ES2252795T3

ES2252795T3 - Proteinas "smoothened" de vertebrados.

Info

Publication number: ES2252795T3
Application number: ES97944533T
Authority: ES
Inventors: Frederic J. De Sauvage; Arnon Rosenthal; Donna M. Stone
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-09-30
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2017-09-29
Also published as: US6407216B1; CA2267181A1; EP0939769B1; AU725701B2; IL129139A0; US5990281A; AU4600597A; IL129139A; DE69734596T2; EP0939769A1; WO1998014475A1; JP2001501476A; JP4671371B2; DK0939769T3; ZA978503B; DE69734596D1; ATE309270T1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS HOMOLOGOS DE PROTEINAS SMOOTHENED DE VERTEBRADOS, INCLUYENDO PROTEINAS SMOOTHENED HUMANAS Y MURINAS. SE PROPORCIONAN TAMBIEN COMPOSICIONES QUE INCLUYEN QUIMERAS DE PROTEINAS SMOOTHENED DE VERTEBRADOS, UN ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA DICHAS PROTEINAS Y ANTICUERPOS CONTRA LAS MISMAS.

Description

Proteínas "Smoothened" de vertebrados.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a nuevas proteínas Smoothened que interactúan con moléculas de señalización Hedgehod y Patched implicadas en la proliferación y diferenciación celular. En particular, la invención hace referencia a proteínas Smoothened de vertebrados identificadas y aisladas y al DNA que las codifica, incluyendo proteínas Smoothened de rata y humanas y varias formas modificadas de las mismas, a los anticuerpos contra Smoothened de vertebrados y a diversas utilizaciones de lo anterior.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de organismos multicelulares depende, al menos en parte, de mecanismos que específicamente, dirigen o mantienen la información posicional del patrón de células, tejidos u organismos. Diversas moléculas de señalización secretadas, como los miembros del factor-beta de crecimiento transformante ("TGF-beta"), Wnt, factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF"), y familias hedgehog, se han asociado con la actividad de patrón de células distintas y estructuras en Drosophila al igual que en vertebrados [Perrimon, Cell, 0:517-520 (1995)].

Estudios de embriones de Drosophila han demostrado que, a nivel del blastodermo celular y en estadios posteriores del desarrollo, la información se mantiene a través de los límites celulares mediante vías de transducción de señal. Dichas vías se cree que se inician mediante señales extracelulares como Wingless ("Wg") y Hedgehog ("Hh"). La señal extracelular, Hh ha demostrado que controla la expresión de las moléculas de señalización TGF-beta, Wnt y FGF, e inicia acciones de señalización de corto y largo intervalo. Una acción de intervalo corto de Hh en Drosophila, por ejemplo, se halla en la epidermis ventral, en donde Hh se asocia el hecho de que las células adyacentes mantengan la expresión de wingless (wg) [Perrimon, Cell, 76:7681-784 (1984)]. En el sistema nervioso central de vertebrados, por ejemplo. Sonic hedghog ("SHh", un homólogo de vertebrados secretado de dHh) se expresa en las células de la notocorda y se asocia con la inducción de la formación de la placa basal dentro del tubo neural de forma dependiente del contacto [Roelink y col., Cell:761-775 (1994)]. Perrimon, Cell, 80:517-520 (1995) proporciona una revisión general de algunas acciones de intervalo largo asociadas con Hh.

Estudios de la proteína Hh en Drosophila ("dHh") han mostrado que hh codifica una proteína nativa de 46 KDa que se corta en una forma de 39 KDa después del corte de la secuencia señal, lo que produce una forma amino-terminal de 19 KDa y una forma carboxi-terminal de 26 KDa [Lee y col., Science, 266:1528-1537 (1994)]. Lee y col., publicaron que las formas de 19 KDa y 26 KDa tienen propiedades bioquímicas distintas y se distribuyen de forma diferente. DiNardio y col., y otros autores describieron que la proteína dHh desencadena una cascada de transducción de señal que activa wg [DiNardio y col., Nature, 332:604-609 (1988); Hidalgo e Ingham, Development, 110:291-301 (1990); Ingham e Hidalgo, Development, 117:283-291 (1993)] y al menos otro gen de polaridad de segmentos, patched (ptc) [Hidalgo e Ingham, supra; Tabata y Kornberg, Cell, 76:89-102 (1994)]. Las propiedades y características de dHh se describen también en las revisiones de Ingham y col., Curr. Opin. Genet. Dev., 5:492-498 (1995) y Lumsden y Graham y col., Curr. Biol., 5:1347-1350 (1995). Las propiedades y características del homólogo de vertebrados de dHh, Sonic Hedgehog, se describiron por Echelard y col., Cell, 75:1417-1430 (1993); Krauss y col., Cell, 75:1431-1444 (1993); Riddle y col., Cell, 75:1401-1416 (1993); Johnson y col., Cell, 79:1165-1173 (1994); Fan y col., Cell, 81:457-465 (1995); Roberts y col., Development, 121:3163-3174 (1995); y Hyness y col., Cell, 80:95-101 (1995).

En Perrimon, Cell, 80:517-520 (1995), se reporta que los mecanismos bioquímicos y los receptores por los cuales las moléculas de señalización como Wg y Hh regulan las actividades, la transcripción, o ambas, de los transductores de señal secundaria no son todavía bien conocidos. En Drosophila, evidencias genéticas indican que Frizzled ("Fz") funciona para transmitir y transducir las señales de polarización en las células epidérmicas durante el desarrollo del pelo y las cerdas. Los homólogos de rata de Fz que tienen similitudes estructurales con miembros de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G han sido descritos por Chan y col., J. Biol. Chem. 267:2502-2507 (1992). Específicamente, Chan y col., describieron el aislamiento de dos cDNAs distintos de una librería de células de rata, el primer cDNA codifica una proteína de 641 residuos, Fz-1, con una homología del 46% con el Fz de Drosophila, y un segundo cDNA que codifica una proteína, Fz-2, de 570 aminoácidos que tiene una homología del 80% con Fz-1. Chan y col., estipulan que fz de mamífero constituye una familia de genes importantes en la transducción de señal y en la transmisión intercelular de la información de la polaridad durante la morfogénesis tisular o en tejidos distintos. Recientemente, Bhanot y col., han descrito la identificación de un gen de Drosophila, frizzled2 (Dfz2), y predicen una proteína Dfz2, que puede funcionar como un receptor Wg en células en cultivo [Bhanot y col., Nature, 382:225-230 (1996)]. Bhanot y col., describen, sin embargo, que no existen evidencias que demuestren que se requiera Dfz2 para la señalización de Wg.

Aunque algunas evidencias sugieren que las respuestas celulares a dHh son dependientes de la proteína transmembrana, smoothened (dSmo), [Nusslein-Volhard y col., Wilheim Roux's Arch. Dev. Biol., 193:267-282 (1984); Jurgens y col., Heuvel e Ingham, Nature, 382:547-551 (8 de agosto de 1996)], y están reguladas negativamente por la proteína transmembrana, "Patched" [(Hooper y Scout, Cell, 59:751-765 (1989); Nakano y col., Nature, 341:508-513 (1989); Hidalgo e Ingham, supra; Ingham y col., Nature, 353:184-187 (1991)], los receptores para las proteínas Hh no están todavía caracterizados. Diversos productos génicos, incluyendo la proteína Patched, el factor de transcripción cubitus interruptus, la serin/treonin quinasa "fusionada", y los productos génicos de Costal-2, smoothened (smo) y Suppresor of fused (Su(fu)), han sido implicados como componentes putativos de la vía de señalización Hh.

Estudios previos con Drosphila condujeron a la hipótesis de que ptc codificaba el receptor de Hh [Ingham y col., Nature, 353; 184-187 (1991)]. La actividad del producto ptc, que es una proteína múltiple de superficie celular que se expande por la membrana referida como Patched [Hooper y Scout, supra], reprime los genes wg y ptc, siendo la señal antagonista, Hh. Patched fue propuesta por Ingham y col., como un receptor activo constitutivamente que se inactiva por la unión de Hh, y en consecuencia permite la transcripción de genes de respuesta a Hh. Tal como se publicó por Bejsovec y Wieschaus, Development, 119:501-517 (1993), Hh tiene efectos en los embriones de Drosophila null ptc y por ello no puede ser el único receptor Hh. Según ello, el papel de Patched en la señalización no se conoce completamente.

Goodrich y col., aislaron un gen patched murino [Goodrich y col., Genes Dev., 10:301-313 (1996)]. Los homólogos patched humanos se han descrito recientemente. Por ejemplo, Hahn y col., Cell, 85:841-851 (1996) describen el aislamiento e un homólogo de Drosophila, ptc. El gen presenta hasta un 67% de identidad de secuencia a nivel nucleotídico y un 60% a nivel aminoacídico con el gen de Drosphila [Hahn y col., supra]. Johnson y col., también proporcionan una secuencia aminoacídica predicha de una proteína Patched humana [Jonson y col., Science, 272:1668-1671 (1996)]. Jonson y col., describen que la proteína de 1447 aminoácidos tiene un 96% y un 40% de identidad de secuencia con Patched de ratón y Drosophila, respectivamente. Los datos sobre el ratón y el hombre de estos investigadores sugieren que patched es un gen de copia única en mamíferos. Según Hahn y col., Cell, 85:841-851 (1996), el análisis demostró la presencia de tres extremos 5' distintos para el gen ptc humano. Hahn y col., postularon que al menos habían tres formas distintas de la proteína Patched en las células de mamífero: la forma ancestral representada por la secuencia murina y las dos formas humanas. Patched se discute posteriormente en una revisión reciente por Marigo y col., Development, 122:1225 (1996).

Los estudios en Drosophila también han conducido a la hipótesis de que Smo podría ser un receptor candidato para Hh [Alcedo y col., supra; van den Heuvel e Ingham, supra]. El gen smoothened (smo) se identificó como un gen de polaridad de segmentos e inicialmente se denominó smooth [Nusslein-Volhard col., supra]. Dado que dicho nombre ya describía otro locus, el gen de polaridad de segmentos se renombró smoothened [Lindsey y Zimm, "The Genome of Drosophila melanogaster", San Diego, CA, Academia Press (1992)]. Tal como se publicó por primera vez por Nusslein-Volhard y col., supra, el gen smo es necesario para el mantenimiento de la segmentación en los embriones de Drosophila melanogaster.

Alcedo y col., supra, han descrito recientemente el clonaje del gen smoothened de Drosophila [véase también, van den Heuvel e Ingham, supra]. Alcedo y col., publicaron que el análisis de hidropatía es predictivo de que la proteína Smo putativa sea una proteína de membrana integral con siete hélices alfa que se expanden por la membrana, un segmento hidrofóbico cercano al extremo N-terminal y una cola C-terminal hidrofóbica. Por ello, Smo puede pertenecer a la familia de receptores serpentina, cuyos miembros están acoplados a proteínas G. Alcedo y col., supra, también publicaron que smo es necesario para la señalización de Hh y que actúa por debajo de hh y ptc.

