KR20130045779A - 미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법 - Google Patents
미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법에 대한 것이다. 본 발명의 미성숙 항체를 이용한 연속 검출장치 및 연속 검출방법을 이용하면, 분자량이 작은 물질을 연속적으로 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법에 대한 것이다.
질병에 관련된 지표물질에 대한 연속적인 측정에 대한 요구는 특히 원내 입원한 중환자의 경우 그 필요성이 증대되고 있으나 무한재활용이 가능한 인식소재의 확보와 장기간 센서운용 등 기술적 문제로 요구를 충족시키지 못하고 있다.
특히, 최근 들어 당뇨병 진단에 있어 연속혈당측정에 대한 연구가 매우 활발하며, 이것은 며칠(예: 최장 5일) 동안의 체내 혈당농도에 분포를 파악하여 혈당조절에 필요한 인슐린 투여 양 및 시기를 결정하고 평가하기 위함이다. 암 재발 진단의 경우 몇 달 간격으로 진행되고, 급성심근경색이나 패혈쇼크의 경우에는 몇 시간 간격으로 특이 분석물질에 대해 검사가 실시되는 데 비해, 혈당은 불과 몇 분 간격으로 검출하여 혈액 내 그 등락을 며칠 동안 모니터한 결과로부터 당뇨병의 진단이나 인슐린 주사의 효과 등을 검정한다(도 1 참조). 이와 같이, 혈당 농도의 변화속도는 섭취하는 음식물의 종류와 체내 인슐린 분비 등 개인차에 따라 다르지만 호발성 질환 마커 중 가장 빠르며 더욱이 그 연속진단은 당뇨병 진단 및 효과적인 치료를 위해 필요하다.
현재 상용화된 연속혈당측정 시스템에서는 1회용 혈당측정 스트립에서와 같이 glucose oxidase와 같은 효소반응을 이용하며 몇 분 간격으로 혈장 혹은 세포 간질액에 존재하는 혈당농도에 비례하여 발생하는 반응산물을 전기화학적으로 측정한다. 그러나 장기간 운용 시 효소의 부분적인 불활성화가 진행되어 센서의 기준선 변화가 지속적으로 일어나므로 측정 정확도가 낮아지는 문제점이 있다. 이러한 문제는 하루 3-4회 잦은 보정을 통해 어느 정도 완화될 수 있지만, 그 때 마다 말초혈액을 채취하고 1회용 스트립으로 혈당을 측정해야 하는 고통과 번거로움을 피할 수 없다.
이와 같은 효소를 이용하는 혈당센서에서의 문제점을 근본적으로 해결하고자 효소 대신에 당 부착단백질인 lectin 계열의 concanavalin A(Con A)를 인식소재로 이용하려는 시도가 최근에 활발히 연구되고 있으나, Con A는 체내에서 다양한 독성효과를 유발하는 것으로 알려져 있어서 이것을 이식형 바이오센서의 인식소재로 이용하는 데는 한계점이 있는 실정이다. 또 다른 당 부착단백질로서 glucose binding protein(GBP)을 혈당 인식소재로 채택하려는 시도도 최근에 활발히 연구되고 있으나, GBP를 장기간 혈당 모니터링에 적용하기 위해서는 임상조건하에서 측정재현성과 수명에 한계가 있다.
한편, 대한민국 특허등록 제0958198호 에는 가역반응특성과 고친화력을 동시에 지닌 인식성분을 이용한 실시간 연속 검출장치가 기재되어 있다. 상기 검출장치를 당과 같이 분자량이 작은 물질 검출에 이용하기 위해서는, 혈당 연속검출 시 요구되는 응답시간은 최종 반응 평형상태의 95% 도달 기준으로 약 10분 이내(L. K. Gilliam 등, Diabetes. Technol. The., Vol. 11, Page S75-82, 2009)를 충족시키기 위해, 인식성분으로 혈당 검출에 적합한 항체로, 탈착반응 속도상수(kd)가 1x10-2 sec-1 정도이며, 항원-항체 결합체의 반감기는 70초 정도인(G. Schreiber, Protein-protein interactions, Biomolecular Sensors, CRC Press. 2002) 항체를 제조해야 하나, 이와 같은 반응특성을 지닌 항체는 일반적인 방법으로는 얻기 어려운 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분자량이 작은 분석물질과 신속하게 부착반응 및 탈착반응 하는 새로운 인식소재를 생산하고 이를 센서표면에 고정시키거나 혹은 반투과성 막 등으로 제한된 액체상에 가두어 수행하는 연속검출방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 분석물질 검출용 미성숙 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 미성숙 항체를 이용한 연속검출장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 연속검출장치를 이용한 분석물질 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 분석물질 및 운반단백질을 중합시키는 단계; 상기 분석물질 및 운반단백질 중합체로 동물을 1회 또는 2회 면역화 시키는 단계; 상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 하이브리도마 세포주를 얻는 단계; 및 상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계를 포함하는 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 예에 따르면, 상기 분석물질과 운반단백질의 중합비율이, 1:1 내지 1:50 몰 비율일 수 있다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 분석물질 검출용 미성숙 항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 예에 따르면, 상기 분석물질은 분자량 5,000 이하인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예에 따르면, 상기 분석물질은 포도당일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 미성숙 항체는 분석물질과 가역반응을 하는 것 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 분석물질과 미성숙 항체반응시 부착속도상수(k a )는 1×103 Lmol-1sec-1 내지 1×107 Lmol-1sec-1이고, 탈착속도상수(k d )는 1×10-5 sec-1 내지 1×10-1 sec- 1 이며,평형부착상수(K A = ka/kd)가 1×105 L/mol 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 상기 미성숙 항체를 포함하는 분석물질의 연속 검출장치를 제공한다.
본 발명의 바람직한 예에 따르면, 상기 검출장치는 시료 유입 채널; 상기 미성숙 항체, 리간드 중합체 및 센서를 포함하는 시료 분석 사이트; 및 시료 배출 채널로 구성되며, 상기 미성숙 항체는 분석 사이트 내에 분산되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예에 따르면, 상기 시료 분석 사이트 내로 유입된 분석물질과 리간드 중합체는 상기 미성숙 항체에 대해 경쟁적으로 부착반응 하며, 상기 센서는 상기 미성숙 항체와 리간드 중합체간 반응으로부터 발생된 신호를 탐지하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 신호 세기가 시료 내 분석물질의 농도에 반비례하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 시료 분석 사이트는 시료 유입 채널과 반투과성 막으로 구분되는 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법을 제공한다: a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트 내로 주입시키는 단계; b) 상기 분석물질을 반투과성 막을 통하여 시료 분석 사이트 내로 유입시키는 단계; c) 상기 시료 분석 사이트 내에서 분석물질을 리간드 중합체와 가역반응성 인식성분에 대해 경쟁 반응시키는 단계; d) 상기 리간드 중합체와 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계; e) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 시료 분석 사이트 내의 분석물질이 반투과성 막을 통하여 유출되고 동시에 분석물질과 인식성분 간의 결합이 탈착되는 단계; f) 상기 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및 g) 상기 분석 사이트 내 가역반응성 인식성분과 리간드 중합체를 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 f) 단계를 반복함으로써 시료 내 분석물질의 농도 변화를 연속적으로 측정하는 단계.
