ES2263177T3

ES2263177T3 - Proteina tirosina fosfatasa, ptp lambda analoga a ptp kappa/mu.

Info

Publication number: ES2263177T3
Application number: ES97927799T
Authority: ES
Inventors: Jill Cheng; Laurence A. Lasky
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2017-05-22
Also published as: US6083748A; EP0912733B1; AU3217197A; DK0912733T3; EP0912733A1; ATE323764T1; JP3587857B2; PT912733E; WO1997044458A1; IL127108A0; US5976852A; AU722949B2; DE69735716D1; JPH11511033A; CA2253431A1; DE69735716T2; US5928887A; ZA974526B; US5814507A

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS POLIPEPTIDOS DE LA PROTEINA RECEPTORA TIROSINA FOSFATASA. ESPECIFICAMENTE, ESTA INVENCION SE REFIERE A LA NUEVA PROTEINA RECEPTORA TIROSINA FOSFATASA LA RELACIONADA CON PROTEINAS RECEPTORAS TIROSINA FOSFATA SAS KA Y MI DE ADHESION HOMOTIPICA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A ANALOGOS DE ESTOS POLIPEPTIDOS EN OTROS MAMIFEROS, A DERIVADOS FUNCIONALES DE LOS MISMOS, ANTICUERPOS CAPACES DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE A ESTOS POLIPEPTIDOS, ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN ESTOS POLIPEPTIDOS, VECTORES QUE CONTIENEN Y SON CAPACES DE EXPRESAR TALES ACIDOS NUCLEICOS Y CELULAS HUESPEDES RECOMBINANTES TRANSFORMADAS CON TALES ACIDOS NUCLEICOS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE ESTOS POLIPEPTIDOS DE LA PROTEINA RECEPTORA TIROSINA FOSFATASA Y ENSAYOS PARA LA IDENTIFICACION DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE ESTOS POLIPEPTIDOS.

Description

Proteína tirosina fosfatasa, PTP \lambda análoga a PTP \kappa/\mu.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos de proteína tirosina fosfatasa receptora. Más particularmente, la presente invención se refiere a una nueva proteína tirosina fosfatasa receptiva denominada en la presente memoria como PTP \lambda.

Antecedentes de la invención

Un número extraordinario de procesos celulares se encuentra regulado por la fosforilación de las tirosinas de una diversidad de proteínas. La fosforilación de la tirosina resulta inducida por una multitud de moléculas análogas a receptores, así como por una amplia diversidad de enzimas intracelulares. Los efectos de la fosforilación de las tirosinas son numerosos, y modulan un abanico de operaciones durante el desarrollo, así como otras operaciones celulares. Evidentemente, la importancia de la fosforilación de las tirosinas se ve subrayada por la necesidad de mecanismos que regulen cuidadosamente los niveles de estos sucesos. De esta manera, las proteínas tirosina quinasa representan mediadores positivos de la fosforilación de las tirosinas, mientras que las proteínas tirosina fosfatasa (PTPs) inducen la eliminación del fosfato de las tirosinas. El equilibrio de los niveles de tirosina fosfato de esta manera se encuentra mediado por las actividades relativas de estos dos tipos de enzimas. Por lo tanto, resulta evidente que los mecanismos que regulan la función celular a través de la fosforilación de las tirosinas requiere proteínas específicas que medien tanto en la regulación positiva como en la regulación negativa de los niveles de este aminoácido modificado.

Las PTPs representan una familia de enzimas creciente que puede encontrarse en formas tanto receptoras como no receptoras (Tonks, Semin. Cell Biol. 4:373-453, 1993; Walton et al., Ann. Rev. Biochem. 62:101-120, 1993, y Sun et al., Trends Biochem. Sci. 19(11):480-485, 1994). Las PTPs no receptoras son una familia altamente diversa, y contienen varios motivos, además del dominio de PTP enzimáticamente activo, que sirven para regular la región de la célula ocupada por estas proteínas, así como la especificidad de sustrato de estos enzimas. Las PTPs receptoras también son un grupo altamente diverso que queda unificado por la inclusión de un dominio transmembrana que las orienta hacia la membrana plasmática de la célula. Recientemente, las PTPs receptoras se han subdividido en 8 tipos basándose en su contenido de dominios (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7(5):650-657, 1995). Todos estos subtipos contienen uno o dos dominios PTPasa en sus caras citoplasmáticas, con una diversidad de motivos extracelulares, incluyendo dominios similares a mucina fuertemente O-glucosilados (por ejemplo CD45), dominios de sulfato de condroitina (por ejemplo, PTP \gamma) y segmentos cortos altamente glucosilados (por ejemplo, PTP \alpha). La familia más grande de PTPs es la familia que contiene diversos motivos relacionados con aquéllos que se encuentran en las moléculas de adhesión. Entre estos motivos se incluyen los dominios similares a inmunoglobulina (IgG) y las regiones de fibronectina de tipo III (FnIII) similares a aquéllas que se encuentran en las moléculas de adhesión celular, tales como ICAM, N-CAM y Ng-CAM (Rao et al., J. Cell Biol. 118:937-949, 1992). Además, un subgrupo de estas PTPs similares a moléculas de adhesión, incluyendo las PTPs \kappa y \mu, contiene un tercer dominio denominado MAM, siglas que corresponden a motivo meprina/A5/PTP \mu (Beckman et al., Trends Biochem. Sci. 18:40-41, 1993). El motivo MAM se ha demostrado previamente que se encuentra implicado en el reconocimiento célula-célula en las neuronas (Jiang et al., J. Biol. Chem. 267:9185-9193, 1992; Takagi et al., Neuron 7:295-307, 1991; e Hirata et al., Neurosci. Res. 17:159-169, 1993). Resulta interesante que datos recientes sugieren que tres de estas PTPs similares a moléculas de adhesión aparentemente se encuentran implicadas en el guiado neural durante el desarrollo en Drosophila (Desai et al., Cell 84:599-609, 1996, y Kreuger et al., Cell 84:611-622, 1996). Conjuntamente, estos datos estructurales son consistentes con la hipótesis de que las PTPs receptoras abarcan una familia diversa de proteínas enzimáticamente activas que contienen varios motivos de superficie celular interesantes potencialmente implicados en la detección del ambiente extracelular.

Las PTPs \kappa y \mu son los receptores mejor caracterizados como moléculas de adhesión (Brady-Kalnay et al., supra, Jiang et al., Mol. Cell Biol. 13:2942-2951, 1993, y Gebbink et al., Febs. Lett. 290(1-2):123-130, 1991). Se ha demostrado que ambas PTPs se ha demostrado que median en la adhesión homotípica. De esta manera, una diversidad de ensayos, incluyendo los basados en células, así como los basados en moléculas, han demostrado que el dominio extracelular de estos enzimas puede unirse con elevada especificidad de una manera homofílica (Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 268:961-972, 1993; Gebbink et al., J. Biol. Chem. 268:16101-16104, 1993, y Sap et al., Mol. Cell Biol. 14:1-9, 1994). Resulta interesante que mezclando experimentos se revela que estas PTPs estrechamente relacionadas no se unen entre sí de modo heterofílico, sugiriendo que el dominio extracelular está destinado a reconocer otras células que expresan específicamente receptores idénticos, una situación que recuerda mucho al sistema de adhesión homotípica de la cadherina (Kemler et al., Trends Genet. 9:317-321, 1993). Aunque los dominios extracelulares requeridos para esta unión homotípica siguen siendo controvertidos, es probable que tanto el motivo MAM como la región IgG se encuentren implicados en interacciones homofílicas (Brady-Kalnay et al., J. Biol. Chem. 269:28472-28477, 1994, y Zondag et al., J. Biol. Chem. 270(24):14247-14250, 1995). Aunque estos datos sugieren que estos enzimas de adhesión homofílica se encuentran implicados en el reconocimiento de otras células que expresan tipos similares de receptores, otros datos han sugerido que este suceso de reconocimiento podría desempeñar un papel en la unión de estas células entre sí. De esta manera, Tonks y colaboradores han demostrado recientemente que el receptor PTP \mu se asocia específicamente con el complejo catenina/cadherina de las moléculas de adhesión celular homotípica (Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 130(4):977-986, 1995). También demostraron que el tratamiento de las células con el inhibidor de PTP, pervanadato, daba lugar a la regulación positiva de la fosforilación de las tirosinas de las cadherinas y cateninas, un resultado que sugería la existencia de un papel para una PTP, potencialmente una PTP \mu, en el mantenimiento del complejo cadherina/catenina en un estado infrafosforilado. Resulta interesante que los trabajos anteriores sugerían que el nivel de fosforilación de las tirosinas de este complejo se correlacionaban con la capacidad adhesiva de las cadherinas (Beherns et al., J. Cell Biol. 120:757-766, 1993), un resultado que es consistente con la hipótesis de que la adhesión entre células mediada por las cadherinas podría encontrarse regulada por sus niveles de fosforilación de las tirosinas según determinan las interacciones homotípicas entre las PTPs receptoras, tales como la \kappa y la \mu.

El descubrimiento de que las PTPs \kappa y \mu median en la adhesión homotípica, conjuntamente con la distribución algo restringida en los tejidos de estas PTPs (Jiang et al., supra, 1993, y Gebbink et al., supra, 1991) ha sugerido que podrían existir miembros adicionales de esta familia de enzimas adhesivos. En la presente memoria se dan a conocer la clonación y la caracterización del tercer miembro de esta familia de receptores PTP, denominado PTP \lambda. El polipéptido de PTP \lambda que se da a conocer en la presente memoria contiene motivos estructurales que son muy similares a aquéllos que se encuentran en PTP \kappa y \mu. Además, este nuevo receptor PTP \lambda revela una distribución en los tejidos que es divergente de la descrita anteriormente para otros miembros de esta familia.

Descripción resumida de la invención

Los presentes inventores han analizado un gran número de PTPs procedentes de una población de células hematopoyéticas murinas primitivas utilizando PCR de consenso. A partir de esta población se clonó un nuevo polipéptido de proteína tirosina fosforilasa receptora que se encuentra relacionado con las PTPs receptoras \kappa y \mu. Los presentes inventores han denominado a esta nueva proteína tirosina fosforilasa, "PTP \lambda". A diferencia de otros polipéptidos de PTP receptores conocidos, PTP \lambda se expresa predominantemente en los tejidos adultos de cerebro, pulmón y riñón de mamífero, pero predominantemente no se expresa en el tejido hepático de mamífero adulto.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado de proteína tirosina fosfatasa (PTP) receptora según la reivindicación 1.

(1) Un polipéptido de PTP puede expresarse predominantemente en tejido de cerebro, pulmón y riñón de mamífero adulto; y

(2) predominantemente no expresarse en tejido hepático de mamífero adulto,

en el que dicho polipéptido es capaz de desfosforilar los residuos tirosina fosforilados.

Los derivados de estos nuevos polipéptidos de PTP pueden conservar sustancialmente su capacidad de desfosforilar los residuos tirosina fosforilados.

Un grupo preferente de polipéptidos de PTP incluye un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 2); un homólogo adicional de mamífero de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1, y un derivado de cualquiera de los polipéptidos anteriores que conserva sustancialmente la capacidad de desfosforilar los residuos tirosina.

Las moléculas de ácidos nucleicos aislados pueden codificar los nuevos polipéptidos de PTP dados a conocer en la presente invención.

Los vectores pueden comprender ácidos nucleicos que codifican los nuevos polipéptidos de PTP de la presente invención, unidos operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector y las células transformadas con dichos vectores.

Los anticuerpos pueden ser capaces de unirse específicamente a los nuevos polipéptidos de PTP de la presente invención, y líneas celulares de hibridoma que producen dichos anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos agonistas, que estimulan la capacidad de los nuevos polipéptidos de PTP de desfosforilar las tirosinas, o anticuerpos antagonistas, que bloquean esta actividad.

Los procedimientos para producir los polipéptidos de PTP pueden comprender la transformación de una célula huésped con ácidos nucleicos que codifican dicho polipéptido, el cultivo de la célula transformada y la recuperación de dicho polipéptido del cultivo celular.

Un ensayo para identificar un antagonista o un agonista de un nuevo polipéptido de PTP de la presente invención puede comprender poner en contacto un dominio fosfatasa del polipéptido de PTP con un antagonista o agonista candidato, y realizar un seguimiento de la capacidad del dominio fosfatasa de desfosforilar residuos tirosina.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1D. El ADNc y la secuencia proteica derivada de PTP \lambda. Se ilustra el ADNc (SEC ID nº 1) y la secuencia proteica derivada (SEC ID nº 2) del clon de longitud completa de PTP \lambda homólogo con un fragmento PCR de tamaño reducido derivado de las células progenitoras hematopoyéticas utilizando cebadores de consenso de PTP. Se presentan los aminoácidos con sus denominaciones estándar de una letra.

Figuras 2A-2B. Homología entre PTP \lambda, PTP \kappa y PTP \mu. Se ilustran como residuos en cajas las homologías de aminoácidos entre los polipéptidos PTP \lambda (ptplambda) (SEC ID nº 2), PTP \kappa (ptpkappa) (SEC ID nº 3) y PTP \mu (ptpmu) (SEC ID nº 4). Se presentan los aminoácidos con sus denominaciones estándar de una letra. También se muestra por encima de las secuencias de aminoácidos los dominios predichos anteriormente a partir de PTP \kappa y de PTP \mu. Entre estos dominios se incluyen los dominios de secuencia de señal (SS), MAM (mePrin, A5, PTP \mu), tipo inmunoglobulina (IgG), tipo fibronectina de tipo III (FnIII), dominio transmembrana (TMD), tipo cadherina (Cadherina) y de fosfatasa dual (PTPasa I y PTPasa II).

Figura 3. Estructuras comparativas de dominio de PTP \lambda, PTP \kappa y PTP \mu. Se ilustran las homologías de los aminoácidos en porcentaje entre los diversos dominios de los polipéptidos PTP \lambda, PTP \kappa y PTP \mu. Entre estos dominios se
incluyen la secuencia de señal (SS), MAM (mePrin, A5, PTP \underline{\mu}), tipo inmunoglobulina (IgG), tipo fibronectina de tipo III (FnIII), dominio transmembrana (TMD), tipo cadherina (Cadherina) y de fosfatasa dual (PTPasa I y PTPasa II).

Figura 4. Actividad de tirosina fosfatasa de inmunoprecipitados de PTP \lambda procedentes de células PC 12. Se inmunoprecipitaron lisados de células PC 12 con anticuerpo preinmune (Pre-immune) o con anticuerpo contra el dominio citoplasmático del polipéptido PTP \lambda (anti-PTP \lambda). Los inmunoprecipitados se incubaron con dos péptidos inmovilizados diferentes con las tirosinas fosforiladas (PPS1 y PPS2) utilizando un kit de ensayo de tirosina fosfatasa disponible comercialmente. Los inmunoprecipitados se llevaron a cabo en ausencia o en presencia del inhibidor de tirosina fosfatasa vanadato. Se determinó la actividad de tirosina fosfatasa mediante el examen de la unión residual de un anticuerpo antifosfotirosina con el péptido inmovilizado, de manera que una DO_{405} reducida se correlaciona con la actividad de tirosina fosfatasa.

Figura 5. Análisis de transferencia Northern de la expresión de PTP \lambda. Se sondearon transferencias Northern disponibles comercialmente con un fragmento de PTP \lambda marcado con ^{32}P bajo condiciones estándar de hibridación. El secante de la izquierda ilustra el transcrito de PTP \lambda en ARN obtenido a partir de embriones murinos en el día de desarrollo mostrado en la figura. El secante de la derecha ilustra un análisis del transcrito de PTP \lambda en ARN procedente de a. corazón, b. cerebro, c. bazo, d. pulmón, e. hígado, f. músculo esquelético, g. riñón y h. testículo.

