturalización tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un extremo de pH, y

(d): seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR original con respecto a la unión del ligando seleccionado; en el que la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) corresponde a la misma clase de ligando que el ligando seleccionado en la etapa (b).

Los inventores han apreciado que, con el fin de mejorar la probabilidad de cristalización de un GPCR en una forma biológicamente relevante (que es por tanto farmacológicamente útil), es deseable no sólo aumentar la estabilidad de la proteína, sino también que la proteína tenga esta estabilidad aumentada cuando está en una conformación particular. La conformación se determina mediante un ligando seleccionado, y es una conformación biológicamente relevante, en particular una conformación farmacológicamente relevante. Por tanto, puede considerarse que el método de la invención es un método para seleccionar mutantes de un GPCR que tienen estabilidad aumentada de una conformación particular, por ejemplo pueden tener termoestabilidad conformacional aumentada. El método puede usarse para crear GPCR conformacionalmente bloqueados, estables, mediante mutagénesis. Los GPCR mutantes seleccionados son formas eficazmente más puras de las moléculas originales porque una proporción mucho más alta de los mismos ocupa un estado conformacional particular. La selección deliberada de una conformación de receptor elegida resuelta a partir de otras conformaciones mediante el uso de un ligando (o ligandos) que se unen preferentemente a esta conformación es por tanto una característica importante de la invención. También puede considerarse que el método es un método para seleccionar GPCR mutantes que son más manejables para la cristalización.

Por tanto, la invención incluye un método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) mutante con estabilidad conformacional aumentada, comprendiendo el método

(a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(c): determinar si el o cada GPCR mutante cuando se encuentra en la conformación particular tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad conformacional del GPCR original cuando se encuentran en la misma conformación particular con respecto a la unión a ese ligando midiendo la desnaturalización manifestada por la pérdida de capacidad de unión al ligando, en condiciones de desnaturalización tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un extremo de pH, y

En una revisión del genoma susceptible de selección como diana farmacológica por Hopkins y Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730, la tabla 1 contiene una lista de familias de proteínas muchas de las cuales son GPCR. Overington et al. (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996 proporcionan más detalles de dianas farmacológicas, y la figura 1 indica que más de un cuarto de los fármacos actuales seleccionan como diana los GPCR. Existen 52 dianas de GPCR para fármacos disponibles por vía oral de un total de 186 dianas totales en esta categoría.

GPCR adecuados para su uso en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, receptor β-adrenérgico, receptor de adenosina, en particular receptor de adenosina A2a, y receptor de neurotensina (NTR). Otros GPCR adecuados se conocen ampliamente en la técnica e incluyen aquéllos enumerados en Hopkins y Groom citado anteriormente. Además, la International Union of Pharmacology produce una lista de GPCR (Foord et al. (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288, y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphardb.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward). Se observará que los GPCR están divididos en diferentes clases, basadas principalmente en sus similitudes de secuencia de aminoácidos. También están divididas en familias con referencia a los ligandos naturales a los que se unen. Todos los GPCR están incluidos en el alcance de la invención.

Las secuencias de aminoácidos (y las secuencias de nucleótidos de los ADNc que las codifican) de muchos GPCR están disponibles fácilmente, por ejemplo con referencia a GenBank. En particular, Foord et al. citado anteriormente proporciona los símbolos génicos humanos y los ID génicos de ser humano, ratón y rata de Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). También debe observarse que, debido a que la secuencia del genoma humano está sustancialmente completa, las secuencias de aminoácidos de los GPCR humanos puede deducirse de la misma.

Aunque el GPCR puede derivarse de cualquier fuente, se prefiere particularmente que sea de una fuente eucariota. Se prefiere particularmente que se derive de una fuente de un animal vertebrado tal como un mamífero o un ave. Se prefiere particularmente que el GPCR se derive de rata, ratón, conejo o perro o primate no humano o ser humano, o de pollo o pavo. Para evitar dudas, se incluye dentro del significado de “derivado de” que un ADNc o gen se obtuvo originalmente usando material genético de la fuente, pero que la proteína puede expresarse en cualquier célula huésped posteriormente. Por tanto, resultará evidente que un GPCR eucariota (tal como un GPCR de mamífero o aviar) puede expresarse en una célula huésped procariota, tal como E. coli, pero considerarse que se deriva de mamífero o ave, según sea el caso.

En algunos ejemplos, el GPCR puede estar compuesto de más de una subunidad diferente. Por ejemplo, el receptor peptídico relacionado con el gen de calcitonina requiere la unión de una única proteína de hélice transmembrana (RAMP1) para adquirir sus características de unión a ligando fisiológicas. Se conocen ampliamente en la técnica proteínas que interaccionan con GPCR, auxiliares, accesorias, efectoras que se combinan con el GPCR para formar

o modular un complejo funcional e incluyen, por ejemplo, receptor cinasas, proteínas G y arrestinas (Bockaert et al. (2004) Curr Opinion Drug Discov y Dev 7, 649-657).

Los mutantes del GPCR original pueden producirse de cualquier manera adecuada y proporcionarse en cualquier forma adecuada. Por tanto, por ejemplo, pueden prepararse una serie de mutantes específicos de la proteína original en los que cada residuo de aminoácido en toda o parte de la proteína original se cambia independientemente a otro residuo de aminoácido. Por ejemplo, puede ser conveniente hacer mutaciones en aquellas partes de la proteína para las que se predice que son transmembrana. Se conoce la estructura tridimensional de rodopsina (Li et al. (2004) J Mol Biol 343, 1409-1438; Palczewski et al. (2000) Science 289, 739745), y es posible modelar determinados GPCR usando esta estructura. Por tanto, de manera conveniente, las partes del GPCR que deben mutar pueden basarse en modelado. De manera similar, están disponibles programas informáticos que modelan las regiones transmembrana de los GPCR basándose en hidrofobicidad (Kyle y Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132), y pueden usarse modelos de este tipo cuando se seleccionan partes de la proteína que deben mutar. Puede emplearse mutagénesis dirigida al sitio convencional, o pueden usarse procedimientos basados en la reacción en cadena de la polimerasa ampliamente conocidos en la técnica. Es

posible, pero menos deseable, usar métodos de presentación de ribosomas en la selección de la proteína mutante.

Normalmente, cada aminoácido seleccionado se sustituye por Ala (por ejemplo mutagénesis de exploración de Ala), aunque puede sustituirse por cualquier otro aminoácido. Si el aminoácido seleccionado es Ala, puede sustituirse convenientemente por Leu. Alternativamente, el aminoácido puede sustituirse por Gly (por ejemplo mutagénesis de exploración de Gly), que puede permitir un empaquetamiento más estrecho de hélices vecinas que puede bloquear la proteína en una conformación particular. Si el aminoácido seleccionado es Gly, puede sustituirse convenientemente por Ala.

Aunque el aminoácido usado para sustituir el aminoácido dado en una posición particular es normalmente un aminoácido que se produce de manera natural, normalmente un aminoácido “codificable”, puede ser un aminoácido no natural (en cuyo caso la proteína se prepara normalmente mediante síntesis química o mediante el uso de aminoacil-ARNt no naturales). Un aminoácido “codificable” es uno que se incorpora en un polipéptido mediante traducción de ARNm. También es posible crear aminoácidos no naturales o introducir enlaces no peptídicos en una posición dada mediante modificación química covalente, por ejemplo mediante tratamiento postraduccional de la proteína o semisíntesis. Estas modificaciones postraduccionales pueden ser naturales, tal como fosforilación, glicosilación o palmitoilación, o sintéticas o biosintéticas.

Alternativamente, los mutantes pueden producirse mediante un procedimiento de mutagénesis al azar, que puede ser de toda la proteína o de una parte seleccionada de la misma. Los procedimientos de mutagénesis al azar se conocen ampliamente en la técnica.

Convenientemente, el GPCR mutante tiene un aminoácido sustituido en comparación con la proteína original (por ejemplo está mutado en una posición de aminoácido). De esta manera, puede evaluarse la contribución a la estabilidad conformacional de una única sustitución de aminoácido. Sin embargo, el GPCR mutante sometido a ensayo para determinar la estabilidad conformacional puede tener más de un aminoácido sustituido en comparación con la proteína original, tal como 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 sustituciones.

Tal como se comenta en más detalle a continuación, pueden hacerse combinaciones de mutaciones basándose en los resultados del método de selección. Se ha encontrado que en algunos casos específicos combinar mutaciones en una única proteína mutante conduce a un aumento adicional en la estabilidad conformacional. Por tanto, se apreciará que el método de la invención puede usarse de una manera iterativa, por ejemplo, llevándolo a cabo para identificar las mutaciones individuales que aumentan la estabilidad conformacional, combinando esas mutaciones en un único GPCR mutante que es el GPCR proporcionado entonces en la parte (a) del método. Por tanto, pueden seleccionarse proteínas mutantes mutadas de manera múltiple usando el método.

No es necesario que el GPCR original sea la proteína que se produce de manera natural. Convenientemente, puede ser una versión modificada mediante ingeniería genética que puede expresarse en un organismo huésped adecuado, tal como Escherichia coli. Por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 1, una versión modificada mediante ingeniería genética conveniente del receptor β-adrenérgico de pavo es una que está truncada y carece de los residuos 1-33 de la secuencia de aminoácidos (es decir βAR34-424). El GPCR original puede ser una forma truncada de la proteína que se produce de manera natural (truncada en cualquiera o ambos extremos), o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma. Alternativa o adicionalmente, el GPCR original, en comparación con un GPCR que se produce de manera natural, puede modificarse con el fin de mejorar, por ejemplo, la solubilidad, estabilidad proteolítica (por ejemplo mediante truncación, deleción de bucles, mutación de sitios de glicosilación o mutación de cadenas laterales de aminoácidos reactivas tales como cisteína). En cualquier caso, el GPCR original es una proteína que puede unirse al ligando seleccionado, siendo el ligando uno del que se sabe que se une al GPCR que se produce de manera natural. Convenientemente, el GPCR original es uno que, al añadir un ligando apropiado, puede afectar a una cualquiera o más de las actividades en el sentido de 3’ de las que se sabe comúnmente que se ven afectadas por la activación de proteínas G.

Sin embargo, se apreciará que la estabilidad conformacional del mutante debe compararse con un original con el fin de poder evaluar un aumento en la estabilidad conformacional.

Se selecciona un ligando, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando se encuentra en una conformación particular. Normalmente, el ligando se unirá a una conformación del GPCR original (y puede provocar que el GPCR adopte esta conformación), pero no se une tan fuertemente a otra conformación que pueda adoptar el GPCR. Por tanto, puede considerarse que la presencia del ligando estimula al GPCR a adoptar la conformación particular. Por tanto, puede considerarse que el método es una manera de seleccionar GPCR mutantes que están atrapados en una conformación de relevancia biológica (por ejemplo estado unido al ligando), y que son más estables con respecto a esa conformación.

La conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) corresponde a la clase de ligando seleccionado en la etapa (b).

Preferiblemente el ligando seleccionado es de la clase agonista de ligandos y la conformación particular es una conformación agonista, o el ligando seleccionado es de la clase antagonista de ligandos y la conformación particular es una conformación antagonista.

Preferiblemente el ligando seleccionado es de la clase agonista de ligandos y la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) es la conformación agonista.

Preferiblemente, la afinidad de unión al ligando seleccionado por el receptor mutante debe ser igual o mayor que aquélla por el receptor de tipo natural; los mutantes que muestran una unión al ligando seleccionado significativamente reducida normalmente se rechazan.

Por “ligando” se incluye cualquier molécula que se une al GPCR y que provoca que el GPCR se encuentre en una conformación particular. El ligando es preferiblemente uno que provoca que más de la mitad de las moléculas de GPCR en general estén en una conformación particular.

Se conocen muchos ligando adecuados.

Normalmente, el ligando es un agonista completo y puede unirse al GPCR y puede provocar una respuesta biológica completa (100%), medida por ejemplo mediante el acoplamiento de proteínas G, eventos de señalización en el sentido de 3’ o un resultado fisiológico tal como vasodilatación. Por tanto, normalmente, la respuesta biológica es el intercambio GDP/GTP en una proteína G, seguido por estimulación de la ruta efectora ligada. La medición, normalmente, es el intercambio GDP/GTP o un cambio en el nivel del producto final de la ruta (por ejemplo AMPc, GMPc o fosfatos de inositol). El ligando también puede ser un agonista parcial y puede unirse al GPCR y puede provocar una respuesta biológica parcial (<100%).

El ligando también puede ser un agonista inverso, que es una molécula que se une a un receptor y reduce su actividad basal (es decir no estimulada por un agonista) a veces incluso hasta cero.

El ligando también puede ser un antagonista, que es una molécula que se une a un receptor y bloquea la unión de un agonista, evitando así una respuesta biológica. Los agonistas inversos y agonistas parciales pueden, en ciertas condiciones de ensayo, ser antagonistas.

Los ligandos anteriores pueden ser ortostéricos, mediante lo que se incluye el significado que se combinan con el mismo sitio que el agonista endógeno; o pueden ser alostéricos o alotópicos, mediante los que se incluye el significado que se combinan con un sitio distinto del sitio ortostérico. Los ligandos anteriores pueden ser sintópicos, mediante lo que se incluye el significado que interaccionan con otro(s) ligando(s) en el mismo sitio o un sitio solapante. Pueden ser reversibles o irreversibles.

En relación con los antagonistas, pueden ser superables, con lo que se incluye el significado que el máximo efecto de agonista no se reduce ni mediante el pretratamiento ni el tratamiento simultáneo con antagonista; o pueden ser insuperables, mediante lo que se incluye el significado que el máximo efecto del agonista se reduce o bien mediante el pretratamiento o bien el tratamiento simultáneo con antagonista; o pueden ser neutros, mediante lo que se incluye el significado que el antagonista es uno sin actividad de agonista inverso o agonista parcial. Los antagonistas normalmente son también agonistas inversos.

Los ligandos para su uso en la invención también pueden ser moduladores alostéricos tales como moduladores alostéricos positivos, potenciadores, moduladores alostéricos negativos e inhibidores. Pueden tener actividad como agonistas o agonistas inversos por sí mismos o pueden sólo tener actividad en presencia de un agonista o agonista inverso en cuyo caso se usan en combinación con tales moléculas con el fin de unirse al GPCR.

Neubig et al. (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606, describen diversas clases de ligandos.

Preferiblemente, los ligandos mencionados anteriormente son restos orgánicos o inorgánicos pequeños, pero pueden ser péptidos o polipéptidos. Normalmente, cuando el ligando es un resto orgánico u orgánico pequeño, tiene una Mr de desde 50 hasta 2000, tal como de desde 100 hasta 1000, por ejemplo de desde 100 hasta 500.

Normalmente, el ligando se une al GPCR con una Kd de desde mM hasta pM, tal como en el intervalo de desde μM (micromolar) hasta nM. Generalmente, se prefieren los ligandos con la Kd más baja.

Se conocen ampliamente en la técnica los ligandos de molécula orgánica pequeña, por ejemplo véanse los ejemplos a continuación. Otros ligandos de molécula pequeña incluyen 5HT que es un agonista completo en el receptor 5HT1A; eltoprazina que es un agonista parcial en el receptor 5HT1A (véase Newman-Tancredi et al. (1997) Neuropharmacology 36, 451-459); (+)-butaclamol y espiperona son agonistas inversos del receptor D2 de dopamina (véase Roberts y Strange (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 34-42); y WIN55212-3 es un antagonista neutro de CB2 (Savinainen et al. (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 636-645).

El ligando puede ser un peptidomimético, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico (PNA) o un aptámero. Puede ser un ion tal como Na+ o Zn2+, un lípido tal como oleamida, o un hidrato de carbono tal como heparina.

El ligando puede ser un polipéptido que se une al GPCR. Tales polipéptidos (con los que se incluyen oligopéptidos) son normalmente de desde Mr 500 hasta Mr 50.000, pero pueden ser más grandes. El polipéptido puede ser una proteína que interacciona con GPCR que se produce de manera natural u otra proteína que interactúa con el GPCR,

o un derivado o fragmento de las mismas, siempre que se una selectivamente al GPCR en una conformación particular. Las proteínas que interaccionan con GPCR incluyen aquéllas asociadas con la señalización y aquéllas asociadas con el tráfico, que a menudo actúan mediante dominios PDZ en la parte C terminal del GPCR.

Los polipéptidos de los que se sabe que se unen a determinados GPCR incluyen cualquiera de una proteína G, una arrestina, una proteína RGS, una receptor cinasa de proteínas G, una RAMP, una 14-3-3 proteína, un NSF, una periplaquina, una espinofilina, una GPCR cinasa, una receptor tirosina cinasa, un canal iónico o subunidad del mismo, una anquirina y una proteína Homer o Shanks. Otros polipéptidos incluyen las subunidades NR1 o NR2a del receptor NMDA, calciona, o un marco de dominio de fibronectina. El polipéptido puede ser uno que se une a un dominio extracelular de un GPCR, tal como fibulina-1. El polipéptido puede ser otro GPCR, que se une al GPCR seleccionado en un heteroligómero. Una revisión de las interacciones proteína-proteína en los GPCR se encuentra en Milligan y White (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 513-518, o en Bockaert et al. (2004) Curr. Opinion Drug Discov. Dev. 7, 649-657.

El ligando polipeptídico puede ser convenientemente un anticuerpo que se une al GPCR. Con el término “anticuerpo” se incluyen los anticuerpos que se producen de manera natural, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. También se incluyen moléculas y anticuerpos modificados mediante ingeniería genética que son similares al anticuerpo en sus características de unión, incluyendo moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos de dominio (Acd). También debe hacerse mención de anticuerpos de camélido y anticuerpos de camélido modificados mediante ingeniería genética. Tales moléculas que se unen a los GPCR se conocen en la técnica y en cualquier caso pueden prepararse usando tecnología ampliamente conocida. Anticuerpos adecuados, incluyen unos usados en la actualidad en radioinmunoanálisis (RIA) para los GPCR puesto que tienden a reconocer epítopos conformacionales.

El polipéptido también puede ser una proteína de unión basada en un marco modular, tal como proteínas con repetición de anquirina, proteínas con repetición de armadillo, proteínas ricas en leucina, proteínas con repetición de tetratriopéptido o proteínas con repetición de anquirina diseñadas (DARPins) o proteínas basadas en dominios de lipocalina o fibronectina o estructuras de andamiaje de afilina basadas en o bien ubiquitina humana o bien cristalina gamma humana.

En una realización de la invención, el ligando está unido covalentemente al GPCR, tal como una proteína G o proteína de fusión de arrestina. Algunos GPCR (por ejemplo receptor de trombina) se escinden en el extremo Nterminal mediante una proteasa y el nuevo extremo N-terminal se une al sitio del agonista. Por tanto, tales GPCR son fusiones GPCR-ligando naturales.

Se apreciará que el uso de anticuerpos, u otros polipéptidos de unión “universales” (tales como las proteínas G de las que se sabe que se acoplan con muchos GPCR diferentes) pueden ser particularmente ventajosos en el uso del método en GPCR “huérfanos” para los que no se conocen el ligando natural, y ligandos de molécula pequeña.