본 발명에 따른 미성숙 항체는 분석물질 농도 변화에 따라 자발적으로 분석물질과 결합 혹은 해리하는 특성을 가지므로, 동일한 인식소재의 무한재활용이 가능하게 되고 따라서 시료 내 분석물질 농도의 연속적인 탐지가 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 인식소재 선별 시 상대 리간드와의 결합 및 해리에 있어서 요구되는 반응속도를 결정하는 각 종 진단마커의 반복 검출시간을 나타내는 도표이다.
도 2는 분자크기가 작은 물질에 대한 (가) 인식소재를 생산하기 위해 면역원으로 각각 다른 반응조건에서 제조한 분자량 10,000 덱스트란-KLH 중합체들; (나) 인식소재에 대한 리간드를 제조하기 위해 각각 다른 조건에서 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 리간드 중합체들; 및 (다) 말토트리오조-BSA 중합체들을 제조 후 조건에 따라 분자크기 변화를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 도 2의 분자량 10,000 덱스트란-KLH 중합체들을 면역원으로 생쥐에 일정 간격으로 주입한 면역횟수에 따라 동물로부터 채취한 항혈청의 반응성을 도 2의 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체를 리간드로 고정시킨 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 수행한 면역분석 결과를 나타내는 도표이다.
도 4는 생쥐의 미성숙 면역계로부터 유래된 단일클론 항체들(Glu #4, #26, 그리고 #45)의 반응특이성을 분석하기 위해 (가) 운반단백질; (나) 도 2의 말토트리오즈-BSA 중합체; (다) 도 2의 NaIO4 산화반응에 의해 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체; (라) 도 2의 DVS 교차결합에 의해 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체; 및 (마) 분자량 10,000 덱스트란을 각각 리간드로 고정시킨 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 수행한 면역분석 결과를 나타내는 표이다.
도 5는 항체클론 Glu #26의 분자량 1,000 덱스트란 리간드에 대한 부착 및 탈착 반응속도 특성을 비표지센서 시스템인 Octet Red를 이용하여 제조사에서 제공한 과정에 따라 분석한 도표 및 이로부터 결정한 항체의 반응속도상수이다.
도 6은 분자량 1,000 덱스트란 리간드가 고정된 센서를 Glu #26 항체(인식소재) 용액에 담가 구성한 면역센서의 포도당 분석원리 및 비표지센서 시스템 Octet Red를 이용하여 구축한 혈당 면역센서의 농도응답을 나타낸 도표이다.
도 7은 도 6에서 구축한 혈당 면역센서의 농도응답 재현성을 포도당 부재 시 그리고 농도변화 시에 측정하여 나타낸 도표이다.
도 2는 분자크기가 작은 물질에 대한 (가) 인식소재를 생산하기 위해 면역원으로 각각 다른 반응조건에서 제조한 분자량 10,000 덱스트란-KLH 중합체들; (나) 인식소재에 대한 리간드를 제조하기 위해 각각 다른 조건에서 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 리간드 중합체들; 및 (다) 말토트리오조-BSA 중합체들을 제조 후 조건에 따라 분자크기 변화를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 도 2의 분자량 10,000 덱스트란-KLH 중합체들을 면역원으로 생쥐에 일정 간격으로 주입한 면역횟수에 따라 동물로부터 채취한 항혈청의 반응성을 도 2의 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체를 리간드로 고정시킨 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 수행한 면역분석 결과를 나타내는 도표이다.
도 4는 생쥐의 미성숙 면역계로부터 유래된 단일클론 항체들(Glu #4, #26, 그리고 #45)의 반응특이성을 분석하기 위해 (가) 운반단백질; (나) 도 2의 말토트리오즈-BSA 중합체; (다) 도 2의 NaIO4 산화반응에 의해 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체; (라) 도 2의 DVS 교차결합에 의해 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체; 및 (마) 분자량 10,000 덱스트란을 각각 리간드로 고정시킨 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 수행한 면역분석 결과를 나타내는 표이다.
도 5는 항체클론 Glu #26의 분자량 1,000 덱스트란 리간드에 대한 부착 및 탈착 반응속도 특성을 비표지센서 시스템인 Octet Red를 이용하여 제조사에서 제공한 과정에 따라 분석한 도표 및 이로부터 결정한 항체의 반응속도상수이다.
도 6은 분자량 1,000 덱스트란 리간드가 고정된 센서를 Glu #26 항체(인식소재) 용액에 담가 구성한 면역센서의 포도당 분석원리 및 비표지센서 시스템 Octet Red를 이용하여 구축한 혈당 면역센서의 농도응답을 나타낸 도표이다.
도 7은 도 6에서 구축한 혈당 면역센서의 농도응답 재현성을 포도당 부재 시 그리고 농도변화 시에 측정하여 나타낸 도표이다.
본 발명은 분자량이 작은 분석물질과 신속하게 부착반응 및 탈착반응 하는 새로운 인식소재 및 이를 이용한 분석물질의 연속검출에 대한 것이다. 본 발명에 따르면, 분석물질 농도 변화에 따라 자발적으로 분석물질과 결합 혹은 해리하는 인식소재를 진단에 이용하므로, 동일한 인식소재의 무한재활용이 가능하게 되고 따라서 시료 내 분석물질 농도의 연속적인 탐지가 가능하게 된다.
본 발명에서, 상기 분석물질이란 시료 분석 사이트에 포함되어 있는 센서를 사용하여 검출하고자 하는 목적으로 센서 표면으로 주입시키는 물질을 의미하며, 분자량 5,000 이하인 것일 수 있고, 구체적으로 시료 내 분석물질인 생명체 대사물질, 호르몬, 치료약, 마약, 핵산, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 분석물질은 포도당과 같이 크기가 작은 분석물질인 것이 바람직하다.