Figura 6. Expresión de ARNm de PTP \lambda en el embrión de rata E15.5. Se muestran emulsiones autorradiográficas de una sección sagital (A) de un embrión, y aumentos más elevados del cerebro embrionario medio (C), médula espinal (D), riñón (F) y pulmón hibridados con una sonda antisentido de PTP \lambda marcada con ^{33}P-UTP. Delante de las autorradiografías de campo oscuro se encuentran las imágenes correspondientes de campo iluminado de la sección sagital del embrión (B), riñón (G) y pulmón (I). La hibridación con una sonda de control de cadena sentido de PTP \lambda se muestra en una sección de médula espinal embrionaria E15.5 (E). (A,B,C,D,E), barra: 1,0 mm; (F,G,H,I), barra: 0,2 mm.

Figura 7. Expresión de ARNm de PTP \lambda en cerebro P1 y adulto de rata. Se muestran emulsiones autorradiográficas de secciones coronales de cerebro P1 de rata (A,B,C) y cerebro de rata adulta (D,E) hibridadas con una sonda antisentido de PTP \lambda marcada con ^{33}P-UTP. Las secciones coronales del cerebro P1 se encuentran al nivel del septo (A), hipocampo (B) y sustancia negra (C). Para el animal adulto, las secciones coronales de cerebro se encuentran al nivel del septo (D) y del hipocampo y la sustancia negra (E). Se muestra la hibridación con una sonda de control de cadena sentido de PTP \lambda en una sección coronal adulta a nivel de la sustancia negra (F). (A,B,C), barra: 1,0 mm, (D,E,F), barra: 1,0 mm.

Figura 8. Expresión de PTP \lambda en células PC 12. Se ilustra el transcrito de PTP \lambda observado en ARN de células PC 12 no tratadas (-) o tratadas (+) con 10 ng/ml de factor de crecimiento nervioso (NGF) para los días mostrados en la parte superior de la figura. La transferencia inferior muestra la señal de \beta-actina obtenida para cada uno de los ARNs.

Figura 9. Análisis de inmunofluorescencia de la expresión de PTP \lambda en células PC 12. Las células PC 12 se dejaron sin tratar o se trataron con 10 ng/ml de factor de crecimiento nervioso (NGF) durante 7 días para inducir la formación de neuritas. Al final de este tiempo, las células se permeabilizaron y se tiñeron con suero preinmune o con anticuerpos contra el dominio intracelular de PTP \lambda. Las células se lavaron y se observaron mediante microscopía de fluorescencia confocal. El panel A muestra los resultados sin NGF y con suero preinmune. El panel B muestra los resultados sin NGF y con suero anti-PTP \lambda. El panel C muestra los resultados con NGF y suero anti-PTP \lambda. El panel D muestra los resultados obtenidos con NGF y suero anti-PTP \lambda a un aumento más elevado que en el panel C. Las flechas muestran las neuritas extendidas teñidas positivamente.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Las expresiones "proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora", "proteína tirosina fosfatasa \lambda" y "PTP \lambda" se utilizan indistintamente y se refieren a un polipéptido nativo de proteína tirosina fosfatasa unido a membrana que (1) se expresa predominantemente en tejido de cerebro, pulmón y riñón adultos de mamífero, y (2) predominantemente no se expresa en el tejido hepático de mamífero adulto, en el que el polipéptido es capaz de desfosforilar los residuos tirosina fosforilados. Las expresiones anteriores también pretenden abarcar los derivados funcionales de estas tirosina fosfatasas nativas.

La expresión "tirosina fosfatasa nativa" en el presente contexto se refiere a un polipéptido tirosina fosfatasa de origen natural que presenta las características descritas, de cualquier especie animal humana o no humana, con o sin la metionina de iniciación, ya sea purificada a partir de la fuente natural, sintetizada, producida mediante tecnología de ADN recombinante o mediante cualquier combinación de estos y/u otros procedimientos. La PTP \lambda nativa incluye específicamente la proteína PTP \lambda murina nativa mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 2).

Un "derivado funcional" de un polipéptido es un compuesto que presenta una actividad biológica cualitativa en común con el polipéptido nativo. De esta manera, un derivado funcional de un polipéptido PTP \lambda nativo es un compuesto que presenta una actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido PTP \lambda nativo, por ejemplo ser capaz de desfosforilar residuos tirosina fosforilados. La expresión "derivados funcionales" incluye, aunque sin limitación, fragmentos de polipéptido nativo de cualquier especie animal (incluyendo el ser humano), derivados de polipéptidos nativos (humanos y no humanos) y fragmentos de los mismos, variantes de glucosilación de un polipéptido nativo, y análogos péptidos y no péptidos de polipéptidos nativos, con la condición de que presenten una actividad biológica en común con un polipéptido nativo respectivo. El término "fragmentos" comprende las regiones dentro de la secuencia de un polipéptido nativo maduro. El término "derivado" se utiliza para definir variantes de secuencias de aminoácidos, y modificaciones covalentes de un polipéptido nativo. La expresión "análogos no péptidos" se refiere a compuestos orgánicos que muestran sustancialmente la misma superficie que análogos péptidos de los polipéptidos nativos. De esta manera, los análogos no péptidos de la PTP \lambda nativa de la presente invención son compuestos orgánicos que muestran sustancialmente la misma superficie que los análogos péptidos de la PTP \lambda nativa. Estos compuestos interaccionan con otras moléculas de manera similar a los análogos péptidos, e imitan una actividad biológica de una PTP \lambda nativa de la presente invención. Los derivados funcionales del polipéptido de la PTP \lambda nativa de la presente invención presentan por lo menos el 65%, más preferentemente por lo menos el 75%, todavía más preferentemente por lo menos el 85%, más preferentemente por lo menos el 95%, de identidad global de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en
la figura 1 (SEC ID nº 2), y sustancialmente conservan la capacidad de desfosforilar los residuos tirosina fosforilados.

La expresión "actividad biológica" en el contexto de la definición de derivados funcionales se define como la posesión en común cualitativamente de por lo menos una función de adhesión, reguladora o efectora con un polipéptido nativo (por ejemplo PTP \lambda). Los derivados funcionales de la PTP \lambda nativa de la presente invención se encuentran unificados por su capacidad cualitativa de desfosforilar residuos tirosina fosforilados. Preferentemente, los derivados funcionales de los polipéptidos PTP \lambda nativos de la presente invención conservan cualitativamente por lo menos una de las siguientes propiedades biológicas de las moléculas nativas: mediación de la adhesión celular, y participación en el guiado neural.

Las expresiones "modificación covalente" y "derivados covalentes" se utilizan intercambiablemente e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las modificaciones de un polipéptido nativo o fragmento del mismo con un agente derivatizante orgánico proteico o no proteico, las fusiones con las secuencias de polipéptido heterólogo y las modificaciones post-traduccionales. Las modificaciones covalentes tradicionalmente se han introducido haciendo reaccionar residuos aminoácidos diana con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con caras seleccionadas o con residuos terminales, o mediante mecanismos de control de las modificaciones post-traduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Determinadas modificaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de las células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparaginilo con frecuencia se desamidan post-traduccionalmente para formar los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones ligeramente ácidas. Entre otras modificaciones post-traduccionales se incluyen la hidroxilación de la prolina y de la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos serilo, tirosina o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisinas, argininas e histidinas (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86, 1983). Entre los derivados/modificaciones covalentes se incluyen específicamente las proteínas de fusión que comprenden secuencias nativas de PTP \lambda de la presente invención y sus variantes de secuencia de aminoácidos, tales como las inmunoadhesinas, y las fusiones N-terminales con señales de señal heterólogas.

Las expresiones "expresada predominantemente", "expresión predominante" y los equivalentes gramaticales de los mismos se definen como un nivel de expresión de un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que resulta fácilmente detectable mediante análisis de transferencia northern bajo condiciones restrictivas.

Las expresiones "identidad" u "homología" con respecto a un polipéptido nativo y su derivado funcional se definen en la presente memoria como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de un polipéptido nativo correspondiente, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si resulta necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Ni las extensiones N-terminales ni C-terminales ni las inserciones debe interpretarse que reducen la identidad u homología. Los procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica.

El término "agonista" se utiliza para referirse a análogos péptido y no péptido de la PTP \lambda nativa de la presente invención y a anticuerpos que se unen específicamente a la PTP \lambda nativa con la condición de que conserven por lo menos una actividad biológica de una PTP \lambda nativa. Preferentemente, los agonistas de la presente invención conservan la capacidad cualitativa de desfosforilar residuos tirosina fosforilados.

El término "antagonista" se utiliza para referirse a una molécula que inhibe una actividad biológica de una PTP \lambda nativa de la presente invención. Preferentemente, los antagonistas de la presente invención inhiben la capacidad de la PTP \lambda de la presente invención de desfosforilar tirosinas. Los antagonistas preferentes esencialmente bloquean por completo la desfosforilación de las tirosinas causada por la PTP \lambda.

Habitualmente, los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-\alpha-aminoácidos de origen natural. Sin embargo, en algunas realizaciones pueden encontrarse D-aminoácidos en los polipéptidos o péptidos de la presente invención con el fin de facilitar la restricción conformacional. Por ejemplo, con el fin de facilitar la formación y estabilidad de los enlaces disulfuro, puede proporcionarse un D-aminoácido cisteína en uno o ambos extremos de un derivado funcional de un péptido o de un antagonista péptido de la PTP \lambda nativa de la presente invención. Los aminoácidos se identifican por sus denominaciones de una o tres letras:

Asp	D	ácido aspártico	Ile	I	isoleucina
Thr	T	treonina	Leu	L	leucina
Ser	S	serina	Tyr	Y	tirosina
Glu	E	ácido glutámico	Phe	F	fenilalanina
Pro	P	prolina	His	H	histidina
Gly	G	glicina	Lys	K	lisina
Ala	A	alanina	Arg	R	arginina
Cys	C	cisteína	Trp	W	triptófano
Val	V	valina	Gln	Q	glutamina
Met	M	metionina	Asn	N	asparagina

Estos aminoácidos pueden clasificarse de acuerdo a la composición química y propiedades de sus cadenas laterales. Se clasifican ampliamente en dos grupos: con carga y sin carga. Cada uno de estos grupos se divide en subgrupos para clasificar los aminoácidos con mayor exactitud:

I. Aminoácidos con carga

Residuos ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico

Residuos básicos: lisina, arginina, histidina

II. Aminoácidos sin carga

Residuos hidrofílicos: serina, treonina, asparagina, glutamina

Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina

Residuos no polares: cisteína, metionina, prolina

Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano.

La expresión "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos nativa.

Las variantes de sustitución son aquéllas en las que se ha eliminado por lo menos un residuo aminoácido en la secuencia nativa y se ha insertado un aminoácido diferentes en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, donde sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, donde se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.

Las variantes de inserción son aquéllas en las que se ha insertado uno o más aminoácidos en posición inmediatamente contigua a un aminoácido en una posición particular en la secuencia nativa. Inmediatamente contiguo a un aminoácido significa conectado al grupo funcional \alpha-carboxi o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes de deleción son aquéllas en las que se ha eliminado uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa. Habitualmente, las variantes de deleción presentarán la deleción de uno o dos aminoácidos en una región particular de la molécula.

Los "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas (Igs)" son glucoproteínas con las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos muestran especificidad para un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen ambos anticuerpos y otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles reducidos por el sistema linfático y a niveles incrementados por los mielomas.

Los anticuerpos e inmunoglobulinas nativos habitualmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también presenta puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante, en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadenas ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186:651-663, 1985; Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4592-4596, 1985).

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensivamente en su secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra distribuida uniformemente a lo largo de la totalidad del dominio variable de los anticuerpos. Se encuentra concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables, en los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas nativas pesada y ligera comprenden cada una de ellas cuatro regiones FR, que mayoritariamente adoptan una configuración de lámina \beta, conectadas mediante tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina \beta. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad con las regiones FR y, con las CDRs de otra cadena, contribuyendo a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991). Los dominios constantes no se encuentran directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc" cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da lugar a un fragmento F(ab')_{2} que presenta dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de unión cruzada a un antígeno.

"Fv" se refiere al fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión a antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En esta configuración, las tres CDRs de cada dominio variable interaccionan, definiendo un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis CDRs proporcionan especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicos para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y de unirse a un antígeno, aunque a una afinidad inferior a la del sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente memoria para Fab' en el que el residuo o residuos de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que presentaban cisteínas de bisagra entre ellos. Por otra parte, también son conocidos los acoplamientos químicos entre fragmentos de anticuerpo.

Las cadenas ligeras de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a cualquiera de dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden incluirse en diferentes clases. Existen cinco clases importantes de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas clases se dividen adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, delta, epsilon, \gamma, y \mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales únicos (incluyendo los anticuerpos agonistas y antagonistas), las composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica, así como los fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab, F(ab')_{2} y Fv), con la condición de que muestren la actividad biológica deseada.

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La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de aparición natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales resultan ventajosos en que resultan sintetizados por el cultivo de hibridoma, no contaminado con otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567, Cabilly et al.).

Los anticuerpos monoclonales en la presente invención incluyen específicamente los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos", en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (patente US nº 4.816.567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras secuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituye por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que ni se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o de marco importadas. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar adicionalmente y optimizar la función de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos, en el que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles ver Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann et al., Nature 332:323-329, 1988; documento EP nº B-239.400 publicada el 30 de septiembre de 1987; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; y documento EP nº B-451.216 publicada el 24 de enero de 1996).

En el contexto de la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente, y todas estas designaciones incluyen la progenie. También se aprecia que toda la progenie puede ser exactamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones artificiales o aleatorias. Se incluye la progenie mutante que presenta la misma función o propiedad biológica, según se ha cribado en la célula originalmente transformada.

Las expresiones "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" se refieren a un segmento de ADN, habitualmente de doble cadena, en el que puede haberse insertado un segmento de ADN foráneo. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN que no se encuentra naturalmente en la célula huésped. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo a una célula huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, y generarse varias copias del vector y de su ADN (foráneo) insertado. Además, el vector contiene los elementos necesarios que permiten traducir el ADN foráneo para formar un polipéptido. De esta manera pueden sintetizarse rápidamente muchas moléculas del polipéptido codificado por el ADN foráneo.

La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión a ribosoma, y posiblemente otras secuencias hasta el momento poco conocidas. Las células eucarióticas es conocido que utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o de un líder secretorio se encuentra ligado operablemente a ADN de un polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se sitúa de manera que se facilite la traducción. Generalmente, "ligado operablemente" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, son contiguas y se encuentran en la misma fase de lectura. Sin embargo, no resulta necesario que los intensificadores sean contiguos. El ligamiento se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, pueden utilizarse adaptadores o línkers de oligonucleótidos de síntesis de acuerdo con la práctica convencional.

Las "inmunoadhesinas" o "quimeras PTP \lambda-inmunoglobulina" son moléculas quiméricas similares a anticuerpos que combinan el dominio o dominios funcionales de una proteína de unión (habitualmente un receptor, una molécula de adhesión celular o un ligando) con una secuencia de inmunoglobulina. El ejemplo más común de este tipo de proteína de fusión combina las regiones de bisagra y Fc de una inmunoglobulina (Ig) con dominios de un receptor de superficie celular que reconoce un ligando específico. Este tipo de molécula se denomina "inmunoadhesina" debido a que combina las funciones "inmune" y "de adhesión"; otros nombres utilizados con frecuencia son "quimera Ig", "proteína de fusión Ig" o "proteína de fusión Fc" o "globulina receptora".

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos de cadena única o de doble cadena de longitud corta que se sintetizan químicamente mediante procedimientos conocidos (tales como la química fosfotriéster, fosfito o fosforamidita, utilizando técnicas en fase sólida, tales como aquéllas descritas en la patente EP nº 266.032, publicada el 4 de mayo de 1988, o mediante intermediarios desoxinucleósidos H-fosfonato, tal como describen Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14:5399, 1986). A continuación, se purifican en geles de poliacrilamida.