Tal como se discute en Pennisi, Science, 272:1583-1584 (1996), se cree que ciertos genes del desarrollo desempeñan un papel en el cáncer ya que controlan el crecimiento celular y la especialización. Estudios recientes sugieren que patched es un supresor de tumores, o un gen cuya pérdida de inactivación contribuye al crecimiento excesivo de las células cancerosas. Específicamente, Hahn y col., y otros investigadores hallaron que patched está mutado en algunas formas comunes de carcinomas de células basales en el hombre [Hahn y col., Cell, 85:841-851 (1996): Jonson y col., supra; Gailani y col., Letters. Nature Genetics, 13 de septiembre de 1996]. Hahn y col., hallaron las alteraciones que supuestamente inactivan el producto del gen patched en seis pacientes no relacionados con el síndrome del nevo de células basales ("BCNS"), un conjunto hereditario de defectos múltiples que incluyen cánceres y anomalías del desarrollo. Hahn y col., también reportaron la implicación en la tumorigénesis de la vía de ptc mediante el clonaje del gen supresor del tumor pancreático, DPC4. Los homólogos de vertebrados de los otros dos genes de polaridad de segmentos de Drosophila, el mamífero murino Wntl [Rijsewijk y col., Cell, 50:649 (1987)] y el de glioblastoma humano GLI [Kinzler y col., Science, 236:70 (1987)], también han sido implicados en el cáncer.

Resumen de la invención

Los solicitantes han identificado clones del cDNA que codifican nuevas proteínas Smoothened de vertebrados, denominadas aquí como "vSmo". En particular, se han identificado clones de cDNA que codifican Smoothened de rata y Smoothened humana. Sorprendentemente, se ha hallado que las proteínas vSmo de la invención co-expresan con las proteínas Patched y forman complejos físicos con Patched. Los solicitantes también descubrieron que vSmo sola no se une a Sonic hedgehog, pero que los homólogos de vertebrados de Patched se unen a Sonic hedgehog con una afinidad relativamente alta. Se cree que Sonic hedgehog puede mediar sus actividades biológicas a través de un receptor de multi-subunidades en el que vSmo es un componente de señalización y Patched es un componente de unión a ligando, así como un supresor regulado por ligando de vSmo. Según ello, sin limitarse a ninguna teoría, las condiciones patológicas, como el carcinoma de células basales, asociado con Patched inactivado (o mutado) pueden ser el resultado de la actividad constitutiva de vSmo o de la señalización de vSmo como consecuencia de la regulación negativa de Patched.

La invención proporciona una Smoothened de vertebrados aislada. En particular, la invención proporciona una Smoothened de vertebrados de secuencia nativa, la cual en una realización, incluye una secuencia aminoacídica que comprende los residuos 1 a 793 de la Figura 1 (SEC ID NO:2). La invención también proporciona la secuencia nativa de Smoothened de vertebrados que incluye una secuencia aminoacídica que comprende los residuos 1 a 787 de la Figura 4 (SEC ID NO:4). En otras realizaciones, la proteína Smoothened de vertebrados aislada comprende una secuencia aminoacídica que tiene por lo menos un 80% de identidad con los residuos de Smoothened de vertebrados de secuencia nativa 1 a 787 de la Figura 4 (SEC ID NO:4), o los residuos 1 a 793 de la Figura 2 (SEC ID NO:2).

En otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden la Smoothened de vertebrados fusionada con un polipéptido o secuencia aminoacídica heteróloga. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende una Smoothened de vertebrados fusionada a una secuencia de etiqueta epitópica.

En otra realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la Smoothened de vertebrados. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico es un RNA o DNA que codifica una Smoothened de vertebrados, o es complementaria con dicha secuencia de ácido nucleico, y permanece unida establemente en condiciones astringentes. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico se selecciona a partir de:

(a): la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1 (SEC ID NO:1) que codifica los residuos 1 a 793 (es decir, los nucleótidos 450-452 a 2826-2828), inclusive;

(b): la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 4 (SEC ID NO:3) que codifica los residuos 1 al 787 (es decir, nucleótidos 13-15 a 2371-2373), inclusive; o

(c): una secuencia correspondiente con la secuencia de (a) o (b) dentro del ámbito de la degeneración del código genético.

En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Smoothened de vertebrados. También se proporciona la célula huésped que comprende el vector o la molécula de ácido nucleico y asimismo un procedimiento para la producción de Smoothened de vertebrados.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Smoothened de vertebrados. El anticuerpo puede ser un anticuerpo antagonista o neutralizante.

En otra realización, la invención proporciona animales transgénicos o knock-out no-humanos.

En otra realización de la invención se proporcionan los artículos de fabricación y los equipos que incluyen Smoothened de vertebrados o los anticuerpos contra Smoothened de vertebrados.

Otra realización de la invención proporciona complejos proteicos que comprenden la proteína Smoothened y la proteína Patched de vertebrados. En una realización, los complejos incluyen además proteína Hedgehog de vertebrados. Opcionalmente, Patched de vertebrados comprende una secuencia que es un derivado o un fragmento de una proteína Patched de secuencia nativa.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica (SEC ID NO:1) y la aminoacídica deducida (SEC ID NO:2) de una proteína Smoothened de rata de secuencia nativa.

La Figura 2 muestra la estructura primaria de Smo de rata (rSmo) y Smo de Drosophila (dsmo). Las secuencias del péptido señal están subrayadas, los aminoácidos conservados están encuadrados, las cisteínas están marcadas con un asterisco, los sitios potenciales de glicosilación con cuadrados oscuros y los siete dominios transmembrana hidrofóbicos están sombreados.

La Figura 3 muestra la distribución de SHH, Smo y Patched en tejidos de rata adulta y embrionales mediante hibridación in situ. SHH (columna izquierda), Smo (columna central) y Patched (columna derecha, sin incluir las inserciones). Fila E15 Sag, secciones sagitales de embriones de rata E15. Filas E9, E10, E12 y E15, secciones transversales de pliegues neurales de E9. E10, tubo neural y somitas; E12 y E15, tubo neural. Las indicaciones en la fila de E12 muestran secciones del primordio de las extremidades anteriores de embriones de rata E12. Leyenda- ht= corazón; sk= piel; bl= vejiga; ts= testículos; lu= pulmón; to= lengua; vtc= columna vertebral; nf= pliegue neural; nc= notocorda; so= somita; fp= placa basal; vh= cuerno ventral; vz= zona ventricular; cm = mesodermo cardíaco y vm= cara ventral del hemisferio cerebral.

La Figura 4 muestra la secuencia nucleotídica (SEC UD NO:3) y aminoacídica (SEC ID NO:4) deducidas para la Smoothened humana de secuencia nativa.

La Figura 5 muestra la estructura primaria de Smo humana (hSmo) y Smo de rata (rat.Smo) y la homología con Smo de Drosohila (dros.smo). Los aminoácidos conservados están enmarcados.

La Figura 6 muestra los resultados de los ensayos de unión e inmunoprecipitación que muestran que SHH-N- se une a mPatched pero no a rSmo. La tinción de las células que expresan rSmo etiquetada con Flag (a y b) o mPatched etiquetada con Flag (c, d, y e) con (a) anticuerpo anti-Flag(Smo); (c) anticuerpo anti-Myc (mPatched); (b y d) IgG-SHH-N; o (e) SHH-N etiquetada con Flag. (f) Co-inmunoprecipitación de mPatched etiquetada con un epitopo (Patched) o rSmo etiquetada con un epitopo (Smo) con IgG-SHH-N.

(g) Unión de SHH-N-I^{125} (SHH-I^{125}) con las células que expresan mPatched o rSmo en ausencia o presencia de SHH-N no marcada. (h) Co-inmunoprecipitación de SHH-I^{125} por mPatched etiquetada con un epitopo (Patched) o rSmo etiquetada con un epitopo (Smo). (i) Unión competitiva de SHH-I^{125} con las células que expresan mPatched o mPatched más rSmo.

La Figura 7 muestra (a) una doble tinción inmunohistoquímica de Patched (rojo) y Smo (verde) en células transfectadas. El amarillo indica la co-expresión de dos proteínas. (b y c) Detección del complejo Patched-Smo mediante inmunoprecipitación. (b) Imunoprecipitación con anticuerpos contra Patched etiquetado con un epitopo y análisis por transferencia de Western con anticuerpos contra Smo etiquetado con un epitopo. (c) Inmunoprecipitación con anticuerpos contra Smo etiquetado con un epitopo y análisis por transferencia de Western con anticuerpos contra Patched etiquetado con un epitopo. (d y e) Co-inmunoprecipitación de SHH-I^{125} unida a células que expresan tanto Smo como Patched con anticuerpos contra las etiquetas epitópicas de Smo (d) o de Patched (e).

La Figura 8 muestra una transferencia de western de un gel-SDS que demuestra el nivel de expresión de Patched de tipo salvaje (WT) y un mutado (mutante).

La Figura 9 muestra un modelo que describe el receptor de SHH putativo y su activación propuesta por SHH. Tal como se muestra en el modelo, Patched es un componente de unión al ligando y vSmo es un componente de señalización en un receptor de SHH de multi-subnidades.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "Smoothened de vertebrados", "proteína Smoothened de vertebrados" y "vSmo" cuando se utilizan aquí abarcan la Smoothened de vertebrados de secuencia nativa y las variantes de la misma (definiéndose aquí cada una de ellas). Estos términos abarcan la Smoothened de diversos animales clasificados como vertebrados, incluyendo los mamíferos. En una realización preferida, la Smoothened de vertebrados es una Smoothened de rata (rSmo) o humana (hSmo). La Smoothened de vertebrados puede aislarse de diversas fuentes, como por ejemplo de diversos tejidos humanos o o de otras fuentes, o prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Una "Smoothened de vertebrados de secuencia nativa" comprende una proteína que tiene la misma secuencia aminoacídica que una Smoothened de vertebrados derivada de la naturaleza. Por ello, una Smoothened de vertebrados de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de la Smoothened natural humana, de rata, o de cualquier otro vertebrado. Dicha Smoothened de vertebrados de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "Smoothened de vertebrados de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas naturales de las Smoothened de vertebrados, las formas variantes naturales (p.ej., las formas de ayuste alternativo) y las variantes alélicas naturales de Smoothened de vertebrados. En una realización de la invención, la Smoothened de vertebrados de secuencia nativa es una Smoothened de secuencia nativa madura que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:4. En otra realización de la invención, la Smoothened de vertebrados de secuencia nativa es una Smoothened de secuencia nativa madura que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:2.

El término "variante de Smoothened de vertebrados" se refiere a una Smoothened de vertebrados, tal como se define más adelante, que tiene por lo menos una identidad de secuencia del 100% con la Smoothened de vertebrados con la secuencia aminoacídica deducida que se muestra en la SEC ID NO:4 para la Smoothened humana o la SEC ID NO:2 para la de rata. Dichas variantes de Smoothened de vertebrados incluyen, por ejemplo, proteínas de Smoothened de vertebrados en donde uno o más residuos aminoacídicos se añaden en el extremo N- o C-terminal, o dentro, de las secuencias SEC ID NO:4 o SEC ID NO:2; en donde aproximadamente se delecionan de uno a 30 residuos aminoacídicos, u opcionalmente se sustituyen por uno o más residuos aminoacídicos; y derivados de lo mismo, en donde se ha modificado covalentemente un residuo aminoacídico de modo que el producto resultante tenga un aminoácido que no esté presente en la naturaleza. Generalmente, una variante de Smoothened de vertebrados tendrá al menos una identidad de secuencia del 80%, más preferentemente de al menos el 90% e incluso más preferentemente de al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEC ID NO:4 o SEC ID NO:2.