상기 인식소재란 상기 센서의 용액 내 분산 혹은 표면에 고정되어 있으면서 분석물질과 특이적으로 결합 가능한 물질로, 미성숙 항체, 항체, 수용체, 핵산, 효소, 앱타머, 펩타이드 또는 분자인쇄 인공막일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 상기 인식소재는 미성숙 항체일 수 있는데, 동물의 미성숙 면역계를 이용하여 항원에 대한 특이성이 높을 뿐 아니라, 분석물질과의 탈착속도가 높아 신속한 분석물질 검출이 가능하다. 동물의 미성숙 면역계를 이용한 미성숙 항체의 제조 과정을 대략적으로 설명하면 다음과 같다.
단백질이나 병원체와 같이 크기가 큰 외래물질(즉, 면역원)을 동물 체내에 주입 시 동물의 면역계는 그 물질을 제거하기 위해 외래물질을 독특하게 인지하는 항체를 생산한다. 면역반응 초기 항체들은 일반적으로 친화력이 낮지만 면역글로블린 M 타입의 분자들이 많아 다중결합에 의해 효과적으로 외래 침입에 대응한다. 동일한 외래물질이 반복하여 침입할 경우, 면역계는 성숙되는데 특히 과도 돌연변이(hypermutation) 기작을 통해 친화력이 높은 면역글로블린 G 타입의 항체를 생산한다.
이와 같이 면역계가 성숙됨에 따라 생산되는 항체의 친화력 변화는 물론 항원과 반응하는 항체의 부착 및 탈착속도의 변화도 관찰된다. 면역반응의 초기에는 즉, 외래물질이 대략 2-3주일 간격으로 3회 미만 침입 시 항원에 대한 반응속도 특히 탈착속도가 매우 빠른 항체들이 일반적으로 생산된다. 생산된 항체의 부착속도상수(k a )는 1×104 Lmol-1sec-1 내지 1×107 Lmol-1sec-1, 그리고 탈착속도상수(k d )는 ×10-3 sec-1 내지 1×10-2 sec-1 범위의 신속 반응특성을 가지는 것을 특징으로 한다. 그러나 3회 이상 반복적으로 면역반응이 유도되면 과도 돌연변이가 유발되고 이 과정에 의해 특히 항원과의 반응에서 탈착속도가 매우 느린 항체가 일반적으로 생산되기 시작한다. 이와 같은 면역계의 성숙과정에 따라 생산된 항체는 결국 친화력(KA = 부착속도상수(ka)/탈착속도상수(kd))이 현저히 증가되고 동시에 항원에 대한 특이성도 증가된다.
반응속도가 느린 기존 항체의 경우 특히, 탈착속도가 느린 경우가 대부분인데 이 항체는 분석물질과 결합 후 분석물질 농도가 낮아지더라도 결합체의 해리가 매우 느리거나 어렵다. 이러한 반응특성은 연속측정 시 매우 긴 응답시간을 초래하거나 혹은 해리를 가속시키기 위해 가혹조건(예: 산성 pH)의 사용이 불가피하여 실시간 검출이 원천적으로 불가능하게 된다.
그러나 미성숙 항체와 같이 부착 및 탈착 반응속도가 모두 높은 경우 분석물질의 농도에 따라 항체는 자발적으로 분석물질과 결합 혹은 결합체로부터 해리되므로 항체 및 항체를 이용한 센서의 연속재활용이 가능하게 된다. 더욱이 시료 내 농도변화가 급격한 분석물질 측정에 적용하는 경우 센서의 응답시간이 빨라지고 따라서 분석물질의 실시간 검출이 가능하게 된다.
본 발명의 상기 미성숙 항체는 분석물질과 가역반응을 하는 것 일 수 있다.
분석물질과 본 발명의 미성숙 항체반응시 부착속도상수(k a )는 1×103 Lmol-1sec-1 내지 1×107 Lmol-1sec-1이고, 탈착속도상수(k d )는 1×10-5 sec-1 내지 1×10-1 sec-1 이며,평형부착상수(K A = ka/kd)가 1×105 L/mol 이상인 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 (1) 분석물질 및 운반단백질을 중합시키는 단계; (2) 상기 분석물질 및 운반단백질 중합체로 동물을 1회 또는 2회 면역화 시키는 단계; (3) 상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 하이브리도마 세포주를 얻는 단계; 및 (4) 상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계를 포함하는 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법에 대한 것이다.
본 발명의 미성숙 항체 제조방법을 단계별로 설명하면, 다음과 같다.
(1) 분석물질 및
운반단백질을
중합시키는 단계
상기 분석물질은 위에서 정의한 바와 같으며, 상기 운반단백질은 KLH(keyhole lymphet hemocyanin), BSA(bovine serum albumin), 오브알부민(ovalbumin), 그리고 면역글로불린(immunoglobulin)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 분석물질과 운반단백질은 화학반응을 통해 중합될 수 있으며, 당분자를 산화시켜 단백질에 중합시키거나, 당과 단백질을 화학적으로 교차결합 시킬 수 있다. 구체적으로, 당 분자를 NaIO4로 산화시켜 단백질에 중합시키거나(M. Barbara Wilson 등, J. Immuno. Methods, Vol. 12, Page 171-181, 1976) divinyl sulfone(DVS) cross-linker로 당과 단백질을 화학적으로 교차결합 시키는 것일 수 있다(S. Liu 등, Langmuir, Vol. 18, Page 8350-8357, 2002).
상기 분석물질과 운반단백질의 중합비율은 1:4 내지 1:25 중량비인 것이 바람직하다.
또한, 분석물질과 운반단백질을 중합한 후, 정제하는 것이 바람직하다.
(2) 상기 분석물질 및
운반단백질
중합체로 동물을 1회 또는 2회
면역화 시키는
단계
상기 (1)에서 수득한 중합체로 동물(생쥐 등)을 일정 간격으로 면역화 시키고 그 면역횟수에 따라 동물로부터 채취한 항혈청 내 항체의 분석물질과의 반응성을 분석한다. 항혈청의 반응성이 감소하는 회차 이전에서의 면역화 된 동물의 미성숙 면역계로부터의 비장세포를 이용하여 하기 (3), (4) 단계를 수행한다.
구체적인 예로, 분석물질이 포도당이나 덱스타란일 경우, 2차 면역화까지 면역횟수에 비례하여 증가하지만 3차 면역화부터는 대부분 감소하는 추세를 나타낸다. 이러한 동물 체내 포도당에 대한 항체의 생성은 자기인식과 같은 현상이므로 과도 돌연변이가 일어나는 3차 면역화 시기부터는 거부되는 것으로 해석된다. 따라서 2회 면역화 된 동물의 미성숙 면역계로부터 얻어진 비장세포를 이용하여 하기 단계를 수행한다.