La hibridación preferentemente se lleva a cabo bajo "condiciones astringentes", que significa que (1) se utiliza una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC, o (2) se utiliza durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 nM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es la utilización de formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6/8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%. Todavía otro ejemplo es la hibridación con un tampón de dextrán sulfato al 10%, 2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado a alta astringencia consistente en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

"Transformación" significa introducir ADN en un organismo de manera que el ADN sea replicable, sea como elemento extracromosómico o mediante integración en el cromosoma. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para las células. El tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio, tal como describe Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69:2110, 1972, y Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:154, 1970, generalmente se utiliza para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. Para las células de mamífero, sin estas paredes celulares, resulta preferente el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham, F. y van der Eb, A., Virology 52:456-457, 1978. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped han sido descritos por Axel, en la patente US nº 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen, P. et al., J. Bact. 130:946, 1977, y de Hsiao, C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir el ADN en las células, tales como la inyección nuclear, la electroporación o la fusión de protoplasto.

Los términos "recuperación" o "aislamiento" referidos a un fragmento dado de ADN de un digerido de restricción significan la separación del digerido en un gel de poliacrilamida o de agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de interés mediante la comparación de su movilidad con la de fragmentos de ADN marcador de peso molecular conocido, extracción de la sección de gel que contiene el fragmento deseado, y separación del ADN del gel. Este procedimiento es conocido de manera general. Por ejemplo, ver R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9:6103-6114, 1981, y D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980.

El término "ligación" se refiere al procedimiento de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (T. Maniatis et al., supra, 1982, supra, página 146). A menos que se indique lo contrario, la ligación puede llevarse a cabo utilizando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por cada 0,5 mg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.

El término "preparación" referido al ADN de transformantes significa aislar el ADN de plásmido del cultivo microbiano. A menos que se indique lo contrario, puede utilizarse el procedimiento de álcali/SDS de Maniatis et al., supra, página 90, 1982.

B. Producción de PTP \lambda mediante tecnología de ADN recombinante 1. Identificación y aislamiento de ácidos nucleicos que codifican la PTP \lambda

Las proteínas nativas PTP \lambda de la presente invención pueden aislarse a partir de bibliotecas de ADNc o genómicas. Por ejemplo, puede construirse una biblioteca adecuada de ADNc mediante la obtención de ARNm poliadenilado a partir de células que es conocido que expresan la proteína PTP \lambda deseada, y utilizar el ARNm como molde para sintetizar ADNc de doble cadena. Son fuentes adecuadas de ARNm, las células hematopoyéticas murinas primitivas y las células PC12. El ARNm que codifica la PTP \lambda nativa de la presente invención se expresa, por ejemplo, en tejidos derivados de órganos adultos de cerebro, pulmón, riñón, corazón, músculo esquelético y testículo. El gen que codifica el nuevo polipéptido de PTP \lambda de la presente invención también puede obtenerse de una biblioteca genómica, tal como una biblioteca de cósmido genómico humano, o de una biblioteca genómica de células embrionarias (ES) derivadas de ratón.

Las bibliotecas, sean de ADNc o genómicas, seguidamente se criban con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. Para las bibliotecas de expresión de ADNc, entre las sondas adecuadas se incluyen los anticuerpos monoclonales y policlonales que reconocen y específicamente se unen a un polipéptido de PTP \lambda. Para las bibliotecas de ADNc, entre las sondas adecuadas se incluyen sondas de oligonucleótidos cuidadosamente seleccionadas (habitualmente de aproximadamente 20 a 80 bases de longitud) que codifican partes conocidas o sospechadas de un polipéptido de PTP \lambda de la misma especie o de una especie diferente, y/o ADNcs complementarios u homólogos o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o un gen similar. Entre las sondas apropiadas para cribar las bibliotecas de ADN genómico se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, los oligonucleótidos, ADNcs o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o un gen similar, y/o ADNs genómicos homólogos o fragmentos de los mismos. El cribado de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en los capítulos 10 a 12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Si se aísla un ADN codificante de un enzima de la presente invención mediante la utilización de secuencias de oligonucleótidos cuidadosamente seleccionadas para cribar bibliotecas de ADNc de diversos tejidos, las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente inequívocas para minimizar el número de falsos positivos. La secuencia o secuencias actuales de nucleótidos habitualmente se diseñan basándose en regiones que presentan la mínima redundancia de codones. Los oligonucleótidos pueden encontrarse degenerados en una o más posiciones. La utilización de oligonucleótidos degenerados resulta de particular importancia en el caso de que se cribe una biblioteca de una especie en la que no se conozca el patrón de uso preferente de los codones.

Los oligonucleótidos deben etiquetarse de manera que puedan detectarse al hibridarse con ADN en la biblioteca que se criba. El procedimiento preferente de marcaje es utilizar ATP (por ejemplo \gamma^{32}P) y polinucleótido quinasa para marcar radioactivamente el extremo 5' del oligonucleótido. Sin embargo, pueden utilizarse otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la biotinilación o el marcaje enzimático.

Los ADNc que codifican la PTP \lambda también pueden identificarse y aislarse mediante otras técnicas conocidas de tecnología de ADN recombinante, tales como la clonación directa de expresión, o mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como se describe en la patente US nº 4.683.195, publicada el 28 de julio de 1987, en la sección 14 de Sambrook et al., supra, o en el capítulo 15 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. editores, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1991. La utilización de la técnica de PCR para obtener ADNc codificante de PTP \lambda murina también se ilustra en los ejemplos.

Tras el aislamiento del ADNc que codifica un enzima PTP \lambda de una especie, los ADNcs de otras especies también pueden obtenerse mediante hibridación interespecífica. De acuerdo con este enfoque, se sondean bibliotecas de ADNc o genómicas humanas, o de otros mamíferos, con secuencias de oligonucleótidos marcados seleccionadas de entre las secuencias de PTP \lambda (tales como PTP \lambda murina) siguiendo criterios conocidos, entre los cuales se encuentran que la secuencia debe ser de longitud suficiente y suficientemente inequívoca para minimizar el número de falsos positivos. Típicamente resulta suficiente un oligonucleótido marcado con ^{32}P de aproximadamente 30 a 50 bases, particularmente si el oligonucleótido contiene uno o más codones para metionina o para triptófano. El ácido nucleico es ADN identificado y separado del ácido nucleico contaminante que codifica otros polipéptidos aislado de la fuente de ácidos nucleicos. La hibridación preferentemente se lleva a cabo bajo "condiciones astringentes", tales como las descritas anteriormente en la presente memoria.

Una vez se conoce la secuencia, también puede obtenerse mediante síntesis química el gen que codifica un polipéptido de PTP \lambda particular, siguiendo uno de los procedimientos descritos en Engels y Uhimann, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28:716, 1989. Entre estos procedimientos se incluyen los procedimientos triéster, fosfito, fosforamidita y H-fosfonato, la PCR y otros procedimientos de autocebado, y las síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos.

2. Clonación y expresión de ácidos nucleicos que codifican PTP \lambda

Una vez se encuentra disponible el ácido nucleico que codifica la PTP \lambda, generalmente se liga en un vector de expresión replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión.

Los vectores de expresión y clonación son bien conocidos en la técnica y contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. La selección del vector apropiado depende de: 1) si debe utilizarse para la amplificación de ADN o para la expresión de ADN, 2) el tamaño del ADN a insertar en el vector, y 3) la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y la célula huésped para la que es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque sin limitarse a ellos, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente indicados, las secuencias deseadas de codificación y de control, se lleva a cabo utilizando técnicas estándar de ligación. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se cortan, se ajustan y se ligan nuevamente en la forma deseada para generar los plásmidos deseados. Para el análisis de confirmación de la secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación comúnmente se utilizan para transformar células de E. coli, por ejemplo la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC nº 31.446) y los transformantes exitosos se seleccionan por su resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina, en su caso. Los plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309, 1981, o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499, 1980.

Los polipéptidos de la presente invención pueden expresarse en una diversidad de células huésped procarióticas o eucarióticas. Entre los procariotas adecuados se incluyen los organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Un huésped de clonación preferente es E. coli 294 (ATCC nº 31.446), aunque resultan adecuados otros procariotas gram-negativos o gram-positivos, tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC nº 31.537), E. coli W3110 (ATCC nº 27.325), especies de Pseudomonas o Serratia marcesans.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos, tales como hongos filamentosos o levaduras, resultan huéspedes adecuados para los vectores de la presente invención. Saccharomyces cerevisae, o levadura común de panadero, es la utilizada más comúnmente y que resulta útil en la presente invención, tal como S. pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140, 1981), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737, 1983), yarrowia (patente EP nº 402.226); Pichia pastoris (patente EP nº 183.070), Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979) y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985).

Las células huésped adecuadas también pueden derivarse de organismos multicelulares. Estas células huésped son capaces de actividades complejas de procesamiento y de glucosilación. En principio, resulta utilizable cualquier cultivo de células eucarióticas, sea de un cultivo de vertebrado o de invertebrado, aunque las células de mamífero, tal como el ser humano, resultan preferentes. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y células huésped de insecto permisivas correspondientes, tales como células huésped de Spodoptera frugiperda (oruga), de Aedes aegypti (mosquito), de Aedes albopictus (mosquito), de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y de Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology 6:47-55, 1988; Miller et al., en Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., editores, vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), páginas 277-279, y Maeda et al., Nature 315:592-594, 1985. Se encuentran públicamente disponibles una diversidad de dichas cepas víricas, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV, y estos virus pueden utilizarse como el virus de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Típicamente, se transfectan células vegetales mediante incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que se ha manipulado previamente para que contenga ADN de PTP \lambda. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN codificante del polipéptido de PTP \lambda se transfiere a la célula vegetal huésped que se transfecta, y que, bajo las condiciones apropiadas, expresará el ADN de PTP \lambda. Además, se encuentran disponibles secuencias reguladoras y de señal compatibles con las células vegetales, tales como el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias de señal de poliadenilación (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:561, 1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región corriente arriba del gen 780 de ADN-T son capaces de activar o de incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en el tejido vegetal que contiene ADN recombinante (ver la patente EP nº 321.196, publicada el 21 de junio de 1989).

Sin embargo, el mayor interés lo ha suscitado las células de vertebrado, y la propagación de las células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) es conocida per se (ver Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores, 1973). Son ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles la línea CV 1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATTC CRL nº 1651); la línea celular de riñón embrionario humano (células 293, o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977); las células de riñón de hámster neonato 9BHK, ATCC CCL nº 10; las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980; las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biot. Reared. 23:243-251, 1980); las células de riñón de mono (CV1, ATCC CCL nº 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 nº 587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL nº 2); las células de riñón canino (MDCK, ATTC CCL nº 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL nº 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL nº 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL nº 51): células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44068, 1982); células MRC 5; células FS4 y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped preferentes son las células 293 de riñón embrionario humano y las células de ovario de hámster chino.

Resultan particularmente útiles en la práctica de la presente invención los vectores de expresión que permiten la expresión transitoria en células de mamífero de ADN codificante de un polipéptido de PTP \lambda. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas transitorios, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten convenientemente la identificación positiva de polipéptidos codificados por ADNs de clones, así como el cribado rápido de estos polipéptidos para propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, los sistemas de expresión transitoria resultan particularmente útiles en la invención para los fines de identificar análogos y variantes de un polipéptido de PTP \lambda.

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de los polipéptidos de PTP \lambda en cultivo celular recombinante de vertebrado se describen en Getting et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantel et al., Nature 281:40-46, 1979; Levinson et al., patentes EP nº 117.060 y EP nº 117.058. Resultan plásmidos particularmente útiles para la expresión en cultivo de células de mamífero de los polipéptidos de PTP \lambda, pRK5 (patente EP nº 307.247) o pSV16B (publicación PCT nº WO 91/08291).

Otros vectores de clonación y expresión adecuados para la expresión de los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención en una diversidad de células huésped se describen, por ejemplo, en la patente EP nº 457.758, publicada el 27 de noviembre de 1991. En la actualidad se encuentran comercialmente disponibles una gran diversidad de vectores de expresión. Un vector de expresión comercial ejemplar de levadura es pPIC.9 (Invitrogen), mientras que un vector de expresión comercialmente disponible adecuado para la transformación de células de E. coli es PET15b (Novagen).

C. Cultivo de células huésped

Las células procarióticas utilizadas para producir los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención se cultivan en medios adecuados, tal como se describe de manera general en Sambrook et al., supra.

Las células de mamífero pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como el medio F10 de Ham (Sigma), el medio mínimo esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) resultan adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios indicados en Ham y Wallace, Meth. Enzymol. 58:44, 1979; Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255, 1980, patentes US nº 4.767.704, nº 4.657.866, nº 4.927.762, o nº 4.560.655; patentes WO nº 90/03430, WO nº 87/00195, o la patente US nº Re. 30.985 pueden utilizarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según resulte necesario con hormonas y/o con otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco Gentamycin^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía alternativa. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, convenientemente son aquéllas utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la clonación o expresión, según sea el caso, y resultarán evidentes para el experto ordinario en la materia.

Las células huésped a las que se hace referencia en la presente exposición abarcan a las células en cultivo celular in vitro, así como las células que se encuentran en un animal o planta huésped.

Se contempla además que el polipéptido de PTP \lambda de la presente invención se produzca mediante recombinación homóloga, o mediante procedimientos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen ADN que codifica el polipéptido de PTP \lambda particular.

D. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern convencional, transferencia northern para cuantificar la transcripción en ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980), transferencia en mancha (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias que se proporcionan en la presente memoria. Pueden utilizarse diversos marcajes, más comúnmente isótopos radioactivos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también pueden utilizarse otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos con la biotina modificada para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como sitio para la unión a avidina o a anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia diversidad de marcajes, tales como radionucleidos, compuestos fluorescentes, enzimas o similares. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo donde el dúplex se encuentra unido a la superficie, de manera que al formarse el dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de cultivos celulares o líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión en producto génico. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguido de la reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico unido, en las que los marcajes habitualmente son detectables visualmente, tales como marcajes enzimáticos, marcajes fluorescentes, marcajes luminiscentes y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible adecuada para la utilización en la presente invención se describe en Hse et al., Am. J. Clin. Pharm. 75:734-738, 1980.

Los anticuerpos útiles para la tinción y/o ensayo inmunohistoquímico pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden preparase en cualquier animal. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido de PTP \lambda nativo, o contra un péptido sintético basado en la secuencia de ADN proporcionada en la presente invención, tal como se describe adicionalmente después.

E. Variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de PTP \lambda nativa

Las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de PTP \lambda nativa se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ADN de PTP \lambda, o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Existen dos variables principales en la construcción de variantes de secuencia de aminoácidos: la localización del sitio de la mutación, y la naturaleza de la mutación. Con la excepción de los alelos de origen natural, que no requieren la manipulación de la secuencia de ADN codificante del polipéptido de PTP \lambda, las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de PTP \lambda preferentemente se construyen haciendo mutar el ADN, para lograr un alelo o una secuencia de aminoácidos variante que no se observa en la naturaleza.

Un grupo de las mutaciones se crea dentro de por lo menos uno de los dominios fosfatasa (PTPasa I y/o PTPasa II) de una proteína PTP \lambda nativa. En vista de la implicación de estos dominios en la actividad enzimática de PTP \lambda, las alteraciones de aminoácidos en estos dominios se espera que resulte en cambios marcados en las propiedades enzimáticas de las proteínas nativas. Las sustituciones no conservativas en última instancia puede resultar en variantes de PTP \lambda que pierden la capacidad de desfosfatar tirosinas y, por lo tanto, resultarán útiles como antagonistas de la PTP \lambda nativa. Las variantes de PTP \lambda mutadas para incrementar la actividad enzimática de las proteínas nativas también pueden obtenerse, y encontrarán utilidad, como potentes mediadores en la adhesión celular.

De manera similar, las alteraciones de aminoácidos en los dominios MAM de IgG de las proteínas PTP \lambda nativas es previsible que afecten a la capacidad de estos receptores de mediar en la adhesión celular homotípica, y en la especificidad de la interacción homofílica mediada.