Una vez que se ha seleccionado el ligando, entonces se determina si el o cada GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con el GPCR original con respecto a la unión a ese ligando. Se apreciará que esta etapa (c) es una en la que se determina si el o cada GPCR mutante tiene una estabilidad aumentada (en comparación con su original) para la conformación particular que se determina mediante el ligando seleccionado. Por tanto, el GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado tal como se mide mediante la unión al ligando o mientras se une el ligando seleccionado. Tal como se discutirá más adelante, se prefiere particularmente que la estabilidad conformacional aumentada se evalúe mientras se une el ligando seleccionado.

La estabilidad conformacional aumentada se mide convenientemente durante un tiempo de vida prolongado del mutante en las condiciones impuestas que pueden conducir a inestabilidad (tales como calor, condiciones de detergente fuerte, agentes caotrópicos, etcétera). La desestabilización en la condición impuesta se determina normalmente midiendo la desnaturalización o pérdida de estructura. Tal como se discutirá más adelante, esto puede manifestarse por sí mismo por la pérdida de capacidad de unión a ligando o pérdida de indicadores de estructura secundaria o terciaria.

Tal como se describe con respecto a la figura 12 más adelante (que representa una realización preferida particular), existen diferentes formatos de ensayo que pueden usarse para determinar la estabilidad conformacional del GPCR mutante.

En una realización el GPCR mutante puede ponerse en contacto con un ligando antes de someterse a un

procedimiento en el que se determina la estabilidad conformacional del mutante (permaneciendo el GPCR mutante y ligando en contacto durante el periodo de prueba). Por tanto, por ejemplo, cuando el método se usa para seleccionar GPCR mutantes que en una conformación se unen a un ligando y que tienen termoestabilidad mejorada, el receptor se pone en contacto con el ligando antes de calentarse, y luego la cantidad de ligando unido al receptor tras el calentamiento puede usarse para expresar termoestabilidad en comparación con el receptor original. Esto proporciona una medida de la cantidad del GPCR que conserva la capacidad de unión a ligando tras la exposición a las condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, calor), lo que a su vez es un indicador de estabilidad conformacional.

En una realización alternativa (pero menos preferida), el GPCR mutante se somete a un procedimiento en el que la estabilidad conformacional del mutante se determina antes de ponerse en contacto con el ligando. Por tanto, por ejemplo, cuando el método se usa para seleccionar receptores de membrana mutantes que en una conformación se unen a un ligando y que tienen termoestabilidad mejorada, en primer lugar se calienta el receptor, antes de ponerse en contacto con el ligando, y luego la cantidad de ligando unida al receptor puede usarse para expresar termoestabilidad. De nuevo, esto proporciona una medida de la cantidad del GPCR que conserva la capacidad de unión a ligando tras la exposición a las condiciones desnaturalizantes.

En ambas realizaciones, se apreciará que la comparación de estabilidad conformacional del mutante se hace con referencia a la molécula original en las mismas condiciones.

Se apreciará que en ambas de estas realizaciones, los mutantes que se seleccionan son unos que tienen estabilidad conformacional aumentada cuando se encuentran en la conformación particular en comparación con la proteína original.

La vía preferida puede depender del GPCR específico, y dependerá del número de conformaciones accesibles para la proteína en ausencia de ligando. En la realización descrita en la figura 12, se prefiere que el ligando esté presente durante la etapa de calentamiento porque esto aumenta la probabilidad de que se seleccione la conformación deseada.

De lo anterior, se apreciará que la invención incluye un método para seleccionar un GPCR mutante con termoestabilidad conformacional aumentada, comprendiendo el método (a) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original, (b) seleccionar un antagonista o un agonista que se une al GPCR original, (c) determinar si el o cada mutante tiene termoestabilidad conformacional aumentada cuando está en presencia de dicho antagonista o agonista midiendo la capacidad del GPCR mutante de unirse a dicho antagonista o agonista seleccionado a una temperatura particular y tras un tiempo particular en comparación con el GPCR original y (d) seleccionar aquellos GPCR mutantes que se unen a más de dicho antagonista o agonista seleccionado a la temperatura particular y tras el tiempo particular que el GPCR original en las mismas condiciones; en el que la conformación particular en la que se proporciona el GPCR en la etapa (c) corresponde a la clase de ligando seleccionado en la etapa (b). En la etapa (c), un periodo de tiempo fijado a la temperatura particular se usa normalmente en la medición de la capacidad del GPCR mutante para unirse a dicho antagonista o agonista seleccionado. En la etapa (c), normalmente se eligen una temperatura y un tiempo en los que la unión de dicho antagonista o agonista seleccionado por el GPCR original se reduce en un 50% durante el periodo de tiempo fijado a esta temperatura (lo que es indicativo de que el 50% del receptor está inactivado; “cuasi” Tm).

Convenientemente, cuando el ligando se usa para someter a ensayo el GPCR (es decir se usa para determinar si está en un estado no desnaturalizado), el ligando está marcado de manera detectable, por ejemplo radiomarcado o marcado de manera fluorescente. En otra realización, la unión a ligando puede evaluarse midiendo la cantidad de ligando no unido usando un sistema de detección secundario, por ejemplo un anticuerpo u otro componente de unión de alta afinidad unido covalentemente a un resto detectable, por ejemplo una enzima que puede usarse en un ensayo colorimétrico (tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano). También puede usarse la metodología FRET. Se apreciará que no es necesario que el ligando usado para someter a ensayo el GPCR mutante en la determinación de su estabilidad conformacional sea el mismo ligando que el seleccionado en la etapa (b) del método.

Aunque es conveniente medir la estabilidad del GPCR original y del mutante usando la capacidad para unirse un ligando como indicador de la presencia de una proteína no desnaturalizada, se conocen otros métodos en la técnica. Por ejemplo, los cambios en los espectros de fluorescencia pueden ser un indicador sensible de desplegamiento, mediante o bien el uso de fluorescencia de triptófano intrínseca o bien el uso de sondas fluorescentes extrínsecas tales como 1-anilino-8-naptalenosulfonato (ANS), por ejemplo tal como se implementó en el método Thermofluor™ (Mezzasalma et al., J Biomol Screening, 2007, Abr.; 12(3):418-428). La estabilidad proteolítica, el intercambio deuterio/hidrógeno medido mediante espectrometría de masas, geles nativos azules, electroforesis de zona capilar, espectros de dicroismo circular (CD) y dispersión de luz también pueden usarse para medir el desplegamiento mediante la pérdida de señales asociadas con estructura secundaria o terciaria. Sin embargo, todos estos métodos requieren que la proteína se purifique en cantidades razonables antes de que puedan usarse (por ejemplo altas cantidades pmol/nmol), mientras que el método descrito en los ejemplos hace uso de cantidades pmol de GPCR esencialmente no purificado.

En una realización preferida, en la etapa (b) se seleccionan dos o más ligandos de la misma clase, la presencia de cada uno de los cuales provoca que el GPCR se encuentre en la misma conformación particular. Por tanto, en esta realización, pueden usarse uno o más ligandos (ya sean naturales o no naturales) de la misma clase (por ejemplo agonista completo o agonista parcial o antagonista o agonista inverso). Incluyendo múltiples ligandos de la misma clase en este proceso, ya sea en serie o en paralelo, minimiza el riesgo teórico de modificar inadvertidamente mediante ingeniería genética y seleccionar conformaciones de receptor mutado de manera múltiple sustancialmente diferentes al original, por ejemplo en su sitio de unión, pero que aún puede, debido a cambios compensatorios, unir el ligando. Las siguientes etapas pueden usarse para mitigar este riesgo:

1.: Seleccionar un conjunto químicamente distinto (por ejemplo n=2-5) de ligandos, en una clase farmacológica común tal como se evidencia mediante, por ejemplo, un ensayo espectroscópico o funcional o de unión. Debe pensarse que estos ligandos se unen a una región espacial común del receptor, tal como se evidencia, por ejemplo, mediante estudios de unión competitiva usando receptores mutados y/o de tipo natural, y/o mediante modelado molecular, aunque no necesariamente expresarán un farmacóforo común.

2.: Preparar mutantes de receptor individuales o múltiples destinados a aumentar la estabilidad conformacional, y someter a ensayo para determinación una unión ajustada usando el conjunto completo de ligandos. Los ensayos pueden hacerse en paralelo, repetirse o ejecutarse en serie.

3.: Confirmar la autenticidad del mutante de receptor estabilizado mediante la medición, por ejemplo, de la isoterma de unión para cada ligando, y mediante la medición del cambio de estabilidad con el ligando (la ventana debería normalmente estar estrechada en comparación con el tipo natural).

Con el fin de evitar cambios en la afinidad aparente provocados por perturbaciones al sitio de unión tras la mutación, preferiblemente deben usarse ligandos de la misma clase farmacológica, pero diferente clase química, para obtenerel perfil del receptor. Éstos deberían mostrar normalmente cambios similares en la afinidad (mutante frente a original, por ejemplo tipo natural) a pesar de tener diferentes propiedades de reconocimiento molecular. Los experimentos de unión deben realizarse preferiblemente usando un ligando marcado dentro de la misma clase farmacológica.

No obstante, debe reconocerse que pueden existir sustratos conformacionales que sean específicos para clases químicas de ligando dentro de la misma clase farmacológica, y éstos pueden estabilizarse específicamente en el procedimiento dependiendo de la clase química del ligando seleccionado.

Normalmente el ligando seleccionado se une al GPCR mutante con una potencia similar con respecto a su unión al GPCR original. Normalmente, los valores de Kd para el ligando particular que se une al GPCR mutante y al GPCR original están dentro de 5-10 veces uno respecto a otro, tal como dentro de 2-3 veces. Normalmente, la unión del ligando al GPCR mutante en comparación con el GPCR original no sería más de 5 veces más débil y no más de 10 veces más fuerte.

Normalmente, los receptores mutantes que se han estabilizado conformacionalmente en la conformación seleccionada deben unirse al ligando seleccionado con aproximadamente igual afinidad (es decir normalmente dentro de 2-3 veces) o mayor afinidad que el receptor original. Para los mutantes de conformación agonista, los mutantes normalmente se unen a los agonistas con la misma o mayor afinidad que el GPCR original y normalmente se unen a antagonistas con la misma o menor afinidad que el GPCR original. De manera similar para mutantes de conformación antagonista, los mutantes normalmente se unen a los antagonistas con la misma o mayor afinidad que el GPCR original y normalmente se unen a los agonistas con la misma o menor afinidad que el GPCR original.

Los mutantes que muestran una reducción significativa (normalmente mayor que 2-3 veces) en la afinidad por el ligando seleccionado normalmente se rechazan.

Normalmente, el orden de rango de unión de un conjunto de ligandos de la misma clase es comparable, aunque puede haber uno o dos inversiones en el orden, o puede haber un valor que discrepe del conjunto.

En una realización adicional, pueden usarse dos o más ligandos que se unen simultáneamente al receptor en la misma conformación, por ejemplo un modulador alostérico y un agonista ortostérico.

Para evitar dudas, y tal como resulta evidente a partir de los ejemplos, no es necesario usar múltiples ligandos para que el método sea eficaz.

En una realización adicional, puede ser ventajoso seleccionar aquellos GPCR mutantes que, mientras todavía pueden unirse al ligando seleccionado, no pueden unirse, o se unen menos fuertemente que el GPCR original, a un segundo ligando seleccionado que es de una clase diferente con respecto al primer ligando. Por tanto, por ejemplo, el GPCR mutante puede ser uno que se selecciona basándose en que tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión a un antagonista seleccionado, pero el GPCR mutante así seleccionado se somete a

pruebas adicionales para determinar si se une a un agonista completo (o se une menos fuertemente a un agonista completo que su GPCR original). Se seleccionan los mutantes que no se unen al (o tienen unión reducida del) agonista completo. De esta manera, se hace una selección adicional de un GPCR que está bloqueado en una conformación particular.

Se apreciará que el ligando seleccionado (con respecto a la parte (b) del método) y el ligando (segundo) adicional tal como se comentó anteriormente, puede ser cualquier par de clases de ligando, por ejemplo: antagonista y agonista completo; agonista completo y antagonista; antagonista y agonista inverso; agonista inverso y antagonista; agonista inverso y agonista completo; agonista completo y agonista inverso; etcétera.

Se prefiere que el receptor mutante se una al ligando (segundo) adicional con una afinidad que es menos del 50% de la afinidad que tiene el receptor original por el mismo ligando (segundo) adicional, más preferiblemente menos del 10% y todavía más preferiblemente menos del 1% o el 0,1% o el 0,01% de la afinidad por el receptor original. Por tanto, la Kd para la interacción del segundo ligando con el receptor mutante es mayor que para el receptor original. Tal como se muestra en el ejemplo 1, el receptor β-adrenérgico mutante βAR-m23 (que se seleccionó mediante el método de la invención usando un antagonista) se une a un agonista 3 órdenes de magnitud más débil que su original (es decir la Kd es 1000 x mayor). De manera similar, en el ejemplo 2, el receptor de adenosina A2a mutante Rant21 se une a un agonista 2-4 órdenes de magnitud más débil que su original.

Este tipo de contraselección es útil debido a que puede usarse para dirigir el procedimiento de mutagénesis más específicamente (y por tanto más rápida y más eficientemente) a lo largo de una ruta hacia una conformación pura tal como se define por el ligando.

Preferiblemente, el GPCR mutante se proporciona en una forma solubilizada adecuada en la que mantiene su integridad estructural y está en una forma funcional (por ejemplo puede unirse al ligando). Se usa un sistema de solubilización apropiado, tal como un detergente adecuado (u otro agente anfipático) y sistema de tampón, que el experto en la técnica puede elegir para que sea eficaz para la proteína particular. Los detergentes típicos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, dodecilmaltósido (DDM) o CHAPS u octilglucósido (OG) o muchos otros. Puede ser conveniente incluir otros compuestos tales como hemisuccinato de colesterol o el propio colesterol o heptano-1,2,3-triol. Puede ser útil la presencia de glicerol o prolina o betaína. Es importante que el GPCR, una vez solubilizado desde la membrana en la que se encuentra, debe ser lo suficientemente estable para someterse a ensayo. Para algunos GPCR, el DDM será suficiente, pero pueden añadirse glicerol u otros polioles para aumentar la estabilidad para fines de ensayo, si se desea. Puede lograrse estabilidad adicional para fines de ensayo, por ejemplo, solubilizando en una mezcla de DDM, CHAPS y hemisuccinato de colesterol, opcionalmente en presencia de glicerol. Para GPCR particularmente inestables, puede desearse solubilizarlos usando digitonina o polímeros anfipáticos (amphipols) u otros polímeros que pueden solubilizar los GPCR directamente desde la membrana, en ausencia de detergentes tradicionales y mantener la estabilidad permitiendo normalmente que un número significativo de lípidos permanezca asociado con el GPCR. También pueden usarse nanodiscos para solubilizar proteínas de membrana extremadamente inestables en una forma funcional.

Normalmente, el GPCR mutante se proporciona en un extracto bruto (por ejemplo de la fracción de membrana de la célula huésped en la que se ha expresado, tal como E. coli). Puede proporcionarse en una forma en la que la proteína mutante comprende normalmente al menos el 75%, más normalmente al menos el 80% o el 85% o el 90%

o el 95% o el 98% o el 99% de la proteína presente en la muestra. Por supuesto, se solubiliza normalmente tal como se discutió anteriormente, y entonces el GPCR mutante está asociado habitualmente con moléculas de detergente y/o moléculas de lípido.

Puede seleccionarse un GPCR mutante que tenga estabilidad conformacional aumentada con respecto a cualquier desnaturalizante o condición desnaturalizante tal como con respecto a uno cualquiera o más de calor, un detergente, un agente caotrópico o un extremo de pH.

En relación con una estabilidad conformacional aumentada con respecto al calor (es decir termoestabilidad conformacional), esto puede determinarse fácilmente midiendo la unión a ligando o usando métodos espectroscópicos tales como fluorescencia, CD o dispersión de luz a una temperatura particular. Normalmente, cuando el GPCR se une a un ligando, la capacidad del GPCR para unirse a ese ligando a una temperatura particular puede usarse para determinar la termoestabilidad conformacional del mutante. Puede ser conveniente determinar una “cuasi Tm” es decir la temperatura a la que el 50% del receptor está inactivado en las condiciones indicadas tras la incubación durante un periodo de tiempo dado (por ejemplo 30 minutos). Los mutantes GPCR de termoestabilidad conformacional mayor tienen una cuasi Tm aumentada en comparación con sus originales.

En relación con una estabilidad conformacional aumentada con respecto a un detergente o con respecto a un caótropo, normalmente se incuba el GPCR durante un tiempo definido en presencia de un detergente de prueba o un agente caotrópico de prueba y se determina la estabilidad conformacional usando, por ejemplo, la unión a ligando

o un método espectroscópico tal como se discutió anteriormente.

En relación con un extremo de pH, se escogería un pH de prueba típico (por ejemplo en el intervalo de 4,5 a 5,5 (pH

bajo) o en el intervalo de 8,5 a 9,5 (pH alto).

Debido a que se usan detergentes relativamente fuertes durante los procedimientos de cristalización, se prefiere que el GPCR mutante sea conformacionalmente estable en presencia de tales detergentes. El orden de “fuerza” de determinados detergentes es DDM, glucósido o maltósido C11 -C10 -C9 -C8, óxido de laurildimetilamina (LDAO) y SDS. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea más conformacionalmente estable con respecto a cualquiera de glucósido o maltósido C9, glucósido o maltósido C8, LDAO y SDS, y entonces se prefiere que se usen estos detergentes para pruebas de estabilidad.

Debido a su facilidad de determinación, se prefiere que se determine la termoestabilidad conformacional, y se eligen aquellos mutantes que tienen una termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con la proteína original con respecto a la condición seleccionada. Se apreciará que el calor actúa como desnaturalizante, y esto puede eliminarse fácilmente enfriando la muestra, por ejemplo colocándola en hielo. Se cree que la termoestabilidad también puede ser una guía para la estabilidad conformacional con respecto a otros desnaturalizantes o condiciones desnaturalizantes. Por tanto, es probable que la termoestabilidad conformacional aumentada se traduzca en estabilidad conformacional en detergentes desnaturalizantes, especialmente aquéllos que son más desnaturalizantes que DDM, por ejemplo aquellos detergentes con un grupo de cabeza más pequeño y una cadena de alquilo más corta y/o con un grupo de cabeza cargado. Se ha encontrado que un GPCR termoestable también es más estable frente a detergentes fuertes.

Cuando se usa un extremo de pH como la condición desnaturalizante, se apreciará que esto puede eliminarse rápidamente añadiendo un agente neutralizante. De manera similar, cuando se usa un caótropo como desnaturalizante, el efecto desnaturalizante puede eliminarse diluyendo la muestra por debajo de la concentración en la que el caótropo ejerce su efecto caotrópico.