(3) 상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터
하이브리도마
세포주를 얻는 단계
상기 (2)에서 수득한 B-세포 등의 면역세포를 단일클론 생산 표준공정에 기반하여 암세포와 융합하고, HAT 스크리닝 과정에 의해 융합된 하이브리도마 세포를 획득할 수 있다.
단일클론 세포는 제한희석(limiting dilution) 과정을 통하여 획득할 수 있으며, 각 세포로부터 생산되는 단일클론 항체의 반응특성을 분석하기 면역분석을 실시하여, 분석물질과 특이적으로 반응하는 항체를 선별한다.
(4) 상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계
본 단계는 항원과 특이하게 반응하는 항체 중에서 항원의 농도변화에 따라 항원과의 부착 및 탈착이 신속한 가역반응성 항체를 선별하기 위한 과정이다.
본 단계에서는 실시간 반응결합을 추적할 수 있는 선별시스템을 이용할 수 있으며, 구체적으로 Bio-Layer Interferometry(BLI) 센서와 같은 비표지 센서가 장착된 선별시스템을 이용하여 부착 및 탈착 반응속도를 실시간으로 측정할 수 있다.
선별된 항체는 그 농도 변화(증가 혹은 감소)를 단지 원동력으로 비표지 센서에 고정된 항원과 반응하며 반응이 유도된 후 불과 수 분 내에 새로운 평형상태에 도달한다. 새로운 평형에 도달하는 요구 시간(최종 평형상태의 95% 기준)은 시료 내 분석물질의 농도 증감 속도와 의료진단의 경우 임상조건에 따라 변화된다(도 1 참조). 본 발명의 예시로서, 연속 혈당측정에 적합하도록 선별한 단일클론 항체(Glu #26)의 반응특성(부착반응속도상수(k a ), 탈착반응속도상수(k d ), 그리고 부착평형상수(KA = k a /k d ))을 도 5의 나에 제시하였다. 항체의 부착반응속도상수는 평균 4.15x104 M-1s-1, 탈착속도상수는 평균 1.10x10-2 s-1인데, 부착반응속도는 속도상수(k a )뿐만 아니라 반응물의 농도에 의해 조절되는 반면에 탈착반응속도는 단지 속도상수(k d )에 의해서만 결정된다. 따라서 혈당측정 시 요구되는 항체의 반응특성 중 매우 빠른 탈착속도상수가 가장 중요한 요소 중 하나이다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 분석물질 검출용 미성숙 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미성숙 항체를 포함하는 분석물질의 연속 검출장치에 대한 것이다.
상기 검출장치는 시료 유입 채널; 상기 미성숙 항체, 리간드 중합체 및 센서를 포함하는 시료 분석 사이트; 및 시료 배출 채널로 구성되며, 상기 미성숙 항체는 분석 사이트 내에 분산되어 있는 것일 수 있다.
상기 시료 분석 사이트 내로 유입된 분석물질과 리간드 중합체는 상기 미성숙 항체에 대해 경쟁적으로 부착반응 하며, 상기 센서는 상기 미성숙 항체와 리간드 중합체간 반응으로부터 발생된 신호를 탐지하는 것일 수 있다.
상기 경쟁적 부착반응의 한 예로서, 분석계는 BLI 비표지 센서 표면에 고정된 포획 리간드(덱스트란(11))-운반단백질(12) 중합체, 일정 농도의 당 특이항체(Glu #26(10)), 그리고 시료에 포함된 포도당(13)으로 구성된다(도 6, 가). 포획 리간드는 액체상의 당 특이항체에 부착반응하기 위해 표준시료 내에 포함된 포도당 분자(임상시료 농도범위: 10-1,000 mg/dL)와 경쟁한다. 따라서 시료 내 포도당 농도가 증가하면 포획 리간드에 대한 항체의 부착이 억제되므로 비표지 센서로부터의 신호는 감소하게 된다(도 6, 나). 결국, 센서 신호가 포도당 농도에 반비례하는 표준곡선을 얻을 수 있고, 이 표준곡선은 미지의 임상시료에 포함된 포도당 농도를 측정하기 위해 사용된다.
이와 같은 혈당검출 면역센서는 임상 농도범위의 포도당 측정에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 체내 혈당농도 변화를 추적하는데 필요한 센서의 응답속도도 충족시킬 수 있다. 특히, 당뇨 환자의 경우 식사 직후 포도당 농도는 전형적으로 2 mg dL-1min-1 속도로 증가한다. 연속 혈당측정 시 센서는 혈당 농도변화 속도와 같거나 더 빠른 응답속도를 나타내어야 실시간 모니터링이 가능하게 된다. 본 발명을 통해 생산된 당 특이항체(Glu #26)의 반응특성은(도 5, 나 참조) 포도당 측정을 위해 사용될 수 있는 후보 인식물질로 알려진 Con A의 특성과 매우 유사하다. Glu #26의 탈착반응 속도상수(koff)로부터 계산된 항원-항체 반응결합체의 반감기는 약 70초인데 이것은 연속 혈당측정의 필요조건을 충족시킬 수 있는 것으로 판단된다.
상기 시료 분석 사이트는 시료 유입 채널과 반투과성 막으로 구분되는 것일 수 있다.
본 발명의 미성숙 항체(10)는 시료 내 분석물질(13)인 포도당과 같은 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질과 신속하게 반응하는 것을 특징으로 한다. 또한 미성숙 항체가 장착된 상기 센서는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체로부터 발생된 신호를 직접 탐지하는 비표지 센서(14) (도 6의 (가) 참조), 또는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 탐지하는 표지 센서인 것을 특징으로 한다. 상
본 발명에서, 상기 비표지 센서는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체에 비례하여 변화하는 센서 상의 질량, 진동자의 저항, 전하분포 변화에 의한 표면 왜곡, 에너지 전달 등을 신호로서 측정한다. 센서표면의 결합체 질량 변화에 따라 광 굴절각 차이를 나타내는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 센서 (Robert Karlsson 등, Journal of Immunological Methods, Vol. 145, Page 229-240, 1990), 진동자의 저항이나 전하분포를 감지하는 캔틸레버(cantilever) 센서 (Hans-Jurgen Butt, Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 180, Page 251-260, 1996), 광도파로(evanescent) 센서 (R. G. Eenink 등, Analytica Chimica Acta, Vol. 238, Page 317-321, 1990), 나아가 나노차원의 선 혹은 간격을 이용한 나노센서 (Fengli Qu 등, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, Page 1749-1755, 2007) 등이 비표지 센서로 사용될 수 있다.