Alternativamente, o adicionalmente, las alteraciones de aminoácidos pueden llevarse acabo en sitios que difieren en las proteínas PTP \lambda en diferentes especies, o en regiones altamente conservadas, dependiendo del objetivo a conseguir. Los sitios en estas localizaciones típicamente se modificarán en serie, por ejemplo mediante (1) sustitución en primer lugar con selecciones conservativas y después con selecciones más radicales, dependiendo de los resultados conseguidos; (2) delecionar el residuo o residuos diana, o (3) insertar residuos de la misma o diferente clase contiguos al sitio localizado, o combinaciones de las opciones 1 a 3. Una técnica que resulta útil se denomina "escaneo de alaninas" (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989). La sustitución de motivos de secuencia dentro de los dominios MAM, IgG, FNIII o PTPasa de las proteínas PTP \lambda nativas de la presente invención por secuencias procedentes de la PTP \kappa nativa y/o de los receptores PTP \mu se espera que resulte en variantes con especificidades alteradas.

En todavía otro grupo de los polipéptidos PTP \lambda variantes de la presente invención, uno o más de los dominios funcionalmente menos significativos puede delecionarse o inactivarse. Por ejemplo, la deleción o la inactivación del dominio transmembranal proporciona variantes solubles de la proteína nativa. Alternativamente, o adicionalmente, el dominio citoplasmático puede delecionarse, truncarse o alterarse de otra manera.

Los aminoácidos de origen natural pueden dividirse en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutros hidrofóbicos: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen sobre la orientación de las cadenas: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones conservativas implican intercambiar un miembro dentro de un grupo por otro miembro dentro del mismo grupo, mientras que las sustituciones no conservativas suponen intercambiar un miembro de estas clases por otro. Los cambios sustanciales de función o de identidad inmunológica se llevan a cabo mediante la selección de sustituciones que son menos conservativas, es decir, que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo en conformación de lámina o de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de los nuevos polipéptidos de PTP \lambda nativos de la presente invención serán aquellos en los que: (a) se sustituye un residuo hidrofílico, por ejemplo serilo o treonilo, por (o con) un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) se sustituye una cisteína o una prolina por (o con) cualquier otro residuo; (c) se sustituye un residuo que presenta una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, por (o con) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) se sustituye un residuo que presenta una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, por (o con) una que no presenta una cadena lateral, por ejemplo glicina.

Las deleciones en secuencias de aminoácidos generalmente son de entre 1 y 30 residuos, más preferentemente de entre aproximadamente 1 y 10 residuos, y típicamente son contiguas. Sin embargo, resultan adecuadas la deleción del extremo C-terminal, la deleción de cualquier otro extremo N-terminal adecuado o la deleción de la región transmembranal, conservando la actividad biológica o la reactividad inmunológica cruzada de la PTP \lambda nativa.

Una clase preferente de variantes de sustitución y/o de deleción de la presente invención es aquélla que implica una región transmembranal de una nueva molécula de PTP \lambda. Las regiones transmembranales son dominios altamente hidrofóbicos o lipofílicos del tamaño apropiado para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que anclan la proteína PTP \lambda en la membrana celular y permiten la formación de complejos homotípicos. La inactivación del dominio transmembranal, típicamente por deleción o por sustitución de los residuos de hidroxilación del dominio transmembranal, facilita la recuperación y la formulación mediante la reducción de su afinidad lipídica celular o membranal y mediante el incremento de su solubilidad acuosa. Si se delecionan los dominios transmembranales y citoplasmáticos se evita la introducción de epítopos potencialmente inmunogénicos, sea por exposición a polipéptidos de otra manera intracelulares que pueden resultar reconocidos por el cuerpo como foráneos, o mediante inserción de polipéptidos heterólogos que resultan potencialmente inmunogénicos. La inactivación de la función de unión de la membrana se consigue mediante la deleción de suficientes residuos para producir un perfil de hidropatía sustancialmente hidrofílico en ese sitio o mediante sustitución por residuos heterólogos que consigan el mismo resultado.

Una ventaja principal de las variantes transmembranales inactivadas de los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención es que pueden secretarse hacia el medio de cultivo de los huéspedes recombinantes. Estas variantes son solubles en líquidos corporales, tales como la sangre, y no presentan una afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular, simplificando de esta manera considerablemente su recuperación del cultivo de células recombinantes. A título general, estas variantes solubles no presentan un dominio transmembranal funcional y preferentemente no presentan un dominio citoplasmático funcional. Por ejemplo, el dominio transmembranal puede sustituirse por cualquier secuencia de aminoácidos, por ejemplo una secuencia aleatoria o secuencias predeterminadas de entre aproximadamente 5 y 50 serinas, treoninas, lisinas, argininas, glutaminas, ácidos aspárticos y residuos hidrofílicos similares, que conjuntamente muestran un perfil de hidropatía hidrofílico. Al igual que las variantes solubles por deleción (truncadas), estas variantes se secretan al medio de cultivo de los huéspedes recombinantes.

Entre las inserciones de aminoácidos se incluyen las fusiones amino-terminales y/o carboxilo-terminales de longitud comprendida entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuencia de un residuo aminoácido o de múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína PTP \lambda) pueden presentar de manera general entre aproximadamente 1 y 10 residuos, más preferentemente entre 1 y 5 residuos, más preferentemente entre 1 y 3 residuos. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen los polipéptidos de PTP \lambda con un residuo metionilo N-terminal, un artefacto de su expresión directa en cultivo de células bacterianas recombinantes, y una fusión de una secuencia de señal heteróloga N-terminal con el extremo N-terminal de la molécula de PTP \lambda para facilitar la secreción de la PTP \lambda madura de las células huésped recombinantes. Estas secuencias de señal generalmente se obtienen de, y de esta manera son homólogas de, la especie de la célula huésped pretendida. Entre las secuencias adecuadas se incluyen STII o Lpp para E. coli, el factor alfa para las levaduras, y las señales víricas, tales como gD del herpes, para las células de mamífero.

Entre las otras variantes de inserción de las moléculas nativas de PTP \lambda se incluyen la fusión del extremo N-terminal o C-terminal de la molécula de PTP \lambda con polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo polipéptidos bacterianos, tales como la beta-lactamasa o un enzima codificado por el locus trp de E. coli, o una proteína de levadura, y las fusiones C-terminales con proteínas que presentan una vida media prolongada, tales como las regiones de inmunoglobulina (preferentemente las regiones constantes de inmunoglobulina), la albúmina, o la ferritina, tal como se describe en la patente WO nº 89/02922, publicada el 6 de abril de 1989.

Las variantes de inserción adicionales son derivados inmunológicamente activos de los nuevos polipéptidos de PTP \lambda, que comprenden el polipéptido de PTP y un polipéptido que contiene un epítopo de un polipéptido foráneo inmunológicamente competente, es decir, un polipéptido que es capaz de inducir una respuesta inmunológica en el animal en el que debe administrarse la fusión, o que es capaz de unirse a un anticuerpo cultivado contra un polipéptido foráneo. Son ejemplos típicos de estos polipéptidos inmunológicamente competentes los alérgenos, los epítopos autoinmunes, u otros inmunógenos potentes o antígenos reconocidos por anticuerpos preexistentes en el receptor de fusión, incluyendo polipéptidos bacterianos, tales como trpLE, \beta-galactosidasa, polipéptidos víricos, tales como la proteína gD del herpes, y similares.

Las fusiones inmunogénicas se producen mediante unión cruzada in vitro o mediante cultivo de células recombinantes transformadas con ADN codificante de un polipéptido inmunogénico. Resulta preferente que la fusión inmunogénica sea una en la que la secuencia inmunogénica se encuentra unida o insertada en una nueva molécula de PTP \lambda o fragmento de la misma por uno o más enlaces peptídicos. Por lo tanto, estos productos consisten en una cadena lineal de polipéptido que contiene el epítopo de PTP \lambda, y por lo menos un epítopo foráneo al polipéptido de PTP \lambda. Se apreciará que se encuentra dentro del alcance de la presente invención introducir los epítopos en cualquier sitio dentro de una molécula de PTP \lambda de la presente invención o de un fragmento de la misma. Estas inserciones inmunogénicas resultan particularmente útiles cuando se formulan en un portador farmacológicamente aceptable y se administran a un sujeto con el fin de cultivar anticuerpos contra la molécula de PTP \lambda, anticuerpos que, a su vez, resultan útiles como herramientas diagnósticas, en tipado de tejidos, o en la purificación de nuevos polipéptidos de PTP \lambda mediante técnicas de inmunoafinidad conocidas per se. Alternativamente, en la purificación de los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención, se utilizan parejas de unión para el polipéptido foráneo fusionado, por ejemplo anticuerpos, receptores o ligandos, para adsorber la fusión de las mezclas impuras, después de lo cual la fusión se eluye y, si se desea, se recupera la nueva PTP \lambda de la fusión, por ejemplo mediante corte enzimático.

Debido a que con frecuencia resulta difícil predecir por adelantado las características de una variante de polipéptido de PTP \lambda, se apreciará que resultará necesario algún cribado para seleccionar la variante óptima.

Tras identificar la mutación o mutaciones deseadas, el gen codificante de una variante de PTP \lambda puede obtenerse, por ejemplo, mediante síntesis química, tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Más preferentemente, se prepara el ADN codificante de una secuencia de aminoácidos variante de PTP \lambda mediante mutagénesis sitio-dirigida del ADN que codifica una variante preparada anteriormente o una versión no variante de la PTP \lambda. La mutagénesis sitio-dirigida (específica de sitio) permite la producción de variantes de PTP \lambda mediante la utilización de secuencias específicas de oligonucleótidos que codifican la secuencia la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos contiguos, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que se atraviesa. Típicamente, resulta preferente un cebador de una longitud comprendida entre aproximadamente 20 y 25 nucleótidos, con alteración de aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se altera. En general, las técnicas de mutagénesis sitio-específica son bien conocidas en la técnica, como ejemplifican publicaciones tales como, Edelman et al., DNA 2:183, 1983. Tal como se apreciará, la técnica de mutagénesis sitio-específica típicamente utiliza un vector fago que existe en forma tanto de cadena única como de doble cadena. Entre los vectores típicos que resultan útiles en la mutagénesis sitio-dirigida se incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, tal como dan a conocer Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton editor, Elsevier, Amsterdam (1981). Éste y otros vectores fago se encuentran disponibles comercialmente y su utilización es bien conocida por los expertos en la materia. Un procedimiento versátil y eficiente para la construcción de mutaciones sitio-específicas dirigidas a oligodesoxirribonucleótidos en fragmentos de ADN utilizando vectores derivados de M13 ha sido publicado por Zoller, M.J. y Smith, M., Nucleic Acids Res. 10:6487-6500, 1982. Además, los vectores plásmido que contienen un origen de replicación de fago de cadena única (Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3, 1987) pueden utilizarse para obtener ADN de una cadena. Alternativamente, se introducen sustituciones de nucleótidos mediante la síntesis del fragmento de ADN apropiado in vitro, y su amplificación mediante procedimientos de PCR conocidos en la técnica.

La técnica de PCR también puede utilizarse para crear variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de PTP \lambda. En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR, se lineariza ADN molde de plásmido (1 \mug) mediante la digestión con una endonucleasa de restricción que presenta un único sitio de reconocimiento en el ADN de plásmido fuera de la región que debe amplificarse. De este material, se añaden 100 ng a una mezcla de PCR que contiene tampón para PCR, que contiene los cuatro desoxinucleótido trifosfatos y se incluyen en los kits GeneAmp^{R} (obtenidos de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) y 25 pmoles de cada cebador oligonucleótido, hasta un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se cubre con una capa de 35 \mul de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC, se deja brevemente sobre hielo, y después se añade por debajo de la capa de aceite mineral 1 \mul de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Tag) (5 unidades/\mul), adquiridos de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA). A continuación, la mezcla de reacción se inserta en un ciclador térmico de ADN (adquirido de Perkin-Elmer Cetus) programado de la manera siguiente:

2 minutos a 55ºC,

30 segundos a 72ºC, después 19 ciclos de lo siguiente:

30: segundos a 94ºC,

30: segundos a 55ºC, y

30: segundos a 72ºC.

Al final del programa, se retira el vial de reacción del ciclador térmico y se transfiere la fase acuosa a un nuevo vial, se extrae con fenol/cloroformo (50:50 en volumen) y se precipita con etanol, y el ADN se recupera mediante procedimientos estándar. Este material posteriormente se somete a tratamientos apropiados para la inserción en un vector.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis por inserción de un casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene 34:315, 1985.

Además, el procedimiento denominado de expresión en fagémido puede resultar útil para preparar variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos de PTP \lambda nativa o variante o de sus fragmentos. Este procedimiento implica (a) construir un vector de expresión replicable que comprende un primer gen que codifica un receptor a mutar, un segundo gen que codifica por lo menos una parte de una proteína de cubierta fágica natural o de tipo salvaje en la que el primer y el segundo gen son heterólogos, y un elemento de regulación transcripcional ligado operablemente al primer y segundo genes, formando de esta manera una fusión génica que codifica una proteína de fusión; (b) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gen, formando de esta manera una familia de plásmidos relacionados; (c) transformar células huésped adecuadas con el plásmido; (d) infectar las células huésped transformadas con un fago ayudante que presenta un gen que codifica la proteína de cubierta fágica; (e) cultivar las células huésped infectadas transformadas bajo condiciones adecuadas para formar partículas fagémidas recombinantes que contienen por lo menos una parte del plásmido y capaces de transformar el huésped, ajustando las condiciones de manera que sólo una cantidad menor de las partículas fagémidas exprese más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula; (f) poner en contacto las partículas fagémidas con un antígeno adecuado de manera que por lo menos una parte de las partículas fagémidas se una al antígeno; y (g) separar las partículas fagémidas que se unen de aquéllas que no se unen. Las etapas (d) a (g) pueden repetirse una o más veces. Preferentemente, en este procedimiento el plásmido se encuentra bajo control estricto del elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan de manera que la cantidad o el número de partículas fagémidas que expresan más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula sea inferior a aproximadamente el 1%. Además, preferentemente la cantidad de partículas fagémidas que expresan más de una copia de la proteína de fusión es inferior al 10% de la cantidad de partículas fagémidas que expresan una sola copia de la proteína de fusión. Más preferentemente, la cantidad es inferior al 20%. Típicamente en este procedimiento, el vector de expresión contiene además una secuencia de señal secretoria fusionada al ADN que codifica cada subunidad del polipéptido, y el elemento regulador de la transcripción es un sistema promotor. Los sistemas promotores preferentes se seleccionan de entre los promotores lacZ, \lambda PL, tac, T7 polimerasa, triptófano y fosfatasa alcalina y las combinaciones de los mismos. Además, normalmente el procedimiento utiliza un fago ayudante seleccionado de entre M13K07, M13R408, M13-VCS y Phi X 174. El fago ayudante preferente es M13K07, y la proteína de cubierta preferente es la proteína de cubierta del gen III del fago M13. El huésped preferente es E. coli, y la cepas deficientes en proteasa de E. coli.

Pueden obtenerse detalles adicionales de las técnicas de mutagénesis anteriores y otras similares en libros generales, tales como, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., editores, supra.

F. Variantes de glucosilación

Las variantes de glucosilación se encuentran incluidas dentro del alcance de la presente invención. Incluyen variantes que carecen por completo de glucosilación (no glucosiladas), variantes que presenta por lo menos un sitio glucosilado más que la forma nativa (desglucosiladas), así como las variantes en las que se ha modificado la glucosilación. Se encuentran incluidas las variantes desglucosiladas y no glucosiladas de secuencias de aminoácidos, PTP \lambda nativa desglucosilada y no glucosilada, y otras variantes de glucosilación. Por ejemplo, puede utilizarse la mutagénesis por sustitución o por deleción para eliminar los sitios de glucosilación N-gliados u O-ligados en la molécula nativa o variante de PTP \lambda de la presente invención, por ejemplo el residuo asparagina puede delecionarse o sustituirse por otro residuo básico, tal como lisina o histidina. Alternativamente, los residuos flanqueantes que forman el sitio de glucosilación pueden sustituirse o delecionarse, aunque los residuos de asparagina no resultan modificados, con el fin de evitar la glucosilación mediante la eliminación del sitio de reconocimiento de glucosilación.

