CN114395049A - 一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物材料学技术领域。本发明提供了一种靶向SARS‑CoV‑2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用,所述修饰肽材料的结构为共价弹头‑连接臂‑亲和肽。本发明的修饰肽材料可用于建立SARS‑CoV‑2检测方法,也可作为抑制剂,抑制SARS‑CoV‑2与细胞受体血管紧张素转化酶2结合,从而作为预防和阻断SARS‑CoV‑2病毒感染的新型冠状病毒肺炎治疗方案。其特异性、稳定性、结合能力较强,可以有效阻止新冠病毒的细胞侵入过程,在病毒抑制方面具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料学技术领域,尤其涉及一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用。
背景技术
SRAS-CoV-2病毒为β属新型冠状病毒,病毒表面的刺突(S)蛋白是一种由S1和S2两个亚基组成的寡聚跨膜蛋白,是病毒感染宿主细胞的重要结合位点。S1亚基中的受体结合结构域(RBD)可与宿主细胞受体细胞受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合,进而触发病毒与宿主细胞的融合,这种SARS-CoV-2 RBD与人ACE2受体的结合亲和力可达纳摩尔级,被认为是SRAS-CoV-2极易在人群中传播的重要原因之一。因此基于ACE2开发靶向SRAS-CoV-2 S蛋白RBD的高亲和力特异性生物识别材料具有可行性。
目前,已报道的靶向SARS-CoV-2 S蛋白的高亲和力特异性生物识别材料主要包括蛋白、适配体和肽。蛋白类主要包括如SARS-CoV-2 S蛋白抗体,人ACE2受体等,其制备技术较为成熟、应用广泛、亲和力强,然而蛋白类生物大分子无法化学合成、制备成本高。通过体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选的对SARS-CoV-2 S蛋白具有特异性结合能力的适配体材料已经得到报道,其化学合成方便、价格低廉且可以在脱水条件下长期保存。然而,适配体与靶标蛋白的结合主要依赖于氢键、疏水作用、电荷相互作用等弱作用力,其对SARS-CoV-2 S蛋白的结合过程容易受到溶液基质条件的影响,极大限制了其实用性。
用ACE2部分氨基酸组成的多肽或通过从头计算方法设计的多肽等肽类生物识别材料得到了广泛研究。肽材料由2~50个氨基酸缩合组成,与蛋白质相比,其具有较短的氨基酸序列长度,可以人工合成与修饰,成本低,具有较好的化学和构象稳定性。特别是分子量低于20kDa的短肽在病毒生物传感分析技术构建以及病毒治疗中受到青睐。然而,现有靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域的亲和肽在结合稳定性以及抑制RBD-ACE2相互作用等方面仍存在较多不足,从而限制了其在复杂基质样本检测、SARS-CoV-2病毒感染预防和抑制等方面的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用,本发明的修饰肽材料的特异性、稳定性、结合能力较强,可以有效阻止新冠病毒与人ACE2受体的结合。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料,所述修饰肽材料的结构为共价弹头-连接臂-亲和肽。
作为优选,所述亲和肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或者SEQ ID No.1所示氨基酸序列经一个或几个氨基酸替换、添加和/或缺失得到的具有相似结构和功能的衍生序列,所述连接臂为NH2-PEG12-COOH。
作为优选,所述共价弹头的结构为含有{SF}X1{SF}X1{SF}的多肽或序列为d(X2)nd(SF)m的寡核苷酸序列,所述X1为甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺;所述X2为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶;所述n≥1,m≥3。
本发明还提供了所述的共价弹头的结构为含有{SF}X1{SF}X1{SF}的多肽的修饰肽材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)利用亲和肽、NH2-PEG12-COOH和含有序列为CX1CX1C的多肽合成含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽;
(2)将含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽、4-溴苯磺酰氟和磷酸盐缓冲液混合后得到混合液,将混合液在35~40℃条件下反应10~20h,得到含有{SF}X1{SF}X1{SF}-连接臂-亲和肽的多肽。
作为优选,所述混合液中含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽的浓度为0.1~0.5mM,所述混合液中4-溴苯磺酰氟的浓度为含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽浓度的30倍以上,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05~0.15M,pH为6.5~7.5。
本发明还提供了所述的共价弹头的结构为d(X2)n d(SF)m的修饰肽材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)利用亲和肽、NH2-PEG12-COOH和半胱氨酸合成C-PEG12-亲和肽;
(2)合成有n+m个碱基的寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列的3'端用马来酰亚胺修饰,靠近3'端的m个碱基进行硫代磷酸修饰,得到d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺
(3)将C-PEG12-亲和肽、d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺和醋酸三乙胺缓冲液混合后得到混合液,将混合液在20~30℃条件下反应10~20h,得到d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽;