En una realización particular de la invención, el GPCR es el receptor β-adrenérgico (por ejemplo de pavo) y el ligando es dihidroalprenolol (DHA), un antagonista.

En una realización preferida adicional de la invención, el GPCR es el receptor de adenosina A2a (A2aR) (por ejemplo, de ser humano) y el ligando es ZM 241385 (4-[2-[[7-amino-2-(2-furil)[1,2,4]-triazolo[2,3-α][1,3,5]triazin-5-il]amino]etil] fenol), un antagonista o NECA (5’-N-etilcarboxamidoadenosina), un agonista.

Todavía en una realización preferida adicional, el GPCR es el receptor de neurotensina (NTR) (por ejemplo, de rata) y el ligando es neurotensina, un agonista.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para preparar un GPCR mutante, comprendiendo el método

(a): llevar a cabo el método del primer aspecto de la invención,

(b): identificar la posición o posiciones del residuo o los residuos de aminoácido mutados en el GPCR mutante o los GPCR mutantes que se han seleccionado por la estabilidad conformacional aumentada, y

(c): sintetizar un GPCR mutante que contiene una mutación en una o más de las posiciones identificadas.

Como puede verse en los ejemplos, sorprendentemente, los cambios a un único aminoácido dentro del GPCR pueden aumentar la estabilidad conformacional de la proteína en comparación con la proteína original con respecto a una condición particular en la que la proteína se encuentra en una conformación particular. Por tanto, en una realización del método del segundo aspecto de la invención, un único residuo de aminoácido de la proteína original se cambia en la proteína mutante. Normalmente, el residuo de aminoácido se cambia al residuo de aminoácido hallado en el mutante sometido a prueba en el método del primer aspecto de la invención. Sin embargo, puede sustituirse por cualquier otro residuo de aminoácido, tal como cualquier residuo de aminoácido que se produce de manera natural (en particular, un residuo de aminoácido “codificable”) o un aminoácido no natural. Generalmente, por conveniencia, el residuo de aminoácido se sustituye por uno de los otros 19 aminoácidos codificables. Preferiblemente, es el residuo de aminoácido sustituido que está presente en el mutante seleccionado en el primer aspecto de la invención.

También como puede verse en los ejemplos, un aumento adicional en la estabilidad conformacional puede obtenerse sustituyendo más de uno de los aminoácidos de la proteína original. Normalmente, cada uno de los aminoácidos sustituidos es uno que se ha identificado usando el método del primer aspecto de la invención. Normalmente, cada aminoácido identificado se sustituye por el aminoácido presente en la proteína mutante aunque, tal como se observó anteriormente, puede sustituirse por cualquier otro aminoácido.

Normalmente, el GPCR mutante contiene, en comparación con la proteína original, desde 1 hasta 10 aminoácidos sustituidos, preferiblemente desde 1 hasta 8, normalmente desde 2 hasta 6 tal como 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos sustituidos.

Se apreciará que los múltiples mutantes pueden someterse al método de selección del primer aspecto de la invención. En otras palabras, los múltiples mutantes pueden proporcionarse en la etapa (a) del método del primer aspecto de la invención. Se apreciará que mediante el primer y/o segundo aspecto de la invención pueden prepararse GPCR mutagenizados de manera múltiple, cuya conformación se ha seleccionado para crear una proteína con múltiples mutaciones puntuales muy estable desde el punto de vista conformacional.

Los GPCR mutantes pueden prepararse mediante cualquier método adecuado. Convenientemente, la proteína mutante se codifica por una molécula de ácido nucleico adecuada y se expresa en una célula huésped adecuada. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas que codifican para el GPCR mutante pueden prepararse usando técnicas de clonación convencionales, mutagénesis dirigida al sitio y PCR tal como se conoce ampliamente en la técnica. Los sistemas de expresión adecuados incluyen sistemas de expresión inducibles o constitutivos en bacterias o levaduras, sistemas de expresión en virus tales como baculovirus, virus del bosque de Semliki y lentivirus, o transfección transitoria en células de mamífero o insecto. Las células huésped adecuadas incluyen células de E. coli, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Spodoptera frugiperda y Trichoplusiani. Las células huésped animales adecuadas incluyen HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40, etcétera. Se sabe que algunos GPCR requieren lípidos específicos (por ejemplo colesterol) para funcionar. En este caso, es deseable seleccionar una célula huésped que contenga el lípido. Adicional o alternativamente el lípido puede añadirse durante el aislamiento y la purificación de la proteína mutante. Se apreciará que estos sistemas de expresión y células huésped también pueden usarse al proporcionar el GPCR mutante en la parte (a) del método del primer aspecto de la invención.

Se conocen ampliamente en la técnica métodos biológicos moleculares para clonar y modificar mediante ingeniería genética genes y ADNc, para mutar ADN, y para expresar polipéptidos a partir de polinucleótidos en células huésped, tal como se muestra a modo de ejemplo en “Molecular cloning, a laboratory manual”, tercera edición, Sambrook, J. y Russell, D.W. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

En una realización adicional del primer o segundo aspecto de la invención se determina si el GPCR mutante seleccionado o preparado puede acoplarse a una proteína G. También se prefiere que se determine si el GPCR mutante seleccionado o preparado puede unirse a una pluralidad de ligandos de la misma clase como el ligando seleccionado con un orden de rango y/o amplitud de afinidad comparables a los del GPCR original.

Los GPCR mutantes con estabilidad conformacional aumentada en comparación con sus GPCR originales, particularmente aquéllos con termoestabilidad conformacional aumentada, puede prepararse mediante métodos de la invención.

Receptor -adrenérgico mutante

Los receptores β-adrenérgicos se conocen ampliamente en la técnica. Comparten homología de secuencia entre sí y se unen a adrenalina.

Un receptor β-adrenérgico mutante que, en comparación con el receptor β-adrenérgico de tipo natural correspondiente, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor β-adrenérgico de pavo tal como se expone en la figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338, puede prepararse mediante métodos de la invención.

El receptor β-adrenérgico mutante puede ser un mutante de cualquier receptor β-adrenérgico siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácido tal como se establece con referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor β-adrenérgico de pavo dada.

Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea uno de los que tiene al menos el 20% de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor β-adrenérgico de pavo dada, tal como se determinó usando MacVector y CLUSTALW (Thompson et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680). Más preferiblemente, el receptor mutante tiene al menos el 30% o al menos el 40% o al menos el 50% de identidad de secuencia de aminoácidos. Existe generalmente un grado más alto de identidad de secuencia de aminoácidos que se conserva alrededor del sitio ortostérico (“activo”) al que se une el ligando natural.

Tal como se describe en el ejemplo 1 y la figura 1 más adelante, la sustitución individual de los siguientes residuos de aminoácido en la secuencia β-adrenérgica de pavo original (tal como se muestra en la figura 9) conduce a un aumento en la termoestabilidad: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338.

Por tanto, los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptores β-adrenérgicos de pavo mutantes en

los que, en comparación con su original, uno o más de estos residuos de aminoácido se han sustituido por otro residuo de aminoácido. Los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptores β-adrenérgicos mutantes a partir de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se sustituyen por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el original puede ser un receptor β-adrenérgico que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural siempre que conserve la capacidad de unión a ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor βadrenérgico que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor β-adrenérgico de pavo cuando el receptor β-adrenérgico de pavo y el otro receptor β-adrenérgico se comparan usando MacVector y CLUSTALW.

La figura 9 muestra una alineación entre el receptor β-adrenérgico de pavo y los receptores β-adrenérgicos β1, β2 y β3 humanos.

Puede verse que Ile 72 de β1 humano corresponde a Ile 55 del receptor β-adrenérgico de pavo; Ile 47 de β2 humano corresponde a Ile 55 del receptor β-adrenérgico de pavo; y Thr51 de β3 humano corresponde a De 55 del receptor βadrenérgico de pavo. Otros residuos de aminoácido correspondientes en β1, β2 y β3 humanos pueden identificarse fácilmente con referencia a la figura 9.

Se prefiere que el aminoácido particular se sustituya por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular es una Ala, se prefiere que se sustituya por una Leu (por ejemplo, véase Ala 234, Ala 282 y Ala 334 del receptor β-adrenérgico de pavo en la figura 1).

Se prefiere que el receptor β-adrenérgico mutante tenga un aminoácido diferente en comparación con su original en más de una posición de aminoácido puesto que es probable que esto proporcione mayor estabilidad conformacional. Mutantes de receptor β1 humano particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácido se sustituyen por otro residuo de aminoácido: K85, M107, Y244, A316, F361 y F372. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Se preparan los receptores β1 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 ó 6 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

Mutantes de receptor β2 humano particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes aminoácidos se sustituyen por otro residuo de aminoácido: K60, M82, Y219, C265, L310 y F321. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Se prefieren los receptores β2 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 ó 6 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

La figura 26 muestra el efecto sobre la termoestabilidad cuando se transfirieron seis mutaciones termoestabilizantes en β1-m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) directamente al receptor β2 humano (mutaciones equivalentes K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M), preparando β2-m23 humano. Las Tm para β2 y β2-m23 humano eran de 29ºC y 41ºC respectivamente, mostrando así a modo de ejemplo la capacidad de transferencia de mutaciones termoestabilizantes de un receptor a otro receptor. Por consiguiente, un mutante de receptor β2 humano particularmente preferido es uno que comprende las mutaciones K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M.

Mutantes de receptor β3 humano particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes aminoácidos se sustituyen por otro residuo de aminoácido: W64, M86, Y224, P284, A330 y F341. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Se prefieren receptores β3 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 ó 6 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

Combinaciones de mutaciones particularmente preferidas se describen en detalle en las tablas 1 y 2 en el ejemplo 1, y los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptores β-adrenérgicos de pavo mutantes, y también receptores β-adrenérgicos mutantes en los que los aminoácidos en la posición correspondiente se han sustituido por otro aminoácido, normalmente el mismo aminoácido que se indica en las tablas 1 y 2 en el ejemplo 1.

Mutantes particularmente preferidos son aquéllos que contienen mutaciones en los aminoácidos que corresponde al residuo de aminoácido dado con referencia al receptor β-adrenérgico de pavo: (R68S, Y227A, A282L, A334L) (véase m6-10 en la tabla 2 más adelante); (M90V, Y227A, F338M) (véase m7-7 en la tabla 2 más adelante); (R68S, M90V,

V230A, F327A, A334L) (véase m10-8 en la tabla 2 a continuación); y (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) (véase m23 en la tabla 2 a continuación).

Receptor de adenosina mutante

Los receptores de adenosina se conocen ampliamente en la técnica. Comparten homología de secuencia entre sí y se unen a adenosina.

Un receptor de adenosina mutante que, en comparación con la adenosina de tipo natural correspondiente, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de adenosina A2a humano tal como se expone en la figura 10: Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315, Ala 54, Val 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239, puede prepararse mediante métodos de la invención.

El receptor de adenosina mutante puede ser un mutante de cualquier receptor de adenosina siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácido tal como se establece con referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor de adenosina A2a humano dado.

Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea uno que tiene al menos el 20% de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor de adenosina A2a humano dada, tal como se determinó usando MacVector y CLUSTALW. Preferiblemente, el GPCR mutante tiene al menos el 30% o al menos el 40% o al menos el 50% o al menos el 60% de identidad de secuencia. Normalmente, hay un grado más alto de conservación de secuencia en el sitio de unión a adenosina.

Tal como se describe en el ejemplo 2 más adelante, la sustitución individual de los siguientes residuos de aminoácido en la secuencia del receptor de adenosina A2a humano (tal como se muestra en la figura 10) conduce a un aumento en la termoestabilidad cuando se mide con el agonista 5’-N-etilcarboxamidoadenosina (NECA):

Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315.

La sustitución de los siguientes residuos de aminoácido en la secuencia del receptor A2a humano (tal como se muestra en la figura 10) conduce a un aumento en la termoestabilidad cuando se mide con el antagonista ZM 241385 (4-[2-[[7-amino-2-(2-furil)[1,2,4]-triazolo[2,3-α][1,3,5]triazin-5-il]amino]etil]fenol):

Ala 54, Val 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239.

Por tanto, los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptores de adenosina A2a humanos mutantes en los que, en comparación con su original, uno o más de estos residuos de aminoácido se han sustituido por otro residuo de aminoácido. Los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptores de adenosina mutantes a partir de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se sustituyen por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el original puede ser un receptor de adenosina que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión a ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor de adenosina que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor de adenosina A2a humano cuando el receptor de adenosina A2a humano y el otro receptor de adenosina se comparan usando MacVector y CLUSTALW.

La figura 10 muestra una alineación entre el receptor de adenosina A2a humano y otros tres receptores de adenosina humanos (A2b, A3 y A1).

Puede observarse que, por ejemplo, Ser 115 en el receptor A2b (indicado como AA2BR) corresponde a Gly 114 en el receptor An. De manera similar, puede observarse que Ala 60 en el receptor A3 (indicado como AA3R) corresponde a Ala en el receptor A2a, etcétera. Otros residuos de aminoácido correspondientes en los receptores de adenosina humanos A2b, A3 y A1 pueden identificarse fácilmente con referencia a la figura 10.

Se prefiere que el aminoácido particular en el original se sustituya por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular en el original es una Ala, se prefiere que se sustituya por una Leu.

Se prefiere que el receptor de adenosina mutante tenga un aminoácido diferente en comparación con su original en más de una posición de aminoácido. Receptores A2b de adenosina humanos particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácido se sustituyen por otro residuo de aminoácido: A55, T89, R123, L236 y V240. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val

o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Se prefieren receptores de adenosina A2b humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

Receptores de adenosina A3 humanos particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácido se sustituyen por otro residuo de aminoácido: A60, T94, W128, L232 y L236. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Se prefieren receptores de adenosina A3 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

Receptores de adenosina A1 humanos particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes residuos se sustituyen: A57, T91, A125, L236 y L240. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Combinaciones particularmente preferidas de mutaciones se describen en detalle en el ejemplo 2. Los métodos de la invención pueden usarse para preparar estos receptores de adenosina A2a humanos mutantes, y también otros receptores de adenosina mutantes en los que los aminoácidos en las posiciones correspondientes se han sustituido por otro aminoácido, normalmente el mismo aminoácido que se indicó en el ejemplo 2.

Mutantes del receptor de adenosina particularmente preferidos son aquéllos que contienen mutaciones en los aminoácidos que corresponden al residuo amino dado con referencia al receptor de adenosina A2a humano: (A54L, K122A, L235A) (Rant 17); (A54L, T88A, V239A, A204L) (Rant 19); y (A54L, T88A, V239A, K122A) (Rant 21).

Receptor de neurotensina mutante

Los receptores de neurotensina se conocen en la técnica. Comparten homología de secuencia y se unen a neurotensina.

Un receptor de neurotensina mutante que, en comparación con el receptor de neurotensina de tipo natural correspondiente, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se expone en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399, puede prepararse mediante métodos de la invención.

Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea uno que tiene al menos el 20% de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de receptor de neurotensina de rata dada, tal como se determinó usando MacVector y CLUSTALW. Preferiblemente, el GPCR mutante tiene al menos el 30% o al menos el 40% o al menos el 50% de identidad de secuencia de aminoácidos.

El receptor de neurotensina mutante puede ser un mutante de cualquier receptor de neurotensina siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácido tal como se establece con referencia a la secuencia de aminoácido de receptor de neurotensina de rata dada.

Tal como se describe en el ejemplo 3 más adelante, la sustitución individual de los siguientes residuos de aminoácido en la secuencia de receptor de neurotensina de rata (tal como se muestra en la figuras 11 y 28) conduce a un aumento en la termoestabilidad cuando se considera con respecto a la ausencia de neurotensina. Leu 72, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Lys 176, Thr 179, Met 181, Ser 182, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Leu 256, Asn 262, Val 268, Met 293, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Ser 362, Ala 385, Cys 386, Trp 391, Arg 392, His 393, Lys 397, Pro

399.

Tal como se describe en el ejemplo 3 más adelante, la sustitución individual de los siguientes residuos de aminoácido en la secuencia de receptor de neurotensina de rata (tal como se muestra en la figuras 11 y 28) conduce a un aumento en la termoestabilidad cuando se considera con respecto a la presencia de neurotensina. Ala 69, Ala 73, Ala 86, Ala 90, His 103, Val 165, Glu 166, Ala 177, Arg 183, Val 229, Met 250, Ile 253, Ile 260, Thr 279, Thr 294,

Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Pro 389, Gly 390, Arg 395.

Por tanto, los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptor de neurotensina de rata mutante en el que, en comparación con su original, uno o más de estos residuos de aminoácido se han sustituido por otro residuo de aminoácido. Los métodos de la invención también pueden usarse para preparar receptores de neurotensina mutantes a partir de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se sustituyen por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el original puede ser un receptor de neurotensina que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión a ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor de neurotensina que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor de neurotensina de rata cuando el receptor de neurotensina de rata y el otro receptor de neurotensina se comparan usando MacVector y CLUSTALW.

La figura 11 muestra una alineación entre el receptor de neurotensina de rata y dos receptores de neurotensina humanos 1 y 2. Puede verse, por ejemplo, que Ala 85 del receptor de neurotensina humano 1 corresponde a Ala 86 del receptor de neurotensina de rata, ese Phe 353 del receptor de neurotensina humano 1 corresponde a Phe 358 del receptor de neurotensina de rata, etcétera. Otro residuo de aminoácido correspondiente en los receptores de neurotensina humanos 1 y 2 pueden identificarse fácilmente con referencia a la figura 11.

Se prefiere que el receptor de neurotensina mutante tenga un aminoácido diferente en comparación con su original en más de una posición de aminoácido. Receptores de neurotensina humanos particularmente preferidos (NTR1) son aquéllos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácido se sustituyen por otro residuo de aminoácido: Ala 85, His 102, Ile 259, Phe 337 y Phe 353. Normalmente, los residuos de aminoácido dados se sustituyen por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Se prefieren los receptores de neurotensina (NTR1) humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

Receptores de neurotensina (NTR2) humanos particularmente preferidos son aquéllos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácido se sustituyen por otro residuo de aminoácido: V54, R69, T229, P331 y F347. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se sustituye por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo). Se prefieren receptores de neurotensina (NTR2) humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describieron anteriormente.

Combinaciones particularmente preferidas de mutaciones se describen en detalle en el ejemplo 3. Los métodos de la invención pueden usarse para preparar estos receptores de neurotensina de rata mutantes, y también otros receptores de neurotensina mutantes en los que los aminoácidos en las posiciones correspondientes se han sustituido por otro aminoácido, normalmente el mismo aminoácido que se indica en el ejemplo 3.

Mutantes de receptor de neurotensina particularmente preferidos son aquéllos que contienen mutaciones en los residuos de aminoácido que corresponden al residuo de aminoácido dado con referencia al receptor de neurotensina de rata: (F358A, A86L, I260A, F342A) (Nag7m); (F358A, H103A, I260A, F342A) (Nag7n).