Además, los polipéptidos de PTP \lambda no glucosilados que presentan los sitios de glucosilación de una molécula nativa pueden producirse en cultivo de células procarióticas recombinantes debido a que los procariotas no pueden introducir glucosilación en los polipéptidos.

Las variantes de glucosilación pueden producirse mediante la selección de células huésped apropiadas o mediante procedimientos in vitro. Las células de levadura y de insecto, por ejemplo, introducen glucosilación que varía significativamente respecto a la de los sistemas de los mamíferos. De manera similar, las células de mamífero que presentan un origen diferente de especie (por ejemplo hámster, murinas, porcinas, bovinas u ovinas) o de tejido (por ejemplo, pulmón, hígado, linfoides, mesenquimales o epidérmicos) que la fuente de los polipéptidos de PTP \lambda, se criban rutinariamente para su capacidad para introducir glucosilación variante, según se caracteriza, por ejemplo, mediante niveles elevados de manosa o relaciones variantes de manosa, fucosa, ácido siálico y otros azúcares que se encuentran típicamente en las glucoproteínas de mamífero. El procesamiento in vitro de la PTP \lambda típicamente se consigue mediante hidrólisis enzimática, por ejemplo digestión con neuraminidasa.

G. Modificación covalente de polipéptidos de PTP \lambda

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de PTP \lambda se encuentran incluidas dentro del alcance de la presente invención. Estas modificaciones se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar residuos aminoácidos específicos de los polipéptidos de PTP \lambda con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con caras seleccionadas o con residuos terminales, o mediante el control de los mecanismos de modificación post-traduccional en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes resultan útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos del polipéptido de PTP \lambda, o para la preparación de anticuerpos anti-PTP \lambda en la purificación por inmunoafinidad del recombinante. Por ejemplo, la inactivación completa de la actividad biológica de la proteína tras la reacción con ninhidrina sugeriría que por lo menos un residuo arginilo o lisilo resulta crítico para su actividad, después de lo cual los residuos individuales que se modificaron bajo las condiciones seleccionadas se identifican mediante aislamiento de un fragmento de péptido que contiene el residuo aminoácido modificado. Estas modificaciones se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos de un experto ordinario en la materia y se llevan a cabo sin experimentación innecesaria.

Los residuos cisteinilo con la mayor frecuencia se hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, proporcionando derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidilo se derivatizan mediante reacción con dietilpirocarbonato a un pH comprendido entre 5,5 y 7,0 debido a que este agente es relativamente específico de la cadena lateral histidilo. También resulta útil el para-bromofenacilo; la reacción preferentemente se lleva a cabo en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y amino-terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes presenta el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilo. Entre los otros reactivos adecuados para derivatizar los residuos que contienen \alpha-amino se incluyen los imidoésteres, tales como el picolinimidato de metilo; el fosfato de piridoxal; el piridoxal; el cloroborohidruro; el ácido trinitrobencenosulfónico; la O-metilisourea; la 2,4-pentanodiona; y la reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.

Los residuos arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos el fenilglioxal, la 2,3-butanodiona, la 1,2-ciclohexanodiona y la ninhidrina. La derivatización de los residuos arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como el grupo amino epsilon de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosilo puede llevarse a cabo, con particular interés en la introducción de marcajes espectrales en los residuos tirosilo mediante reacción con compuestos diazonio aromáticos o tetranitrometano. Con la mayor frecuencia, se utiliza N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosilo se yodan utilizando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su utilización en radioinmunoensayo.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo con frecuencia se desamidan en los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamida bajo condiciones ligeramente ácidas. Ambas formas de estos residuos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Entre las otras modificaciones se incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los grupos serilo, treonilo o tirosilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86, 1983), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Las moléculas además pueden unirse covalentemente a polímeros no proteináceos, por ejemplo a polietilenglicol, polipropilenglicol o a polioxialquilenos, de la manera descrita en U.S.S.N. nº 07/257.296, o en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337.

La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil para la preparación de agregados intramoleculares de polipéptidos de PTP \lambda con polipéptidos, así como para la unión cruzada del polipéptido de PTP \lambda con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para la utilización en ensayos o la purificación por afinidad. Además, un estudio de los enlaces cruzados entre cadenas proporciona información directa sobre la estructura conformacional. Entre los agentes de unión cruzada utilizados comúnmente se incluyen 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniltetano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, imidoésteres homobifuncionales, y maleimidas bifuncionales. Los agentes derivatizantes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato proporcionan intermediarios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, matrices reactivas insolubles en agua, tales como los carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sistemas de sustratos reactivos descritos en las patentes US nº 3.959.642, nº 3.969.287, nº 3.691.016, nº 4.195.128, nº 4.247.642, nº 4.229.537, nº 4.055.635, y nº 4.330.440 se utilizan para la inmovilización y entrecruzamiento de proteínas.

Determinadas modificaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de las células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparaginilo con frecuencia se desamida post-traduccionalmente en los residuos glutaminilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones ligeramente ácidas. Ambas formas de estos residuos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Entre las otras modificaciones post-traduccionales se incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo, treonilo o tirosilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de la lisina, de la arginina y de la histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Proteins, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86, 1983).

Son derivados adicionales de los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención las denominadas "inmunoadhesinas", que son moléculas quiméricas similares a anticuerpos que combinan el dominio o dominios funcionales de una proteína de unión (habitualmente un receptor, una molécula de adhesión celular o un ligando) con la secuencia de inmunoglobulina. El ejemplo más común de este tipo de proteína de fusión combina las regiones bisagra y Fc de una inmunoglobulina (Ig) con dominios de un receptor de superficie celular que reconoce un ligando específico. Este tipo de molécula se denomina "inmunoadhesina" debido a que combina funciones "inmune" y "de adhesión"; otros nombres utilizados con frecuencia son "quimera Ig", "Ig-" o "Fc-proteína de fusión" o "receptor globulina".

Hasta el momento, se ha informado en la técnica de más de cincuenta inmunoadhesinas. Entre las inmunoadhesinas informadas en la literatura se incluyen, por ejemplo, fusiones del receptor de célula T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940, 1987; CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531, 1989; Traunecker et al., Nature 339:68-70, 1989; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353, 1990; Byrn et al., Nature 344:667-670, 1990); L-selectina (receptor de localización) (Watson et al., J. Cell Biol. 110:2221-2229, 1990; Watson et al., Nature 349:164-167, 1991); selectina E (Mulligan et al., J. Immunol. 151:6410-17, 1993; Jacob et al., Biochemistry 34:1210-1217, 1995); selectina P (Mulligan et al., supra; Hollenbaugh et al., Biochemistry 34:5678-84, 1995); ICAM-1 (Stauton et al., J. Exp. Med. 176:1471-1476, 1992; Martin et al., J. Virol 67:3561-68, 1993; Roep et al., Lancet 343:1590-93, 1994); ICAM-2 (Damle et al., J. Immunol. 148:665-71, 1992); ICAM-3 (Holness et al., J. Biol. Chem. 270:877-84, 1995); LFA-3 (Kanner et al., J. Immunol. 148, 2:23-29, 1992); glucoproteína L1 (Doherty et al., Neuron 14:57-66, 1995); TNF-R1 (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-539, 1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:2883-86, 1991; Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489, 1991); TNF-R2 (Zack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2335-39, 1993; Wooley et al., J. Immunol. 151:6602-07, 1993); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313, 1990); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730, 1991); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569, 1991); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144, 1991); receptores NP (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067, 1991); receptor a de IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115, abstr. 1448, 1991); receptor HGF (Mark, M.R. et al., J. Biol. Chem., presentado para publicación, 1992); cadena a y \beta de IFN-yR (Marsters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5401-05, 1995); trk-A, B y C (Shelton et al., J. Neurosci. 15:477-91, 1995); IL-2 (Landolfi, J. Immunol. 146:915-19, 1991); IL-10 (Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600, 1995).

El diseño de inmunoadhesina más simple y fácil combina la región o regiones de unión de la proteína "adhesina" con las regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Habitualmente, al preparar las quimeras de PTP \lambda-inmunoglobulina de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de PTP \lambda deseado se fusiona C-terminalmente con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, aunque las fusiones N-terminales también resultan posibles. Típicamente en estas fusiones, el polipéptido quimérico codificado conserva dominios bisagra CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina por lo menos funcionalmente activos. También se realizan fusiones con el extremo C-terminal de la parte Fc de un dominio constante, o en posición inmediatamente N-terminal al CH1 de la cadena pesada o en la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no resulta crítico; son conocidos sitios particulares y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de las quimeras PTP \lambda-inmunoglobulina.

En una realización preferente, la secuencia de un polipéptido de PTP \lambda nativa maduro, o de una forma soluble (con dominio transmembranal inactivado), se fusiona con el extremo N-terminal de la parte C-terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo IgG-1. Resulta posible fusionar la región constante completa de una cadena pesada con la secuencia de PTP \lambda. Sin embargo, más preferentemente, en la fusión se utiliza una secuencia que se inicia en la región bisagra inmediatamente corriente arriba del sitio de corte de la papaína (que define el Fc de IgG químicamente; residuo nº 216, considerando que el primer residuo de la región constante de cadena pesada es el nº 114 (Kobel et al, supra) o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización particularmente preferente, la secuencia de PTP \lambda (de longitud completa o soluble) se fusiona con la región bisagra, y CH2 y CH3 o CH1, bisagra, dominios CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG-1, IgG-2 o IgG-3. El sitio exacto en el que se lleva a cabo la fusión no resulta crítico, y el sitio óptimo puede determinarse mediante experimentación rutinaria.

En algunas realizaciones, las quimeras de PTP \lambda-inmunoglobulina se ensamblan como multímeros, y particularmente como homodímeros o tetrámeros (patente WO nº 91/08298). Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas presentan estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en la que existen IgG, IgD e IgE. Se repite una unidad de cuatro en las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado; IgM generalmente existe en forma de pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas que se mantienen agrupadas mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en forma multimérica en el suero. En el caso de un multímero, cada unidad de cuatro puede ser igual o diferente.

A continuación se muestran esquemáticamente diversas quimeras ensambladas de PTP \lambda-inmunoglobulina ejemplares que se encuentran dentro del alcance de la presente invención:

(a) AC_{L}-AC_{L};

(b) AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(c) AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];

(d) AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(e) V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y

(f) [A-Y]_{n}-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},

en las que:

cada A representa secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes de nuevo polipéptido de PTP \lambda ,

V_{L} es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina;

V_{H} es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina;

C_{L} es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;

C_{H} es un dominio constante de cadena pesada de una inmunoglobulina;

n es un número entero superior a 1;

Y designa el residuo de un agente de entrecruzamiento covalente.

En aras de la brevedad, las estructuras anteriormente indicadas únicamente muestran las características clave; no indican los dominios de unión (J) ni otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los enlaces disulfuro. Sin embargo, en los casos en que se requieran estos dominios para la actividad de unión, se interpretará que se encuentran presentes en las localizaciones habituales en las que se encuentran en las moléculas de inmunoglobulina.

Alternativamente, las secuencias de aminoácidos de PTP \lambda pueden insertarse entre las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina, de manera que se obtenga una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada quimérica. En la presente realización, las secuencias de polipéptido de PTP \lambda se fusionan con el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de la inmunoglobulina, sea entre el dominio bisagra y el dominio CH2, o entre los dominios CH2 y CH3. Se ha informado de constructos similares en Hoogenboom, H.R. et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037, 1991.

Aunque no resulta necesaria la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente invención, puede encontrarse presente en asociación covalente con un polipéptido de fusión PTP \lambda-cadena pesada de inmunoglobulina, o fusionada directamente con el polipéptido de PTP \lambda. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina típicamente se coexpresa con el ADN codificante de la proteína de fusión PTP \lambda-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera se encontrarán asociadas covalentemente proporcionando una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos por enlaces disulfuro. Se dan a conocer los procedimientos adecuados para la preparación de estas estructuras, por ejemplo, en la patente US nº 4.816.567, publicada el 28 de marzo de 1989.

En una realización preferente, las secuencias de inmunoglobulina utilizadas en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención procedente de un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina IgG. Una ventaja importante de la utilización de IgG-1 es que las inmunoadhesinas IgG-1 pueden purificarse eficientemente sobre proteína A inmovilizada. En contraste, la purificación de IgG-3 requiere proteína G, un medio significativamente menos versátil. Sin embargo, deben considerarse otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas cuando se selecciona la pareja de fusión de IgG para una construcción particular de inmunoadhesina. Por ejemplo, la bisagra IgG-3 es más larga y más flexible, de manera que puede alojar dominios "adhesina" más grandes que podrían no plegarse o funcionar apropiadamente al fusionarse con IgG-1. Aunque las inmunoadhesinas IgG típicamente son monovalentes o bivalentes, otros subtipos de IgG, tales como IgA e IgM, pueden dar lugar a estructuras diméricas o pentaméricas, respectivamente, de la unidad homodimérica básica de Ig. Las inmunoadhesinas multiméricas resultan ventajosas en que pueden unirse con sus dianas respectivas con mayor avidez que sus contrapartidas basadas en IgG. Son ejemplos que se han informado de estas estructuras: CD4-IgM (Traunecker et al., supra); ICAM-IgM (Martin et al., J. Virol. 67:3561-68, 1993); y CD2-IgM (Arulandam et al., J. Exp. Med. 177:1439-50, 1993).

Para las inmunoadhesinas PTP \lambda-Ig, diseñadas para la aplicación in vivo, las propiedades farmacocinéticas y las funciones efectoras especificadas por la región Fc también resultan importantes. Aunque IgG-1, IgG-2 e IgG-4 presentan todas vidas medias in vivo de 21 días, sus potencias relativas en la activación del sistema del complemento son diferentes. IgG-4 no activa el complemento, e IgG-2 es significativamente más débil en la activación del complemento que IgG-1. Además, al contrario que IgG-1, IgG-2 no se une a receptores de Fc en células mononucleares o en neutrófilos. Aunque IgG-3 resulta óptima para la activación del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente un tercio de la de otros isotipos de IgG. Otra consideración importante en el diseño de inmunoadhesinas para su utilización en terapias en el ser humano es el número de variantes alotípicas del isotipo particular. En general, resultan preferentes los isotipos de IgG con menos alotipos definidos serológicamente. Por ejemplo, IgG-1 presenta sólo cuatro sitios alotípicos definidos serológicamente, dos de los cuales (G1m y 2) se encuentran situados en la región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. Por el contrario, existen 12 alotipos definidos serológicamente en IgG-3, la totalidad de los cuales se encuentran en la región Fc; sólo tres de estos sitios (G3m5, 11 y 21) presentan un alotipo que no es inmunogénico. De esta manera, la potencial inmunogenicidad de una inmunoadhesina y3 es superior a la de una inmunoadhesina \gamma1.

Las inmunoadhesinas PTP \lambda-Ig se construyen más convenientemente mediante la fusión de la secuencia de ADNc codificante de la parte de PTP \lambda en el mismo marco de lectura que una secuencia de ADNc de IgG. Sin embargo, también puede llevarse a cabo la fusión a los fragmentos de Ig genómicos (ver, por ejemplo, Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940, 1987; Aruffo et al., Cell 61:1303-1313, 1990; Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144, 1991). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Los ADNcs codificantes de regiones constantes de cadena pesada de IgG pueden aislarse basándose en la secuencia publicada procedente de bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos del bazo o de sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Otros derivados comprenden los nuevos péptidos de la presente invención unidos covalentemente a un polímero no proteico. El polímero no proteico habitualmente es un polímero hidrofílico de síntesis, es decir, un polímero que de otra manera no se encontraría en la naturaleza. Sin embargo, resultan útiles polímeros que existen en la naturaleza y que se producen mediante procedimientos recombinantes o in vitro, e igualmente resultan útiles los polímeros que se aíslan a partir de fuentes naturales. Los polímeros polivinilo hidrofílicos se encuentran dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo el alcohol polivinílico y la polivinilpirrolidona. Resultan particularmente útiles los polivinilaquilén éteres, tales como el polietilenglicol y el polipropilenglicol.