또한, 상기 표지 센서는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체에 비례하여 신호를 발생시키기 위해 인식성분에 표지물질을 표지하여 반응시킨 후 표지물질로부터의 신호를 측정한다. 신호를 발생시키는 표지물질로는 형광체, 발광체, 효소, 금속입자, 플라스틱 입자, 자성입자 등이 사용되며 이로부터 발생되는 형광, 발광, 발색, 전기화학, 자기장 등을 탐지하는 센서가 표지 센서로 사용될 수 있다.
이와 같은 새로운 개념의 미성숙 항체 기반의 면역센서는 질병이나 증세에 대한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 현존하는 거의 모든 면역분석시스템들이 안고 있는 한번 사용한 후 폐기하는 1회용 성능의 한계를 극복할 수 있고 인체의 만성질병 혹은 고위험군 환자에 대한 연속적인 감시가 가능하게 된다. 더욱이 현재의 진단체계에서 진단결과를 얻기 위해 시간이 오래 걸리고 또한 환자상태 감지 데이터를 실험실에서 분석할 필요가 있을 경우 진찰시점과 진료결과가 나오는 시간의 차이가 많아서 정확한 질병진단이나 적시 치료에 어려움이 많은 문제점을 해결할 수 있다.
또한 본 발명의 미성숙 항체 기반의 면역센싱 기술은, 생명체 대사물질, 호르몬, 핵산, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 분석하는데 활용될 수 있는데, 산업분야 별 제품군을 예시로서 정리하면 다음과 같다. 의료진단 산업으로는, 고위험군(만성질환자, 노인, 중환자) 연속진단시스템 제품, 당뇨환자 감염 연속진단시스템 제품, 그리고 좌변기 건강모니터링 시스템 제품 등을 들 수 있다. 인공장기 산업으로는, 인공췌장 제어시스템 제품 등 인공장기 제어 등에 적용할 수 있다. 환경 산업으로는, 강물, 연안, 해양 오염 연속감시시스템 제품 등을 들 수 있다. 생물 및 식품 산업으로는, 생물공정 연속모니터링시스템 제품과 식품 생산공정 연속모니터링시스템 제품 등에 적용될 수 있다.
한편, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법에 대한 것이다:
a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트 내로 주입시키는 단계; b) 상기 분석물질을 반투과성 막을 통하여 시료 분석 사이트 내로 유입시키는 단계; c) 상기 시료 분석 사이트 내에서 분석물질을 리간드 중합체와 가역반응성 인식성분에 대해 경쟁 반응시키는 단계; d) 상기 리간드 중합체와 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계; e) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 시료 분석 사이트 내의 분석물질이 반투과성 막을 통하여 유출되고 동시에 분석물질과 인식성분 간의 결합이 탈착되는 단계; f) 상기 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및 g) 상기 분석 사이트 내 가역반응성 인식성분과 리간드 중합체를 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 f) 단계를 반복함으로써 시료 내 분석물질의 농도 변화를 연속적으로 측정하는 단계.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실험재료
본 발명의 실시예를 위해 사용된 재료 및 구입처는 다음과 같다. 덱스트란(분자량: 1,000 및 10,000), 말토트리오조(maltotriose), 포도당(D(-)glucose), divinyl sulfone (DVS), Sephadex (G-15, G-25, G-50, 및 G-100), Con A, HAT 배지보완제(medium supplement), 염소 항 생쥐 IgG 항체(goat anti-mouse IgG antibody; whole IgG에 대해 특이)-horseradish peroxidase(HRP) 중합체, 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB), casein (sodium salt 형태, 우유로부터 추출), 우혈청 알브민(bovine serum albumin; BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), 그리고 polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20)는 시그마 사(St. Louis, MO)로부터 구입되었다. 총 IgG 정량키트(mouse IgG core ELISA) 및 HRP는 KOMA Biotech 사(한국 서울)로부터 공급되었다. Octet Red aminopropylsilane (APS) 센서 팁 및 샘플 희석액은 ForteBio 사(San Francisco, CA)에서 구입되었고, NaIO4, NaCNBH3, 그리고 glycoprotein detection reagent(GDR)는 Pierce(Rockford, IL)에서 구매되었다. Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 및 태아 우 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 Welgene 사(한국 대구) 및 PAA Laboratory 사(캐나다 온타리오)로부터 각각 공급되었다. 본 발명에서 사용된 그 외 다른 시약들은 분석등급을 사용하였다.
실시예
1. 다당류 성분과
운반단백질
간 중합체 제조
두 종류의 덱스트란(분자량 1,000 및 10,000)과 말토트리오즈를 운반단백질과 화학적으로 중합시켰다. 운반단백질은 동물면역화 목적인 경우 KLH를 그리고 포획 리간드로 이용할 목적인 경우 BSA를 사용하였다. 이러한 목적을 위해 다음과 같은 다른 두 화학적 중합방법이 이용되었다.
Periodate 산화 방법. 두 종류의 덱스트란을 먼저 10 내지 100 mM 최종 농도로 탈이온수(DIW; 100 mL)에 용해시킨 NaIO4로 각각 산화시켰다. 1시간 동안 반응시킨 후, 과량의 NaIO4는 140 mM NaCl을 포함한 10 mM 인산 완충용액(pH 7.4; PBS)에 대해 30분 씩 2회 투석과정을 통하여 제거되었다. 별도의 제시가 없는 경우, 모든 반응은 실온에서 orbital shaker 위에서 수행되었다. 이와 같이 산화된 각 덱스트란에 대해 280배 과량 몰 비율로 KLH와 혼합한 후 50 mM NaCNBH3를 포함한 PBS 내에서 10시간 동안 중합 반응시켰다. 동일한 과정이 덱스트란과 BSA 간의 중합에도 이용되었다. 중합 반응 후 PBS에 대해 투석시켰고, 중합되지 않은 덱스트란 성분은 젤 칼럼(BSA 중합체의 경우 Sephadex G-50 젤 및 KLH 중합체의 경우 Sephadex G-100 젤)을 통해 분리되었다. Bradford 방법을 이용한 유출분획 분석 후, 단백질 성분을 포함한 분획들을 모아서 약 1 mg/mL 단백질 농도가 되도록 농축시켰다. 농축액들은 소량으로 나누어 신속히 얼린 후 보관하였다. 또한, 말토트리오즈도 분자량 1,000 크기의 덱스트란-BSA 중합체 합성과정과 동일한 조건 하에서 중합되었다.