Receptor muscarínico mutante

Los receptores muscarínicos se conocen en la técnica. Comparten homología de secuencia y se unen a muscarina.

Un receptor muscarínico mutante que, en comparación con el receptor muscarínico de tipo natural correspondiente, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor muscarínico humano M1 tal como se expone en la figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 y Met 384, puede prepararse mediante métodos de la invención.

Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea uno que tiene al menos el 20% de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor muscarínico humano dada, tal como se determinó usando MacVector y CLUSTALW. Preferiblemente, el GPCR mutante tiene al menos el 30% o al menos el 40% o al menos el 50% de identidad de secuencia de aminoácidos.

El receptor muscarínico mutante puede ser un mutante de cualquier receptor muscarínico siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácido tal como se establece con referencia a la secuencia de aminoácidos

de receptor muscarínico dada.

Por tanto, los métodos de la invención pueden usarse para preparar un receptor muscarínico humano mutante en el que, en comparación con su original, uno o más de estos residuos de aminoácido se han sustituido por otro residuo de aminoácido. Los métodos de la invención pueden usarse para preparar receptores muscarínicos mutantes a partir de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se sustituyen por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el original puede ser un receptor muscarínico que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión a ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor muscarínico que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor muscarínico humano cuando el receptor muscarínico humano y el otro receptor muscarínico se comparan usando MacVector y CLUSTALW.

Se prefiere que el aminoácido particular se sustituya por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular es una Ala, se prefiere que se sustituya por una Leu.

Tal como se muestra en los ejemplos 1-3 y se describió anteriormente, se han identificado mutaciones termoestabilizantes ampliamente dispersas a lo largo de las secuencias del receptor beta-adrenérgico de pavo, el receptor de adenosina humano, el receptor de neurotensina de rata y el receptor muscarínico humano. La figura 17 proporciona una alineación de estas secuencias con la secuencia del beta-2AR humano de manera que cuando las mutaciones termoestabilizantes se posicionan sobre las secuencias entonces, en 11 casos de un total de 70, dos secuencias contienen mutaciones en la misma posición (indicadas en la figura 17 con una estrella). Por tanto, se apreciará que una vez que se han identificado una o más mutaciones estabilizantes en un GPCR, un GPCR adicional con estabilidad aumentada puede generarse alineando las secuencias de aminoácidos de los GPCR y haciendo la misma una o más mutaciones en la posición o posiciones correspondientes. Este concepto se muestra a modo de ejemplo claramente en la figura 26 en el que las seis mutaciones termoestabilizantes en β1-m23 de pavo se transfirieron directamente al receptor β2 humano. El mutante resultante, β2-m23, tenía una Tm 12ºC mayor que la del receptor β2 humano.

Por consiguiente, los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención pueden usarse en un método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada con respecto a su GPCR original, comprendiendo el método:

(i): identificar en la secuencia de aminoácidos el uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad conformacional aumentada con respecto al primer GPCR original, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y

(ii): hacer una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR en la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada con respecto al segundo GPCR original; en el que

el uno o más mutantes de un primer GPCR original pueden seleccionarse o prepararse según los métodos de la invención. Por consiguiente, se apreciará que el uno o más mutantes de un primer GPCR original pueden prepararse mediante métodos de la invención, y puede usarse en un método para crear GPCR conformacionalmente bloqueados, estables, mediante mutagénesis.

Por ejemplo, tras la selección de GPCR mutantes que tienen estabilidad conformacional aumentada en una conformación particular según los métodos de la invención, la mutación estabilizante puede identificarse y el aminoácido en una posición correspondiente en un segundo GPCR sustituido para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en una conformación particular con respecto a un segundo GPCR original.

Para evitar dudas, el primer GPCR original puede ser un GPCR que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión a ligando.

Normalmente, identificar la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original implica alinear sus secuencias de aminoácidos con la del GPCR original, por ejemplo usando el programa Clustal W (Thompson et al., 1994).

Por “posición o posiciones correspondientes”, se incluye el significado de la posición en la secuencia de aminoácidos de un segundo GPCR que se alinea con la posición en la secuencia de aminoácidos del primer GPCR, cuando el primer y segundo GPCR se comparan mediante alineación, por ejemplo usando MacVector y Clustal W. Por ejemplo, tal como se muestra en la alineación en la figura 17, las seis mutaciones estabilizantes en β1-m23 de pavo,

R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A y F338M, están en posiciones que corresponden a los residuos K60, M82, Y219, C265, L310 y F321 respectivamente en el receptor β2 humano.

Habiendo identificado la posición o posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácidos de un segundo GPCR, los aminoácidos en esas posiciones se sustituyen por otro aminoácido. Normalmente, los aminoácidos se sustituyen por los mismos aminoácidos que sustituyeron a los aminoácidos en las posiciones correspondientes en el mutante del primer GPCR original (a menos que ya sean ese residuo). Por ejemplo, en la posición 68 en β1-m23 de pavo (R68S), un residuo de arginina se sustituyó por un residuo de serina. Por tanto, en la posición correspondiente en el receptor β2 humano, la posición 60 (K60), el residuo de lisina se sustituye preferiblemente por un residuo de serina.

Las mutaciones pueden hacerse en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, tal como se describió anteriormente y usando técnicas ampliamente establecidas en la técnica.

Se apreciará que el segundo GPCR puede ser cualquier otro GPCR. Por ejemplo, las mutaciones estabilizantes en un GPCR de una especie pueden transferirse a un segundo GPCR de otra especie. De manera similar, las mutaciones estabilizantes en una isoforma de GPCR particular pueden transferirse a un segundo GPCR que sea una isoforma diferente. Preferiblemente, el segundo GPCR original es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original. Los análisis filogenéticos han dividido los GPCR en tres clases principales basándose en la similitud de secuencia de proteína, es decir, clases 1, 2 y 3 cuyos prototipos son rodopsina, el receptor de secretina, y los receptores metabotrópicos de glutamato, respectivamente (Foord et al. (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288). Por tanto, el segundo GPCR puede ser un GPCR que es de la misma clase de GPCR que el primer GPCR original. De manera similar, los GPCR se han dividido en familias con referencia a ligandos naturales tales como glutamato y GABA. Por tanto, el segundo GPCR puede ser de la misma familia de GPCR que el primer GPCR original. Una lista de clases y familias de GPCR se ha producido por la International Union of Pharmacology (Foord et al. (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphardb.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward.

Se apreciará que el segundo GPCR original debe poder alinearse con el primer GPCR original de manera que las posiciones correspondientes de las mutaciones en el primer GPCR puedan determinarse en el segundo GPCR. Por tanto normalmente, el segundo GPCR original tiene al menos el 20% de identidad de secuencia con respecto al primer GPCR original y más preferiblemente al menos el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% de identidad de secuencia con respecto al primer GPCR original. Sin embargo, algunos GPCR tienen identidad de secuencia baja (por ejemplo: los GPCR de familia B y C) y al mismo tiempo son muy similares en su estructura. Por tanto, el umbral del 20% de identidad de secuencia no es absoluto.

Los inventores han razonado que la identificación de motivos estructurales en los que se encuentra la una o más mutaciones en un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada, serán útiles en la producción de GPCR mutantes adicionales con estabilidad conformacional aumentada.

Por consiguiente, los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención pueden usarse en un método para producir un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) mutante con estabilidad conformacional aumentada con respecto a su GPCR original, comprendiendo el método:

(i): proporcionar uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad conformacional aumentada con respecto al primer GPCR original

(ii): identificar en un modelo de proteína de membrana estructural el motivo o motivos estructurales en los que el uno

: o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y

(iii) hacer una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un motivo o motivos estructurales correspondientes en un segundo GPCR original, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada con respecto al segundo GPCR original; en el que el uno o más mutantes de un primer GPCR original pueden seleccionarse o prepararse según los métodos de la invención.

El mapeo de mutaciones conformacionalmente estabilizantes en uno o más modelos estructurales conocidos puede usarse para identificar motivos estructurales particulares en los que se encuentran tales mutaciones estabilizantes. Se han mapeado mutaciones conformacionalmente estabilizantes del receptor β1-adrenérgico en modelos estructurales del receptor β2-adrenérgico (Rasmussen et al. (2007) Nature 450, 383-387; Cherezov et al. (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al. (2007) Science 318: 1266-1273) con el fin de identificar tales motivos. Por ejemplo, la tabla (vi) enumera las mutaciones del receptor β1-adrenérgico de pavo que se han mapeado en el receptor β2-adrenérgico humano y describe los motivos estructurales correspondientes en los que se encuentran. Tal como se comentó en el ejemplo 4, el mapeo de la mutación Y227A (equivalente a Y219 en el receptor β2 humano) en el receptor β2-adrenérgico humano revela su posición en la superficie de contacto entre hélices de manera que la mutación puede mejorar el empaquetamiento en la superficie de contacto helicoidal (véanse las

figuras 15, 16 y 23). De manera similar, el mapeo de la mutación M90V (equivalente a M82 en el receptor β2 humano) en el receptor β2-adrenérgico humano revela que está en la hélice 2 en un punto en el que la hélice está curvada (véanse las figuras 15, 16 y 20). Se encontró que otras mutaciones se encuentran en motivos estructurales adicionales que incluyen superficies de hélice transmembrana apuntando hacia la bicapa lipídica, regiones límite hidrófoba-hidrófila, cavidades de unión de proteína y regiones de bucle (véanse la tabla (vi) y las figuras 18-19, 2122 y 24-25).

Tales motivos estructurales, en virtud de los cuales están contenidas mutaciones conformacionalmente estabilizantes, son importantes en la determinación de la estabilidad de la proteína. Por tanto seleccionar como diana las mutaciones para estos motivos proporcionará la generación de GPCR mutantes conformacionalmente estabilizados. De hecho, existen varios casos en los que más de una mutación se mapeó en el mismo motivo estructural. Por ejemplo, las mutaciones Y227A, V230A y A234L en el receptor β1-adrenérgico de pavo se mapearon en la misma superficie de contacto helicoidal, las mutaciones V89L y M90V se mapearon en la misma curvatura helicoidal y las mutaciones F327A y A334L se mapearon en la misma superficie helicoidal que apunta hacia la bicapa lipídica (tabla (vi)). Por tanto, cuando se ha identificado una mutación conformacionalmente estabilizante, la determinación del motivo estructural en el que está ubicada esa mutación permitirá la identificación de mutaciones conformacionalmente estabilizantes adicionales.

Se apreciará que el uno o más mutantes de un primer GPCR original pueden prepararse mediante métodos de la invención, y pueden usarse en un método para crear GPCR conformacionalmente bloqueados, estables, mediante mutagénesis. Por ejemplo, tras la selección de GPCR mutantes que tienen estabilidad conformacional aumentada en una conformación particular según los métodos de la invención pueden identificarse los motivos estructurales en los que se encuentran tales mutaciones estabilizantes. Hacer una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define el motivo estructural correspondiente en otro GPCR entonces puede usarse para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en una conformación particular con respecto a su GPCR original.

Se ha realizado una alineación de secuencias múltiple de las secuencias de aminoácidos de los receptores beta2AR humano, NTR1 de rata, beta-1 AR de pavo, de adenosina A2aR humano y muscarínico M1 (figura 17) que muestra que, cuando las mutaciones termoestabilizantes identificadas (véanse los ejemplos 1-3) se posicionan en las secuencias entonces, en 11 casos de un total de 70, dos secuencias contienen mutaciones en la misma posición (indicadas en la figura 17 con una estrella). Sin querer restringirse a ninguna teoría, los inventores creen que las mutaciones termoestabilizantes en estas posiciones deben ser de transferabilidad potenciada para su mapeo en un modelo de proteína de membrana estructural. Por tanto, el mutante del primer GPCR original puede ser el receptor beta-2AR humano mutante, NTR1 de rata, beta-1 AR de pavo, de adenosina A2aR humano o muscarínico M1 humano que, en comparación con su receptor original correspondiente, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del beta2 AR humano tal como se expone en la figura 17: Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 y Val 317, preparado mediante métodos de la invención.

Con el fin de identificar el motivo o motivos estructurales, las mutaciones conformacionalmente estabilizantes se mapean en una estructura conocida de una proteína de membrana.

Por “proteína de membrana” quiere decirse una proteína que está unida a o asociada con una membrana de una célula u orgánulo. Preferiblemente, la proteína de membrana es una proteína integral de membrana que está integrada permanentemente en la membrana y sólo puede retirarse usando detergentes, disolventes no polares o agentes desnaturalizantes que rompan físicamente la bicapa lipídica.

El modelo estructural de una proteína de membrana puede ser cualquier modelo estructural adecuado. Por ejemplo, el modelo puede ser una estructura cristalina conocida. Los ejemplos de estructuras cristalinas de GPCR incluyen rodopsina bovina (Palczewski, K. et al., Science 289, 739-745. (2000)) y receptor β2-adrenérgico humano (Rasmussen et al., Nature 450, 383-7 (2007); Cberezov et al. (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al. (2007) Science 318:1266-1273). Las coordenadas para la estructura del preceptor β2-adrenérgico humano pueden encontrarse en el RCSB Protein Data Bank con los códigos de registro: 2rh1, 2r4r y 2r4s. Alternativamente, el modelo estructural puede ser un modelo generado por ordenador basándose en la homología o usando métodos de predicción de estructuras de novo (Qian et al. Nature (2007) 450: 259-64).

Se apreciará que las mutaciones conformacionalmente estabilizantes de un GPCR mutante dado pueden mapearse en un modelo estructural de cualquier proteína de membrana que tenga suficiente similitud estructural con el GPCR. En particular, el dominio de la proteína de membrana debe tener suficiente similitud estructural con el dominio del GPCR en el que se encuentra la mutación conformacionalmente estabilizante, para que una mutación dada pueda transferirse.

Un dominio de proteína está definido normalmente como un ensamblaje plegado de manera diferenciada de elementos de estructura secundaria que puede ser independiente como una proteína individual o ser parte de una

proteína más grande en combinación con otros dominios. Es comúnmente una unidad evolutiva funcional.

Los GPCR son proteínas de dominio esencialmente individuales excluyendo aquéllas con dominios N-terminales grandes. Por tanto, normalmente, el modelo estructural es de una proteína de membrana que comprende al menos un dominio que tiene suficiente similitud estructural con el GPCR.

La similitud estructural puede determinarse indirectamente mediante el análisis de identidad de secuencia, o directamente mediante comparación de estructuras.

Con respecto a la identidad de secuencia, la secuencia de aminoácidos que codifica para el dominio del GPCR en el que el mutante tiene al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, se alinea con una secuencia de aminoácidos que codifica para un dominio de una proteína de membrana para la que está disponible un modelo estructural. Se apreciará que una o más de estas secuencias puede contener una secuencia insertada o extensiones N-terminales o C-terminales que son adicionales al dominio conservado de núcleo. Para una alineación óptima, tales secuencias se eliminan para no sesgar el análisis. Las proteínas de membrana con suficiente identidad de secuencia a lo largo del dominio en cuestión pueden usarse entonces como modelo estructural para mapear mutaciones. Se ha demostrado para dominios de proteína soluble que su estructura 3D se conserva ampliamente por encima del 20% de identidad de secuencia y se conserva bien por encima del 30% de identidad, aumentando el nivel de conservación estructural a medida que aumenta la identidad de secuencia hasta el 100% (Ginalski, K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177). Por tanto, se prefiere que el modelo de proteína de membrana estructural sea un modelo de una proteína de membrana que contiene un dominio que comparte al menos el 20% de identidad de secuencia con el dominio de GPCR mutante que contiene el al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y más preferiblemente al menos el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos el 95% o el 99% de identidad de secuencia.

La identidad de secuencia puede medirse mediante el uso de algoritmos tales como BLAST o PSI-BLAST (Altschul et al., NAR (1997), 25, 3389-3402) o métodos basados en modelos Hidden Markov (Eddy S et al., J Comput Biol (1995) Spring 2 (1) 9-23). Normalmente, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede determinarse usando cualquier programa informático adecuado, por ejemplo el programa GAP del University of Wisconsin Genetic Computing Group y se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula con respecto a los polipéptidos cuya secuencia se ha alineado de manera óptima. La alineación puede llevarse a cabo alternativamente usando el programa Clustal W (Thompson et al., 1994). Los parámetros usados pueden ser tal como sigue: Parámetros de alineación por emparejamiento rápido: tamaño K-tuple(palabra); 1, tamaño de ventana; 5, penalización de hueco; 3, número de diagonales superiores; 5. Método de puntuación: x por ciento. Parámetros de alineación múltiple: penalización abierta de hueco; 10, penalización de extensión de hueco; 0,05. Matriz de puntuación: BLOSUM.

Además de la identidad de secuencia, puede determinarse la similitud estructural directamente mediante la comparación de modelos estructurales. Pueden usarse modelos estructurales para detectar regiones de similitud estructural no evidentes a partir del análisis de secuencia solo, y que pueden o no ser contiguas en la secuencia. Por ejemplo, se cree que los GPCR de familia B y C comparten estructuras similares; sin embargo, su identidad de secuencia es muy baja. De manera similar, las acuaporinas de espinaca que transportan agua SoPip2, E. coli AqpZ, Methanococcus AqpM, Aqp4 de rata, Aqp1 humana y Aqp0 de oveja comparten una identidad de secuencia baja pero todas tienen estructuras similares.

Pueden construirse modelos estructurales de alta fidelidad para proteínas de estructura desconocida usando paquetes de software convencionales tales como MODELLER (Sali A y Blundell T, J Mol Biol (1993) 234(3) 779815), en los que la estructura se modela sobre una estructura conocida de una proteína homóloga. Tal modelado mejora con la identidad de secuencia creciente. Normalmente, la identidad de secuencia entre la secuencia de estructura desconocida y una secuencia de estructura 3D conocida es más del 30% (Ginalski, K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177). Además, métodos de predicción de estructura de novo basados en la secuencia sola pueden usarse para modelar proteínas de estructura desconocida (Qian et al., (2007) Nature 450:259-64). Una vez que las estructuras se han determinado experimentalmente o derivado mediante modelado, pueden detectarse regiones de similitud estructural mediante comparación directa de dos o más estructuras 3D. Pueden, por ejemplo, comprender elementos de estructura secundaria de una arquitectura y topología particular que pueden detectarse mediante el uso de software tal como DALI (Holm, L y Sander, C (1996) Science 273, 595-603). Pueden comprender disposiciones locales de cadenas laterales de aminoácidos y la estructura principal del polipéptido, o conjuntos específicos de átomos o grupos de átomos en una disposición espacial particular, que, por ejemplo, también puede detectarse mediante el uso de representaciones teóricas gráficas (Attymiuk, P et al., (2005) J Amer Soc Info Sci Tech 56 (5) 518-528). En este enfoque, los átomos o grupos de átomos dentro de las proteínas o regiones de proteínas que van a compararse se representan normalmente como los nodos de un gráfico, describiendo los bordes del gráfico los ángulos y las distancias entre los nodos. Los patrones comunes en estos gráficos indican motivos estructurales comunes. Este enfoque puede extenderse para incluir cualquier descriptor de átomos o grupos de átomos, tales como aceptor o donador de enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad, forma, carga o aromaticidad; por ejemplo las proteínas pueden mapearse espacialmente según tales descriptores usando GRID y usarse esta

representación como base para la búsqueda de similitud (Baroni et al. (2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294). Las descripciones de los métodos, disponibilidad de software, y directrices para la selección definida por el usuario de parámetros, umbrales y tolerancias se describen en las referencias facilitadas anteriormente.