(4)将d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽转移到磷酸盐缓冲液中,得到d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液,将d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液和4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液混合后在35~40℃条件下反应10~20h,得到d(X2)nd(SF)m-连接臂-亲和肽。
作为优选,所述步骤(3)的混合液中d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺的浓度为30~50μM,所述步骤(3)中的混合液中C-PEG12-亲和肽的浓度为d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺浓度的10倍以上,所述醋酸三乙胺缓冲液的浓度为0.4~0.6M,pH为7.5~8.5。
作为优选,所述步骤(4)中的磷酸盐缓冲液的浓度为0.4~0.6mM,pH为6.5~7.5;所述步骤(4)中d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液中d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽的浓度为30~50μM,所述4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液中4-溴苯磺酰氟的浓度为d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽浓度的100倍以上,所述d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液和4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液的体积比为0.8~1.2:1。
本发明还提供了所述修饰肽材料在制备检测SARS-CoV-2的产品中的应用。
本发明还提供了所述的修饰肽材料在制备抑制SARS-CoV-2病毒药物中的应用。
本发明提供了一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用,所述修饰肽材料的结构为共价弹头-连接臂-亲和肽。本发明的修饰肽材料可用于建立SARS-CoV-2检测方法,也可作为抑制剂,抑制SARS-CoV-2与细胞受体血管紧张素转化酶2结合,从而作为预防和阻断SARS-CoV-2病毒感染的新型冠状病毒肺炎治疗方案。其特异性、稳定性、结合能力较强,可以有效阻止新冠病毒的细胞侵入过程,在病毒抑制方面具有较好的应用前景。
附图说明
图1为SEQ ID No.1所示的亲和肽与SARS-COV-2 S蛋白RBD的结合构象;
图2为生物膜层干涉法测定的EQ ID No.1所示的亲和肽与SARS-COV-2S蛋白RBD的亲和力;
图3为{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽的质谱数据;
图4为{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽的HPLC数据;
图5为)SDS-PAGE凝胶电泳图,其中(1)为CGCGC-PEG12-亲和肽,(2)为{SF}G{SF}G{SF}-PEG12-亲和肽,(3)为d(T)7 d(T*)7-PEG12-亲和肽,(4)为d(T)7 d(SF)7-PEG12-亲和肽;
图6为{SF}G{SF}G{SF}-PEG12-亲和肽的SARS-CoV-2抑制剂筛选试剂盒测试结果;
图7为d(T)7 d(SF)7-PEG12-亲和肽的HPLC数据;
图8为d(T)7 d(SF)7-PEG12-亲和肽的SARS-CoV-2抑制剂筛选试剂盒测试结果;
图9为{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽的原理和技术路线;
图10为d(T)7 d(SF)7-PEG12-亲和肽的原理和技术路线;
图11为d(T)7 d(SF)7-PEG12-亲和肽的15%变性PAGE凝胶电泳数据。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料,所述修饰肽材料的结构为共价弹头-连接臂-亲和肽。
在本发明中,所述亲和肽优选为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或者SEQ ID No.1所示氨基酸序列经一个或几个氨基酸替换、添加和/或缺失得到的具有相似结构和功能的衍生序列。
在本发明中,所述连接臂优选为NH2-PEG12-COOH。
在本发明中,所述共价弹头的结构优选为含有{SF}X1{SF}X1{SF}的多肽或序列为d(X2)nd(SF)m的寡核苷酸序列。
在本发明中,所述X1优选为甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺。
在本发明中,所述X2优选为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。
在本发明中,所述n≥1,进一步优选为5≤n≤10,再进一步优选为n=7。
在本发明中,所述m≥3,进一步优选为5≤n≤10,再进一步优选为n=7。
本发明还提供了所述共价弹头的结构为含有{SF}X1{SF}X1{SF}的多肽的修饰肽材料的制备方法:
(1)利用亲和肽、NH2-PEG12-COOH和含有序列为CX1CX1C的多肽合成含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽;
(2)将含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽、4-溴苯磺酰氟和磷酸盐缓冲液混合后得到混合液,将混合液在35~40℃条件下反应10~20h,得到含有{SF}X1{SF}X1{SF}-连接臂-亲和肽的多肽。
在本发明中,所述混合液中含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽和4-溴苯磺酰氟的浓度比例优选为1:30~1:200,进一步优选为1:50~1:150,再进一步优选为1:100。
在本发明中,所述混合液中含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽的浓度优选为0.2~0.4mM,进一步优选为0.3mM;所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.05~0.15M,进一步优选为0.1M;所述磷酸盐缓冲液的pH优选为6.5~7.5,进一步优选为7.0。