DVS 를 이용한 가교반응 . 두 종류의 덱스트란(각 1 mM)을 100 mM carbonate 완충용액(pH 10.3)에 각각 용해시킨 후 여기에 10 내지 250 과량 몰 비율의 DVS를 첨가하여 화학적으로 활성화시켰다. 이 혼합물을 37에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS에 대해 2회 투석시켜 과량의 DVS를 제거하였고 또한 pH를 낮추었다. KLH 혹은 BSA와 중합시키기 위해, 그 단백질을 당 성분이 280배 과량 몰 비율이 되도록 첨가하였고 37에서 10시간 동안 반응시켰다. 분자량 10,000인 덱스트란에 대해, 그 최종 반응물을 PBS에 대해 2회 투석시킨 후 반응하지 않은 당 성분은 위에서 언급한 바와 같이 젤 칼럼(10 mL) 상에서 분리시켰다. 단백질을 포함한 분획들을 모아서 농축시켰고 위에서와 같이 얼려 보관하였다. 말토트리오즈도 같은 과정에 의해 단백질과 중합시켰고 당 과량 몰 비율은 5,000배 까지 사용하였다.
합성된 모든 중합체들에 대해 그 분자크기 변화 여부를 확인하기 위해 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 방법을 이용하여 분석하였다(도 2). 제조한 모든 중합체에 대해, 운반단백질 대비 당 성분의 중합비율이 증가할수록 중합체 밴드의 분자크기는 비례하여 증가하는 것으로 나타났고 이로부터 중합반응이 매우 효과적으로 진행됨을 알 수 있었다.
중합비율 결정. 제조한 당-단백질 중합체의 중합비율을 결정하기 위해 당 및 단백질의 함유량을 분석하였다. 먼저, 표준곡선을 작성하기 위해 당 원료성분(각 50 mL)을 10 내지 2,000 mg/mL 농도가 되도록 PBS로 희석하였고 실온에서 15분 간 NaIO4(최종 50 mM)로 산화시켰다. 이와 같이 산화된 성분들에 1 M NaOH 용액에 용해된 0.5% GDR(150 mL)을 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰고, 각 발색된 색조밀도를 흡광도 400 nm에서 측정하였다. 각 중합체의 단백질 함량은 Bradford 분석법에 의해 측정되었다(J. M. Walker 및 N. J. Kruger, The Protein Protocols Handbook, Humana Press, 1996). 이 결과를 각 성분에 대해 표준곡선을 작성하였고 미지 시료의 정량에 적용하였다.
전형적으로 30 mM 혹은 50 mM NaIO4 조건에서 합성한 덱스트란-BSA 중합체에 적용한 결과 평균 중합비율은 각각 몰 비로 4.1 혹은 22인 것으로 결정되었고 이 중합체들을 아래 실험에서 포획 리간드로 사용하였다.
실시예
2. 생쥐 단일클론 항체 생산
생쥐 면역화. 덱스트란에 특이한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작을 위해 면역화 횟수를 제외하고는 통상적인 표준방법에 따라 실시하였다. 구체적으로, 위에서 제조한 덱스트란(분자량 10,000)-KLH 중합체(각 생쥐에 대해 매번 80 mg/mL)를 생후 6주된 암컷 BALB/c 생쥐 4마리의 복강에 면역원으로 주사하여 면역시킨 후 2주 간격으로 2회 부스팅하였다. 면역 활성시험을 위해, 면역화 전에 그리고 각 부스팅 후 7일째 각 생쥐로부터 항혈청 시료를 채취하였다.
면역분석을 통한 항혈청 반응성 시험. 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 실시하고자, 덱스트란(분자량 10,000)-BSA 중합체(1 mg/mL)를 PBS로 희석하였고 마이크로타이터 플레이트의 각 웰(100 mL 씩)에 분주하였다. 그 플레이트를 100% 습도가 유지되는 밀폐상자 내에 넣어 37에서 1시간 동안 반응시킨 후 탈이온수로 세척하였다. 이러한 조건은 특별히 언급이 없는 한 아래 과정에서도 동일하게 사용되었다. 잔여표면은 Casein-PBS(200 mL)으로 블로킹 되었다. 생쥐에서 채취된 항혈청을 0.1% tween 20이 포함된 Casein-PBS(Casein-PBS-TW)으로 1,000배 희석하였고 각 웰 내에 분주하였다(100 mL). 반응 후, HRP와 중합된 염소 항 생쥐 IgG 항체를 순차적으로 반응시켰다. 마지막으로, TMB를 포함한 HRP 효소기질 용액(100 mL)을 실온에서 15분 간 반응시킨 후 2 M 황산용액(50 mL)을 넣어 발색반응을 중지시켰다. 발색 색조밀도는 흡광도 450 nm에서 마이크로타이터 플레이트 리더기(VERSA max, Molecular Device 사; 미국 Sunnyvale)로 측정하였다. 음성 배경신호를 제하기 위해, 동일한 과정을 BSA가 코팅된 웰로 반복하였다.
면역화가 진행됨에 따라 다른 동물로부터 채취된 항혈청의 덱스트란에 대한 반응성은 대부분 두 번째 면역화까지 증가하였다(도 3). 그 후, 면역화 된 동물에 따라 약간의 차이는 있지만 덱스트란에 대한 반응성은 대부분 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 덱스트란이 포도당의 폴리머 분자이기 때문에 본 발명자들에게 매우 흥미로운 것으로 인식되었다. 즉, 동물의 면역계는 체내에 존재하는 포도당 유도체에 대해서는 항체 생성을 조절 혹은 억제하는 것으로 예측되었다. 따라서 항체생산을 위한 다음 과정에서는 덱스트란에 대해 면역화 상태가 고조된 그러나 면역계가 미성숙 된 2회 면역화 된 생쥐를 이용하였다.
세포 융합 및 하이브리도마 세포 선별. 2회 면역화 후 3일째에 생쥐를 희생시켜 비장을 적출하여 얻은 비장세포를 마이앨로마(myeloma) 세포주(Sp2/0 Ag14)와의 세포융합을 실시하였다. 융합된 하이브리도마 세포는 HAT 선택과정을 이용하여 스크리닝되었고 이로부터 생산된 항체들의 반응성은 고정된 항원을 이용한 ELISA 법을 통해 위에서 설명된 바와 같이 측정되었다. 여러 다른 반응성을 지닌 항체를 생산하는 하이브리도마 클론들을 미리 선별한 후 제한희석 과정을 이용하여 단일클론으로 분리하였다. 각 배양배지(10% FBS를 포함한 DMEM) 내 각 항체 농도는 IgG 정량키트를 이용하여 결정되었다.