El término "etiqueta epitópica" cuando se utiliza aquí hace referencia a un polipéptido etiqueta que tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que se pueda generar un anticuerpo, que es suficientemente corto para que no interfiera con la actividad de Smoothened de vertebrados. El polipéptido etiqueta es también preferentemente único de modo que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con otros epitopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen por lo general al menos seis residuos aminoacídicos y normalmente entre 8-50 residuos aminoacídicos (preferentemente entre 9-30 residuos).

El término "aislado", cuando se utiliza para describir las proteínas diversas descritas aquí, significa que la proteína se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interfieren normalmente con la utilización diagnóstica o terapéutica de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otras sustancias proteicas o no-proteicas. En realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) a un nivel suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna utilizando un secuenciador spinning cup, o (2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. La proteína aislada incluye la proteína in situ dentro de las células recombinantes, ya que así al menos un componente del entorno natural de vSmo no estará presente. Aunque, por lo general, la proteína aislada se preparará al menos mediante una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que generalmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico de vSmo. Una molécula de ácido nucleico de vSmo aislada es distinta en la forma o ajuste en la que se halla en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico de vSmo aisladas se diferencian en consecuencia de las moléculas de ácido nucleico de vSmo que existen de forma natural en las células. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de vSmo aislada incluye moléculas de ácido nucleico de vSmo contenida en células que generalmente expresa vSmo si, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halla en una localización cromosómica distinta a la natural en las células.

El término "secuencias control" hace referencia a las secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación e intensificadores de la transcripción.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al DNA por un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador están unidos operativamente a una secuencia codificante si ello afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de tal modo que se facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de DNA unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porque ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en las dianas de restricción convenientes. Si dichas dianas no existieran, se pueden utilizar adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o engarces de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales anti-vSmo (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y las composiciones de anticuerpo anti-vSmo con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posibles que puedan suceder de forma natural y que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos al estar dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen los anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por ayuste de un dominio variable (incluyendo el hipervariable) de un anticuerpo anti-vSmo con un dominio constante (p.ej., anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o la designación de clase o subclase de inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (p.ej., Fab, F(ab')2 y Fv), siempre que presenten la actividad deseada. Véase, p.ej., la patente americana U.S. 4.816.567 y Mage y col., en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Por ello, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de a partir de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse que se requiera una producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden generarse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o pueden generarse mediante procedimientos del DNA recombinante tal como se describe en la patente americana U.S. 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de librerías de fagos generadas utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos) que contienen una mínima secuencia derivada de la inmunoglobulina no-humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no-humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata, o el conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan los residuos de la región de entramado Fv (FR) de la inmunoglobulina humana por los correspondientes residuos no-humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o de entramado importadas. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y optimizar la generación del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá todos o al menos uno, típicamente dos, dominios variables, en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente todas las regiones de entramado FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de forma óptima al menos una porción de una región constante o dominio de inmunoglobulina (Fc), típicamente el de una inmunoglobulina humana.

El término "vertebrado" tal como se utiliza aquí hace referencia a cualquier animal clasificado como un vertebrado que incluye ciertas clases de peces, reptiles, pájaros, y mamíferos. El término "mamífero" tal como se utiliza aquí hace referencia a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, el ganado vacuno, las ratas, los ratones, los caballos, los perros y los gatos.

II. Modos para llevar a cabo la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de homólogos vertebrados de Smoothened. En particular, los solicitantes han identificado y aislado la Smoothened humana y de rata. Las propiedades y características de la Smoothened humana y de rata se describen con mayor detalle en los Ejemplos de más adelante. Según las propiedades y características de Smoothened humana y de rata descritas aquí, los solicitantes creen que la Smoothened de vertebrados es un componente de señalización en un receptor Hedgehog de multisubunidades (en particular Sonic Hedgehog "SHH").

A continuación se detalla una descripción sobre cómo puede prepararse Smoothened de vertebrados.

A. Preparación de vSmo

Las técnicas adecuadas para la producción de vSmo son bien conocidas en la materia e incluyen el aislamiento de vSmo de una fuente endógena del polipéptido, la síntesis peptídica (utilizando un sintetizador peptídico) y las técnicas recombinantes (o cualquier combinación de estas técnicas). La descripción de más adelante hace referencia principalmente a la producción de vSmo mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de vSmo. Se contempla, desde luego, la posibilidad de utilizar procedimientos alternativos, bien conocidos en la materia, para preparar vSmo.

1. Aislamiento del DNA que codifica vSmo

El DNA que codifica vSmo puede obtenerse de cualquier librería de cDNA preparada a partir de un tejido que posea mRNA de vSmo y que lo exprese a un nivel adecuado. Según ello, el DNA de Smo humana puede obtenerse de forma conveniente a partir de una librería de cDNA preparada a partir de tejidos humanos, como la librería de cDNA de pulmón embrionario humano descrita en el Ejemplo 3. El DNA de Smo de rata puede obtenerse de forma adecuada de una librería de cDNA preparada de tejidos de rata, como la descrita en el Ejemplo 1. El gen que codifica vSmo puede también obtenerse de una librería genómica o mediante síntesis oligonucleotídica.

Las librerías pueden cribarse con sondas (como los anticuerpos contra vSmo u oligonucleótidos o polipéptidos, tal como se describe en los Ejemplos) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Las sondas se marcan preferentemente de modo que puedan detectarse tras hibridación con el DNA en la librería que se rastrea. Los procedimientos de marcaje son bien conocidos en la materia, e incluyen la utilización de marcajes radioactivos como el ATP marcado con P^{32}, la biotinilización o el marcaje enzimático. El cribado de una librería de cDNA o genómica con una sonda seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos estándares, como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (New York; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica vSmo es la utilización de la PCR [Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1995)].

El ácido nucleico que tiene toda la secuencia codificante de la proteína puede obtenerse mediante cribado de librerías seleccionadas de cDNA o genómicas utilizando las secuencias aminoacídicas deducidas aquí, y, si fuera necesario, utilizando procedimientos de extensión del cebador tal como se describe en Sambrook y col., supra, para detectar los precursores e intermediarios del procesamiento del mRNA que pueden no haberse retro-transcrito en cDNA.

Las variantes de vSmo pueden prepararse introduciendo los cambios nucleotídicos adecuados en el DNA de vSmo, o mediante síntesis del polipéptido de vSmo deseado. Los expertos en la materia tendrán en cuenta que los cambios aminoacídicos (comparados con la secuencia nativa) pueden alterar los procesos post-traduccionales del vSmo, como el cambio de número o la posición de los sitios de glicosilación.

Las variaciones en la secuencia nativa de vSmo pueden generarse utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras o no que se indican en la patente americana U.S. 5.364.934. Estas incluyen la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (de sitio dirigida), el cribado por alaninas y la mutagénesis por PCR.

2. Inserción de ácido nucleico en un vector de replicación

El ácido nucleico (p.ej., el cDNA o el DNA genómico) que codifica vSmo puede insertarse en un vector replicable para el posterior clonaje (amplificación del DNA) o para la expresión. Diversos vectores están disponibles públicamente. Los componentes del vector incluyen por lo general, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, cada una de las cuales se describe más adelante.

(i) Componente de Secuencia señal

La vSmo puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como una fusión polipéptídica con una secuencia aminoacídica o un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido con una diana de corte en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA de vSmo que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga insertada es preferentemente una que sea reconocida y procesada (es decir, se corte por una peptidasa señal) por la célula huésped.

(ii) Componente de Origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como los de clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped. Por lo general, en los vectores de clonaje esta secuencia es una que permite que el vector se replique de forma independiente del DNA cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus.

La mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, capaces de replicarse en al menos una clase de organismos, pero que se transfectan en otro organismo para su expresión. Por ejemplo, se clona un vector en E. coli y a continuación el mismo vector se transfecta en células de levadura o de mamífero para su expresión aún cuando no sea capaz de replicarse de forma independiente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA puede también amplificarse mediante inserción en el genoma del huésped. Esto se logra fácilmente utilizando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA que es complementaria de una secuencia hallada en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del DNA de vSmo.

(iii) Componente de genes de selección

Los vectores de expresión y clonaje contienen de forma típica un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huéspedes transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metrotexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo, p.ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transformaron con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y por ello sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina [Southern y col., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982)], el ácido micofenólico (Mulligan y col., Science, 209:1422 (1980)] o la higromicina [Sugden y col., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)]. Los tres ejemplos proporcionados más arriba utilizan genes bacterianos bajo el control eucariótico para transmitir la resistencia al fármaco adecuado, G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico de vSmo, como el DHFR o la timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión selectiva de modo que únicamente los transformantes se adaptan a sobrevivir al haber incorporado el marcador. La presión de selección se impone mediante el cultivo de los transformantes en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo a la amplificación del gen de selección y del DNA que codifica vSmo. La amplificación es el proceso por el cual genes con mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento están repetidos en tándem en los cromosomas de generaciones sucesivas de las células recombinantes.

Las células transformadas con el gen de selección DHFR pueden, en primer lugar, ser identificadas mediante cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metrotexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza el DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Las células transformadas se exponen a niveles crecientes de metotrexato. Ello conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR, y, concomitantemente, a múltiples copias de otro DNA que comprende los vectores de expresión, como el DNA que codifica vSmo.

(iv) Componente Promotor

Los vectores de expresión y clonaje contienen generalmente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de vSmo. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente entre unos 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y la traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, como la secuencia de ácido nucleico de vSmo, a la que están unidos operativamente. Dichos promotores se dividen en dos clases, los inducibles y los constitutivos. Los inducibles son aquellos promotores que inician niveles aumentados de transcripción del DNA bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, p.ej., la presencia o la ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Actualmente, se conoce una gran diversidad de promotores reconocidos por diversas células huéspedes potenciales. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica vSmo tras haber eliminado el promotor de la fuente de DNA mediante digestión con enzimas de restricción e inserción de la secuencia promotora aislada en el vector.

Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes eucariotas incluyen los sistemas de promotor de la \beta-lactamasa y de la lactosa [Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y los promotores híbridos como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)].

Las secuencias promotoras son bien conocidas para los eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada a aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia que se halla a 70-80 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT, en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucarióticos existe una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli-A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en los vectores de expresión eucarióticos.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1996); Holland, Biochemistry, 17:4900)], como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa. Se describen también vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras en la patente europea EP 73.657.

La transcripción de vSmo a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma aviar, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus 40 de simio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma adecuada como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40 [Fiers y col., Nature, 273,113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)]. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene como un fragmento de restricción HindIII [Greenaway y col., Gene, 18:355-360 (1982)]. Un sistema para expresar DNA en huéspedes mamíferos utilizando el virus papiloma bovino como un vector se describe en la patente americana U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana U.S. 4.601.978 [Véase también Gray y col., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión del cDNA que codifica el interferón inmune en las células de mono; Reyes y col., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cDNA del interferón-\beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa derivado del virus herpes simplex; Canaani y Berg., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en cultivos de células de ratón y de conejo; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT de bacterias en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición larga terminal del virus del sarcoma de Rous como promotor].