El modelo de proteína de membrana estructural puede ser un modelo de GPCR estructural. Se apreciará que el modelo estructural de un GPCR puede ser un modelo del primer GPCR original. Por ejemplo, las mutaciones estabilizantes dentro de un GPCR mutante que tiene estabilidad conformacional aumentada pueden mapearse directamente en la estructura del primer GPCR original e identificarse los motivos estructurales en los que están ubicadas tales mutaciones. Cuando la estructura del primer GPCR original se desconoce, pueden usarse modelos estructurales de otros GPCR. Por ejemplo, las mutaciones conformacionalmente estabilizantes en un GPCR de una especie pueden mapearse en un modelo estructural conocido del mismo GPCR de otra especie. De manera similar, las mutaciones conformacionalmente estabilizantes en una isoforma de GPCR particular pueden mapearse en un modelo estructural conocido de otra isoforma de GPCR. Además, las mutaciones conformacionalmente estabilizantes de un GPCR puede mapearse en un GPCR de la misma clase o familia. Una lista de clases y familias de GPCR se ha producido por la International Union of Pharmacology (Foord et al. (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279288) y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphar-db.org/GPCR/ ReceptorFamiliesForward.

Tal como se describieron anteriormente, se apreciará que el modelo estructural es de cualquier GPCR siempre que tenga suficiente similitud estructural a lo largo del dominio en el que el GPCR mutante tiene al menos un aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original. Por tanto, se prefiere que el GPCR comparta al menos el 20% de identidad de secuencia con el mutante del primer GPCR original a lo largo del dominio de proteína que contiene el al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y más preferiblemente al menos el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos el 95% o el 99% de identidad de secuencia. Sin embargo, los inventores reconocen que el umbral del 20% de identidad de secuencia no es absoluto. Los GPCR con menos del 20% de identidad de secuencia con respecto al primer GPCR original también pueden servir como modelo estructural a los que se transfieren mutaciones estabilizantes, en los que la identidad de secuencia baja se compensa con otras similitudes, incluyendo, por ejemplo, la presencia de los mismos motivos de secuencia, unión a la misma proteína G o que tienen la misma función, o que tienen sustancialmente los mismos perfiles de hidropatía en comparación con el primer GPCR original.

El mapeo de mutaciones conformacionalmente estabilizantes en el modelo estructural puede hacerse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, normalmente, la secuencia de aminoácidos del GPCR para el que está disponible el modelo estructural se alinea con la secuencia de aminoácidos del mutante del primer GPCR original. La posición o posiciones del al menos un residuo de aminoácido diferente en el GPCR mutante con respecto al primer GPCR original puede ubicarse entonces en la secuencia de aminoácidos del GPCR para el que está disponible un modelo estructural.

Por “motivo estructural” se incluye el significado de una descripción tridimensional de la ubicación en un modelo estructural de GPCR de una mutación termoestabilizante. Por ejemplo, el motivo estructural puede ser cualquier motivo estructural secundario o terciario dentro del GPCR. Por “motivo estructural terciario” se incluye cualquier descriptor de átomos o grupos de átomos, tales como aceptor o donador de enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad, forma, carga o aromaticidad. Por ejemplo, las proteínas pueden mapearse espacialmente según tales descriptores usando GRID y usarse esta representación como base para definir un motivo estructural (Baroni et al. (2007) J Chem Inf Mod 47,279-294).

La tabla (vi) enumera los motivos estructurales en los que se halló que se encuentran las mutaciones estabilizantes del receptor β1 adrenérgico de pavo. Como se observa a partir de la tabla, las mutaciones se posicionan en varias ubicaciones distintas. Tres mutaciones están en regiones de bucle que se predice que son accesibles para disolvente acuoso. Ocho mutaciones están en las hélices α transmembrana y apuntan hacia la bicapa lipídica; tres de estas mutaciones están cerca del extremo de las hélices y puede considerarse que están en la capa límite hidrófoba-hidrófila. Ocho mutaciones se encuentran en las superficies de contacto entre las hélices α transmembrana, tres de las cuales están dentro de una región o bien distorsionada o bien curvada de la hélice y otras dos mutaciones se producen en una hélice pero están adyacentes a una o más otras hélices que contienen una curvatura adyacente en el espacio al residuo mutado. Estas últimas mutaciones podrían afectar el empaquetamiento de los aminoácidos dentro de la región de curvatura, lo que podría dar como resultado la termoestabilización. Otra mutación está en una cavidad de unión a sustrato.

Por consiguiente, el motivo estructural puede ser cualquiera de una superficie de contacto helicoidal, una curvatura de hélice, una hélice opuesta a una curvatura de hélice, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica en la capa límite hidrófoba-hidrófila, un región de bucle o una cavidad de unión a proteína.

Identificar un motivo estructural en el que se encuentra una mutación conformacionalmente estabilizante sugiere la importancia de ese motivo en la estabilidad de la proteína. Por tanto, hacer una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un motivo o motivos estructurales correspondientes en un segundo GPCR original, debe

proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacionalmente aumentada con respecto al segundo GPCR original.

La secuencia de aminoácidos que define un motivo estructural es la secuencia de aminoácidos primaria de los residuos de aminoácido que se combinan en la estructura secundaria o terciaria de la proteína para formar el motivo estructural. Se apreciará que una secuencia de aminoácidos primaria de este tipo puede comprender residuos de aminoácido contiguos o no contiguos. Por tanto, identificar la secuencia de aminoácidos que define el motivo estructural implicará determinar los residuos implicados y posteriormente definir la secuencia. Las mutaciones pueden hacerse en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo tal como se describió anteriormente y usando técnicas ampliamente establecidas en la técnica.

Por “motivo o motivos estructurales correspondientes” quiere decirse el motivo o motivos estructurales análogos identificados en el modelo estructural que están presentes en el segundo GPCR original. Por ejemplo, si se identificó una superficie de contacto helicoidal, la superficie de contacto helicoidal correspondiente en el segundo GPCR original sería la superficie de contacto entre las hélices que son análogas a las hélices presentes en el modelo estructural. Si se identificó una curvatura helicoidal, la curvatura helicoidal correspondiente sería la curvatura en la hélice que es análoga a la hélice curvada presente en el modelo estructural. Un motivo o motivos estructurales análogos en el segundo GPCR original pueden identificarse buscando secuencias de aminoácidos similares en la secuencia del segundo GPCR original que define el motivo o motivos en el modelo estructural, por ejemplo, mediante alineación de secuencia. Además, en la técnica están disponibles ampliamente algoritmos basados en ordenador que pueden usarse para predecir la presencia de motivos de proteína basados en una secuencia de aminoácidos. Por tanto, basándose en la posición relativa de un motivo particular dentro de la secuencia de aminoácidos y su posición con respecto a otros motivos, puede identificarse fácilmente un motivo estructural análogo. Se apreciará que si un modelo estructural del segundo GPCR original está disponible, el motivo o motivos estructurales análogos pueden mapearse directamente en la estructura de la proteína. Normalmente, la secuencia de aminoácidos que define el motivo estructural análogo tiene al menos el 20% de identidad de secuencia con la secuencia que define el motivo en el modelo estructural, más preferiblemente al menos el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% y el 90% de identidad de secuencia y aún más preferiblemente el 95% y el 99% de identidad de secuencia.

El segundo GPCR original puede ser el primer GPCR original. Para evitar dudas, el segundo GPCR original puede tener la secuencia que se produce de manera natural del primer GPCR original, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien a la proteína que se produce de manera natural o bien a un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la unión a ligando.

Alternativamente, el segundo GPCR original puede no ser el primer GPCR original. Por ejemplo, puede haberse identificado un mutante de un primer GPCR original que tiene estabilidad conformacional aumentada pero se desea generar un mutante de un GPCR diferente con estabilidad conformacional aumentada. Preferiblemente, el segundo GPCR original es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original tal como se describió anteriormente. Sin embargo, se apreciará que el segundo GPCR original pueda ser cualquier GPCR conocido siempre que comparta suficiente similitud estructural con el primer GPCR original, de manera que contenga un motivo estructural correspondiente en el que se encuentre la mutación conformacionalmente estabilizante del mutante del primer GPCR original. Por tanto normalmente, el segundo GPCR original tiene al menos el 20% de identidad de secuencia con respecto al primer GPCR original y más preferiblemente al menos el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% de identidad de secuencia. Sin embargo, tal como se mencionó anteriormente, algunos GPCR tienen identidad de secuencia baja (por ejemplo los GPCR de familia B y C) pero son similares en su estructura. Por tanto el umbral del 20% de identidad de secuencia no es absoluto.

Puesto que existen potencialmente miles de mutaciones que pueden examinarse en un GPCR para determinar la estabilidad conformacional aumentada, es ventajoso seleccionar como diana mutaciones particulares de las que se sabe que son importantes para conferir estabilidad conformacional. Por tanto, se apreciará que pueden usarse GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención en un método de selección de GPCR mutantes con estabilidad aumentada. En particular, llevando a cabo los métodos anteriores en los que el uno o más mutantes de un primer GPCR se seleccionan o preparan según los métodos de la invención pueden usarse para seleccionar como diana mutaciones con respecto a residuos de aminoácido particulares o con respecto a secuencias de aminoácidos que definen motivos estructurales importantes en la determinación de la estabilidad conformacional.

Por consiguiente, los métodos anteriores en los que el uno o más mutantes de un primer GPCR se seleccionan o preparan según los métodos de la invención pueden comprender además:

(I): seleccionar un ligando, siendo el ligando uno que se une al segundo GPCR original cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular

(II): determinar si el o cada mutante del segundo GPCR original cuando se encuentra en una conformación particular tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la

estabilidad del segundo GPCR original cuando se encuentra en la misma conformación particular con respecto a la unión a ese ligando, y

(III) seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad conformacional aumentada en comparación con el segundo GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado.

Se observará que las etapas (I), (II) y (III) corresponden a las etapas (b), (c) y (d) del método del primer aspecto de la invención descrito anteriormente. Por consiguiente, las preferencias de ligando y métodos de evaluación de la estabilidad son tal como se definieron anteriormente con respecto al método del primer aspecto de la invención.

Un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada con respecto a su GPCR original puede producirse mediante el método anterior que comprende las etapas (I), (II) y (III) incluyendo cualquiera de los GPCR mutantes proporcionados a continuación.

Por ejemplo, el GPCR mutante puede ser un GPCR mutante que tiene, en comparación con su receptor original, al menos un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones: (i) según la numeración del receptor β-adrenérgico de pavo tal como se expone en la figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 67, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315, (iii) según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se expone en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399, y (iv) según la numeración del receptor muscarínico tal como se expone en la figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 y Met 384.

La alineación de las secuencias de aminoácidos de β1 AR de pavo, receptor de adenosina humano, receptor de neurotensina de rata y receptor muscarínico humano en la figura 17, muestra que en 11 casos de 70, dos secuencias contienen mutaciones en la misma posición, concretamente en las siguientes posiciones según la numeración del beta2 AR humano tal como se expone en la figura 17: Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 y Val 317. Por tanto, el GPCR mutante puede ser uno que tiene, en comparación con su receptor original, un aminoácido diferente en una cualquiera de estas posiciones.

En otro ejemplo, el GPCR mutante puede ser un receptor β-adrenérgico mutante. Por ejemplo, el receptor βadrenérgico mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor β-adrenérgico de pavo tal como se expone en la figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338.

En otro ejemplo, el GPCR mutante puede ser un receptor de adenosina mutante. Por ejemplo, el receptor de adenosina mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de adenosina A2a humano tal como se expone en la figura 10: Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315.

En otro ejemplo, el GPCR mutante puede ser un receptor de neurotensina mutante. Por ejemplo, el receptor de neurotensina mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se expone en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399.

En otro ejemplo, el GPCR mutante puede ser un receptor muscarínico mutante. Por ejemplo, el receptor muscarínico mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor muscarínico humano tal como se expone en la figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 y Met 384.

Se prefiere que los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención tengan estabilidad conformacional aumentada con respecto a uno cualquiera de calor, un detergente, un agente caotrópico y un extremo de pH.

Se prefiere que los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención tengan termoestabilidad conformacional aumentada.

Se prefiere que los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención, incluyendo los receptores βadrenérgicos, de adenosina y de neurotensina mutantes, tengan una termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con su original cuando están en presencia o ausencia de un ligando para los mismos. Normalmente, el ligando es un antagonista, un agonista completo, un agonista parcial o un agonista inverso, ya sea ortostérico o alostérico. Tal como se discutió anteriormente, el ligando puede ser un polipéptido, tal como un anticuerpo.

Se prefiere que los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención, por ejemplo un receptor βadrenérgico mutante o un receptor de adenosina mutante o un receptor de neurotensina mutante sea al menos 2ºC más estable que su original preferiblemente al menos 5ºC más estable, más preferiblemente al menos 8ºC más estable e incluso más preferiblemente al menos 10ºC o 15ºC o 20ºC más estable que su original. Normalmente, la termoestabilidad de los receptores original y mutante se mide en las mismas condiciones. Normalmente, la termoestabilidad se somete a ensayo en una condición en la que el GPCR se encuentra en una conformación particular. Normalmente, esta condición seleccionada es la presencia de un ligando que se une al GPCR.

Se prefiere que los GPCR mutantes preparados mediante los métodos de la invención, cuando se solubilizan y se purifican en un detergente adecuado tengan una termoestabilidad similar con respecto a rodopsina bovina purificada en dodecilmaltósido. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante conserve al menos el 50% de su actividad de unión a ligando tras calentarse a 40ºC durante 30 minutos. Se prefiere además que el GPCR mutante conserve al menos el 50% de su actividad de unión a ligando tras calentarse a 55ºC durante 30 minutos.

Los GPCR mutantes preparados mediante los métodos dados a conocer en el presente documento son útiles para estudios de cristalización y son útiles en programas de descubrimiento de fármacos. Pueden usarse en mediciones biofísicas de la cinética receptor/ligando y parámetros termodinámicos, por ejemplo, mediante técnicas basadas en fluorescencia o resonancia de plasmón superficial. Pueden usarse en exámenes de unión a ligando, y pueden acoplarse a superficies sólidas para su uso en exámenes de alto rendimiento o como chips biosensores. Los chips biosensores que contienen los GPCR mutantes pueden usarse para detectar moléculas, especialmente biomoléculas.

Un polinucleótido puede codificar para un GPCR mutante preparado mediante los métodos de la invención. En particular, los polinucleótidos pueden codificar para el receptor β-adrenérgico mutante o los receptores de adenosina mutantes o los receptores de neurotensina mutantes preparados mediante los métodos de la invención. El polinucleótido puede ser ADN o puede ser ARN. Normalmente, está comprendido en un vector, tal como un vector que puede usarse para expresar el dicho GPCR mutante. Los vectores adecuados son unos que se propagan en y/o permiten la expresión en células bacterianas o de mamífero o de insecto.

Las células huésped, tales como células bacterianas o eucariotas, pueden contener un polinucleótido que codifica para el GPCR mutante preparado mediante los métodos de la invención. Células adecuadas incluyen células de E. coli, células de levadura, células de mamífero y células de insecto.

La invención ahora se describirá en más detalle con respecto a las siguientes figuras y ejemplos en los que:

Figura 1 Cambios de aminoácido en βAR que conducen a termoestabilidad. El cociente de estabilidad indica el % de actividad de unión restante de los mutantes tras calentar la muestra durante 30 min. a 32ºC. Todos los valores están normalizados con respecto a βAR34-424 (el 50% mostrado como una línea discontinua) para eliminar cualquier variabilidad experimental entre ensayos. Las barras muestran la estabilidad para cada mutante. Las letras en el eje x indican el aminoácido presente en el mutante. El aminoácido original y su posición en βAR34-424 se indica por debajo. Las barras que corresponden al mismo aminoácido en βAR34-424 están en el mismo color con flechas que indican las mejores mutaciones. Se calcularon los errores a partir de mediciones duplicadas; los mejores mutantes volvieron a someterse a ensayo posteriormente para determinar la Tm para cada mutación individual y para proporcionar un orden de rango de estabilidad preciso para cada mutante (véase el ejemplo 1).

Figura 2 Cadenas laterales en rodopsina que están en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestables en βAR34-424. Los residuos de aminoácido equivalentes en rodopsina con respecto a los residuos de aminoácido mutados en βAR34-424 se ubicaron en la estructura de rodopsina, basándose en una alineación entre la rodopsina, el receptor β1 adrenérgico, el receptor de neurotensina y el receptor de adenosina A2a (datos no mostrados). Se muestran las cadenas laterales en la misma hélice transmembrana como modelos de llenado de espacios en el mismo color. El nombre y la posición de los residuos de aminoácido son los de la rodopsina.

Figura 3 Evolución de la termoestabilidad en βAR. Partiendo de βAR-m10-8, las combinaciones de mutaciones se sometieron a transposición sistemáticamente para encontrar la combinación óptima de mutaciones (véase también la tabla 2).

Figura 4 Estabilidad de βAR-m23 y βAR34-424 en el apo-estado o que contiene el antagonista [3H]-DHA unido. Para determinar la Tm en ausencia de ligando (apo-estado, líneas discontinuas), se incubaron receptores solubilizados con detergente durante 30 minutos a las temperaturas indicadas antes de llevar a cabo el ensayo de unión. Para la determinación de Tm de la forma unida al antagonista (líneas continuas), los receptores solubilizados con detergente se incubaron previamente con [3H]-DHA, seguido por incubación a las temperaturas indicadas. βAR-m23 (círculos), y βAR34-424 (cuadrados). Los puntos de datos son de mediciones duplicadas en un experimento representativo.

Figura 5 Unión competitiva de agonistas a βAR-m23 y βAR34-424. Los ensayos de unión se realizaron en receptores parcialmente purificados en DDM; βAR-m23 (triángulos) y βAR34-424 (cuadrados). Se usó [3H]-DHA a una concentración tres veces mayor que la KD del receptor parcialmente purificado (véase Métodos). La unión de [3H]-DHA se completó con concentraciones crecientes de los agonistas, norepinefrina (a) e isoprenalina (b), o con un antagonista, alprenolol (c). Se calcularon el LogCE50 y los valores de CE50 correspondientes para los diferentes ligandos mediante regresión no lineal usando el software Prism de GraphPad y el error para los logCE50 era inferior al 10%. Las CE50 para la unión a ligando con respecto a βAR34-424 y βAR-m23 son: norepinefrina, βAR34-424 1,5 μM, βAR-m23 3,7 mM; isoprenalina, βAR34-424 330 nM, βAR-m23 20 μM; alprenolol, βAR 78 nM, βAR-m23 112 nM.