반응특이성 시험. DVS 교차중합을 통해 합성된 덱스트란(분자량 10,000)-KLH 중합체로 면역화 시켜 얻어진 하이브리도마 클론들로부터 3클론 즉 Glu 4, 26, and 45를 선별하였다. 마이크로 웰 내에 PBS로 희석한 다음 성분들(각 1 mg/mL)을 첨가하여 코팅하였다. 비특이 반응에 대한 대조군으로 BSA 및 KLH, 말토트리오즈-BSA 중합체, 다른 화학반응을 통해 제조한 덱스트란(분자량 1,000)-BSA 중합체, 그리고 분자량 10,000인 덱스트란을 이용하였다. 잔여표면을 Casein-PBS로 코팅한 후, 세포배양액에서 생산된 항체를 Casein-PBS-TW으로 10배 희석하여 반응시켰고 그리고 HRP로 표지된 염소 항 생쥐 IgG 항체를 순차적으로 반응시켰다. 그 다음 과정은 위에서 항혈청 반응성 시험(ELISA)에 대해 설명한 바와 같다.
반응성 시험 결과를 보면(도 4), 그 항체들은 운반단백질과는 반응하지 않는 클론들로부터 선별되었기 때문에 BSA 및 KLH와는 비특이 반응을 하지 않았다(도 4, 가). 시험된 항체들은 우선 포도당 분자가 1,4-결합 형태로 중합된 말토트리오즈와는 전혀 반응하지 않았다(도 4, 나). 반면에, 1,6-글리코시드 연결고리 형태로 중합된 덱스트란에 대해서는 운반단백질 및 그 중합반응 방법에 따라 차이는 있지만 비교적 강하게 반응하였다(도 4, 다 및 라). 이와 같이 항체반응이 포도당 분자 간 연결된 형태에 대해 특이한(glycosidic linkage-specific) 것은 덱스트란을 동물 면역원으로 사용하였기 때문이다. 1,6-글리코시드 연결고리 형태는 글라이코겐을 제외하면 생체성분으로는 드물게 존재하므로 덱스트란에 대한 동물 체내 항체생성이 가능한 것으로 예측된다.
항체들 간 반응성을 비교해 보면, Glu 4 및 45는 운반단백질에 중합된 덱스트란 뿐만 아니라 단독 덱스트란 분자와도 잘 반응하였다(도 4, 마). 이 항체들은 당 성분에 대해 선택성을 갖는 것으로 예측된다. 반면에, Glu 26는 다른 두 항체에 비해 당 성분에 대한 반응성이 일반적으로 낮은 것으로 나타났고, NaIO4 산화반응에 의해 제조된 중합체에 대해서보다는 DVS에 의해 교차결합된 중합체에 더 강한 반응성을 나타내었다(도 4, 다-마 참조).
반응속도상수 결정. 항체클론 Glu 26에 대한 부착 및 탈착 반응속도 특성을 비표지센서 시스템인 Octet Red를 이용하여 제조사에서 제공한 과정에 따라 분석하였다. 우선, PBS에 용해된 덱스트란(분자량 1,000)-BSA 중합체(20 mg/mL)를 APS 센서 팁 표면에 30에서 900초 간 고정시켰고 그 잔여표면은 Casein-PBS에서 블러킹 되었다. 그 덱스트란이 고정된 센서를 Casein-PBS로 희석된 항체용액(10 mg/mL)에 담가 동일한 조건에서 부착 반응시킨 후 다시 블러킹 용액으로 되담가 탈착반응을 유도하였다. 동일한 과정을 단지 casein으로 블로킹 된 음성 대조군 센서에 대해 반복하였다.
제조사에서 제공한 분석 프로그램(Data analysis 6.3)을 이용하여 본래의 항체 반응결과로부터 대조군으로부터 얻은 시험결과를 제함으로서 Glu 26에 대한 각 부착 및 탈착 반응곡선을 구하였다(도 5, 가). 그 프로그램 상의 회귀분석을 통하여 항원-항체 간 부착(ka) 및 탈착(kd) 반응속도상수를 결정하였고, 이로부터 부착평형상수(KA)를 구하였다(도 5, 나). 3번 반복하여 측정한 속도상수들은 잘 일치하였고 그 평균값으로부터 Glu 26 항체클론의 반응성을 특성화하였다. 그 항체의 분자량 1,000인 덱스트란에 대한 부착 및 탈착 반응속도는 다른 항체들에 비해 매우 빠른 것으로 나타났는데, 특히 당 성분에 대한 부착단백질로 잘 알려진 Con A의 mannotriose에 대한 반응속도와 거의 동일하였다. 그러나 Glu 26 항체는 체내 연속 혈당측정 시 Con A가 갖고 있는 잠재적인 문제점 즉, 생체독성(biotoxicity), 당 성분에 대한 비선택적인 반응, 그리고 포획 리간드에 대한 다중 부착반응 등을 극복하거나 완화시킬 수 있는 장점을 제공한다.
실시예
3. 혈당 검출 면역센서 시험 제작
비표지센서를 이용한 농도응답. 덱스트란 중합체(리간드)가 고정된 APS 센서를 Glu 26 항체(포획성분) 용액에 담가 혈당 면역센서를 구성하였다(도 6, 가, 왼쪽). 용액에 포도당을 첨가하면 그 포도당 분자와 고정 리간드 간에 항체에 대한 부착반응 경쟁이 야기된다. 따라서 포도당 농도가 증가하면 고정 리간드와 항체 간의 부착반응이 반비례하여 감소하게 된다(도 6, 가, 오른쪽). 이와 같은 항체와 리간드 간 반응 변화가 신호로 변환될 수 있도록, 그 면역센서를 비표지센서 시스템 내에 장착하여 운영하였다. 우선 APS 센서를 PBS에 60초 간 담근 다음 다시 PBS에 용해된 덱스트란(분자량 1,000)-BSA 중합체(20 mg/mL)에 담가 그 중합체를 센서 팁 상에 30에서 1,500초 간 고정시켰다. 잔여표면을 샘플 희석액으로 블로킹한 후, 센서를 샘플 희석액으로 5배 희석한 Glu 26 항체용액에 담가 1,500초 간 반응시켰다. 센서 팁을 다시 블로킹 용액으로 옮겨 같은 시간 동안 반응시켰다. 이와 동일한 과정을 10 내지 1,000 mg/dL 농도의 포도당이 포함된 용액으로 반복 실험하였다. 또한 단지 BSA(20 mg/mL)로 코팅된 센서를 음성 대조군으로 이용하였다. 실험 결과들에 대해 제조사에서 제공한 프로그램을 이용하여 위에서 설명한 바와 같이 동일하게 분석하였다.