(v) Componente de elemento intensificador

La transcripción de un DNA que codifica vSmo por eucariotas superiores puede incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos del DNA que actúan en cis, generalmente de aproximadamente unas 10-300 pb, y actúan sobre un promotor para aumentar la transcripción. Los intensificadores tienen una orientación y posición relativamente independiente, habiéndose hallado en 5' [Laimins y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78:993 (1981)] y 3' [Lusky y col., Mol. Cell. Bio., 3:1108 (1983)] de la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji y col., Cell, 33:729 (1983)], así como dentro de la secuencia codificante propiamente [Osborne y col., Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)]. Se conocen hoy en día muchas de las secuencias intensificadoras de los genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizará un intensificador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma en el sitio tardío del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre los elementos intensificadores para la activación de promotores eucariotas.

(vi) Componente de finalización de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células huéspedes eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrá también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles generalmente en las regiones 5' y, ocasionalmente 3' de eucariotas o DNAs o cDNAs virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica vSmo.

(vii) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados más arriba utiliza técnicas estándares de ligación. Los plásmidos aislados o los fragmentos de DNA se cortan por enzimas de restricción y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación pueden utilizarse para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y se seleccionan los transformantes satisfactorios por su resistencia a ampicilina o tetraciclina según convenga. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic. Acids Res., 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

(viii) Vectores de expresión transitoria

Se pueden utilizar vectores de expresión proporcionan para la expresión transitoria en células de mamífero del DNA que codifica vSmo. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de modo que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptidos deseado codificado por el vector de expresión [Sambrook y col., supra]. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por los DNAs clonados, así como también un rastreo rápido de dichos polipéptidos por sus propiedades deseadas.

(ix) Ejemplos adecuados de vectores de células de vertebrados

Otros procedimientos, vectores, células huéspedes adecuadas para la adaptación a la síntesis de vSmo en el cultivo de células recombinantes se describen en Gething y col., Nature, 293:620_625 (1981); Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); patentes europeas EP 117.060 y EP 117.058.

3. Selección y transformación de células huéspedes

Las células huéspedes adecuadas para el clonaje o la expresión del DNA en los vectores en la presente invención son las células procariotas, las levaduras o las eucariotas superiores descritas más arriba. Los procariotas adecuados para este propósito incluyen pero no se limitan a las eubacterias, como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo. Las enterobacteriáceas como Escherichia. Y de preferencia, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos.

Además de los microbios procariotas, los eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras pueden ser adecuadas para el clonaje o la expresión de huéspedes para vectores que codifican vSmo. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común del pan, es el microorganismo huésped eucariota más comúnmente utilizado. Sin embargo, también es posible utilizar diversos otros géneros, especies y cepas disponibles comúnmente.

Las células huésped adecuadas para la expresión de vSmo glicosilada se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar procesos complejos y de glicosilación. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es factible de utilizar, bien sean cultivos de células de vertebrados o de invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos.

La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) es bien conocida en la materia [véase, p.ej., Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)]. Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos útiles son la línea CVI transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión. Graham y col., J. Gen. Virol., 36:59 (1977); células de riñón de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,23;243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5 y células FS4.

Las células huésped se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión y clonaje descritos anteriormente para la producción de vSmo y se cultivan en medio nutritivo modificado según sea adecuado para la inducción de promotores, selección de transformantes, o la amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por una células huésped independientemente de que se expresen o no secuencias codificantes. Numerosos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, CaPO4 la electroporación. Una transfección satisfactoria se reconoce generalmente cuando tiene lugar cualquier indicación de la operatibilidad del mencionado vector dentro de la célula huésped.

La transformación significa la introducción de DNA en un organismo de modo que el DNA sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándares adecuadas a dichas células. El tratamiento del calcio utiliza cloruro cálcico, tal como se describe en Sambrook y col., supra, o se utiliza la electroporación para procariotas u otras células que contienen barreras de paredes celulares importantes. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, tal como se describió por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden transfectarse utilizando el tratamiento ultrasonido tal como se describe en la patente internacional WO 91/00358, publicada el 10 de enero de 1991.

Para las células de mamífero sin esas paredes celulares, el procedimiento preferido es el de la precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspectos generales sobre las transformaciones de sistemas de células huésped de mamíferos se han descrito en la patente americana U.S. 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, otros procedimientos para la introducción del DNA en las células también pueden ser utilizados como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, p.ej., el polibreno y la poliomitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (199) y Mansour y col., Nature, 336:348-352 (1988).

4. Cultivo de células huésped

Las células procariotas utilizadas para producir vSmo pueden cultivarse en un medio adecuado tal como se describe en Sambrook y col., supra.

Las células huéspedes de mamífero utilizadas para producir vSmo pueden cultivarse en muy diversos medios. Ejemplos de medios disponibles comercialmente incluyen el Ham'sF10 (Sigma), el Minimal Essential Medium
("MEM", Sigma), el RPMI-1640 (Sigma) y el Dulbecco's Modified Eagle's Medium ("DMEM", Sigma). Cualquier medio puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina, o el factor de crecimiento epidérmico), sales (como el cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como el HEPES), nucleósidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina^{TM}), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes generalmente a concentraciones finales del orden micromolar), y glucosa o una fuente equivalente de energía. También se puede incluir cualquier otro suplemento a las concentraciones adecuadas que deberían ser del conocimiento del experto en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son los utilizados con anterioridad con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes a un experto en la materia.

En general, los principios básicos, los protocolos y las técnicas prácticas para la maximización de la productividad de cultivos de células de mamífero pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology; a Practical Approach, M. Butler, ed., (IRL Press, 1991).

Las células huésped referidas en esta descripción abarcan células en cultivo así como las células que se hallan dentro de un animal huésped.

5. Detección de la amplificación/expresión génicas

La amplificación génica y/o la expresión pueden cuantificarse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de mancha (análisis de DNA), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Se pueden utilizar diversos marcajes, siendo los radioisótopos los más comunes, y en particular el P32. Sin embargo, otras técnicas también pueden utilizarse, como la utilización de nucleótidos modificados por biotina para su introducción en un polinucleótidos. La biotina se utiliza a continuación como el sitio para la avidina o anticuerpos, que a su vez pueden estar marcados con una gran variedad de marcajes, como los radioisótopos, fluorocromos o enzimas. Alternativamente, se pueden utilizar los anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, de RNA, de DNA-RNA o de DNA-proteína. Los anticuerpos también se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo si el dúplex está unido a una superficie, de modo que tras la formación de dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia de un anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica, alternativamente, puede cuantificarse mediante procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejidos del cultivo celular o de fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Con técnicas de tinción inmunohistoquímicas, se prepara una muestra de células, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguido de la reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto del gen acoplado, si los marcajes son detectables visualmente, como los marcajes enzimáticos, fluorescentes o luminiscentes.

Los anticuerpos de utilidad para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de fluidos puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia de proteína nativa de vSmo o contra un péptido sintético basado en la secuencia de DNA proporcionada aquí.

6. Purificación de vSmo

Se contempla que puede ser deseable purificar alguna forma de vSmo de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que son esencialmente homogéneas como vSmo. Como una primera etapa, el medio de cultivo o el lisado puede centrifugarse para eliminar restos celulares particulados, y a continuación se puede purificar el vSmo de las proteínas y polipéptidos contaminantes solubles, con los siguientes procedimientos que son un ejemplo de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o una resina de intercambio catiónico como el DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de proteína A Sepharose para eliminar los contaminantes como la IgG. Las variantes de vSmo pueden recuperarse de la misma manera que una vSmo de secuencia nativa, teniendo en cuenta cualquier cambio que pueda aparecer en las propiedades debido a la variación.

También puede ser útil un inhibidor de proteasa como el fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y los antibióticos pueden incluirse para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos.

7. Modificaciones covalentes de vSmo

Las modificaciones covalentes de vSmo se incluyen dentro del ámbito de la presente invención. Un tipo de modificación covalente de la vSmo incluida dentro del ámbito de la presente invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo de la proteína. La "alteración del patrón de glicosilación nativo" está pensada con el propósito de delecionar una o más moléculas de carbohidratos que se hallan en lasecuencia nativa de vSmo, y/o adicionar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa de vSmo.

La glicosilación de polipéptidos es típicamente N- u O-. La N-glicosilación hace referencia a la unión de la molécula de carbohidrato con la cadena lateral de un residuo de asparraguina. Las secuencias del tripéptido asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la molécula de carbohidrato con la cadena lateral de la asparraguina. Por ello, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La O-glicosilación hace referencia a la unión de uno de los azúcares de la N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxilamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación a la vSmo puede lograrse mediante alteración de la secuencia aminoacídica de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para la sitios de N-glicosilación). La alteración también puede realizarse mediante adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina en la vSmo de secuencia nativa (para sitios de O-glicosilación). La secuencia aminoacídica de vSmo puede opcionalmente alterarse mediante cambios a nivel del DNA, en particular mutando el DNA que codifica la proteína vSmo en bases preseleccionadas de modo que los codones que se generan se traducirán en los aminoácidos deseados. Las mutaciones del DNA pueden generarse mediante diversos procedimientos descritos en la patente americana 5.364.934,
supra.

Otros medios para incrementar el número de moléculas de carbohidratos en vSmo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos al polipéptido. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los azúcares también se pueden unir a (a) la arginina y la histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La eliminación de las porciones de carbohidrato presentes en la proteína vSmo puede lograrse químia o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de los codones que codifican los residuos aminoacídicos que sirven como dianas de glicosilación. Por ejemplo, la desglicosilación química mediante exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente puede resultar en el corte de la mayoría de los azúcares excepto del azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981). El corte enzimático de porciones de carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse utilizando diversas endo- o exo-glicosidasas tal como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

La glicosilación en sitios potenciales de glicosilación puede evitarse mediante la utilización del compuesto tunicamicina tal como describe Duskin y col., J. Biochem. 257:3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de las uniones proteína-N-glicósido.

8. Quimeras de vSmo

La presente invención también proporciona moléculas quiméricas que comprende vSmo fusionada con otra secuencia aminoacídica heteróloga de polipéptido. En una realización, las moléculas quiméricas comprenden una fusión de la vSmo con un polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo con el que un anticuerpo anti-etiqueta puede unirse selectivamente. El epitopo etiqueta se proporciona generalmente en el extremo amino- o carboxi-terminal de vSmo. Dichas formas etiquetadas con un epitopo de vSmo son deseables al igual que su presencia pueda detectarse utilizando un anticuerpo marcado contra el polipéptido etiqueta. También, la provisión de etiquetas epitópicas permite que vSmo se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta. Las técnicas de purificación por afinidad y ensayos diagnósticos que implican anticuerpos se describen más adelante.