Los polipéptidos de PTP \lambda pueden unirse a diversos polímeros no proteicos, tales como el polietilenglicol, el polipropilenglicol o los polioxialquilenos, de la manera indicada en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337.

Los polipéptidos de PTP \lambda pueden atraparse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo, técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., editor, 1980.

H. Preparaciones de anticuerpos anti-PTP \lambda (i) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales contra una molécula de PTP \lambda generalmente se cultivan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de la PTP \lambda y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar la PTP \lambda o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácidos diana con una proteína que resulte inmunogénica en la especie que debe inmunizarse, por ejemplo la hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosuccinmida éster (conjugación a través de los residuos cisteína). La N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R^{1}N = C = NR, en la que R y R^{1} son diferentes grupos alquilo.

Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunogénicos mediante la combinación de 1 mg o de 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiple sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. 7 a 14 días después se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para título de anticuerpos anti-PTP \lambda. Los animales se refuerzan hasta alcanzar títulos estables. Preferentemente, los animales se refuerzan con el conjugado de la misma PTP \lambda, pero conjugada con una proteína diferente y/o utilizando un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo celular recombinante en forma de fusiones de proteína. Además, se utilizan agentes de agregación, tales como alúmina, para intensificar la respuesta inmunológica.

(ii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posiblemente mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica la característica del anticuerpo de que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-PTP \lambda de la presente invención pueden prepararse utilizando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (Cabilly et al., patente US nº 4.816.567).

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente para este ADN. Tras su aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, tales como las células COS de simio, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, con el fin de conseguir la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984), o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que presentan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-PTP \lambda de la presente invención.

Típicamente dichos polipéptidos no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio de unión a antígeno con especificidad para un polipéptido de PTP \lambda y otro sitio de unión a antígeno con especificidad para un antígeno diferente.

También pueden prepararse anticuerpos quiméricos o híbridos in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química de la síntesis de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito se incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.

Para las aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos de la invención típicamente se marcan con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser cualquiera capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un isótopo radioactivo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; biotina; marcajes isotópicos radioactivos, tales como, por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C o ^{3}H, o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.

Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido para conjugar separadamente el anticuerpo con el grupo detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature 144:945, 1962; David et al., Biochemistry 13:1014, 1974; Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981; y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407, 1982.

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147-158, CRC Press Inc., 1987).

(iii) Anticuerpos humanizados

Los procedimientos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos de la técnica. Generalmente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más aminoácidos de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "de importación", que típicamente se obtienen de un dominio variable "de importación". La humanización esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 322:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988) mediante la sustitución de las CDRs de roedor o la secuencias CDR de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con ello, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly, supra), en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se han sustituido por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

Resulta importante que los anticuerpos se humanicen conservando la afinidad elevada para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferente, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran disponibles comúnmente y resultarán familiares para los expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas de ordenador que ilustran y muestran las estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis e residuos que influyen sobre la capacidad de la inmuoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos del FR pueden seleccionarse y combinarse con la secuencia de consenso y de importación de manera que la característica deseada del anticuerpo, tal como la afinidad incrementada para el antígeno o antígenos diana, se consiga. En general, los residuos de la CDR se encuentran implicados directa y sustancialmente en la influencia sobre la unión del antígeno. Para detalles adicionales ver la solicitud US nº de serie 07/934.373, presentada el 21 de agosto de 1992, que es una continuación en parte de la solicitud nº de serie 07/715.272, presentada el 14 de junio de 1991.

Alternativamente, ahora resulta posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunizarlos, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de región de unión de la cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal resulta en la inhibición total de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de matrices génicas de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en estos ratones mutantes de la línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos tras el reto con antígenos (ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255, 1993; Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993).

(iv) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que presentan especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para un polipéptido de PTP \lambda, la otra es para cualquier otro antígeno. Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos con conocidos de la técnica.

Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas pesadas presentan diferentes especificidades (Millstein y Cuello, Nature 305:537-539, 1983). Debido a la organización aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía por afinidad, resulta más bien laboriosa, y los rendimientos de producto son reducidos. Se dan a conocer procedimientos similares en la publicación de solicitud de patente PCT nº WO 93/08829 (publicada el 13 de mayo de 1993) y en Traunecker et al., EMBO 10:3655-3659, 1991.

De acuerdo con un enfoque diferente y más preferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo por lo menos parte de la bisagra, y la segunda y tercera regiones constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina (CH2 y CH3). Resulta preferente la presencia de la región constante de la primera cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican la fusión de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Ello proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, resulta posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipéptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados, o cuando las proporciones no resultan de significación particular. En una realización preferente de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja cadena pesada-cadena ligera de inmunogloblina (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, debido a que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una vía fácil de separación. Este enfoque se da a conocer en la solicitud de patente PCT nº WO 94/04690, publicada el 3 de marzo de 1994.

Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.

(v) Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (publicación de solicitud PCT nº WO 91/00360 y nº WO 92/200373; patente EP nº 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento conveniente de entrecruzamiento. Son bien conocidos de la técnica, agentes adecuados de entrecruzamiento, y se dan a conocer en la patente US nº 4.676.980, junto con varias técnicas de entrecruzamiento.

1. Análogos péptidos y no péptidos de los polipéptidos de PTP \lambda

Los análogos péptidos de los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención se modelan basándose en la estructura tridimensional de los polipéptidos nativos. Los péptidos pueden sintetizarse mediante técnicas bien conocidas, tales como las técnicas de síntesis en fase sólida descritas inicialmente en Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154, 1963. Otras técnicas de síntesis de péptidos se describen en, por ejemplo, Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2a edición, 1976, así como en otras obras de referencia disponibles fácilmente para los expertos en la materia. Puede encontrarse un resumen de las técnicas de síntesis de péptidos en Stuart y Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984. También pueden prepararse péptidos mediante tecnología de ADN recombinante, utilizando una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado.

Además de los análogos de péptidos, la presente invención también contempla compuestos (por ejemplo orgánicos) no péptidos que muestran sustancialmente la misma superficie que los análogos péptidos de la presente invención y que, por lo tanto, interaccionan con otras moléculas de una manera similar.

J. Utilización de los polipéptidos de PTP \lambda

Los análogos péptidos de los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención resultan útiles para una diversidad de fines. Por ejemplo, los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención resultan útiles en la identificación y purificación del ligando de PTP \lambda, para el que una posible localización es el cerebro. La purificación puede llevarse a cabo mediante la utilización del receptor o receptores nativos o inmunoadhesinas, comprendiendo una fusión del dominio extracelular del receptor o receptores con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Los ligandos se espera que resulten útiles en el tratamiento de enfermedades del tipo parálisis.

Un nivel incrementado de expresión de los receptores de PTP \lambda de la presente invención puede resultar útil en la reducción de la metástasis de diversos tumores de pulmón y de otros órganos. La expresión del receptor puede regularse positivamente con anticuerpos anti-PTP \lambda, que son capaces de entrecruzarse y de esta manera de activar los receptores. Los agentes de entrecruzamiento no anticuerpos también pueden utilizarse para este fin.

Los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención también resultan útiles como marcadores moleculares de los tejidos en los que se expresan específicamente. Como tales, el polipéptido de PTP \lambda resulta útil para el tipado de tejidos de tejidos específicos de mamífero.

Los polipéptidos de PTP \lambda nativa y sus equivalentes funcionales también resultan útiles en ensayos de cribado diseñados para identificar agonistas o antagonistas de polipéptidos de PTP \lambda nativa. Estos ensayos pueden adoptar la forma de cualquier ensayo de unión de tipo celular o bioquímica convencional, y pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos de ensayo bien conocidos por los expertos en la materia. Un ejemplo es el denominado formado de ensayo "de dos híbridos" utilizando el sistema Matchmaker Two-Hybrid System (Clontech) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Los polipéptidos de PTP \lambda nativa de la presente invención también resultan útiles como marcadores de peso molecular de proteína para los geles de proteínas.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de PTP \lambda de la presente invención también resultan útiles para proporcionar sondas de hibridación para la búsqueda en bibliotecas de ADNc y genómicas de la secuencia codificante de otros análogos de los polipéptidos de PTP \lambda en otras especies.

Resultan útiles los antagonistas del polipéptido de PTP \lambda de la presente invención para inhibir la actividad biológica del enzima, inhibiendo de esta manera los efectos biológicos de la desfosforilación de las tirosinas. Los agonistas del polipéptido de PTP \lambda resultan útiles para incrementar o para simular los efectos biológicos del polipéptido nativo de PTP \lambda.

K. Materiales y métodos 1. Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa

Se aisló ARN mensajero de la fracción no adherente Lin^{lo}CD34^{hi} de células fetales de seno endodérmico (Micro-FastTrack InVitrogene), se transcribió inversamente el ARN poliA+ con hexámeros aleatorios (Promega) y transcriptasa inversa del virus de Moloney de la leucemia murina (SuperScript II, GIBCO BRL). Un cuarto de este ADNc se amplificó por PCR utilizando cebadores oligonucleótidos mixtos degenerados. Se utilizaron los cebadores sentido y antisentido correspondientes a las secuencias de aminoácidos (H/D) FWRM(I/V)W (SEC ID nº 5) (5'-A(C/T)TT(C/T)TGG(A/C)GIATG(A/G)TITGG-3') (SEC ID nº 6) y WPD(F/H)GVP (SEC ID nº 7) (5'-GGIAC(G/A)(T/A)(G/A)(G/A)TCIGGCCA-3') (SEC ID nº 8), respectivamente. Se llevó a cabo PCR en tampón 1 X Taq de ADN polimerasa (GIBCO BRL) más 0,2 mM de cada dNTP, DMSO al 10% y 5 unidades de polimerasa Taq (GIBCO BRL) durante 25 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Los productos de PCR se trataron con enzima Klenow (New England Biolabs) a 30ºC durante 30 minutos, se clonaron en el sitio SmaI del plásmido pRK-5 (Genentech, Inc.) y posteriormente se secuenciaron (Sequenase, USB).

2. Aislamiento de clones de ADNc

Se preparó ADNc de doble cadena ligado a un adaptador a partir de ARN A+ procedente de embriones de ratón de 10 días (kit Marathon-ready de síntesis de ADNc, Clontech) utilizando cebadores hexámeros aleatorios u oligodT. Se aisló el ADNc de longitud completa mediante amplificación 5' o 3' de los extremos del ADNc (RACE) de los ADNc marathon-ready. Se cribó una biblioteca de ADNc lambda de pulmón de ratón adulto de acuerdo con el protocolo estándar, utilizando como sondas, fragmentos de ADNc aislados mediante RACE.

3. Expresión bacteriana de la proteína de fusión GST-PTP

Las secuencias de ADNc que codifican los aminoácidos 791 a 1.436, o los aminoácidos 43 a 741 que contienen la región citoplasmática o la región extracelular de PTP \lambda se obtuvieron mediante PCR. A continuación, se trataron los fragmentos PCR con los enzimas de restricción SaiI y NotI y se clonaron en el plásmido pGEX-4T-1 (Pharmacia). Las proteínas de fusión se purificaron por afinidad utilizando columnas de glutatión-sefarosa (Pharmacia). Se generó antisuero policlonal contra la región citoplasmática (Cy) o extracelular (Ex) mediante la inmunización de conejos con cada proteína de fusión con GST purificada.

4. Inmunofluorescencia indirecta de células PC-12

Se fijaron con formaldehído al 4% y Triton X-100 al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) células PC-12 tratadas con NGF o sin tratar cultivadas sobre cubreobjetos y se permeabilizaron con saponina al 0,05%. A continuación, las células fijadas se bloquearon con suero de cabra normal al 10% más NP40 al 0,05% en PBS, se incubaron con antisuero policlonal primario anti-Cy de conejo (dilución 1:3.000), se lavaron y se incubaron con anticuerpo de cabra etiquetado con ficoeritrina (PE) contra inmunoglobulina G de conejo. Se observaron las células y se tomaron imágenes digitales mediante microscopía confocal de fluorescencia.

5. Inmunoprecipitación y ensayo de tirosina fosfatasa de la PTP \lambda

Se lavaron en PBS frío, células PC-12 que expresaban PTP \lambda endógena, después se lisaron en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, benzamidina 1 mM, leupeptina 1 mg/ml, aprotinina 1 mg/ml, NaF 10 mM, ácido okadaico 0,5 mM, glicerol al 10% (v/v), Triton X-100 al 1% (v/v), desoxicolato sódico al 0,5% (p/v) y SDS al 0,01% (p/v) (EMBO J., 13(16):3763-3771, 1994). Los lisados celulares se preaclararon mediante incubación con 50 ml de proteína A lavada-bolas de sefarosa (Pharmacia). A continuación, el lisado preaclarado se incubó con proteína A-bolas de sefarosa preacopladas con antisuero policlonal de conejo (20 ml de suero/50 ml de bolas) a 40ºC durante 15 horas. El complejo inmunopreciptado de proteína A-sefarosa/PTP A seguidamente se procesó tal como se ha descrito anteriormente (Jiang et al., Mol. Cell Biol. 13(5):2942-2951, 1993). En resumen, el complejo se lavó cuatro veces con tampón HNTG (HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 0,1%) y una vez con tampón M7.6 (Tris-HCl 60 mM, pH 7,6, EDTA 5 mM, DTT 10 mM, NaCl 50 mM, albúmina de suero bovino 50 mg/ml). Se resuspendió el complejo inmunoprecipitado lavado en tampón M7.6 y se sometió a ensayo no radioactivo de proteína tirosina fosfatasa con sustratos oligopéptidos sintéticos (PPS1 corresponde al fragmento C-terminal 53-63 de la hirudina: Biotina-DGDFEEIPEEY-PO_{4} (SEC ID nº 9), PPS2 corresponde a los aminoácidos 1 a 17 de la gastrina humana: Biotina-EGPWLEEEEEAY-PO_{4} (SEC ID nº 10)). El ensayo de PTPasa se llevó a cabo siguiendo los procedimientos del fabricante (kit de ensayo de tirosina fosfatasa, Boehringer Mannheim).

6. Análisis northern

Se utilizó un fragmento de ADNc de 2,5 kb codificante de la región citoplasmática de PTP \lambda para el sondeo de los filtros de transferencia northern multi-tejido murino (Clontech) del ARN A+ de células PC-12.

7. Hibridación in situ

Se fijaron por inmersión durante la noche a 4ºC en paraformaldehído al 4%, embriones de rata E15.5 y cerebros P1, después se protegieron criogénicamente durante la noche en sacarosa al 15%. Se congelaron cerebros frescos de ratas adultas con hielo seco en polvo. Todos los tejidos se cortaron en secciones de 16 \mum y se procesaron para la hibridación in situ para PTP \lambda utilizando sondas de ARN con UTPs marcados con ^{33}P. Las sondas sentido y antisentido se sintetizaron a partir de un fragmento de ADN de 2,5 kb de PTP \lambda utilizando polimerasa SP6 o de T7, respectivamente. Se pondrán de manifiesto detalles experimentales adicionales a partir de los ejemplos no limitativos siguientes.

L. Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y caracterización del ADNc codificante de PTP \lambda

Con el fin de aislar los nuevos receptores proteína tirosina fosfatasa (PTPs) expresados en células hematopoyéticas primitivas murinas, los presentes inventores clonaron fragmentos PCR producidos mediante cebado con secuencias dirigidas contra motivos conservados de proteína en PTPs de varios genes y especies diferentes (Dixon, Ann. Ny Acad. Sci. 766:18-22, 1995). El análisis de 70 subclones diferentes derivados por PCR reveló una serie de PTPs descritas con anterioridad, así como dos nuevas PTPs. Una de estas nuevas PTPs, denominada PTP HSC, es un miembro de la familia PTP PEST de enzimas, y ya ha sido descrita (Cheng et al., Blood, en prensa). El segundo nuevo fragmento PCR era homólogo de las PTPs \kappa y \mu, dos PTPs relacionadas de tipo receptor que median en la adhesión homofílica (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7(5):650-657, 1995).