Figura 6 Estabilidad de βAR-m23 y βAR34-424 en cinco detergentes diferentes. Muestras de βAR34-424 (a), y βAR-m23

(b) solubilizadas en DDM se purificaron parcialmente en columnas de agarosa Ni-NTA permitiendo el intercambio en diversos detergentes diferentes: DDM (cuadrados), DM (triángulos), OG (triángulos invertidos), LDAO (diamantes) y NG (círculos). βAR es tan inestable en OG, NG y LDAO que no fue posible medir ninguna actividad tras la purificación a 6ºC. Se llevaron a cabo los ensayos tal como se describe en los métodos y se muestra la Tm en la intersección entre las curvas y la línea discontinua. Los resultados son de mediciones duplicadas en un experimento representativo realizado en paralelo. (c) Fotomicrografía de un cristal de mutante de βAR-m23, que mostró buen orden mediante difracción por rayos X.

Figura 7 Curva de termoestabilidad de βAR34-424 (Tm). Se realizaron ensayos de unión usando [3H]-dihidroalprenolol (DHA) como radioligando tal como se describe en “Métodos”. Se calentaron las muestras durante 30 minutos a diferentes temperaturas antes del ensayo. La Tm representa la temperatura a la que la unión disminuye hasta el 50%, valor mostrado como una línea discontinua. Los puntos de datos son de duplicados de un único experimento. Este experimento se ha repetido varias veces con resultados similares.

Figura 8 Ensayos de unión por saturación de membranas de βAR34-424 y βAR-m23. Se realizaron ensayos de unión tal como se describe en “Métodos” usando [3H]-dihidroalprenolol (DHA) como radioligando; βAR34-424 (a) y βAR-m23 (b). Se muestran gráficas Scatchard como recuadros junto con los valores correspondientes para Bmax y KD. Los puntos de datos son de duplicados de dos experimentos independientes para cada proteína. Se analizaron los datos mediante regresión no lineal usando el software Prism (GraphPad).

Figura 9 Alineación del receptor β-adrenérgico de pavo con receptores β1, β2 y β3 humanos.

Figura 10 Alineación de receptores de adenosina humanos.

Figura 11 Alineación de receptores de neurotensina.

Figura 12 Diagrama de flujo que muestra los dos formatos de ensayo diferentes de ligando (+) y ligando (-) usados para determinar termoestabilidad del receptor.

Figura 13 Perfil farmacológico del receptor de adenosina A2a mutante termoestable, Rant21. Unión por saturación de (A) antagonista y (B) agonista a receptores solubilizados. (C-F) Inhibición de la unión de [3H]ZM241385 mediante concentraciones crecientes de antagonistas (C) XAC y (D) teofilina, y agonistas (E) NECA y (F) R-PLA; la unión de [3H]ZM241385 (10 nM) en ausencia de ligando no marcado se fijó como el 100%. Se incubó cada receptor solubilizado con ligandos durante una hora en hielo en tampón de unión (Tris 50mM, pH 7,5 y DDM al 0,025%) que contiene NaCl 400 mM (A, C-F). Los datos mostrados son de dos experimentos independientes con cada punto de datos medido por triplicado. Los valores de KD y Ki se proporcionan en la tabla (iii).

Figura 14 Los mutantes termoestables muestran una dependencia disminuida con respecto a lípidos (A) y una supervivencia aumentada a una concentración superior de DDM (B) tras calentar en comparación con el receptor de tipo natural. Los receptores se solubilizaron en DDM al 1% (diluido en Tris 50 mM, pH 7,5 y NaCl 400 mM) y se inmovilizaron en agarosa Ni-NTA para la etapa IMAC. Se realizó el intercambio de tampón que contenía la concentración apropiada de DDM y/o lípidos durante los lavados y la elución de las perlas de Ni-NTA.

Figura 15 El mapeo de las mutaciones en m23 en M90V, Y227A, A282L y F338M en el receptor beta1 adrenérgico de pavo en residuos homólogos (M82, Y219, C265 y A321 respectivamente) en la estructura del receptor beta2 adrenérgico humano (Rasmussen et al. (2007) Nature 15; 383-387; códigos de registro pdb 2R4R y 2R4S) revela su posición en una superficie de contacto helicoidal y una curvatura de hélice respectivamente. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios marcados.

Figura 16 Mapeo de mutaciones en m23 en el receptor beta1 adrenérgico de pavo en residuos homólogos en la estructura del receptor beta2 adrenérgico humano (Cherezov et al. (2007) Science, 318:1258-65; código de registro pdb 2RH1). Se muestra el rastro de Cα del β2AR con el resto de fusión (lisozima T4) eliminado. Las seis mutaciones en βAR-m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) son equivalentes a los residuos de aminoácido K60, M82, Y219, C265, L310, F321 en el β2AR humano. Lys60 está en el extremo intracelular de la hélice 1 y apunta hacia la superficie de contacto lípido-agua. Met82 está cerca de la mitad de la hélice 2 y apunta hacia la cavidad deunión a ligando; la distancia más cercana entre el sustrato carazolol y la cadena lateral Met es 5,7 Å. Tyr219 está hacia el extremo intracelular de la hélice 5 y está en la superficie de contacto de hélice 5-hélice 6. Cys265 está en el extremo de la región de bucle entre las hélices 5 y 6 y apunta hacia fuera de las regiones transmembrana. Leu310 y Phe321 están ambas en la hélice 7 y ambas apuntan hacia la bicapa lipídica.

Figura 17 Alineación múltiple de secuencias de receptores beta-2AR humano, NTR1 de rata, beta-1 AR de pavo, adenosina A2aR humano y muscarínico M1 humano. En cada secuencia, las mutaciones termoestabilizantes se marcan con un cuadrado. Las mutaciones que se producen en dos o más secuencias están indicadas con una estrella.

Figura 18 Mapeo de la mutación 155A de betalAR de pavo (beta2AR I47 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en la superficie de contacto entre 3 hélices (H1, H2 curvatura, H7 curvatura). Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde arriba.

Figura 19 Mapeo de la mutación V89L de beta1AR de pavo (beta2AR V81 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en la curvatura en la hélice 2. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde arriba.

Figura 20 Mapeo de la mutación M90V de beta1AR de pavo (beta2AR M82 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en la curvatura en la hélice 2 orientada hacia la cavidad de unión. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde arriba.

Figura 21 Mapeo de la mutación I129V de beta1AR de pavo (beta2AR I121 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está opuesta a una curvatura en la hélice 5. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde abajo.

Figura 22 Mapeo de la mutación F338M de beta1AR de pavo (beta2AR F321 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en la curvatura en la hélice 7. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde arriba.

Figura 23 Mapeo de la mutación Y227A de beta1AR de pavo (beta2AR Y219 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en la superficie de contacto hélice-hélice. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde abajo.

Figura 24 Mapeo de la mutación A282L beta1AR de pavo (beta2AR C265 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en la región de bucle. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en

posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde arriba.

Figura 25 Mapeo de la mutación R68S de beta1AR de pavo (beta2AR K60 humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro pdb 2RH1). La mutación está en el límite lípido-agua, apuntando hacia el disolvente. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como modelo de llenado de espacios. Se muestran los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes en el receptor β1 adrenérgico de pavo como modelos de llenado de espacios y se colocan flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista desde arriba con ángulo.

Figura 26 Comparación de las termoestabilidades de tres receptores βD adrenérgicos (β1 de pavo (�), β1 humano (�) y β2 humano (�)) y dos receptores termoestabilizados (β1-m23 de pavo (�) y β2-m23 humano (+)). Las seis mutaciones termoestabilizantes en β1-m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) se transfirieron todas directamente al receptor β2 humano (K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M) haciendo β2-m23, basándose en la alineación en la figura 9. Los mutantes resultantes se expresaron de manera transitoria en células de mamíferos, se solubilizaron en dodecilmaltósido al 0,1% y se sometieron a ensayo para determinar la termoestabilidad en el formato sin ligando (calentar el apo-estado, enfriar bruscamente en hielo, añadir 3H-DHA). Las Tm aparentes para β1 y β2-m23 de pavo eran de 23ºC y 45ºC respectivamente, dando un ΔTm de 22ºC tal como se observó anteriormente en el receptor expresado en E. coli. Las Tm para β2 y β2-m23 humanos eran de 29ºC y 41ºC respectivamente, mostrando que el apo-receptor se estabilizó en 12ºC. Esto muestra a modo de ejemplo el principio de la capacidad de transferencia de mutaciones termoestabilizantes de un receptor a otro receptor, que en este caso tienen una identidad del 59%. El receptor β1 humano (Tm~12ºC) es mucho menos estable que el receptor β1 de pavo.

Figura 27 Porcentaje de identidad del receptor β1 adrenérgico de pavo, el receptor de adenosina humano y el receptor de neurotensina de rata con respecto a receptores β adrenérgicos humanos, receptores de adenosina humanos y receptores de neurotensina humanos, respectivamente.

Figura 28 Alineación de receptores de neurotensina.

Ejemplo 1: Estabilización conformacional del receptor -adrenérgico en forma resistente al detergente

Sumario

Hay más de 500 receptores acoplados a la proteína G no olorosos (GPCR) codificados por el genoma humano, muchos de los cuales se predice que son posibles dianas terapéuticas, pero sólo hay una estructura disponible, la de la rodopsina bovina, para representar a toda la familia. Existen muchos motivos para la falta de progreso en la determinación de estructura de GPCR, pero se plantea la hipótesis de que mejorar la estabilidad frente al detergente de estos receptores y simultáneamente bloquearlos en una conformación preferida mejorará enormemente las probabilidades de cristalización. Una estrategia genérica para el aislamiento de mutantes termoestables solubilizados con detergente de un GPCR, el receptor β-adrenérgico, se desarrolló basándose en mutagénesis de exploración de alanina seguido de un ensayo para determinar la estabilidad del receptor. De 318 mutantes sometidos a prueba, 15 mostraron un aumento medible en su estabilidad. Tras la optimización del residuo de aminoácido en el sitio de cada mutación inicial, se construyó un receptor estable de manera óptima combinando mutaciones específicas. El receptor mutante más estable, βAR-m23, contenía 6 mutaciones puntuales que condujeron a una Tm 21ºC más alta que la de la proteína nativa y, en presencia de antagonista unido, βARm23 era tan estable como la rodopsina bovina. Además, βAR-m23 era significativamente más estable en un amplio intervalo de detergentes ideales para cristalización y estaba preferentemente en una conformación antagonista en ausencia de ligando.

Resultados

Selección de mutaciones individuales que aumentan la termoestabilidad del receptor 1 adrenérgico

βAR de eritrocitos de pavo es una diana ideal para estudios estructurales debido a que está ampliamente caracterizado y se expresa en altos niveles en células de insecto usando el sistema de expresión de baculovirus [10,11]. La mejor sobreexpresión de βAR se obtiene usando una versión truncada del receptor que contiene los residuos 34-424 (βAR34-424) [9] y esto se usó como punto de partida para este trabajo. Se usó la mutagénesis de exploración de alanina para definir residuos amino en βAR34-424 que, cuando se mutan, alteraban la termoestabilidad del receptor; si una alanina estaba presente en la secuencia se mutaba a un residuo de leucina. Se hicieron un total de 318 mutaciones a los residuos de aminoácido 37-369, una región que abarca los siete dominios transmembrana y 23 residuos de aminoácido en el extremo terminal C; las mutaciones en 15 residuos de amino no se obtuvieron debido a la fuerte estructura secundaria en el molde de ADN. Tras secuenciar cada mutante para asegurar la presencia de sólo la mutación deseada, se expresaron funcionalmente los receptores en E. coli y se sometieron a

ensayo para determinar la estabilidad.

Se realizó el ensayo para determinar la termoestabilidad en receptores solubilizados con detergente no purificados calentando los receptores a 32ºC durante 30 minutos, enfriando bruscamente la reacción en hielo y realizando después un ensayo de unión a radioligando, usando el antagonista [3H]-dihidroalprenolol, para determinar el número de moléculas de βAR34-424 funcionales restantes en comparación con el control no calentado. Calentar el βAR34-424 no mutado a 32ºC durante 30 min. antes del ensayo redujo la unión a aproximadamente el 50% del control no calentado (figura 7); se normalizaron todos los datos para los mutantes incluyendo el βAR34-424 no mutado como control en cada ensayo realizado. En la primera ronda de examen, dieciocho mutantes mostraron un aumento aparente en su estabilidad, manteniendo más del 75% de unión a antagonista tras calentar y expresándose en E. coli en al menos el 50% de los niveles de βAR34-424 nativo. En vista de la posibilidad de aumentar adicionalmente la estabilidad de estos mutantes, se mutaron cada uno de los 18 residuos a 2-5 residuos de aminoácido alternativos de tamaño o carga variables (figura 1). De estos 18 mutantes, 12 no mejoraron con cambios adicionales, 5 tenían mejor termoestabilidad si estaba presente otro aminoácido y una mutación del primer examen resultó ser un falso positivo. Además, tres residuos que no estaban estabilizados tras la mutación a alanina (V89, S151, L221) se mutaron a un intervalo de otros residuos de aminoácido; las dos posiciones que cuando se mutan a alanina no afectaron a la termoestabilidad tampoco se vieron afectadas por otros cambios. Por el contrario, V89 mostró menos termoestabilidad cuando se muta a alanina, pero la termoestabilidad aumentó cuando se mutaba a Leu. Por tanto, la exploración de alanina inicial proporcionó satisfactoriamente dos tercios de los mejores residuos de aminoácido de los sometidos a prueba para cualquier posición dada.

Se determinaron la posición y el entorno predichos para cada uno de los 16 residuos amino que proporcionaron los mejores aumentos en termoestabilidad cuando se mutan alineando la secuencia de βAR con la de rodopsina cuya estructura se conoce (figura 2). Se predijo que catorce de estos residuos estaban presentes en hélices α transmembrana, estando cinco de los residuos predichos orientados hacia el lípido, 4 estando profundamente enterrados y se predijo que el resto estaría en las superficies de contacto entre las hélices. Se esperaría que algunos de estos residuos interaccionaran entre sí en la estructura de βAR, tal como los aminoácidos G67 y R68 consecutivos (V63 y Q64 en rodopsina), o los aminoácidos dentro de la agrupación Y227, R229, V230 y A234 en la hélice 5 (Y223, Q225, L226 y V230 en rodopsina). Otros residuos de aminoácido que podrían interaccionar en βAR eran Q194A en el bucle 2 externo y D322A en el bucle 3 externo (G182 y P285 en rodopsina, respectivamente).

Se determinó el aumento en la estabilidad que cada mutación individual proporcionó a βAR34-424 midiendo la Tm para cada mutante (resultados no mostrados); la Tm en este contexto es la temperatura que proporcionó una disminución del 50% en la unión funcional tras calentar el receptor durante 30 minutos. Cada mutación aumentó la Tm de βAR34424 en 1-3ºC, con la excepción de M90A y Y227A que aumentaron la Tm en 8ºC.

Combinación de mutaciones para preparar un receptor estable de manera óptima

Inicialmente, se combinaron las mutaciones que mejoraron la termoestabilidad que estaban adyacentes entre sí en la secuencia amino primaria de βAR. Se expresaron y sometieron a ensayo las construcciones que contenían las mutaciones G67A y R68S, o diferentes combinaciones de las mutaciones en el extremo de la hélice 5 (Y227A, R229Q, V230A y A234L); los valores de Tm (resultados no mostrados) fueron sólo 1-3ºC más altos que la Tm para βAR34-424 y un mutante era en verdad ligeramente menos estable, sugiriendo que combinar mutaciones que están adyacentes entre sí en la secuencia de aminoácidos primaria no mejora mucho la termoestabilidad. Posteriormente, se combinaron las mutaciones para las que se predijo que serían distantes entre sí en la estructura. Se realizaron reacciones de PCR usando diversas mezclas de cebadores para combinar hasta 5 mutaciones diferentes de una manera aleatoria y luego se sometieron a prueba para determinar la termoestabilidad (tabla 1). La mejor de estas combinaciones aumentó la Tm más de 10ºC en comparación con la Tm de βAR34-424. En algunos casos, hubo un efecto aditivo claro en la Tm con la incorporación secuencial de mutaciones individuales. Esto se observa en una serie de 3 mutantes, m4-1, m4-7 y m4-2, la adición de V230A a m4-1 aumentando la Tm en 2ºC y la mutación adicional D332A en m4-7 aumentando la Tm 3ºC más. Los mutantes que contenían Y227A y M90A mostraron todos un aumento en la Tm de 10ºC o más. Sólo estas dos mutaciones juntas aumentaron la Tm de βAR34-424 en 13ºC (m7-5), sin embargo, la unión a antagonista total fue inferior al 50% de βAR34-424 sugiriendo una expresión afectada de este mutante. La adición de F338M a m7-5 no aumentó la termoestabilidad, pero aumentó los niveles de expresión funcional en E. coli.

Tabla 1 Combinaciones de mutaciones mediante PCR. Se realizaron 10 reacciones de PCR combinando diferentes pares de cebadores que contenían las mutaciones seleccionadas. Se muestran las reacciones de PCR satisfactorias en la tabla. Se sometió a ensayo la estabilidad de estos nuevos mutantes tal como se describe en la figura 7 y la Tm calculada. Se muestran los resultados como la media ± E.E. de los duplicados.

PCR: Receptor Mutaciones Tm (ºC)

βAR34-424: 31,7±0,1

4: m4-1 G67A, G98A 35,5±0,9

m4-2: G67A, G98A, V230A, 40,9±0,9

D322A

m4-6: G98A, D322A 35,0±0,2

m4-7: G67A, G98A, V230A 38,0±1,2

6: m6-1 Y227A, A234L, A282L, A334L 41,6±0,9

m6-4: R68S, Y227A, A234L, A282L 41,6±0,1

m6-5: R68S, A234L, A282L, A334L 41,9±0,5

m6-9: R685, Y227A, A234L, A282L, A334L 43,7±0,4

m6-10: R68S, Y227A, A282L, A334L 47,4±1,1

m6-11: R68S, A282L, A334L 39,1±0,5

7: m7-1 M90V, A282L, F338M 43,0±0,8

m7-2: M90V, A282L 38,9±0,6

m7-5: M90V, Y227A 45,2±1,0

m7-6: M90V, I129V 40,0±0,6

m7-7: M90V, Y227A, F338M 45,2±2,0

10: m10-4 R68S, M90V, V230A, A334L 46,9±1,0

m10-8: R68S, M90V, V230A, F327A, A334L 47,3±1,4

Los mutantes más termoestables obtenidos, que todavía se expresaban en altos niveles en E. coli, eran m6-10, m77 y m10-8. Estos mutantes contenían colectivamente un total de 10 mutaciones diferentes, produciéndose 8 mutaciones en al menos dos de los mutantes. Se realizó una segunda ronda de mutagénesis usando m10-8 como 5 molde y añadiendo o reemplazando mutaciones presentes en m6-10 y m7-7 (figura 3); algunas de estas mutaciones estaban muy próximas en la secuencia de aminoácidos primaria de βAR y por tanto no eran aditivas como se observó anteriormente, pero muchas mutaciones mejoraron la Tm adicionalmente (tabla 2). Por ejemplo, intercambiar dos mutaciones en m10-8, para crear m18, elevó la Tm hasta 49,6ºC y añadir A282L para preparar m23 aumentó la Tm 3ºC más hasta 52,8ºC. Esto produjo el mutante βAR34-424 más termoestable hasta ahora y se

10 denominará βAR-m23.