Los polipéptidos diana y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la materia. Ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta HA del virus de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10. [evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de glicoproteína D del virus Herpes Simplex (gD) y su anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Se han descrito diversos polipéptidos etiqueta. Ejemplos de ellos incluyen el péptido-Falg [Hopp y col., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido epitópico KT3 [Martin y col., Science, 255:192-194 (1992)]; y el péptido epitópico \alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta del peptídica de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. Una vez seleccionado el polipéptido etiqueta, se puede generar un anticuerpo utilizando las técnicas aquí descritas.

Los procedimientos generales adecuados para la construcción y producción de vSmo etiquetados epitópicamente son los mismos que los descritos anteriormente, las fusiones v-Smo con el polipéptido etiqueta se construyen preferentemente mediante fusión del cDNA que codifica la porción vSmo en el mismo marco de lectura con la secuencia de DNA del polipéptido etiqueta y se expresa la fusión de DNA resultante en las células huésped adecuadas. Generalmente, cuando se preparan quimeras vSmo-polipéptido etiqueta de la presente invención, el ácido nucleico que codifica vSmo se fusionará por su extremo 3’ con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal del polipéptido etiqueta, sin embargo también son posibles las fusiones 5’.

9. Procedimientos de la utilización de vSmo

vSmo, tal como se describe en la presente especificación, tiene utilidad en las aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas. Como un terapéutico, vSmo (o el ácido nucleico que la codifica) puede utilizarse en técnicas de terapia génica in vivo o ex vivo. En las aplicaciones no-terapéuticas, las secuencias de ácido nucleico que codifican vSmo pueden utilizarse para el diagnóstico del tipado específico de tejidos. Por ejemplo, los procedimientos como la hibridación in situ, la transferencia de Northern y de Southern y el análsis de PCR pueden utilizarse para determinar si el DNA y/o el RNA que codifica vSmo están presentes en el tipo celular que se evalúa. El ácido nucleico de vSmo también será de utilidad para preparar vSmo mediante técnicas recombinantes descritas aquí.

vSmo aislada puede utilizarse en ensayos diagnósticos cuantitativos como un control, y así es posible preparar muestras que contienen cantidades desconocidas de vSmo. Las preparaciones de vSmo también son útiles para generar anticuerpos, como los estándares en los ensayos para vSmo (p.ej., mediante marcaje de vSmo para utilizar como un estándar en un ensayo radioactivo, ensayo radioreceptor, o inmunoensayo ligado a enzima), y en técnicas de purificación por afinidad.

Los ácidos nucleicos que codifican vSmo, como vSmo de rata descrito aquí, también pueden utilizarse para generar animales transgénicos o "knock out" que a su vez son de utilidad en el desarrollo y cribado de reactivos de uso terapéutico. Un animal transgénico (p.ej., un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en un ancestro del animal en un estadio prenatal, p.ej., estadio embrional. Un transgén es un DNA que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el cDNA de rata que codifica rSmo o una secuencia adecuada de lo mismo puede utilizarse para clonar el DNA genómico que codifica Smo de acuerdo con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el DNA que codifica Smo. Los procedimientos para generar animales transgénicos, en particular animales como los ratones o ratas, son en la actualidad convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes americanas U.S. 4.736.866 y 4.870.009. De forma característica, se podrían señalar células para la incorporación del transgén de vSmo con intensificadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica vSmo e introducido en la línea germinal del animal en un estadio embrionario pueden utilizarse para examinar el efecto de la expresión aumentada del DNA que codifica vSmo. Dichos animales pueden utilizarse como animales probadores de los reactivos, que en principio confieren protección contra, por ejemplo, las condiciones patológicas asociadas con la actividad constitutiva de vSmo o Hedgehog, incluyendo algunas formas de cáncer derivadas de lo anterior, como por ejemplo el carcinoma de células basales, el síndrome del nevo de células basales y el carcinoma pancreático. De acuerdo con esta faceta de la invención, se trata un animal con el reactivo y si se presenta una incidencia reducida de la condición patológica, comparada con los animales no tratados que portan el transgén, ello sería indicativo de una intervención terapéutica potencial para la condición patológica.

Alternativamente, se puede utilizar el homólogo no-humano de vSmo para construir un animal "knock out" de vSmo, que tenga un gen defectuoso o alterado que codifica vSmo como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica vSmo y el DNA genómico alterado que codifica vSmo introducido en una célula embrional del animal. Por ejemplo, el cDNA de rata que codifica Smo se puede utilizar para clonar el DNA genómico que codifica Smo de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica Smo se puede delecionar o reemplazar por otro gen, como un gen que codifique un marcador seleccionable y pueda utilizarse para controlar la integración. De forma característica, varias kilobases del DNA flanqueante no alterado (tanto en los extremos 5' como 3') se incluyen en el vector [véase p.ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea celular embrional (p.ej., mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que se ha introducido el DNA que se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno [véase p.ej., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocisto de un animal (p.ej., un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase p.ej., Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152]. A continuación, se puede implantar un embrión quimera en un animal huésped hembra pseudopreñada y el embrión se lleva a término para generar un animal "knock out". La progenie que porta el DNA recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contengan el DNA recombinado homólogamente. Los animales knock out pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y pueden utilizarse en el estudio de los mecanismos por los cuales la familia Hedgehog de moléculas ejercen efectos mitogénicos, diferenciativos y morfogénicos.

B. Preparación de anticuerpos anti-vSmo

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-vSmo. Los anticuerpos contra vSmo pueden prepararse como sigue. Ejemplos de anticuerpos incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos y los heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos vSmo pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. De forma típica, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectará en el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir la proteína vSmo o una proteína de fusión de lo mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero a inmunizar. Ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas que pueden utilizarse incluyen pero no se limitan a la hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de soja. También se puede utilizar un agente agregante como el alumbre para intensificar la respuesta inmune. Ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforilo Lípido A, dicorinomycolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede seleccionarse por un experto en la materia sin excesiva experimentación. A continuación, se puede sangrar el mamífero y analizar el suero para titular el anticuerpo. Si se desea, el mamífero puede re-estimularse para aumentar el título del anticuerpo o hasta que el título alcance la meseta en la curva de titulación.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos vSmo pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Éstos se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridomas, como los descritos por Kohler y Milstein, supra. En un procedimiento de hibridomas, se inmuniza (tal como se ha descrito más arriba) generalmente un ratón, un hámster, u o otro animal huésped adecuado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente con el agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluirá de forma característica la proteína vSmo o una proteína de fusión de ésta. Las células que expresan vSmo en su superficie pueden también utilizarse. Por lo general, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si las células que se requieren son las de origen humano, o células del bazo o del nódulo linfático si se utilizan otras fuentes de mamíferos no-humanos. Los linfocitos se fusionan a continuación con una línea celular inmortalizada utilizando un agente fusionante adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son normalmente células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Generalmente, se utilizan líneas de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá de forma característica hipoxantina, aminopterina y timidina (medio "HAT"), sustancias que evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan niveles elevados de expresión estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano también se han descrito como productoras de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

A continuación puede analizarse el medio de cultivo de las células de hibridoma para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra vSmo. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante procedimientos estándares [Goding, supra]. El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, Dulbecco's Modified Eagle's Medium y RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas en el animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o el fluido de ascitas mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como, por ejemplo, la proteína A-Sepharose, la cromatografía de hidroxilapatita, la electroforesis en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden generarse mediante procedimientos del DNA recombinante, como los descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y secuenciarse mediante procedimientos convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en los vectores de expresión, que a continuación son transfectados en las células huésped como p.ej., las células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma, que de otra no producirían la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El DNA también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homólogas [patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., supra] o mediante unión covalente con la secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no-inmunoglobulínico. Dicho polipéptido no-inmunoglobulínico puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o por los dominios variables de un sitio de combinación antigénica de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y de la cadena pesada de modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc, de modo que se previene la unión de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo aminoacídico o se delecionan para evitar la unión.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de éstos, en particular, los fragmentos Fab, puede lograrse utilizando técnicas de rutina bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la digestión puede realizarse utilizando papaína. Ejemplos de digestión con papaína se describen en la patente internacional WO 94/29348, publicada el 22 del 12 de 1994 y la patente americana U.S. 4.342.566. La digestión de papaína de los anticuerpos produce típicamente dos fragmentos de unión con el antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un sitio de unión antigénica único, y un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación antigénica y es todavía capaz de unirse al antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación presente para Fab' la que los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' con cisteínas de la bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplantes químicos de fragmentos de anticuerpos.

3. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos vSmo de la invención comprenden además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de éstos (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no-humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se han reemplazado los residuos de una región de determinación de la complementariedad (CDR) del receptor por residuos de una CDR de una especie no-humana (anticuerpo donante) como el ratón, rata o conejo y que tienen la especificidad, afinidad y capacidad requeridas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no-humanos correspondientes. Los anticuerpos también comprenden residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o de entramado importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos o al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden a los de una inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina. El anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321:322-5325 (1986); Reichmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los procedimientos para la humanización de anticuerpos no-humanos son bien conocidos en la materia. Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos procedentes de una fuente no-humana. Estos residuos aminoacídicos no-humanos son referidos a menudo como residuos de "importación", los cuales se toman generalmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse generalmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeven y col., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante sustitución de las CDRs de roedor o las secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Según ello, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana U.S. 4.816.567), en donde esencialmente menos de un dominio variable humano se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no-humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los que residuos CDR y posiblemente residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la generación de anticuerpos humanizados es de suma importancia con el fin de poder reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento del "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se hibrida con la librería entera de secuencias de dominio variable conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la de roedor es la que se acepta como la secuencia de entramado humana (FR) para el anticuerpo humanizado [Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. Otro procedimiento utiliza una secuencia de entramado particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo determinado de cadenas ligeras y pesadas. La misma secuencia de entramado puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados distintos [Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sic. USA, 89:4285 (199); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)].

Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con el procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles generalmente y son familiares a los expertos en la materia. Los programas informáticos están disponibles e ilustran y muestran las estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos modelos permite analizar el papel más probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR se pueden seleccionar y combinarse a partir de las secuencia consenso y la secuencia importada para lograr la característica deseada del anticuerpo, como una afinidad aumentada por el antígeno(s)
diana. En general, los residuos CDR están directa y más esencialmente implicados en influenciar la unión con el antígeno [véase, la patente internacional WO 94/04679, publicada el 3 de Marzo de 1994].

Se pueden utilizar animales transgénicos (p.ej., ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del anticuerpo del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpos. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo antigénico [véase, p.ej., Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., year in Immuno., 7:33 (1993)]. Los anticuerpos humanos pueden también producirse en librerías de expresión de fagos de anticuerpos [Hoogenboom y Winter, J.Mol. Biol. 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cote y col., y Boerner y col., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cote y col., Monoclonal Antibodies y Cancer Therapy, Alan R Liss. P. 77 (1985) y Boemer y col., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)].