Con el fin de caracterizar adicionalmente el ADNc codificante de esta nueva PTP, se aplicó un enfoque de clonación combinada utilizando RACE, así como la clonación a partir de bibliotecas de ADNc fágico. Las secuencias de ADNc compuesto (SEC ID nº 1) y de la proteína derivada (SEC ID nº 2) determinadas a partir de estos diversos clones se muestran en las figuras 1A-1D. Se insertó dentro de una secuencia Kozak de consenso, el codón de iniciación ATG utilizado para la traducción de este marco de lectura abierto de grandes dimensiones, con varios codones de parada de traducción corriente arriba de este codón iniciador. Tal como puede observarse en las figuras 1A-1D, la proteína (SEC ID nº 2) derivada de este ADNc (SEC ID nº 1) es una molécula de grandes dimensiones similar a un receptor, de 1.436 aminoácidos y un peso molecular aproximado de 161.176 daltons.

Las figuras 2A-2B ilustran que la nueva proteína relacionada con PTP derivada hematopoyéticamente que se da a conocer en la presente memoria muestra un elevado grado de homología tanto con PTP \kappa (\sim60%) como PTP \mu (\sim53%) a lo largo de toda su longitud (Jiang et al., supra, 1993, y Gebbink et al., supra, 1991). Debido a que esta nueva PTP es homóloga a lo largo de toda su longitud con las PTPs \kappa y \mu, aparentemente el nuevo polipéptido de PTP contiene MAM, IgG, 4 dominios fibronectina de tipo III y dos dominios fosfatasa localizados citoplasmáticamente (ver las figuras 2A-2B) (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7(5):650-657, 1995; Jiang et al., supra, 1993, y Gebbink et al., supra, 1991). Estas homologías con el nuevo polipéptido de PTP son algo inferiores a la homología entre PTP \kappa y \mu (\sim62%), sugiriendo que el nuevo polipéptido de PTP que se da a conocer en la presente invención presenta una relación algo más distante con estas dos PTPs que éstas entre sí. Estos datos sugieren que esta nueva PTP es el tercer miembro de la familia PTP de interacción homotípica que contiene las PTPs \kappa y \mu, y por lo tanto los presentes inventores han denominado al nuevo receptor, PTP \lambda.

Tal como puede observarse en la figura 3, las homologías relativas de las secuencias de cada uno de los dominios de estos tres enzimas sugieren que en efecto se encuentran estrechamente relacionadas. Resulta interesante que los datos anteriores sugieren que los dominios tanto MAM como IgG median en la adhesión homotípica específica entre las PTPs \kappa y \mu (Brady-Kalnay et al., supra, 1994; y Zondag et al., supra, 1995), y resulta claro a partir de las comparaciones de secuencia entre estas tres proteínas relacionadas que estos dos dominios son sustancialmente homólogos. Sin embargo, el hecho de que exista un gran número de cambios de secuencia entre estos dos motivos también es consistente con la suposición de que pueden mediar en interacciones homotípicas específicas. De esta manera, resulta probable que, aunque estos motivos sin duda se encuentran relacionados estructuralmente, las diferencias en sus secuencias relativas se encuentran implicadas en el reconocimiento homotípico.

Las homologías de secuencia generales entre las tres proteínas también son relativamente elevadas en los dominios FnIII, aunque la homología en el primero de estos dominios es significativamente superior que en los otros. El trabajo realizado con anterioridad también ha demostrado que un sitio yuxtamembranal entre el dominio transmembranal y el primer dominio fosfatasa presenta una homología distante con una región similar presente en las cadherinas (Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 130(4):977-986, 1995), y este sitio muestra un elevado grado de homología entre estos tres receptores. También se observa un elevado grado de homología de secuencias entre el primer dominio PTPasa de estos tres receptores, con un nivel algo inferior de homología entre los segundos dominios de PTPasa de estas proteínas. Este último resultado podría ser significativo, debido a que se ha informado de que el primer dominio fosfatasa es el motivo enzimático más importante de las regiones de fosfatasa dual en las PTPs receptoras (Pot et al., J. Biol. Chem. 266(29):19688-19696, 1991). La homología entre estos dominios PTPasa incluye muchos de los residuos que anteriormente se ha descubierto que resultan importantes para el reconocimiento de sustrato y la desfosforilación de tirosinas en la PTP 1B (Jia et al., Science 268(5218):1754-1758, 1995), aunque no todos estos residuos se encuentran completamente conservados. En resumen, las homologías de secuencias entre estas tres proteínas sugieren un antepasado común, así como funciones potencialmente similares.

Ejemplo 2 Análisis de la actividad enzimática de PTP \lambda

Con el fin de analizar la actividad enzimática de los dominios PTPasa del nuevo polipéptido de PTP \lambda, los presentes inventores inmunoprecipitaron el enzima procedente de células PC 12 que después en la presente memoria se demuestra que expresan la proteína. En estos experimentos se produjo un anticuerpo policlonal dirigido contra el dominio citoplasmático completo según la predicción a partir de la secuencia de ADNc, mediante inyección en ratones de una fusión con GST que contenía esta región del receptor. El inmunoprecipitado se incubó con un péptido con tirosinas fosforiladas utilizando un kit comercial, y se determinó el grado de desfosforilación utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina. Tal como se muestra en la figura 4, el inmunoprecipitado obtenido utilizando el suero inmunológico presentaba una actividad fosfatasa clara, mientras que el inmunoprecipitado sérico preinmunológico no mostraba esta actividad. Además, la figura 4 demuestra que esta actividad enzimática resultaba completamente inhibida por la inclusión de vanadato, un potente inhibidor de la tirosina fosfatasa. De esta manera, el polipéptido de PTP \lambda codificado por el ADNc (SEC ID nº 1) indicado en la presente memoria y mostrado en las figuras 1A-1D es claramente una proteína tirosina fosfatasa receptora.

Ejemplo 3 Expresión en tejidos del transcrito de PTP \lambda

Tal como se muestra en la figura 5, el análisis de transferencia northern de tejidos fetales, así como adultos, demuestra que el ARNm de PTP \lambda se expresa en una diversidad de tejidos fuera de las células progenitoras hematopoyéticas a partir de las que se clonó originalmente. De esta manera, la expresión del ARNm de PTP \lambda se detecta durante todo el desarrollo embrionario desde el embrión muy temprano en el día 7. Resulta interesante que el análisis de órganos adultos revela que el transcrito de PTP \lambda se expresa específicamente en sólo un subgrupo de tejidos. De esta manera, aparentemente existe un nivel muy elevado de expresión del polipéptido de PTP \lambda en cerebro, pulmón y riñón adultos, un nivel mucho más reducido en corazón, músculo esquelético y testículo, y una falta de expresión evidente a esta exposición en bazo e hígado.

El elevado nivel de expresión de PTP \lambda en pulmón y cerebro, junto a la falta de expresión en el hígado contrasta con PTP \kappa, una PTP que se expresa a nivel elevado en el hígado pero que resulta prácticamente indetectable en pulmón y cerebro (Jiang et al., supra, 1993). De esta manera, a pesar del hecho de que la PTP \kappa se aisló originalmente a partir de células madre hematopoyéticas, no se detectó expresión evidente en dos sitios que contienen células hematopoyéticas, el bazo y el hígado. La falta de señal en el bazo, un órgano que contiene mayoritariamente células hematopoyéticas maduras, sugiere, por lo tanto, que este receptor podría expresarse específicamente en células progenitoras hematopoyéticas más tempranas. Resulta interesante que aparentemente también existe un transcrito de corte y empalme alternativo en el pulmón que no se detecta en los otros dos órganos que expresan este receptor a niveles elevados ni en los embriones, aunque la naturaleza de este transcrito de corte y empalme alternativos todavía no ha sido determinada. En resumen, estos datos demuestran que la PTP \lambda se expresa específicamente en un subgrupo de tejidos adultos, algunos de los cuales divergen respecto a PTP \kappa.

Ejemplo 4 Análisis de hibridación in situ

Los presentes inventores llevaron a cabo un análisis in situ de ARNm del embrión E15.5 de rata y de cerebro P1 y adulto de rata, para determinar los sitios potenciales de producción de PTP \lambda. Los resultados en la figura 6 muestran que se observa una expresión extensiva de PTP \lambda en estructuras esqueléticas, epiteliales y neuronales en desarrollo en todo el embrión E15.5. Se observó expresión sistémica en diversos elementos esqueléticos en desarrollo, tales como el pericondrio vertebral, los discos intervertebrales, dientes, mandíbula y maxilar (figura 6, paneles A y B). La expresión de PTP \lambda en las estruturas genitourinarias incluía el tubérculo genital (figura 6, paneles A y B), la uretra y el seno urogenital (no representado). Entre otras áreas positivas de expresión de PTP \lambda se incluyen el canal anal (no representado), el epitelio de la piel, olfativo y oral, el esófago (figura 6, paneles A y B), la pituitaria (figura 6, paneles A, B y C), el aura mater (figura 6, paneles A, B y D), el riñón (figura 6, paneles A y B), y el pulmón (figura 6, paneles A y B). Una magnificación más elevada revela una expresión restringida a los glomérulos en desarrollo en la región cortical del riñón (figura 6, paneles F y G) y al epitelio bronquiolar del pulmón (figura 6, paneles H e I). En el sistema nervioso embrionario E15.5, se observaron niveles elevados de expresión en el córtex cerebral en desarrollo (figura 6, paneles A y B), suelo del cerebro medio, primordio del plexo coroide, núcleo reticular gigantocelular del tallo cerebral (figura 6, paneles A, B y C), aura mater y médula espinal (figura 6, paneles A, B y D). Una magnificación elevada de la médula
espinal reveló el nivel más elevado de expresión de PTP \lambda en la columna motora ventrolateral (figura 6, panel D).

En el cerebro P1 y adulto, la expresión de PTP \lambda se encontraba localizada en regiones derivadas de esbozos embrionarios que también contenían niveles elevados de expresión. Por ejemplo, la expresión en el cerebro medio embrionario precedió a los niveles elevados de expresión de PTP \lambda en la sustancia negra P1 y adulta (figura 7, paneles C y E, respectivamente). La expresión en el cerebro frontal embrionario (figura 6, panel A) precedió a la expresión observada en las capas internas del córtex P1 y adulto (figura 7, paneles A, B y D, E, respectivamente). La expresión en los primordios del plexo coroide del embrión engendró niveles elevados de expresión en el cerebro P1 (figura 7, panel A), y niveles reducidos de expresión en el cerebro adulto (figura 7, panel D).

En general, la expresión de PTP \lambda en el cerebro adulto aparentemente se encuentra regulada negativamente en comparación con el cerebro P1 (figura 7). Sin embargo, entre las otras áreas de expresión prominente, tanto en el cerebro P1 como adulto, se incluyen el córtex piriforme y el núcleo endopiriforme (figura 7, paneles A y D, respectivamente), los núcleos amigdaloides, el subículo y CAT, CA2 y, en menor grado, CA3 de la formación hipocampal (figura 7, paneles B y E, respectivamente). El cerebro P1 también muestra una expresión intensa en todo el área septal, ganglios basales, tálamo y cerebro medio (figura 7, paneles A, B y C). Se observó una expresión débil en el colículo superior adulto, así como la expresión dispersa por todo el tálamo (figura 7, panel E).

Ejemplo 5 Expresión de PTP \lambda en células PC 12

La expresión de PTP \lambda en diversas regiones en todo el cerebro embrionario, neonatal y adulto sugiere que este receptor podría expresarse en las células PC 12, una línea celular que se deriva de un feocromocitoma neural. En efecto, los experimentos de inmunoprecipitación descritos en el Ejemplo 2 anteriormente demostraron actividad enzimática en precipitados anti-PTP \lambda derivados de estas células. Además, estas células se diferenciarán y extenderán neuritas en respuesta a factor de crecimiento nervioso, de manera que proporcionan un sistema para someter a ensayo un posible papel para la PTP \lambda en esta etapa transitoria del desarrollo. Tal como se muestra en la figura 8, el nuevo polipéptido de receptor PTP \lambda en efecto se expresa en estas células progenitoras neuronales. La figura 8 también ilustra que el tratamiento de estas células con NGF resulta en una regulación positiva modesta (de factor 5) del transcrito codificante de este receptor con una cinética relativamente lenta. Estos datos, de esta manera, resultan consistentes con un papel para este receptor en algún aspecto de la diferenciación neuronal en esta línea celular.

Con el fin de investigar la distribución de PTP \lambda en las células PC12, se llevó a cabo inmunofluorescencia utilizando células que se dejaron sin tratar o que se trataron con NGF para inducir el crecimiento de neuritas teñidas con un anticuerpo dirigido contra el dominio citoplasmático del receptor PTP \lambda. Tal como se muestra en la figura 9, la PTP \lambda se expresa a niveles significativos en células tanto tratadas como no tratadas, confirmando el análisis enzimático mostrado en la figura 4 y el análisis de transferencia northern mostrado en la figura 8. Sin embargo, resulta más interesante la distribución celular del polipéptido de PTP \lambda. Tal como muestra la figura 9, PTP \lambda se observa que está distribuido en las neuritas, así como en las estructuras de crecimiento similares a conos de las puntas de las neuritas. Estos datos son consistentes con un papel para este receptor en la función de las neuritas, tal vez análogo al recientemente descrito para dos receptores PTPs de Drosophila diferentes (Desai et al., supra, y Kreuger et al., supra).

M. Comentario

Los niveles relativos de fosforilación de las tirosinas de una diversidad de proteínas resultan críticos para la regulación de varias actividades durante la diferenciación embrionaria y durante la vida del organismo mamífero. Los niveles absolutos de esta modificación se encuentran mediados a través del equilibrio de las actividades enzimáticas de tirosina quinasas con aquéllas de las tirosina fosfatasas. En ambos casos, estas grandes familias de proteínas llevan a cabo sus funciones a través de dominios enzimáticos conservados que se encuentran acoplados a una multitud de dominios determinantes de especificidad. Estos diversos motivos se encuentran en el contexto tanto de moléculas similares a receptores que atraviesan la membrana, como de formas intracelulares de los enzimas.

Las similitudes en la estructura global de las tirosina quinasas y de las tirosinas fosfatasas sugieren que median sus actividades específicas relativas a través de la utilización de estos diversos dominios. En el caso de algunas de las PTPs receptores, los motivos extracelulares son poco habituales en el aspecto de que contienen regiones altamente glucosiladas con especificidades de ligando hasta el momento desconocidas. Alternativamente, un subgrupo de estas fosfatasas receptoras también contiene una diversidad de dominios, incluyendo los similares a inmunoglobulina y similares a fibronectina, que se encuentran asociados a las actividades de adhesión celular y de unión a ligando en otras familias de proteínas. Entre los más interesantes de estos tipos de PTPs asociados a la adhesión se encuentran los receptores \kappa y \mu, los cuales se encuentran implicados en interacciones de tipo homotípico. Las predicciones anteriores, basadas en la función probable de estos receptores en la mediación de la adhesión celular, así como en su limitada distribución en los tejidos, sugieren que podrían existir otras PTPs similares a \lambda y a \mu con diferentes disposiciones en los tejidos. En la presente invención los presentes inventores dan a conocer el aislamiento del tercer miembro de esta familia de PTPs receptoras de interacción homotípica, PTP \lambda, que podría encontrarse asociada a la construcción de estructuras epiteliales y neutrales durante el desarrollo y en el adulto.