Tabla 2 Mejora de la mejor combinación de mutaciones. Se obtuvieron estos nuevos mutantes mezclando los cambios presentes en los mutantes m6-10, m7-7 y m10-8 mediante PCR. Se sometió a ensayo la estabilidad de estos nuevos mutantes tal como se describe en la figura 7 y se calculó la Tm. Se muestran los resultados como la

15 media ± E.E. de duplicados.

Mutaciones: Tm (ºC)

m17: R68S M90V Y227A V230A - F327A A334L - 48,2±1,4

m18: R68S M90V Y227A V230A A382L F327A - F338M 49,6±0/9

m19: R68S M90V Y327A -A382L F327A - F338M 49,0±0,8

m20: R68S M90V - -- F327A A334L - 48,4±0,7

m21: R68S M90V Y227A -- F327A A334L - 47,0±1,3

m22: R68S M90V Y227A F327A A334L - 47,4±0,5

m23: R68S M90V Y227A -A282L F327A - F338M 52,8±1,4

Se realizaron los ensayos de termoestabilidad usados para desarrollar mutantes de βAR34-424 calentando el receptor en ausencia del antagonista, pero se conoce ampliamente que el ligando unido estabiliza los receptores. Por tanto, 20 se repitieron ensayos de estabilidad para βAR34-424 y βAR-m23 con antagonista unido a los receptores durante la etapa de calentamiento (figura 4). Tal como se esperaba, la Tm del receptor que contenía el antagonista unido durante la incubación era mayor que la del receptor sin antagonista. Para βAR34-424, la Tm era 6ºC mayor con antagonista unido y para βAR-m23 la Tm aumentó 2ºC hasta 55ºC; el menor aumento en la termoestabilidad observado para βAR-m23 cuando se une el antagonista sugiere que el receptor ya está en una conformación más

25 estable, similar al estado de antagonista unido, que βAR34-424 (véase también a continuación). La Tm de βAR-m23 con antagonista unido es muy similar a la Tm de la rodopsina de estado oscuro en dodecilmaltósido (DDM) [12], cuya estructura se ha resuelto por dos laboratorios independientes [13, 14]. Esto sugirió que βAR-m23 es suficientemente estable para la cristalización.

30 Caracterización de βAR-m23

Las tres actividades características medidas para βAR-m23 y βAR34-424 para identificar el efecto de las seis mutaciones eran la afinidad de unión a antagonista, las eficacias relativas de unión a agonista y la capacidad de

βAR-m23 para acoplarse a proteínas G. Experimentos de unión de saturación a membranas usando el antagonista [3H]-dihidroalprenolol (figura 8) mostraron que la afinidad de unión a βAR-m23 (KD 6,5 0,2 nM, n=2) era ligeramente menor que para βAR34-424 (KD 2,8 0,1 nM, n=2), sugiriendo que no existen grandes perturbaciones en la estructura de βARm23 en la conformación unida a antagonista. Esto concuerda con la observación de que ninguna de las mutaciones en βAR-m23 corresponden a aminoácidos que se creen están implicados en unión a ligando. A diferencia de la unión a antagonista, la eficacia de la unión a agonista por βAR-m23 es de 3 órdenes de magnitud más débil que para βAR34-424 (figura 5). La potencia del agonista isoprenalina es sistemáticamente menor en BARm23 y βAR34-424 que para el agonista nativo norepinefrina, indicando que es probable que la conformación unida a agonista para los dos receptores sea similar. Sin embargo, la gran disminución en la eficacia del agonista en βARm23 en comparación con βAR34-424 indica que las 6 mutaciones en βAR-m23 han bloqueado el receptor preferentemente en una conformación unida a antagonista. Desde una perspectiva de cristalización, esto es una ventaja adicional para la termoestabilización, debido a que es esencial tener una población de proteína conformacionalmente homogénea para la producción de cristales de calidad para difracción.

Se realizaron todos los ensayos de termoestabilidad usados para derivar βAR-m23 con receptores solubilizados en DDM. El objetivo del procedimiento de termoestabilización era producir un receptor que sea ideal para cristalografía, lo que significa que sea estable en una variedad de diferentes detergentes y no sólo DDM. Por tanto, se sometió a prueba la estabilidad de βAR-m23 y βAR en una variedad de diferentes detergentes, concentrándose en detergentes pequeños que se usan preferentemente en la cristalización de proteínas integrales de membrana. Se solubilizaron las membranas preparadas a partir de E. coli que expresaban βAR-m23 o βAR34-424 en DDM, se unieron a agarosa Ni-NTA luego se lavaron con o bien DDM, decilmaltósido (DM), octilglucósido (OG), óxido de laurildimetilamina (LDAO) o bien nonilglucósido (NG). Se realizaron los ensayos de estabilidad con los receptores en cada uno de los diferentes detergentes (figura 6). βAR34-424 sólo era estable en DDM y DM, sin eluir receptores activos de la resina lavada con OG, NG o LDAO. Por el contrario, todavía estaba presente βAR-m23 funcional en todos los detergentes y pudo determinarse la Tm. Tal como se esperaba, los detergentes más pequeños eran considerablemente más desnaturalizantes que o bien DDM (Tm 52ºC) o bien DM (Tm 48ºC), con Tm de 25ºC (NG), 23ºC (LDAO) y 17ºC (OG). La diferencia en Tm entre βAR-m23 y βAR34-424 es de aproximadamente 20ºC, independientemente de si los receptores se solubilizaron en o bien DDM o bien DM; no es sorprendente por tanto que no pudiera encontrarse βAR34-424 activo ni siquiera en NG, debido a que la Tm predicha sería de aproximadamente 5ºC, dando como resultado así una rápida inactivación del receptor en las condiciones usadas para la purificación. Se eligió deliberadamente la estrategia de selección usada para la generación de βAR-m23 para que esté basada en la termoestabilidad, debido a que es mucho más sencilla de aplicar que la selección para determinar la estabilidad en detergentes de fuerza creciente. Sin embargo, está claro que el aumento de la termoestabilidad de βAR34-424 también dio como resultado el aumento de la tolerancia a detergentes pequeños ideales para cristalizar proteínas integrales de membrana.

Cristalización de GPCR mutante

Los intentos iniciales para cristalizar varios constructos diferentes de receptor beta-adrenérgico de pavo fallaron. A pesar de experimentar con una variedad de condiciones, usando tanto la secuencia nativa como varios constructos con deleciones de bucle y truncados, durante muchos años, no se obtuvieron cristales.

Sin embargo, una vez que se transfirieron las mutaciones estabilizantes de βAR-m23 a los constructos, se obtuvieron varios cristales diferentes en diferentes detergentes y diferentes condiciones.

Los cristales que se han estudiado más hasta ahora se obtuvieron usando el constructo beta-36 purificado (residuos de aminoácido 34-367 del receptor beta de pavo que contiene los siguientes cambios: mutaciones puntuales C116L y C358A; las 6 mutaciones puntuales termoestabilizantes en m23; la sustitución de los residuos de aminoácido 244278 por la secuencia ASKRK; un cola His6 C-terminal) expresado en células de insectos usando el sistema de expresión de baculovirus, tras transferir el receptor al detergente octil-tioglucósido. El precipitante usado era PEG600 o PEG1000 y los cristales obtenidos son placas alargadas.

También se han llevado a cabo experimentos para ver si, una vez que se hubieron definido las condiciones de cristalización usando el receptor estabilizado, era posible obtener cristales usando el constructo no estabilizado original. Era posible que pudieran haberse obtenido cristales similares o tal vez muy pequeños, pero, de hecho, el “tipo natural” (es decir, la estructura de partida a partir de la que se inició la mutagénesis) nunca proporcionó ningún cristal.

Los cristales tienen forma de placa con el grupo espacial C2 y tienen buena difracción, aunque las dimensiones celulares sí que varían dependiendo de las condiciones de congelación usadas.

En general, una vez que se ha estabilizado un GPCR puede someterse a una variedad de técnicas ampliamente conocidas para la determinación estructural. La técnica más común para cristalizar proteínas de membrana es mediante difusión de vapor (20, 21), habitualmente usando inicialmente unos cuantos miles de condiciones de

cristalización establecidas usando dispositivos robóticos comerciales (22). Sin embargo, algunas veces los cristales formados mediante difusión de vapor son pequeños y desordenados, de modo que entonces pueden emplearse técnicas adicionales. Una técnica implica la co-cristalización (mediante difusión de vapor) de la proteína de membrana con anticuerpos que se unen específicamente a epítopos conformacionales sobre la superficie de las proteínas (23, 24); esto aumenta la superficie hidrófila de la proteína y puede formar contactos cristalinos fuertes. Una segunda alternativa es usar una matriz de cristalización diferente que se denomina comúnmente o bien fase cúbica lipídica o bien mesofase lipídica (25, 26), que también se ha desarrollado en una plataforma robótica (27). Esto ha demostrado ser muy satisfactorio para producir cristales de alta calidad de proteínas con sólo pequeñas superficies hidrófilas, por ejemplo, bacteriorrodopsina (28). Las estructuras de proteína de membrana también pueden determinarse a alta resolución mediante cristalografía electrónica (29).

La evolución de βAR-m23 a partir de βAR34-424 mediante una combinación de mutagénesis de exploración de alanina y la selección de mutantes termoestables ha dado como resultado un GPCR que es ideal para cristalografía. La Tm para βAR-m23 es 21ºC mayor que para βAR34-424 y, en presencia de antagonista, βAR-m23 tiene una estabilidad similar a rodopsina. La Tm aumentada de βAR-m23 ha dado como resultado una estabilidad aumentada en una variedad de detergentes pequeños que inactivan βAR34-424. Además, la estrategia de selección empleada dio como resultado un receptor que está preferentemente en la conformación unida a antagonista, lo que también mejorará las probabilidades de obtener cristales, debido a que la población de conformaciones de receptor será más homogénea que para βAR34-424 de tipo natural. Por tanto, se ha logrado un proceso de estabilización conformacional en un único procedimiento de selección.

No está claro por qué las mutaciones particulares que se han introducido conducen a la termoestabilización del receptor. Las posiciones equivalentes en rodopsina sugieren que los residuos de aminoácido mutados podrían estar apuntando hacia la bicapa lipídica, hacia el centro del receptor o en las superficies de contacto entre estos dos entornos. Dadas las dificultades al tratar de entender las complejidades de la termoestabilización de proteínas solubles [15], parece poco probable que las proteínas de membrana sean más fácil de comprender; se encontró que no hay un patrón particular en los residuos de aminoácido en βAR que, cuando se mutan, conduzcan a termoestabilidad. Sin embargo, puesto que casi el 5% de los mutantes producidos eran más estables que el receptor nativo, la mutagénesis de exploración de alanina representa una estrategia eficaz para identificar rápidamente mutantes termoestables.

El procedimiento que se usó para generar βAR-m23 puede aplicarse igualmente a cualquier proteína de membrana que tenga un ensayo conveniente para detectar actividad en la forma solubilizada con detergente. Aunque se ha seleccionado por la estabilidad en función de la temperatura como el parámetro primario más conveniente, el procedimiento puede extenderse fácilmente para someter a prueba de manera primaria por la estabilidad, por ejemplo, en un detergente fuerte, un extremo de pH o en presencia de sales caotrópicas. La estabilización conformacional de una variedad de receptores, canales y transportadores humanos los hará mucho más adecuados para cristalografía y también permitirá la mejora en la resolución de proteínas de membrana que ya se han cristalizado. Se debe tener la esperanza de que la estabilización conformacional permita que la cristalización de proteínas de membrana se convierta en un problema mucho más manejable con una mayor probabilidad de éxito rápido de lo que es el caso actualmente. Esto debe permitir la cristalización rutinaria de proteínas de membrana humanas en la industria farmacéutica, dando como resultado perspectivas estructurales valiosas en el desarrollo de fármacos.

MÉTODOS

Materiales. El Dr. Tony Wame (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, R.U.) proporcionó gentilmente el receptor β1 adrenérgico truncado de pavo (βAR34-424) [9]. Este constructo de βAR que codifica para los residuos 34424 contiene la mutación C116L para mejorar la expresión [11], y una cola C-terminal de 10 histidinas para la purificación. 1-[4,6-propil-3H]-dihidroalprenolol ([3H]-DHA) lo suministró Amersham Bioscience, la sal de bitartrato de (+)-L-norepinefrina, clorhidrato de (-)-isoprenalina, sal de tartrato de (-)-alprenolol y clorhidrato de s-propranolol procedían de Sigma.

Mutagénesis de βAR. Se ligó el ADNc de βAR en pRGIII para permitir la expresión funcional de βAR en E. coli como proteína de fusión MalE [16]. Se generaron los mutantes mediante PCR usando el plásmido de expresión como molde usando la metodología QuikChange II (Stratagene). Se transformaron las reacciones de PCR en células ultracompetentes XL10-Gold (Stratagene) y se secuenciaron completamente clones individuales para comprobar que sólo estaba presente la mutación deseada. Se combinaron aleatoriamente diferentes mutaciones mediante PCR incluyendo todos los pares de cebadores que introdujeron las siguientes mutaciones: Mut4, G67A, G068A, V230A, D322A y F327A; Mut6, R068S, Y227A, A234L, A282L y A334L; Mut7, M90V, I129V, Y227A, A282L y F338M; Mut10, R68S, M90V, V230A, F327A y A334L. Se transformaron las mezclas de PCR y se secuenciaron los clones para determinar exactamente qué mutaciones se introdujeron.

Preparaciones de membrana y expresión de proteínas. Se realizó la expresión de βAR y los mutantes en células XL10 (Stratagene). Se hicieron crecer cultivos de 50 ml de medio 2xTY que contenía ampicilina (100 μg/ml) a 37ºC

con agitación hasta DO600 = 3 y luego se indujeron con IPTG 0,4 mM. Se incubaron los cultivos inducidos a 25ºC durante 4 h y entonces se recogieron las células mediante centrifugación a 13.000 x g durante 1 min. (alícuotas de 2 ml) y se almacenaron a -20ºC. Para los ensayos, se rompieron las células mediante congelación-descongelación (cinco ciclos), se resuspendieron en 500 μl de tampón [Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM e inhibidores de proteasa (Complete™, Roche)]. Tras una incubación durante 1 h a 4ºC con lisozima 100 μg/ml y ADNasa I (Sigma), se solubilizaron las muestras con DDM al 2% en hielo durante 30 minutos. Se eliminó el material insoluble mediante centrifugación (15.000 x g, 2 min., 4ºC) y se usó el sobrenadante directamente en ensayos de unión a radioligando.

Para preparaciones de membrana a gran escala, se hicieron crecer 2 l y 6 l de cultivo en E. coli de βAR y Mut23, respectivamente, tal como se describió anteriormente. Se recogieron las células mediante centrifugación a 5.000 x g durante 20 min., se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Se resuspendieron los sedimentos en 10 ml de Tris 20 mM pH 7,5 que contenía cóctel inhibidor de proteasa 1x (Complete™ libre de EDTA, Roche); se añadió 1 mg de ADNasa I (Sigma) y se enrasó el volumen final a 100 ml. Se rompieron las células con una prensa francesa (2 pases, 20.000 psi), y se centrifugaron a 12.000 x g durante 45 min. a 4ºC para eliminar residuos celulares. Se centrifugó el sobrenadante (membranas) a 200.000 x g durante 30 min. a 4ºC; se resuspendió el sedimento de membrana en 15 ml de Tris 20 mM pH 7,5 y se almacenó en alícuotas de 1 ml a -80ºC tras congelación rápida en nitrógeno líquido. Se determinó la concentración de proteína mediante el método de negro amido [17]. Se usaron estas muestras en ensayos de unión a radioligando tras descongelar y solubilizarse en DDM al 2% como anteriormente.

Para ensayos de competencia, así como para someter a prueba a diferentes detergentes, se purificó parcialmente PAR solubilizado en DDM, con agarosa Ni-NTA (Qiagen). Se añadieron 200 μl de agarosa Ni-NTA a 2 ml de muestras solubilizadas (10 mg/ml de proteína de membrana) en Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, imidazol 20 mM pH 8 y se incubó durante 1 h a 4ºC. Tras la incubación, se centrifugaron las muestras a 13.000 x g durante 30 s y se lavaron dos veces con 250 μl de tampón (Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, imidazol 20 mM) que contenía detergente (o bien DDM al 0,1%, DM al 0,1%, LDAO al 0,1%, NG al 0,3% o bien OG al 0,7%).

Se eluyeron los receptores en 2 x 100 μl de tampón (NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, imidazol 250 mM pH 8, más el detergente relevante). La KD para la unión de [3H]-DHA a βAR-m23 y βAR34-424 semipurificado era, respectivamente de 3,7 nM y 12,5 nM y la concentración final de [3H]-DHA usada en los ensayos de competencia era 3 veces la KD, es decir, 12 nM para βAR34-424 y 40 nM para βAR-m23.

Ensayos de termoestabilidad y unión a radioligando. Los ensayos de unión de punto único contenían Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, DDM al 0,1% (o el detergente correspondiente) con [3H]-DHA 50 nM y 20-100 μg de proteína de membrana en un volumen final de 120 μl; la equilibración fue durante 1 h a 4ºC. Se evaluó la termoestabilidad incubando la mezcla de ensayo de unión, con o sin [3H]-DHA en la temperatura especificada durante 30 minutos; se pusieron las reacciones en hielo y se añadió [3H]-DHA según fue necesario y se equilibró durante una hora adicional. Se separaron el radioligando libre y unido al receptor mediante filtración en gel tal como se describe anteriormente [18]. Se determinó la unión no específica en presencia de 1 μM de s-propranolol. Se obtuvieron curvas de saturación usando un intervalo de concentración de [3H]-DHA de desde 0,4 nM hasta 100 nM. Se realizaron ensayos de competencia usando una concentración de [3H]-DHA de 12 nM para βAR34-424 y 40 nM para βAR-m23 (es decir, tres veces la KD) y diversas concentraciones de ligandos no marcados (0-100 mM). Se contó la radioactividad en un contador de centelleo líquido Beckman LS6000 y se analizaron los datos mediante regresión no lineal usando el software Prism (GraphPad).