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, con especificidades de unión por al menos dos antígenos distintos. En el caso presente, una de las especificidades es para vSmo, la otra es para cualquier antígeno, y preferentemente para una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Los procedimientos para la generación de anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. De forma tradicional, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas pesada/ligera de inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas pesadas especificidades distintas [Millstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la variedad de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra generalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en la patente internacional WO 93/08829, publicada el 13 de Mayo de 1993 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con una aproximación distinta y más preferida, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de una inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra y las regiones CH2 y CH3. Es preferible que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en organismos huésped adecuados. Esto proporciona una gran flexibilidad para el ajuste de proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones cuando se utilizan proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción para obtener rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados o cuando las proporciones tienen una significación particular. En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina con una especificidad de unión en un brazo, y un par de cadenas pesada/ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica para una más fácil separación. Esta aproximación se describe en la patente internacional WO 94/04690 publicada el 3 de Marzo de 1994. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se hallan dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto que dichos anticuerpos, por ejemplo, se dirijan contra células del sistema inmune [patente americana U.S. 4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [patentes internacionales WO 91/00360, WO 92/200373; patente europea EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente americana U.S. 4.676.980.

6. Utilización de anticuerpos anti-vSmo

Los anticuerpos anti-vSmo se pueden utilizar en ensayos diagnósticos para vSmo, p.ej., para detectar su expresión en células o tejidos específicos. Se pueden utilizar diversas técnicas de ensayo diagnóstico conocidas en la materia, como los ensayos de unión competitiva, los ensayos sándwich directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación conducidos en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos diagnósticos pueden marcarse con una porción detectable. La porción detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, como el H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35} o I^{125}, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como el isotiocionato de fluoresceína, la rodamina, la luciferina, o una enzima, como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa la peroxidasa de rábano. Cualquier procedimiento conocido en la materia para la conjugación del anticuerpo con la porción detectable puede utilizarse, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13, 1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos anti-vSmo también son útiles para la detección o purificación por afinidad de vSmo del cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra vSmo se inmobilizan en un soporte adecuado, como una resina de Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contenga vSmo, y a continuación el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará esencialmente todo el material en la muestra excepto la proteína vSmo, el cual se une al anticuerpo inmobilizado. Por último, se lava el soporte con otro solvente adecuado que liberará la proteína vSmo del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-vSmo también pueden emplearse como terapéuticos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-vSmo pueden utilizarse para bloquear o neutralizar el exceso de señalización de vSmo que puede resultar de Patched mutante o inactivada. Según ello, los anticuerpos anti-vSmo pueden utilizarse en el tratamiento de, o en la mejora de los síntomas causados por una condición patológica resultado de o asociada al exceso de vSmo o la señalización de vSmo. Opcionalmente, se pueden utilizar anticuerpos vSmo agonistas para inducir la formación o aumentar o estimular la regeneración tisular, como por ejemplo la regeneración de tejido epitelial, pulmonar, muscular (como el corazón o el músculo esquelético), neural (como las neuronas serotonérgicas, motoneuronas o efectoras), óseo o tejido del intestino. Esta terapia con anticuerpos para vSmo será de utilidad en aquellos casos donde el tejido esté lesionado por la enfermedad, edad o trauma.

Los anticuerpos anti-vSmo pueden utilizarse o administrarse a un paciente en un vehículo aceptable farmacéuticamente. Vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing co., editado por Oslo y col. Si los anticuerpos anti-vSmo se han de administrar a un paciente, los anticuerpos pueden administrarse mediante inyección (p.ej., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular), o mediante procedimientos como la infusión que aseguran la liberación a la circulación sanguínea en una forma efectiva. Las dosificaciones efectivas y los programas para administrar los anticuerpos anti-vSmo pueden determinarse empíricamente. Todo ello es competencia del experto en la materia, sobreentenderán que la dosificación de anticuerpos anti-vSmo que debe administrarse variará dependiendo de, por ejemplo, el paciente que recibe los anticuerpos, la vía de administración y otros agentes terapéuticos que se administren al mamífero. La guía para seleccionar la dosis apropiada para dichos anticuerpos anti-vSmo se halla en la literatura sobre la utilización terapéutica de anticuerpos, p.ej., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone y col., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 y pp. 303-357; Smith y col., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber y col., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. Una dosificación diaria típica de los anticuerpos anti-vSmo utilizada sola puede hallarse en el intervalo aproximado de 1 \mug/Kg hasta 100 mg/Kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

C. Equipos que contienen vSmo o anticuerpos anti-vSmo

En otra realización de la invención, se proporcionan artículos de fabricación y equipos que contienen vSmo o anticuerpos anti-vSmo. El artículo de fabricación comprende de forma característica un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de diversos materiales como el vidrio o el plástico. El recipiente contiene vSmo o los anticuerpos anti-vSmo. La etiqueta del recipiente puede indicar las instrucciones para su utilización in vivo o in vitro, tal como se han descrito más arriba.

El equipo de la invención comprenderá de forma característica el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes que contendrán materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros y paquetes incluidos con instrucciones para su uso.

D. Composiciones adicionales de importancia

En una realización adicional de la invención, se proporcionan complejos proteicos que comprenden la proteína Smoothened de vertebrados y proteína Patched de vertebrados. Tal como se demostró en los Ejemplos, Smoothened de vertebrados y Patched de vertebrados pueden formar un complejo. Dicho complejo proteico también puede incluir la proteína Hedgehog de vertebrados. En un complejo de estas características, Hedgehog de vertebrados se une a Patched de vertebrados pero no a Smoothened de vertebrados. En una realización preferida, el complejo que comprende Smoothened de vertebrados y Patched de vertebrados es un receptor para Hedgehog de vertebrados.

Patched de vertebrados se une a Smoothened de vertebrados. Opcionalmente, Patched de vertebrados comprende una secuencia que es un derivado de o un fragmento de una secuencia nativa de Patched de vertebrados. Éste último consiste generalmente en una secuencia que tiene al menos un 100% de identidad de secuencia con Patched de vertebrados de secuencia nativa. En una realización, Patched de vertebrados se une directa y específicamente a Smoothened de vertebrados. Alternativamente, se contempla que Patched de vertebrados pueda unirse con Smoothened de vertebrados indirectamente.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo únicamente, y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención de ninguna manera.

Todas las referencias citadas en la presente especificación se han incorporado por su referencia en su totalidad.

Ejemplos

Todos los reactivos disponibles comercialmente referidos en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante salvo que se indique lo contrario. La fuente de las células en los ejemplos siguientes, y en la especificación, están identificadas por su número de acceso ATCC correspondiente al American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Ejemplo 1 Aislamiento y clonado del cDNA de Smoothened de rata

El cDNA de Smoothened de rata de tamaño completo se aisló mediante cribado por hibridación a baja astringencia de 1,2x106 calvas de una librería de cDNA de rata de embriones de 9-10 días (que contenía los cDNAs de tamaño seleccionado >1500 pb), utilizando la región codificante completa de Smoothened de Drosophila [Alcedo y col., supra] (marcado con dCTP-P^{32}) como una sonda. La librería se preparó clonando insertos de cDNA en la diana NotI de un vector RK18 lambda [Klein y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996)] seguido de la ligación con adaptadores XmnI. Las condiciones para la hibridación fueron: 5XSSC, 50% de formamida, 5X Denhardt, fosfato sódico 50 mM (pH 6,5), 5% de sulfato de dextrano, 0,1% de SDS y 50 \mug/ml de DNA de esperma de salmón, durante la noche a 42ºC. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron a una astringencia de 1xSSC a 42ºC y se expusieron durante la noche a una película Kodak X-AR. Se seleccionaron 3 de los 8 positivos para posterior purificación. Después de la amplificación de los fagos purificados de las calvas, se generaron productos de excisión de los fagémidos mediante crecimiento del fago auxiliar M13 (M13K07; obtenido de New England Biolabs), las bacterias (BB4; obtenido de Stratagene), y junto con los fagos purificados en una proporción de 100:10:1. Se recuperó el DNA plasmídico mediante purificación de Qiagen a partir de colonias resistentes a ampicilina tras la infección de BV4 con el fagémido purificado y excisado.

La secuenciación de los tres cDNAs mostró que que eran idénticos, excepto que dos contenían sólo una secuencia parcial, mientras que el tercero contenía la pauta de lectura abierta completa de Smoothened de rata, incluyendo 449 y 1022 nucleótidos, respectivamente en las secuencias 5' y 3' no traducidas y una cola poliA. Este clon de cDNA se secuenció completamente por ambas cadenas.

La secuencia nucleotídica completa de Smoothened de rata (rSmo) se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:1) (referencia también especificada para las solicitudes al depósito de ATCC de Smoothened de rata en pRK5.rsmo.AR140, denominado ATCC Dep. No. 98165). El cDNA contenía una pauta abierta de lectura con un sitio de inicio de la transcripción asignado al codón ATG en las posiciones nucleotídicas 450-452. El marco abierto de lectura en el codón finaliza en las posiciones nucleotídicas 2829-2831.

La secuencia aminoacídica predicha de Smoothened de rata (rSmo) contiene 793 aminoácidos (incluyendo un péptido señal de 32 aminoácidos), tal como se muestra en la figura 1 (SEC ID NO:2). La proteína rSmo parece ser un receptor típico acoplado a proteína G de siete fragmentos transmembrana (7 TM), que contiene 4 sitios de N-glicosilación potenciales y un dominio amino-terminal extracelular putativo de 203 aminoácidos de largo que contiene 13 cisteínas espaciadas estereotípicamente (véase la Fig. 2).

Un alineamiento de la secuencia rSmo con secuencias para dSmo, receptor de wingless y Frizzled de vertebrados demostró que rSmo es homólogo en un 33% con la secuencia dSmo publicada en Alcedo y col., supra (homólogo al 50% en los dominios transmembrana); homólogo al 23% respecto a la secuencia del receptor de wingless publicada en Bhanot y col., supra; y un 25% de homología con la secuencia de Frizzled de vertebrados publicada por Chan y col., supra.

Ejemplo 2 Hibridación in situ y análisis de transferencia de Northern

La hibridación in situ y el análisis de transferencia de Northern se realizaron para examinar la distribución tisular de Smo, Patched y SHH en tejidos embrionales y adultos de rata.

Para la hibridación in situ, se utilizaron embriones de rata E9-E15,5 (Hollister Labs) que se fijaron toda la noche a 4ºC en una solución de paraformaldehído al 4%, luego se crioconservaron en una solución de sacarosa al 20% durante la noche. Los cerebros y médulas espinales de ratas adultas se congelaron en fresco. Todos los tejidos se seccionaron a 16 \mum y se procesaron para la hibridación in situ utilizando sondas de RNA marcadas con UTP-P^{32} tal como se describe en Treanor y col., Nature, 382:80-83 (1996). Las sondas sentido y antisentido se derivaron de la región N-terminal de rSmo utilizando la T7 polimerasa. La sonda utilizada para detectar SHH fue la antisentido de bases 604-1314 de SHH de ratón [Echelard y col., Cell, 75:1417-1430 (1993)]. La sonda utilizada para detectar Patched fue la antisentido de 502-1236 bases de Patched de ratón [Goodrich y col., supra]. El análisis de la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa se realizó tal como se describe en Treanor y col., supra.

Para el análisis de transferencia de Northern, se hibridó una transferencia de Northern de diversos tejidos de rata (Clontech) y se lavó a elevada astringencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando una sonda marcada con dCTP-P32 que abarca la toda región codificante de rSmo.