Los datos más fuertes que sugieren que el nuevo polipéptido de PTP \lambda descrito en la presente memoria es homólogo de los receptores \kappa y \mu se encuentra en el elevado grado de conservación de secuencias entre estas tres proteínas. El análisis de estos tres receptores reveló claramente que el nuevo polipéptido de PTP \lambda de la presente invención presenta un grado elevado de homología de secuencia con PTP \kappa y con PTP \mu a lo largo de la longitud completa de las proteínas. Esta homología incluye los cuatro tipos principales de dominios contenidos en esta familia, incluyendo los dominios MAM, de inmunoglobulina (IgG), de fibronectina de tipo III (FN III) y de fosfatasa dual (PTPasa) (Jiang et al., supra, 1993, y Gebbink et al., supra, 1991). Debido a que los datos anteriores sugieren que los dominios tanto MAM como IgG aparentemente participan en la adhesión homotípica (Brady-Kalnay et al., supra, 1992, y Zondag et al., supra), resulta probable que estos motivos se utilicen para una función similar en la PTP \lambda, una hipótesis que es consistente con un papel para este receptor en la adhesión celular. Sin embargo, el grado de homología de secuencia de estos dominios entre el receptor PTP \lambda que se da a conocer en la presente memoria y los receptores PTP \kappa y PTP \mu es bastante divergente, sugiriendo que el nuevo receptor también podría mediar específicamente en una interacción homofílica únicamente con sí mismo, y no con estos dominios en los otros miembros de la familia (Zondag et al., supra). Tal como se comenta después, estos resultados, junto con la localización en los tejidos de este receptor, sugieren que podría participar en la formación de edificios muy específicos durante el desarrollo. Evidentemente resultará interesante determinar los aspectos estructurales de estos dominios que participan en la unión homofílica, especialmente a la luz de los recientes análisis cristalográficos de una de las cadherinas de interacción homofílica (Shapiro et al., Nature 374(6520):327-337, 1995). Aunque hoy en día resulta difícil interpretar la significación de que se conserven los dominios FNIII, que pueden actuar como dominios espaciadores que extiendan los dominios MAM e IgG funcionalmente críticos desde la superficie celular, la conservación de los dominios de PTP dual se presta a algunos comentarios. Por ejemplo, el grado más elevado de conservación del primer dominio en comparación con el segundo apoya resultados de trabajos anteriores que sugieren que el motivo PTPasa N-terminal es el enzimáticamente activo, mientras que el dominio C-terminal podría participar en la regulación de la actividad enzimática (Pot et al., supra). Los presentes inventores han intentado, sin éxito, expresar bacterianamente formas enzimáticamente activas de los dominios PTPasa de PTP \lambda bajo condiciones que sí proporcionan un nivel elevado de actividad con otra PTP, la PTP HSC (Cheng et al., supra) (J. Cheng y L. Lasky, observaciones no publicadas). Estos datos negativos, que evidentemente podrían ser de índole técnica, sugieren que el polipéptido de PTP \lambda podría requerir un suceso de activación, aunque resulta evidente a partir de los estudios de inmunoprecipitación utilizando células PC 12 que este receptor está dotado de actividad enzimática. Finalmente, los datos anteriores sugieren un papel para esta categoría de PTPs receptores en la regulación cadherina/catenina, y otros investigadores han señalado a un sitio yuxtamembranal intracelular con homología significativa con una región de localización similar en las cadherinas (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7(5):650-657, 1995, y Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 130(41):977-986, 1995). Los presentes inventores también han descubierto un grado muy elevado de conservación de secuencia en esta región, nuevamente consistente con un papel potencial para este dominio en las interacciones de cadherina. En resumen, los datos informados en la presente memoria son consistentes con que PTP \lambda sea el tercer miembro de la familia de PTP receptoras de interacción homotípica.

El análisis de hibridación in situ de la expresión de PTP \lambda en el embrión en desarrollo y en el adulto sugiere algunas hipótesis potencialmente importantes. La expresión de este receptor en una diversidad de áreas esqueléticas en desarrollo, así como en sitios epiteliales que revisten diversos sistemas de órganos con una capa de estas células, junto con el papel propuesto para la PTP \lambda (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7(5):650-657, 1995, y Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 130(4):977-986, 1995) y potencialmente PTP \kappa, en el control de la adhesión de cadherina sugiere que la nueva PTP \lambda podría encontrarse implicada en un tipo similar de control de la adhesión en el embrión en desarrollo. Por ejemplo, el desarrollo de capa epiteliales en los bronquiolos pulmonares y los glomérulos renales requiere la construcción de una lámina de células epiteliales de una célula de grosor. De esta manera, a medida que crecen las células y migran durante la embriogénesis, requerirán un mecanismo por el que detecten la localización de otras células epiteliales en contacto con ellas, de manera que esta contigüidad celular inicie una respuesta de adhesión que inhibiese un movimiento epitelial adicional a través de la intensificación de la adhesión celular. Un mecanismo que proporcionaría este fenómeno de detección sería el propuesto por Tonks y colaboradores (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7(5):650-657, 1995, y Brady-Kalnay et al., J. Cell Biol. 130(4):977-986, 1995). En esta hipótesis, el receptor PTP \mu entra en contacto homofílico con otro receptor PTP \mu en una célula contigua, y este contacto regula positivamente la adhesión mediada por cadherina a través de la desfosforilación del complejo cadherina/catenina. La formación de estructuras epiteliales de una sola célula de grosor en estos órganos embrionarios podría encontrarse mediada por un tipo similar de mecanismo de detección utilizando PTP \kappa. La expresión de este receptor PTP en condrocitos formados de hueso también sería previsible que llevase a cabo un tipo similar de función de detección y adhesión para construir estas estructuras, aunque este tipo de anatomía, que es más compleja que la morfología similar a la epitelial de paredes delgadas descrita anteriormente, sería previsible que implicase tipos más elaborados de mecanismos de detección y de adhesión. Finalmente, debido a que muchos tipos comunes de tumores del pulmón y de otros órganos implican células epiteliales, resulta posible que estén implicadas alteraciones de la función propuesta de este tipo de mecanismo de detección de adhesión en la morfología desorganizada y tasa elevada de metástasis de estos tumores (Kemler, supra, y Beherens et al., supra). Conjuntamente, estas hipótesis sugieren un papel crítico para la PTP \lambda en la formación de diversas estructuras similares a las epiteliales en el embrión.

Algunos datos recientes procedentes del sistema Drosophila también sugieren posibilidades interesantes para la función de PTP \lambda en el sistema nervioso en desarrollo (Desai et al., supra, y Kreuger et al., supra). En estas informaciones, se demostró que tres PTPs receptoras diferentes de Drosophila denominadas DPTP69D, DPTP99A y DLAR, todas las cuales contienen dominios de adhesión IgG y de fibronectina de tipo III similares a aquellos que se encuentran en la PTP \lambda, se encontraban implicadas críticamente en el guiado neuronal en los sistemas nerviosos en desarrollo. De esta manera, las mutaciones en cualquiera de estos receptores resultaba en una pérdida de la capacidad de determinados grupos neurales de reorientarse durante su formación en el embrión. Debido a que PTP \lambda se expresa en varios sitios neurales en desarrollo, resulta posible que desempeñe un papel similar en el guiado de nervios en los mamíferos. De esta manera, la expresión de esta PTP en el cerebro medio, cerebro frontal y otros sitios neurales en desarrollo la dispondría para que funcionase como mediador en el guiado en estos sistemas en maduración. Resulta interesante que la expresión de este receptor en estos esbozos embrionarios se confirmó mediante la expresión en los sitios adultos que surgen de estas estructuras embrionarias. Sin embargo, la expresión en el adulto aparentemente se encontraba algo disminuida en comparación con la observada en el embrión, y se encontraba mucho más organizada. Estos datos sugieren que este enzima podría utilizarse durante la formación neuronal adulta, aunque la reducción aparente de la expresión adulta sugiere un papel potencialmente más crítico durante la embriogénesis. La expresión observada de este receptor en las células PC 12 progenitoras neuronales, junto con la regulación positiva del transcrito durante la formación de neuritas en respuesta a NGF en estas células, también es consistente con un papel para esta PTP receptora durante el guiado neural. En efecto, la observación de que esta PTP se expresa sobre las neuritas, así como sobre las estructuras de crecimiento similares a conos en las puntas de estos procesos es consistente con un papel potencial para este receptor en el guiado neuronal en el sistema nervioso de mamífero. Sin embargo, la cinética relativamente lenta sugiere que ésta podría ser una función tardía. Finalmente, aunque la clara observación de la pérdida de guiado en Drosophila resultaría difícil de recapitular en el ratón, debido a la complejidad relativamente elevada del sistema nervioso de mamífero, sin embargo resultaría potencialmente de interés examinar la formación del sistema nervioso en animales en los que se ha anulado la expresión de este receptor.

En resumen, los datos que se dan a conocer en la presente memoria demuestran la existencia de un tercer miembro de la familia de las PTPs receptoras, PTP \lambda, que aparentemente participa en la adhesión homotípica y, potencialmente, en la formación de órganos mediada por cadherina. El papel que este nuevo receptor podría desempeñar en la formación de láminas epiteliales y estructuras neuronales todavía no ha sido establecido. Sin embargo, la existencia de tres de estos tipos de receptores sugiere además que esta familia creciente podría participar en la formación específica de diversos tipos de estructuras complejas durante el desarrollo, así como en el adulto.

N. Observaciones finales

La descripción anterior detalla procedimientos específicos que pueden utilizarse para la práctica de la presente invención. Tras detallar estos procedimientos específicos, los expertos en la materia poseerán conocimientos suficientes para diseñar procedimientos alternativos fiables para obtener la misma información durante la utilización de los frutos de la presente invención. De esta manera, aunque lo anteriormente expuesto pueda parecer muy detallado en el texto, no debe interpretarse como limitativo del alcance global de la invención; por el contrario, el alcance de la presente invención debe determinarse únicamente a partir de la interpretación legal de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA TIROSINA FOSFATASA ANÁLOGA DE LA PTP \kappa/\mu, PTP \lambda

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DESTINATARIO: Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert

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(B): CALLE: Four Embarcadero Center, Suite 3400

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(C): CIUDAD: San Francisco

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): ZIP: 94111

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: diskete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn emisión nº 1.0, versión nº 1.30

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(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: ADJUNTA

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/652.971

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-ENERO-1996

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(viii): DATOS DEL CESIONARIO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Dreger, Walter H.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 24.190

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: A-64254

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(ix): DATOS DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (415) 781-1989

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(B): FAX: (415) 398-3249

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5.769 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 379..4686

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

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100

101

102

103

104

105

106

107

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.436 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

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108

109

110

111

112

113

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 1.457 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

114

115

116

117

118

119

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.452 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

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120

121

122

123

124

125

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: sitio activo

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..2

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "considérese que ``X'' situado en la posición 1 representa histidina o ácido aspártico"

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

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(B): LOCALIZACIÓN: 6..7

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(D): OTROS DATOS: /nota= "considérese que ``X'' situada en la posición 6 representa isoleucina o valina 11"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:

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\sa{Xaa Phe Trp Arg Met Xaa Trp}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

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(B): LOCALIZACIÓN: 11..12

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(D): OTROS DATOS: /nota = "Considérese que la ``N'' en la posición 11 representa inosina"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AYTTYTGGMG NATGRTNTGG

\hfill

20

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

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(B): LOCALIZACIÓN: 4..5

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(D): OTROS DATOS: /nota: "Considérese que ``X'' localizado en la posición 4 representa fenilalanina o histidina".

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:

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\sa{Trp Pro Asp Xaa Gly Val Pro}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 17 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

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(B): LOCALIZACIÓN: 3..4

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(D): OTROS DATOS: /nota = "Considérese que ``N'' localizada en la posición 3 representa inosina".

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

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(B): LOCALIZACIÓN: 12..13

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(D): OTROS DATOS: /nota = "Considérese que ``N'' localizada en la posición 12 representa inosina".

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGNACRWRRT CNGGCCA

\hfill

17

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9

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\sa{Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:

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\sa{Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr}

Claims

1. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado que es capaz de desfosforilar residuos de tirosina fosforilados, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos de entre el grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1;

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de (a) bajo condiciones astringentes que comprenden el lavado en cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M, SDS al 0,1% a 50ºC;

y

(c) una secuencia de aminoácidos derivada de una especie animal diferente del ratón que posee una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 65% con la secuencia de aminoácidos de (a).

2. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislada según la reivindicación 1 que es de origen murino.

3. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado según la reivindicación 1 que es de origen humano.

4. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado según la reivindicación 1 que se encuentra fusionado con una secuencia de polipéptido heteróloga.

5. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de polipéptido heteróloga es una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

6. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de polipéptido heteróloga es un polipéptido inmunológicamente competente.

7. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado según la reivindicación 1, que comprende además un residuo metionilo N-terminal.

8. Polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora aislado según la reivindicación 1, que no se encuentra glucosilado.

9. Dominio extracelular aislado a partir de un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora que comprende una secuencia de aminoácidos de entre el grupo que consiste en:

(a) aminoácidos 19-748 del polipéptido de proteína tirosina fosfatasa receptora mostrado en la figura 1;

(b) una secuencia de aminoácidos que se encuentra codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de (a) bajo condiciones astringentes que comprenden el lavado en cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M, SDS al 0,1% a 50ºC; y,

10. Dominio extracelular aislado según la reivindicación 9, que es de origen murino.

11. Dominio extracelular aislado según la reivindicación 9, que es de origen humano.

12. Dominio extracelular aislado según la reivindicación 9, que se encuentra fusionado con una secuencia polipeptídica heteróloga.

13. Dominio extracelular aislado según la reivindicación 12, en el que dicha secuencia polipeptídica heteróloga es una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

14. Dominio extracelular aislado según la reivindicación 12, en el que dicha secuencia polipeptídica heteróloga es un polipéptido inmunológicamente competente.

15. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa receptora que desfosforila residuos de tirosina fosforilados, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 379 a 4.686 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1;

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1; y

(c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos de (a) o (b) bajo condiciones astringentes que comprenden el lavado en cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y SDS al 0,1% a 50ºC.

16. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 15, que codifica un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora humana.

17. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 15, que codifica un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora murina.

18. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 15, que comprende los nucleótidos 379 a 4.686 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1.

19. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 15, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1.

20. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 15, 16, 17, 18 ó 19 unida operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

21. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 20.

22. Procedimiento para la producción de un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda receptora que desfosforila residuos de tirosina fosforilados, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de la célula huésped transformada según la reivindicación 21 y la recuperación de dicho polipéptido del cultivo celular.

23. Anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que se encuentra libre de anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína tirosina fosfatasa \kappa o a la proteína tirosina fosfatasa \mu.

24. Anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido de dominio extracelular de proteína tirosina fosfatasa \lambda según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que se encuentra libre de anticuerpos capaces de unirse específicamente a un dominio extracelular de la proteína tirosina fosfatasa \kappa o de la proteína tirosina fosfatasa \mu.

25. Línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo según la reivindicación 23 ó 24.

26. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1; y

(b) una secuencia de aminoácidos que se encuentra codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 bajo condiciones astringentes que comprende el lavado en cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y SDS al 0,1% a 50ºC,

en el que dicho anticuerpo monoclonal se encuentra libre de anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína tirosina fosfatasa \kappa o a la proteína tirosina fosfatasa \mu.

27. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1.

28. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda es de origen humano.

29. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda es de origen murino.

30. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 bajo condiciones astringentes que comprenden el lavado en cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y SDS al 0,1% a 50ºC.

31. Línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

32. Ensayo para la identificación de un antagonista o de un agonista de un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende:

(a) poner en contacto un dominio fosfatasa de un polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda con un antagonista o agonista candidato, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda es capaz de desfosforilar los residuos de tirosina fosforilados y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1; y

una secuencia de aminoácidos que se encuentra codificada por una molécula de ácidos nucleicos que se hibrida con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 bajo condiciones astringentes que comprenden el lavado en cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y SDS al 0,1% a 50ºC; y

(b) realizar el seguimiento de la capacidad de dicho dominio fosfatasa de desfosforilar residuos de tirosina fosforilados.

33. Ensayo según la reivindicación 32, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosforilasas \lambda comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1.

34. Ensayo según la reivindicación 32, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosforilasa \lambda es de origen humano.

35. Ensayo según la reivindicación 32, en el que dicho polipéptido de proteína tirosina fosfatasa \lambda es de origen murino.