포도당 각 농도에서 구한 면역센서의 최대 신호변화를 센서 농도응답으로 채택하였고 그 신호변화의 크기는 포도당 농도에 반비례하는 것으로 나타났다(도 6, 나). 실험한 포도당 농도범위(10 내지 1,000 mg/dL)에서 센서의 농도응답은 약 60%가 변화하였다. 또한 최종 평형상태의 95%를 기준으로 측정한 농도응답 시간은 체내 혈당농도 변화속도 보다 빨라야 측정이 지연되지 않는데, 센서의 응답시간은 약 10분 이내인 것으로 측정되어서 혈당 연속측정의 필요조건을 충족시키는 것으로 판단되었다. 참고로, 도 5의 (나)에 제시한 탈착반응속도를 이용하여 Glu 26 항체의 탈착반응 반감기를 계산하면 약 70초이었다. 이것은 항체가 제공할 수 있는 가장 빠른 반응속도 범위에 속하는 것으로서 이러한 반응특성은 체내 혈당 측정에 적용하기에 충분한 것으로 예측되었다.
반복적인 농도응답. 혈당 면역센서의 반복적인 농도응답을 연속적으로 얻기 위해, 위에서와 같이 비표지센서 시스템 내에서 덱스트란 중합체를 APS 센서 팁에 고정시켰고 잔여표면을 블로킹하였다. 포도당 농도 0, 10, 100, 그리고 1000 mg/dL를 각각 포함한 Glu 26 항체용액(10 mg/mL)을 일련의 마이크로타이터 플레이트 웰에 분주하였고, 준비된 센서를 연속적으로 이동시켜 그 농도응답을 측정하였다. 단, 다음 웰로의 이동 전에 센서를 매번 새로 준비한 Casein-PBS에 담가 탈착반응을 유도하였다. 본 실험은 웰 내 분주된 샘플의 증발에 의해 분석에 영향을 주지 않는 범위 내에서 수행되었다. 센서 신호의 증감이 포도당 농도 변화에 의한 결과임을 확인하기 위해, 위에서와 동일한 조건하에서 단지 Glu 26 항체만을 포함한 샘플에 대해서도 분석하였다. 또한, 센서신호의 기준선을 보정하기 위해 단지 BSA(20 mg/mL)로만 코팅된 센서를 이용하여 같은 과정을 반복하였다. 위에서와 같이, 실험 결과들에 대한 보정은 제조사에서 제공한 프로그램을 이용하였다.
혈당 면역센서의 농도응답 재현성을 시험하기 위해, 단지 Glu 26 항체만을 포함한 용액을 이용하여 8회 반복 측정한 결과 센서로부터의 신호는 평균값을 중심으로 매번 +/- 6.2% 오차범위 내에서 매우 높은 재현성이 있음을 확인하였다(도 7, 가). 또한 면역센서의 포도당 농도응답을 연속 측정한 결과 신호세기는 포도당 농도의 증감에 반비례하여 일관성있게 변화하였다(도 7, 나). 농도응답 시간은 매우 신속해서 최종 평형상태의 95%를 기준으로 부착반응 시 평균 3분 그리고 탈착반응 시 평균 8분 정도인 것으로 측정되었다. 혈당 측정 시 실제 샘플에는 잠재적인 방해물질이 있을 수 있으나, 대표적으로 fructose 및 글라이코겐은 그 농도들이 포도당 농도에 비해 전형적으로 10배 이상 낮고 글루코사민은 항체와는 반응하지 않는 1,4-글리코시드 연결고리로 구성되므로 문제가 되지 않을 것으로 판단된다.
10: 인식성분(미성숙항체 등)
11: 포획 리간드
12: 운반단백질
13: 분석물질(포도당 등)
14: 비표지 혹은 표지 센서
11: 포획 리간드
12: 운반단백질
13: 분석물질(포도당 등)
14: 비표지 혹은 표지 센서
Claims (10)
- 분석물질 및 운반단백질을 중합시키는 단계;
상기 분석물질 및 운반단백질 중합체로 동물을 1회 또는 2회 면역화 시키는 단계;
상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 하이브리도마 세포주를 얻는 단계; 및
상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계를 포함하는 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 분석물질과 운반단백질의 중합비율이, 1:1 내지 1:50 몰 비인 제조방법. - 제1항에 따른 제조방법으로 제조된, 분자량 5,000 이하의 분석물질 검출용 미성숙 항체.
- 제3항에 있어서,
상기 분석물질은 포도당인 것을 특징으로 하는 미성숙 항체. - 제3항에 있어서,
상기 미성숙 항체는 분석물질과 가역반응을 하는 것을 특징으로 하는 미성숙 항체. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미성숙 항체를 포함하는 분석물질의 연속 검출장치.
- 제6항에 있어서,
상기 검출장치는 시료 유입 채널;
상기 미성숙 항체, 리간드 중합체 및 센서를 포함하는 시료 분석 사이트; 및
시료 배출 채널로 구성되며, 상기 미성숙 항체는 분석 사이트 내에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 분석물질의 연속 검출장치. - 제7항에 있어서,
상기 시료 분석 사이트 내로 유입된 분석물질과 리간드 중합체는 상기 미성숙 항체에 대해 경쟁적으로 부착반응 하며, 상기 센서는 상기 미성숙 항체와 리간드 중합체간 반응으로부터 발생된 신호를 탐지하는 것을 특징으로 하는 연속 검출장치. - 제8항에 있어서,
상기 신호 세기가 시료 내 분석물질의 농도에 반비례하는 것을 특징으로 하는 연속 검출장치. - 제6항에 따른 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
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| KR (1) | KR101342755B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104474421A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-04-01 | 青岛恒波仪器有限公司 | 一种治疗小儿夜惊啼哭的中药制剂及其制备方法 |
| CN114594264A (zh) * | 2020-12-03 | 2022-06-07 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于生物膜干涉的多糖与蛋白相互作用亲和力的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR100958198B1 (ko) | 2008-06-18 | 2010-05-14 | 고려대학교 산학협력단 | 실시간 연속 검출장치 |
-
2011
- 2011-10-26 KR KR1020110110201A patent/KR101342755B1/ko active IP Right Grant
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| KR101342755B1 (ko) | 2013-12-19 |
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