Los resultados se ilustran en la Figura 3. Mediante hibridación in situ y análisis de transferencia de Northern, se detectó la expresión del mRNA de rSmo a partir de embriones E9 en adelante en tejidos que respondían a SHH como los pliegues neurales y el tubo neural temprano [Echelard y col., supra, Krauss y col., supra); Roelink y col., supra], en el mesodermo presomítico y somitas (Johnson y col., supra; Fan y col., supra], y el los primordios del desarrollo de extremidades [Riddle y col., supra], los intestinos (Roberts y col., supra) y en el ojo (Krauss y col., supra). También se hallaron transcritos Smo en tejidos cuyo desarrollo está regulado por otros miembros de la familia de proteínas HH como los testículos (HH Desert) [Bitgood y col., Curr. Biol., 6:298-304 (1996)], cartílago (HH Indian) [Vortkamp y col., Science, 273:613-622 (1996)], y el músculo (el pez zebra, HH echinidia)[Currie e Inghma, Nature, 382:452-455 (1996)] (véase p.ej., la Fig. 3; otros resultados no mostrados). En todos los tejidos citados anteriormente, rSmo se co-expresa con rPatched.

Los mRNAs de rSmo y rPatched también se hallaron en y alrededor de las células que expresaban SHH en los tejidos embrionales de pulmón, epiglotis, timo, columna vertebral, lengua, mandíbula, primordios gustativos y dientes (Fig. 3). En el sistema nervioso embrional, rSmo y rPatched se expresaban inicialmente a través de la placa neural: E12, sin embargo, su expresión decrece en las regiones laterales del tubo neural y en P1, se restringe a las células relativamente próximas a la zona ventricular (Fig. 3). En el tejido de rata adulta, la expresión de rSmo se mantiene en el cerebro, pulmón, riñón, testículos, corazón y bazo (resultados no mostrados).

Ejemplo 3 Aislamiento y clonaje del cDNA de Smoothened humana

Una sonda de cDNA que corresponde con la región codificante del gen smoothened de rata (descrita en el Ejemplo 1 anterior) se marcó mediante el procedimiento de hexanucleótidos aleatorios y se utilizó para cribar 10^{6} clones de una librería de cDNA de pulmón embrional humano (Clontech, Inc.) en \lambdagt10. Los filtros duplicados se hibridaron a 42ºC en formamida al 50%, 5XSSC, 10X Denhardt, fosfato sódico 0,05 mM (pH 6,5), pirofosfato sódico al 0,1% y 50 mg/ml de DNA de esperma de salmón. Los filtros se lavaron 2XSSC y luego en 0,5XSSC, SDS al 0,1% a 42ºC. Los fagos que hibridaron se purificaron de las calvas y los insertos de cDNA se subclonaron en pUC118 (New England Biolabs). Dos clones, 5 y 14, que tenían insertos solapantes de aproximadamente 2 y 2,8 Kb, respectivamente, cubrían toda la secuencia codificante de Smoothened humana (véase Fig. 4). Los clones 5 y 14 se han depositado por los solicitantes en el ATCC como puc.118.hsmo.5 y puc.118.hsmo.14, respectivamente, y se les ha asignado el número ATCC Dep. 98162 y 98163, respectivamente. Ambas cadenas se secuenciaron mediante procedimientos de fluorescencia estándares en un secuenciador automátizado ABI377.

La secuencia nucleotídica completa de la Smoothened humana se muestra en la Figura 4 (SC ID NO:3). El cDNA contenía una pauta de lectura abierta con un sitio de inicio de la traducción asignado en el codón ATG en la posición nucleotídica 13-15. La pauta de lectura abierta finaliza en el codón de finalización en las posiciones nucleotídicas 2374-2376.

La secuencia aminoacídica predicha de la Smoothened humana (hSmo) contiene 787 aminoácidos (incluyendo un péptido señal de 29 aminoácidos), tal como se muestra en la Figura 4 (SEC ID NO:4). La hSmo parece ser un recptor típico de membrana, acoplado a proteínas G, con siete regiones transmembrana (7 TM), que contiene 5 sitios potenciales de N-glicosilación y un dominio amino-terminal putativo de 202 aminioácidos de largo con 13 cisteínas espaciadas estereotípicamente.

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas predichas de hSmo y rSmo (véase el Ejemplo 1) demostró un 94% de identidad de secuencia aminoacídica. Un alineamiento de la secuencia de hSmo con las secuencias de dSmo, receptor de wingless y Frizzled de vertebrados demostró que hSmo tenía una homología del 33% con la secuencia publicada para dSmo por Alcedo y col., supra (50% homólogía en los dominios transmembrana); 23% de homología con la secuencia del receptor de wingless publicado por Bhanot y col., supra; y 25% de homología con la secuencia de Frizzled de vertebrados publicado por Chan y col., supra. Véase la Fig. 5 para una comparación de las secuencias de Smo de rata y Smo de Drosophila.

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Ejemplo 4 Ensayos de unión competitiva, co-inmunoprecipitación y unión cruzada

Los ensayos de unión competitiva, co-inmunoprecipitación y unión cruzada se realizaron para caracterizar la asociación física o la unión entre SHH y rSmo, y entre ciertas formas activas biológicas de SHH y las células que expresan rSmo, mPatched, o ambas, rSmo y mPatched.

1. Materiales y métodos

Los DNAs complementarios para rSMo (descritos en el Ejemplo 1); dSMo (descritos en Alcedo y col., supra); HH Desert (descrito en Echelard y col., supra); y Patched murina (descrito en Goodrich y col., Supra) se clonaron en vectores pRK5, y las etiquetas epitópicas [etiqueta epitópica Flag (Kodak/IBI) y etiqueta epitópica Myc (epitope 9E10; Invitrogen)] se añadió al extremo C-terminal mediante mutagénesis basada en PCR.

SHH-N es la porción amino-terminal activa biológicamente de SHH [Lee y col., Science, 266:1528-1537 (1994)]. SHH-N se produjo tal como por Hynes y col., supra. Se utilizó una forma marcada isotópicamente de SHH-N, SHH-N-I^{125}.

Para la producción de IgG-SHH-N, se transfectaron transitoriamente células 293 de riñón embrionario humano con el vector de expresión que codifica SHH-N fusionado en la misma pauta de lectura del residuo aminoacídico 198 de la porción Fc de la IgG gamma humana.

Las células se mantuvieron en medio sin suero (OptiMEM; Gibo BRL) durante 48 horas. El medio se recolectó a continuación y se concentró 10 veces utilizando una membrana centricon-10. El medio condicionado se utilizó a una concentración de 2X.

Los ensayos de unión se condujeron para probar la unión entre las células que expresan rSmo y dSmo y (1) SHH-N etiquetada epitópicamente, (2) una quimera de IgG-SHH-N, y (3) HH Desert etiquetada epitópicamente.

Para la visualización de la unión de SHH, células COS-7 (Genentech, Inc.) que expresaban transitoriamente rSmo o mPatched (Patched murina) se expusieron a SHH-N etiquetada epitópicamente (2 horas a 4ºC), se lavaron 4 veces con PBS, luego se fijaron y se tiñeron con IgG anti-humana conjugada con cy3 (Jackson ImmunoResearch) (para IgG-SHH-N) o un anticuerpo anti-Flag M2 (Kodak(IBI) (para SHH-N etiquetada con Flag).

Para la inmunohistoquímica, células COS-7 transfectadas transitoriamente con las construcciones de expresión se fijaron (10 minutos en paraformaldehido al 2%/Triton-X 100 al 0,2%) y se tiñeron utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Flag M2 (IBI) o un anticuerpo anti-Myc (Invitrogen), seguido de un anti-ratón IgG conjugado con cy3 (Jackson ImmunoResearch).

Para el análisis de unión cruzada, se resuspendieron las células a una densidad de 1-2x10^{6}/ml en medio L15 enfriado en hielo que contenía BSA al 0,1% y 50 pM de SHH marcada con I^{125} (con o sin un exceso de 1000x de SHH no marcada) y se incubaron a 4ºC durante 2 h. Se añadió 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida HCl 10 mM y N-hidroxisulfosuccinimida 5 mM (Pierce Chemical) a las muestras y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se lavaron a continuación 3 veces con 1 ml de PBS. Las células se lisaron en tampón de lisis [Brij-96 al 1% (Sigma), Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, aprotinina 10 \muM, leupeptina 10 \muM] y los complejos proteicos se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra las etiquetas epitópicas tal como se indicó. Las proteínas inmunoprecipitadas se resuspendieron en el tampón de muestra (Tris-HCl 80 mM, pH 6,8), glicerol al 10% (v/v), SDS al 1% (p/v), azul de Bromofenol al 0,025%, se desnaturalizaron y se migraron en geles de SDS-poliacrilamida al 4%, que luego se secaron y se expusieron a una película.

Para los análisis de unión en equilibrio, las células se procesaron como antes, y se incubaron con 50 pM de SHH-I^{125} y diversas concentraciones de SHH-N frío (Cold Ligand). Se utilizó el programa IGOR para determinar K_{d}.

2. Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 6. No se observó ninguna unión de SHH-N etiquetada con epitopo de la proteína quimérica IgG-SHH-N o de HH Deserte etiquetada con epitopo con las células que expresan rSmo o dSmo (Figuras 6a-b y resultados no mostrados). Estos resultados (y los resultados descritos más abajo) indican que rSmo, actuando sola, no es probablemente un receptor para SHH ni HH Deserte. Sin embargo, se hipotetizó que rSmo es un componente de un complejo de receptor SHH de multi-subunidades y que la función de ligando de este complejo de receptor se proporcionaría por otra proteína de membrana como Patched.

Los ensayos de unión también condujeron a analizar la unión entre células que expresan rSmo o Patched murina y (1) SHH etiquetada con epitopo y (2) una quimera IgG-SHH-N. Los resultados muestran que SHH-N etiquetada con epitopo así como una proteína quimérica IgG-SHH-N se unen específicamente a las células que expresan Patched murina (mPatched) (mPatched es 33% idéntica a Patched de Drosophila) (Figura 6c-e). Además, sólo Patched podría ser inmunoprecipitada por la proteína IgG-SHH-N (Figura 6f) y los anticuerpos contra mPatched etiquetada epitópicamente coinmunoprecipitaron fácilmente SHH-N-I^{125} (Fig. 6h) (los anticuerpos contra rSmo no pudieron inmunoprecipitar SH-N-I125 y la quimera IgG-SHH-N no imunoprecipitó rSmo).

Tal como se muestra en la Fig. 6g, el ensayo de unión cruzada de SHH-N-I^{125} con las células que expresan rSmo o mPatched en presencia o ausencia de SHH-N frío demostró que SHH-N-I^{125} se une de forma cruzada a células que expresan mPatched.

El ensayo de unión competitiva de SHH-N-I^{125} y las células que expresan mPatched o mPatched más rSmo también mostraron que mPatched y SHH-N tenían una afinidad relativamente alta de interacción (aproximadamente una K_{d} de 460 pM) (Fig. 6i). Esto corresponde bien a la concentración de SHH-N que se requiere para inducir respuestas biológicas en sistemas múltiples [Fan y col., Hynes y col., supra; Roelink y col., supra]. No se observó unión con las células que expresaban rSmo sólo (resultados no mostrados) y no hubo un aumento de la afinidad de unión a mPatched en presencia de rSmo.