Ubicación de mutaciones termoestables de βAR-m23 en la estructura de rodopsina. Se descargó el archivo pdb para la estructura de rodopsina, código de registro 1GZM [14], del sitio web de Protein Data Bank (www.pdb.org) y se visualizó en el programa PyMOLX11Hybrid (DeLano Scientific). Se ubicaron los residuos de aminoácido equivalentes en rodopsina para las mutaciones termoestables en βAR en la estructura de rodopsina basándose en una alineación entre los cuatro GPCR con los que se está más familiarizado, concretamente rodopsina, receptor β1 adrenérgico, receptor de neurotensina y preceptor de adenosina A2a [19].

Ejemplo 2: Mutantes del receptor de adenosina A2a (A2aR) con termoestabilidad aumentada

1.: 315 mutantes dirigidos al sitio preparados entre los residuos 2-316 de A2aR.

2.: Se han sometido a ensayo todos estos mutantes para determinar la termoestabilidad usando un ensayo que mide la unión a agonista y antagonista tras la etapa de calentamiento (formato ligando(-) tal como se describe en la figura 12).

a.: 26 mutantes mostraron termoestabilidad mejorada cuando se midieron con 3H-NECA (agonista): G114 A, G118A, L167A, A184L, R199A, A203L, L208A, Q210A, S213A, E219A, R220A, S223A, T224A, Q226A, K227A, H230A, L241A, P260A, S263A, L267A, L272A, T279A, N284A, Q311A, P313A, K315A.

b.: 18 mutantes mostraron termoestabilidad mejorada cuando se sometieron a ensayo con 3H-ZM241385

(antagonista): A54L, V57A, H75A, T88A, G114A, G118A, T119A, K122A, G123A, P149A, E151A, G152A, A203L, A204L, A231L, L235A, V239A.

3. Se han combinado mutaciones para generar mutantes en una supuesta conformación antagonista. El A2aR de tipo natural tiene una Tm de 31ºC con ZM241385 unido.

a.: Rant17 A54L+K122A+L235A Tm 48ºC (ZM241385 unido)

b.: Rant19 A54L,T88A,V239A+A204L Tm 47ºC (ZM241385 unido)

c.: Rant21 A54L,T88A,V239A+K122A Tm 49ºC (ZM241385 unido)

4. Se han combinado mutaciones del examen de agonistas, pero han conducido sólo a un nivel muy bajo de mejora en Tm de +2ºC.

Tabla (i) Lista de mutaciones estabilizantes A2aR. Se expresaron los mutantes en E. coli, se solubilizaron en DDM al 2% + glicerol al 10% y se sometieron a prueba para determinar la unión a ligando usando el agonista [3H]-NECA (a la derecha) y el antagonista [3H]-ZM241385 (izquierda). Las concentraciones de radioligandos fueron de 610 veces superiores a su KD medida para el receptor de tipo natural. Se evaluó la expresión del receptor activo mediante la unión a ligando a 4ºC. Se sometió a ensayo la estabilidad calentando el receptor solubilizado en su apoestado a 30ºC durante 30 minutos y luego midiendo su actividad de unión residual. En estas condiciones, la actividad de tipo natural decae al 50% (D.E. = 15%). Se normalizaron los datos obtenidos para la expresión y estabilidad con respecto a valores de tipo natural. Las mutaciones incluidas en tandas posteriores de mutagénesis fueron aquéllas cuya expresión era de ≥ 30-40% y estabilidad ≥130-140% en comparación con el tipo natural. Las líneas en negrita indican la agrupación de mutaciones.

Agonista Antagonista

Mutación: Expresión Estabilidad Mutación Expresión Estabilidad

(%)
(%)
(%)
(%)

tipo natural: 100 100 tipo natural 100 100

S090A: 151 151 A054L 90 140

G114A: 62 143 V057A 44 144

G118A: 71 151 H075A 82 152

L167A: 41 174 T088A 67 230

A184LR199AA203LL208A: 140 73 42 276 150 202 172 215 G114A G118A T119A K122A G123A P149A E151A G152A A203L A204L A231L L235A V239A 73 153

84: 148

90: 148

52: 153

Q210A S213AE219AR220AS223AT224A Q226A K227A: 46 155 90 158

40: 140 54 215

96: 221 63 173

84: 250 70 156

57: 146 111 132

142: 276 40 181

119: 217 90 148

87: 222 85 140

H230A: 57 154 91 134

L241A 139 156

L272A 34 157

T279A: 125 158

N284A: 64 151

Q311A: 49 164

P313A: 44 148

K315A: 64 186

Tabla (ii). Estabilidad de las mejores combinaciones. Se solubilizaron los receptores en DDM al 1% (sin glicerol). Se obtuvo un perfil de fusión calentando el receptor solubilizado a diferentes temperaturas en ausencia (apo-estado) o presencia de ligando (estado ocupado por ligando). Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La D.E. es < 1 ºC.

Tm (ºC): Tm (ºC)

-: + - +

agonista: agonista antagonista antagonista

Tipo natural: 21 29 tipo natural 31 32

Rag 1 (A184L/R199A/L272A): 26 34 Rant 5 (A54L/T88A/V239A) 42 46

Rag 23 (Rag 1+F79A /L208A): 22 38 Rant 21 (Rant 5+K122A) 41 49

Tabla (iii). Resumen de los resultados para los ensayos de competencia de A2aR de tipo natural solubilizado

con detergente y Rant 21 mutante termoestable. Los valores son representativos de dos experimentos

independientes. Se sometió a ensayo cada punto de datos por triplicado y se representa gráficamente como la

5 media ± DE. Se incubó cada receptor solubilizado con ligandos durante una hora en hielo en tampón de unión (Tris 50 mM pH 7,5 y DDM al 0,025%) que contenía NaCl 400 mM. Se fijó la unión de [3H]ZM241385 (10 nM) en ausencia de ligando no marcado en el 100%. Los datos mostrados son de dos experimentos independientes con cada punto de datos medido por triplicado. La incubación de muestras con ligandos fue durante 1 hora en hielo con [3H]ZM241385 a una concentración de 10 nM. Se calcularon los valores de Ki según la ecuación de Cheng y Prusoff

10 usando la ecuación de regresión no lineal del software Prism, aplicando una KD para [3H]ZM241385 de 12 nM para el tipo natural y 15 nM para Rant 21. Rant 21 no se unió a NECA lo suficiente para una determinación de Ki exacta (por tanto se indicó como >1 x 10-1). La afinidad de Rant21 por la unión a agonista se debilita 232 veces para R-PIA y al menos en 1900 veces para NECA.

Ki (M)

XAC: Competidor 2,3 x 16-6 tipo natural 2,3 x 10-6 Rant 21

Teofilina: 1,5 x 10-3 0,9 x 10-3

NECA: 7,0 x 10-6 >1 x 10-1

R-PIA 1,6 x 10-5 3,6 x 10-3

Tabla (iv). Resumen de los resultados para ensayos de saturación de A2aR de tipo natural solubilizado con detergente y mutantes termoestables. Los valores son representativos de tres experimentos independientes. Se sometió a ensayo cada punto de datos por triplicado y se representó como la media ± DE. Se ajustaron los datos a

la ecuación de Michaelis-Menten usando la ecuación de regresión no lineal del software Prism. 20

Receptor: KD (nM)

[3H]NECA (agonista): [3H]ZM241385 (antagonista)

tipo natural: 32 ± 1 12 ± 3

Rag 1: 26 ± 0,4 26 ± 0,5

Rag 23: 21 ± 1 62 ± 1

Rant 21: >450 15 ± 3

Tabla (v). Resumen de estabilidad de receptores de tipo natural y mutantes en diferentes detergentes. Se realizó la solubilización de receptores y el cambio de detergente durante la etapa IMAC. La D.E. es < 1ºC. No fue posible determinar la Tm para algunas combinaciones receptor-detergente, debido a que el receptor era demasiado inestable (†).

Tm (ºC)

Unión a agonista: Unión a antagonista

tipo natural: Rag 23 tipo natural Rag 21

DDM al 0,01%: 27 34 25 39

DM al 0,1%: 23 29 10 28

NM al 0,3%: 22 28 <4 25

NG al 0,3%: t t t 22

OG al 0,6%: <9 16 t 23

LDAO al 0,003%: 28 38 32 42

FC12 al 0,006%: 37 39 43 49

Ejemplos 3: Mutantes del receptor de neurotensina (NTR) con termoestabilidad aumentada

30 1. Se han preparado 340 mutantes dirigidos al sitio entre los residuos 61-400 de NTR

2. Inicialmente, se sometieron a ensayo todos estos mutantes para determinar la termoestabilidad usando un ensayo que mide la unión a 3H-neurotensina (agonista) tras la etapa de calentamiento. 24 mutaciones condujeron a un aumento pequeño pero significativo en la termoestabilidad: A356L, H103A, D345A, A86L, A385L, Y349A, C386A, K397A, H393A, I116A, F358A, S108A, M181A, R392A, D113A, G209A, L205A, L72A, A120L, P399A, Y351A, V268A, T207A, A155L, S362A, F189A, N262A, L109A, W391A, T179A, S182A, M293A, L256A, F147A, D139A, S100A, K176A, L111A, A90L, N270A.

5 3. Se volvieron a someter a prueba los mutantes para determinar la termoestabilidad calentando en ausencia del agonista, usando un ensayo ligeramente diferente en los que se calentaron los mutantes en presencia de 3Hneurotensina (formato de ligando(+) en la figura 12). Los mutantes con termoestabilidad mejorada son : A69L, A73L, A86L, A90L, H103A, V165A, E166A, G215A, V229A, M250A, I253A, A177L, R183A, I260A, T279A, T294A, G306A, L308A, V309A, L310A, V313A, F342A, F358A, V360A, S362A, N370A, S373A, F380A, A385L, P389A, G390A,

10 R395A.

4. También hay mutantes que tienen un nivel de expresión significativamente potenciado en comparación con el receptor de tipo natural y podría usarse para estimular los niveles de producción de preceptor para la cristalización: A86L, H103A, F358A, S362A, N370A, A385L, G390A. Todos éstos también tienen termoestabilidad aumentada.

5. Combinaciones preferidas son

a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A Tm 51ºC (unido a neurotensina )

20 b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A Tm 51ºC (unido a neurotensina)

El NTR de tipo natural tiene una Tm de 35ºC unido a neurotensina.

Ejemplo 4: Identificación de motivos estructurales en los que se encuentran las mutaciones de GPCR 25 estabilizantes.

Se ha determinado la estructura del receptor β2 adrenérgico (20, 21), que es idéntico en el 59% al receptor β1 de pavo, pero con un perfil farmacológico particularmente diferente (22, 23). Con el fin de determinar los motivos estructurales en los que se encuentran las mutaciones estabilizantes del receptor β1 de pavo, se mapearon las

30 mutaciones en la estructura de β2 humano (21).

En primer lugar, se alinearon los receptores beta-adrenérgicos usando ClustalW en el paquete MacVector; se resaltaron las mutaciones termoestabilizantes en β1 de pavo junto con el residuo correspondiente en la secuencia de β2 humano. Se visualizó el modelo de β2 humano (código de registro pdb 2RH1) en Pymol y se mostraron los

35 aminoácidos deseados como modelos de llenado de espacios mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Se determinaron los motivos estructurales en los que se ubicaban las mutaciones estabilizantes mediante inspección visual.

La tabla (vi) enumera las posiciones equivalentes en el receptor β2 correspondiente a las mutaciones 40 termoestabilizantes en βAR-m23 y los motivos estructurales en los que se encuentran.

Tal como se observa a partir de la tabla (vi), las mutaciones se sitúan en varias ubicaciones distintas. Tres mutaciones están en regiones de bucle que se predice que son accesibles para disolvente acuoso (bucle). Ocho mutaciones están en las hélices α transmembrana y apuntan hacia la bicapa lipídica (lípido); tres de estas 45 mutaciones están cerca del extremo de las hélices y puede considerarse que están en la capa límite hidrófila (límite lipídico). Ocho mutaciones se encuentran en las superficies de contacto entre las hélices α transmembrana (superficie de contacto hélice-hélice), tres de las que están o bien dentro de una región curvada o distorsionada de la hélice (curvatura) y otras dos mutaciones se producen en una hélice pero están adyacentes a una o más de otras hélices que contienen una curvatura adyacente en espacio al residuo mutado (curvatura opuesta). Estas últimas

50 mutaciones podrían afectar el empaquetamiento de los aminoácidos dentro de la región curvada, lo que podría dar como resultado termoestabilización. Otra mutación está en una cavidad de unión a sustrato. (cavidad).

Tabla (vi) Posición en la estructura de β2 humano de los residuos de aminoácido equivalentes a las mutaciones termoestabilizantes encontradas en el receptor β1 de pavo y los motivos estructurales en los 55 que se encuentran.

β1 de pavo: β2 humano Descripción

Hélice 1: I55A I47 superficie de contacto curvatura- 3 hélices Figura18

Hélice 1: G67A A59 límite lipídico

Hélice 1: R68S K60 límite lipídico Figura 25

Hélice 2: V89L V81 curvatura Figura19

Hélice 2: M90V M82 curvatura Figura20

Hélice 2: G98A G90 cavidad

Hélice 3: 1129V S151E 1121 S143 bucle de curvatura Figura21

opuesta

Hélice 4: V160A Q194A V152 A186 bucle lipídico

Hélice 5: L221V V213 lípido

Hélice 5: Y227A Y219 superficie de contacto hélice-hélice Figura23

Hélice 5: R229Q R221 lípido

Hélice 5: V230A V222 superficie de contacto hélice-hélice

Hélice 5: A234L A226 superficie de contacto hélice-hélice

Hélice 6: A282L D322A C265 K305 límite lipídico del bucle Figura24

Hélice 7: F327A L310 lípido

Hélice 7: A334L V317 lípido

Hélice 7: F338M F321 curvatura Figura22

Tales motivos estructurales, en virtud de que contienen mutaciones estabilizantes, son importantes en la determinación de la estabilidad de la proteína. Por tanto, dirigir mutaciones a estos motivos facilitará la generación de GPCR mutantes estabilizados. Sin duda, existen varios casos en los que más de una mutación se mapeó en el 5 mismo motivo estructural. Por ejemplo, las mutaciones Y227A, V230A y A234L en el receptor β1 adrenérgico de pavo se mapearon todas en la misma superficie de contacto helicoidal, las mutaciones V89L y M90V se mapearon en la misma curvatura helicoidal y las mutaciones F327A y A334L se mapearon en la misma superficie helicoidal apuntando hacia la bicapa lipídica (tabla (vi)). Por tanto, cuando se ha identificado una mutación estabilizante, la determinación del motivo estructural en el que está ubicada esa mutación permitirá la identificación de mutaciones

10 estabilizantes adicionales.

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Ratnala, V. R., Sanishvili, R., Fischetti, R. F., Schertler, G. F., Weis, W. I. y Kobilka, B. K. (2007) Nature 15, 383-387. 5

21. Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K. y Stevens, R. C. (2007) Science 318:1258-1265.

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23. Parker, E. M., Swigart, P., Nunnally, M. H., Perkins, J. P. y Ross, E. M. (1995) J Biol Chem 270:6482-6487.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para seleccionar un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) con estabilidad conformacional

aumentada, comprendiendo el método 5

(a)

proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(b)

seleccionar un ligando de una clase particular, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando el GPCR se encuentra en una conformación particular,

(c)

determinar si el GPCR o cada GPCR mutante tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad conformacional del GPCR original con respecto a la unión a ese ligando, midiendo la desnaturalización manifestada por la pérdida de capacidad de unión al ligando, en condiciones de desnaturalización tales como calor, un detergente, un agente

15 caotrópico o un extremo de pH, y

(d) seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado; en el que la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) corresponde a la misma clase de ligando que el ligando seleccionado en la etapa (b).
2. Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más mutantes se ponen en contacto con el ligando seleccionado antes de la etapa (c).

25 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el uno o más mutantes se proporcionan en forma solubilizada.
4.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el ligando seleccionado es de la clase agonista de ligandos y la conformación particular es una conformación agonista, o el ligando seleccionado es de la clase antagonista de ligandos y la conformación particular es una conformación antagonista.
5.

Método según la reivindicación 4, en el que el ligando seleccionado es de la clase agonista de ligandos y la conformación particular en la que se encuentra el GPCR en la etapa (c) es la conformación agonista.

35 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la afinidad de unión del mutante por el ligando seleccionado es sustancialmente igual o mayor que la afinidad de unión del original por el ligando seleccionado.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, repitiéndose el método durante una o más rondas, representando los mutantes seleccionados que tienen estabilidad conformacional aumentada en la etapa

(a) el GPCR original en una ronda posterior del método.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se selecciona un GPCR mutante que tiene

estabilidad aumentada con respecto a uno cualquiera o más de calor, un detergente, un agente caotrópico y 45 un extremo de pH.
9.

Método según la reivindicación 8, en el que se selecciona un GPCR mutante con termoestabilidad aumentada.
10.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el ligando es uno cualquiera de un agonista completo, un agonista parcial, un agonista inverso, un antagonista.
11.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ligando es un polipéptido que se une al

GPCR. 55
12.

Método según la reivindicación 11, en el que el polipéptido es cualquiera de un anticuerpo, una anquirina, una proteína G, una proteína RGS, una arrestina, una GPCR cinasa, una receptor tirosina cinasa, una RAMP, un NSF, un GPCR, una subunidad NR1 o NR2a del receptor NMDA, o calciona, un marco de dominio de fibronectina, o un fragmento o derivado del mismo que se une al GPCR.
13.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que en la etapa (b) se seleccionan dos o más ligandos, la presencia de cada uno de los cuales provoca que el GPCR se encuentre en la misma conformación particular.

65 14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se selecciona un GPCR mutante que tiene capacidad reducida para unirse a un ligando de una clase diferente al ligando seleccionado en la etapa (b) en comparación con su original.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el GPCR es uno cualquiera de

un receptor β-adrenérgico, un receptor de adenosina y un receptor de neurotensina. 5
16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el ligando está marcado de manera detectable.
17.

Método según la reivindicación 16, en el que el ligando está marcado de manera fluorescente. 10
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la etapa (c) implica el uso de FRET.
19.

Método para preparar un GPCR mutante, comprendiendo el método 15 (a) llevar a cabo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18,

(b) identificar la posición o posiciones del residuo o los residuos de aminoácido mutados en el GPCR mutante o los GPCR mutantes que se ha(n) seleccionado por la estabilidad conformacional aumentada, y

20 (c) sintetizar un GPCR mutante que contiene un aminoácido de sustitución en una o más de las posiciones identificadas.
20. Método según la reivindicación 19, en el que el GPCR mutante contiene una pluralidad de mutaciones en

comparación con el GPCR original. 25
21.

Método según la reivindicación 1 ó 19, en el que se determina si el GPCR mutante seleccionado o preparado puede acoplarse a una proteína G.
22.

Método según la reivindicación 1 ó 19, en el que se determina si el GPCR mutante seleccionado o

30 preparado puede unirse a una pluralidad de ligandos de la misma clase que el ligando seleccionado con un orden de rango y/o amplitud de afinidad comparables a los del GPCR original.