在本发明中,所述反应的温度优选为36~39℃,进一步优选为37~38℃。
在本发明中,所述反应的时间优选为12~18h,进一步优选为15h。
本发明还提供了所述共价弹头的结构为d(X2)nd(SF)m的修饰肽材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)利用亲和肽、NH2-PEG12-COOH和半胱氨酸合成C-PEG12-亲和肽;
(2)合成有n+m个碱基的寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列的3'端用马来酰亚胺修饰,靠近3'端的m个碱基进行硫代磷酸修饰,得到d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺
(3)将C-PEG12-亲和肽、d(X2)n d(X2*)m-马来酰亚胺和醋酸三乙胺缓冲液混合后得到混合液,将混合液在20~30℃条件下反应10~20h,得到d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽;
(4)将d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽转移到磷酸盐缓冲液中,得到d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液,将d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液和4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液混合后在35~40℃条件下反应10~20h,得到d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽。
在本发明中,所述d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽中的*表示硫代磷酸修饰的核苷酸。
在本发明中,所述的SF为磺酰氟基团修饰。
在本发明中,所述步骤(3)的混合液中d(X2)n d(X2*)m-马来酰亚胺的浓度优选为35~45μM,进一步优选为40μM;所述步骤(3)中的混合液中C-PEG12-亲和肽的浓度和d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺浓度的比例优选为1:10~1:50,进一步优选为1:20~1:40,再进一步优选为1:30;所述醋酸三乙胺缓冲液的浓度优选为0.4~0.6M,进一步优选为0.5M;所述醋酸三乙胺缓冲液的pH优选为7.5~8.5,进一步优选为8.0。
在本发明中,所述步骤(3)中反应的温度优选为22~28℃,进一步优选为25℃。
在本发明中,所述步骤(3)中反应的时间优选为12~18h,进一步优选为15h。
在本发明中,所述步骤(4)中的磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.4~0.6mM,进一步优选为0.5mM;所述步骤(4)中的磷酸盐缓冲液的pH优选为6.5~7.5,进一步优选为7.0;所述d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液中d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽的浓度优选为30~50μM,进一步优选为35~45μM,再进一步优选为40μM;所述4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液中4-溴苯磺酰氟的浓度和d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽浓度的比例优选为1:100~1:500,进一步优选为1:200~1:400,再进一步优选为1:300;所述d(X2)n d(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液和4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液的体积比优选为0.8~1.2:1,进一步优选为1:1。
本发明还提供了所述的修饰肽材料在制备检测SARS-CoV-2的产品中的应用。
本发明还提供了所述的修饰肽材料在制备抑制SARS-CoV-2病毒药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1亲和肽与SARS-COV-2 S蛋白RBD的亲和力测定
运用生物膜层干涉(BLI)技术,对采用多肽固相合成法得到SEQ ID No.1所示的亲和肽与SARS-COV-2 S蛋白RBD直接的亲和力进行测试,将肽链通过生物素化的方式固定到链霉亲和素传感器界面上,测试的溶液条件为含有0.1%牛血清蛋白(BSA),0.05%吐温-20(Tween-20)的10mM PBS缓冲液,使用包括结合-解离两过程的1:1结合动力学模型进行参数拟合。
图1显示SEQ ID No.1所示的亲和肽和SARS-COV-2 S蛋白RBD的结合构象。可以看出,亲和肽与SARS-COV-2 S蛋白RBD形成了稳定的结合构象,形成了多对氢键相互作用;
亲和力测试结果如图2所示,SEQ ID No.1所示的亲和肽和SARS-COV-2 S蛋白RBD结合的Kd值为6.42nM,说明SEQ ID No.1所示的亲和肽有较强的SARS-COV-2 S蛋白RBD亲和能力。
实施例2含有{SF}X1{SF}X1{SF}-连接臂-亲和肽的多肽的合成
以{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽为例
(1)在SEQ ID No.1所示的亲和肽的5'端链接NH2-PEG12-COOH链接臂,在链接臂的氨基端添加多肽序列CGCGC,合成CGCGC-PEG12-亲和肽;
(2)将CGCGC-PEG12-亲和肽、4-溴苯磺酰氟和pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液混合后得到混合液,混合液中CGCGC-PEG12-亲和肽的浓度为0.5mM,4-溴苯磺酰氟的浓度为15mM;将混合液在37℃条件下反应15h,得到{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽。
(3)通过截留量为3kDa的超滤管除掉多余的4-溴苯磺酰氟,纯化产物。所得产物的MAILDI-TOF质谱结果如图3所示,所得分子量与预期分子量所一致,说明得到预期产物;HPLC吸收峰如图4所示,说明所得产物纯度较高。