Ejemplo 5 Ensayos de co-inmunoprecipitación

Para determinar si Patched y Smo forman o interactúan en un complejo físico, se realizaron experimentos de co-inmunoprecipitación.

1. Materiales y Métodos

Para la inmunonhistoquímica doble, células COS-7 transfectadas transitoriamente con construcciones de expresión se permeabilizaron con Triton-X 100 al 0,2%. Las células se fijaron (10 minutos en paraformaldehído al 2%/Triton-X 100 al 0,2%) y se tiñeron utilizando el anticuerpo anti-Flag M2 monoclonal (IBI) y los anticuerpos primarios anti-Myc (Santa Cruz Biotech), seguido de anti-ratón IgG conjugado con cy3 (Jackson ImmunoResearch) y anticuerpos secundarios anti-conejo IgG conjugados con BODIPY (Molecular Probes, Inc.) .

Las células 293 de riñón embrionario humano se transfectaron transitoriamente con vectores de expresión para rSmo etiquetada con epitopo (epitopo Flag) y mPatched (epitopo Myc) y los complejos proteicos resultantes se inmunoprecipitaron con el anticuerpo contra uno de los epitopos y luego se analizaron en una transferencia de western.

Para el ensayo de co-inmunoprecipitación, los lisados de células de riñón embrionario 293 que expresaban transitoriamente rSmo etiquetada con Flag, mPatched etiquetada con Myc o una combinación de las dos proteínas se incubaron (48 horas después de la transfección) en presencia o ausencia de la quimera IgG-SHH-N (1 \mug/ml, 30 minutos a 37ºC) o en presencia de SHH-N-I^{125} con o sin un exceso de SHH-N fría (2 horas a 4ºC9. Las muestras incubadas se lavaron a continuación 3 veces con PBS y se lisaron en tampón de lisis (véase el Ejemplo 4), tal como se describe por Davis y col., Science, 259:1736-1739 (1993). Los lisados celulares se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos y los complejos proteicos solubles se inmunoprecipitaron con proteína A Sepharose (para la IgG-SHH-N) o anticuerpos anti-Flag o anti-Myc seguido por proteína A Sepharose (para rSmo o mPatched etiquetado con epitopo, respectivamente).

Las muestras se calentaron a 100ºC durante 5 minutos en tampón de muestra con SDS desnaturalizante (Tris 125 mM, pH 6,8, SDS al 2%, glicerol al 10%, \beta-mercaptoetanol 100mM, azul de bromofenol al 0,05%) y se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas se detectaron bien mediante exposición del gel seco a una película (para SHH-N-I^{125}) o mediante transferencia a nitrocelulosa e hibridación con anticuerpos contra epitopos Flag o Myc utilizando el sistema de detección ECL (Amersham).

2. Resultados

Los resultados se muestran en la figura 7. En las células que expresan sólo mPatched o rSmo, no se observó co-inmunoprecipitación de los complejos proteicos. Por el contrario, en las células que expresaban tanto mPatched como rSmo (Fig. 7a), rSmo se co-inmunoprecipitó fácilmente con anticuerpos contra mPatched etiquetado con epitopo (Fig. 7b) y mPatched se co-inmunoprecipitó con anticuerpos contra rSmo etiquetado con epitopo (Fig. 7c).

La SHH-N-I125 co-inmunoprecipitó fácilmente por los anticuerpos contra rSmo etiquetada con epitopo o mPatched etiquetada con epitopo de las células que expresaban tanto rSmo como mPatched, pero no de las células que expresaban sólo rSmo (Figs. 7d y 7e). Estos resultados indican que SHH-N, rSmo y mPatched están presentes en el mismo complejo físico y que un complejo rSmo-SHH no se forma en ausencia de mPatched. Aunque no se conoce del todo y sin ceñirse a una teoría en particular, se cree que Patched es un componente de ligando de unión y vSmo es un componente de señalización en un receptor de SHH de multi-subunidades (véase Fig. 9). Patched también se cree que es un regulador negativo de vSmo.

Ejemplo 6

Hahn y col., supra, Johnson y col., supra, y Gailani y col., supra, publicaron que mutaciones de Patched se han asociado con BCNS y el carcinoma de células basales esporádico ("BCC"). Estos investigadores también publicaron que la mayor parte de las mutaciones de Patched en BCNS son truncaciones en las que no se produce proteína funcional. Se cree que BCNS y BCC pueden estar causados o asociados con la activación constitutiva de vSmo, después de liberarse de la regulación negativa inducida por Patched.

Se examinaron los niveles de expresión de Patched murina de tipo salvaje (nativa) y Patched mutante. Una Patched mutante se generó mediante mutagénesis dirigida del cDNA de Patched murino de tipo salvaje (descrito en el Ejemplo 4) y verificado por secuenciación. Patched mutante contenía una inserción de 3 aminoácidos (Pro-Asn-Ile) después del residuo 815 (este mutante se halló en una familia BCN, véase, Hahn y col., supra). Para el análisis de la expresión de proteínas, se transfectaron cantidades iguales de vectores de expresión PRK5 que contenían Patched de tipo salvaje o mutante en células 293, y por muestra se lisó una misma cantidad de células (2x10^{6}). Las proteínas se inmunoprecipitaron de los lisados celulares por el anticuerpo contra Patched etiquetado con epitopo (myc) y se detectaron en una transferencia de Western con el mismo anticuerpo.

Los solicitantes hallaron que la expresión de Patched mutante (que retiene una pauta de lectura abierta completa) se reducía al menos 10 veces comparada con la de tipo salvaje. Véase la Fig. 8.

Material depositado

Los siguientes materiales se han depositado en el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Material	Dep. No. ATCC	Fecha del depósito
Puc.118.hsmo.5	98162	6 de septiembre de 1996
Puc.118.hsmo.14	98163	6 de septiembre de 1996
pRK5.rsmo.AR140	98165	10 de septiembre de 1996

Este depósito se según las consideraciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patentes y sus Regulaciones (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito de 30 años desde la fecha del depósito. El depósito estará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo depositado para el público según la expedición de la patente americana pertinente o tras haber permanecido abierta al público de cualquier solicitud americana o extranjera, quien quiera que sea el primero y asegure una disponibilidad de la progenie al determinado por el Comisionado U.S. de Patentes y Marcas según el acuerdo 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisionado según lo acordado (incluyendo la 37\NAKCFR1.14 con la referencia especial a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud está de acuerdo en que si un cultivo de los materiales en depósito pereciera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán prontamente tras notificación con otro cultivo del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para la práctica de la invención en contravención con los derechos garantizados bajo la autoría de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La especificación escrita precedente se considera suficiente para permitir a un experto en la materia la práctica de la invención. La presente invención no está limitada en su ámbito por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una ilustración sencilla de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea equivalente funcionalmente se hallará dentro del ámbito de esta invención. El depósito del material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida aquí sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo, ni debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones las ilustraciones específicas que se presentan. Incluso, las diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y las descritas aquí serán evidentes a los expertos en la materia a partir de la descripción precedente y se hallan dentro del ámbito de las reivindicaciones anexadas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas Smoothened de vertebrados

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(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 4

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

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(B): CALLE: 460, Point San Bruno Blvd.

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(C): CIUDAD: South San Francisco

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: USA

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(F): CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO MEDIO: 3,5 pulgadas, 1,44 Mb disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE:WinPatin (Genentech)

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(vi): FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE SOLICITUD:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: Svpbpda, Craig G.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 39.044

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA DEL EXPEDIENTE: P1050PCT

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN

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(A): TELÉFONO: 415/225-1489

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(B): TELEFAX: 415/952-9881

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(C): TELEX:910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 3854 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: linear

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO:1:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 793 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: linear

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO:2:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2972 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: linear

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO:3:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 787 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: linear

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO:4:

Claims

1. Polipéptido Smoothened aislado que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con los residuos 1 a 787 de la SEC ID NO:4 o con los residuos 1 a 793 de la SEC ID NO:2.

2. Polipéptido Smoothened de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la identidad de secuencia es de al menos el 90%.

3. Polipéptido Smoothened de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la identidad de secuencia es de al menos el 95%.

4. Polipéptido Smoothened de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende los residuos 1 a 787 de la SEC ID NO:4.

5. Polipéptido Smoothened de acuerdo con la reivindicación 3, que consiste en los residuos 1 a 787 de la SEC ID NO:4.

6. Polipéptido Smoothened de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los residuos 1 a 793 de la SEC ID NO:2.

7. Polipéptido Smoothened de acuerdo con la reivindicación 6, que consiste en los residuos 1 a 793 de la SEC ID NO:2.

8. Molécula quimérica que comprende el polipéptido Smoothened de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 fusionado a una secuencia aminoacídica heteróloga.

9. Molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha secuencia aminoacídica heteróloga es una secuencia etiqueta epitópica.

10. Anticuerpo que se une específicamente con el polipéptido Smoothened de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

11. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, el cual es un anticuerpo monoclonal.

12. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, el cual es un anticuerpo neutralizante.

13. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, el cual es un anticuerpo agonista.

14. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, el cual es un anticuerpo antagonista.

15. Molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido Smoothened de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o la molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o la 9, o el anticuerpo de la reivindicación 11.

16. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, que codifica los residuos 1 a 787 de la SEC ID NO:4.

17. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, que codifica los residuos 1 a 793 de la SEC ID NO:2.

18. Vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.

19. Vector de acuerdo con la reivindicación 18, el cual está unido a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

20. Célula huésped que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 o el vector de la reivindicación 18 o la 19.

21. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, que es una célula procariota.

22. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, que es una célula de levadura.

23. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, que es una célula eucariota.

24. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, que es una célula CHO.

25. Proceso de producción del polipéptido Smoothened que comprende el cultivo de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24.

26. Proceso de acuerdo con la reivindicación 25 que además comprende la recuperación del polipéptido Smoothened del cultivo de células huéspedes.

27. Artículo de fabricación, que comprende un recipiente y una composición contenida en dicho recipiente, en donde la composición comprende un polipéptido Smoothened de acuerdo con las reivindicaciones 1-7.

28. Artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende además un recipiente y una composición contenida en dicho recipiente, en donde la composición comprende un anticuerpo anti-Smoothened de acuerdo con las reivindicaciones 10-14.

29. Artículo de fabricación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28, que además comprende las instrucciones para la utilización del polipéptido Smoothened y/o el anticuerpo anti-Smoothened in vivo o ex vivo.

30. Animal transgénico no-humano que contiene células que expresan el polipéptido Smoothened de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

31. Animal transgénico no-humano que contiene células que tienen un gen alterado que codifica el polipéptido Smoothened de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

32. Animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 30 o la 31, el cual es un ratón.

33. Animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 30 o la 31, el cual es una rata.

34. Complejo proteico que comprende la proteína Smoothened de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y una proteína Patched.

35. Complejo proteico de acuerdo con la reivindicación 34, que además comprende una proteína hedgehog.

36. Complejo proteico de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la proteína hedgehog se une a la proteína Patched, pero no se une a la proteína Smoothened.

37. Complejo proteico de acuerdo con la reivindicación 34 que es un receptor para una proteína hedgehog.