如图5所示,从SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果可以发现,所得{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽和SARS-COV-2 S蛋白RBD之间形成了稳定的共价键,形成的复合物分子量发生改变,使SARS-COV-2 S蛋白RBD原有的蛋白条带消失。如图6所示,所得{SF}G{SF}G{SF}-连接臂-亲和肽能有效抑制SARS-COV-2 S蛋白RBD与人ACE2受体的结合,IC50低于50nM。
实施例3 d(X2)nd(SF)m-连接臂-亲和肽的合成
以d(T)7 d(SF)7-连接臂-亲和肽为例
(1)在SEQ ID No.1所示的亲和肽的5'端链接NH2-PEG12-COOH链接臂,在链接臂的氨基端添加半胱氨酸,合成C-PEG12-亲和肽;
(2)合成有14个T碱基的核苷酸序列,将核苷酸序列的C末端用马来酰亚胺修饰,靠近C端的7个T碱基用硫代磷酸修饰,得到d(T)7 d(T*)7-马来酰亚胺(注:*表示硫代磷酸修饰的核苷酸);
(3)将C-PEG12-亲和肽、d(T)7 d(T*)7-马来酰亚胺和pH为8.0的0.5M醋酸三乙胺缓冲液混合后得到混合液,混合液中C-PEG12-亲和肽的浓度为1mM,混合液中d(T)7 d(T*)7-马来酰亚胺的浓度为40μM,将混合液在25℃条件下反应15h,得到d(T)7 d(T*)7-连接臂-亲和肽;
(4)将d(T)7 d(T*)7-连接臂-亲和肽转移到pH为7.0的0.5mM的磷酸盐缓冲液中得到40μM的d(T)7 d(T*)7-连接臂-亲和肽溶液,将d(T)7 d(T*)7-连接臂-亲和肽溶液和20mM的4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液混合后在37℃条件下反应15h,得到d(T)7 d(SF)7-连接臂-亲和肽。
(5)通过反相-高效液相色谱除掉多余的4-溴苯磺酰氟,纯化产物。HPLC吸收峰如图7所示,说明所得产物纯度较高;
如图8所示,d(T)7 d(SF)7-连接臂-亲和肽能有效抑制SARS-COV-2 S蛋白RBD与hACE2的结合,IC50低于50nM。从SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果也可以发现,d(T)7 d(SF)7-连接臂-亲和肽和SARS-COV-2 S蛋白RBD之间形成了稳定的共价键,形成的复合物分子量发生改变,使SARS-COV-2 S蛋白RBD原有的蛋白条带消失。
由以上实施例可知,本发明提供了一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用,所述修饰肽材料的结构为共价弹头-连接臂-亲和肽。本发明的修饰肽材料可用于建立SARS-CoV-2检测方法,也可作为抑制剂,抑制SARS-CoV-2与细胞受体血管紧张素转化酶2结合,从而作为预防和阻断SARS-CoV-2病毒感染的新型冠状病毒肺炎治疗方案。其特异性、稳定性、结合能力较强,可以有效阻止新冠病毒的细胞侵入过程,在病毒抑制方面具有较好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD的修饰肽材料及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gly Gly Gly Phe
1 5 10 15
Claims (10)
1.一种靶向SARS-CoV-2S蛋白RBD的修饰肽材料,其特征在于,所述修饰肽材料的结构为共价弹头-连接臂-亲和肽。
2.根据权利要求1所述的修饰肽材料,其特征在于,所述亲和肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或者SEQ ID No.1所示氨基酸序列经一个或几个氨基酸替换、添加和/或缺失得到的具有相似结构和功能的衍生序列,所述连接臂为NH2-PEG12-COOH。
3.根据权利要求1或2所述的修饰肽材料,其特征在于,所述共价弹头的结构为含有{SF}X1{SF}X1{SF}的多肽或序列为d(X2)n d(SF)m的寡核苷酸序列,所述X1为甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺;所述X2为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶;所述n≥1,m≥3。
4.权利要求3所述的共价弹头的结构为含有{SF}X1{SF}X1{SF}的多肽的修饰肽材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)利用亲和肽、NH2-PEG12-COOH和含有序列为CX1CX1C的多肽合成含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽;
(2)将含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽、4-溴苯磺酰氟和磷酸盐缓冲液混合后得到混合液,将混合液在35~40℃条件下反应10~20h,得到含有{SF}X1{SF}X1{SF}-连接臂-亲和肽的多肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述混合液中含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽的浓度为0.1~0.5mM,所述混合液中4-溴苯磺酰氟的浓度为含有CX1CX1C-PEG12-亲和肽的多肽浓度的30倍以上,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05~0.15M,pH为6.5~7.5。
6.权利要求3所述的共价弹头的结构为d(X2)n d(SF)m的修饰肽材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)利用亲和肽、NH2-PEG12-COOH和半胱氨酸合成C-PEG12-亲和肽;
(2)合成有n+m个碱基的寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列的3'端用马来酰亚胺修饰,靠近3'端的m个碱基进行硫代磷酸修饰,得到d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺;
(3)将C-PEG12-亲和肽、d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺和醋酸三乙胺缓冲液混合后得到混合液,将混合液在20~30℃条件下反应10~20h,得到d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽;
(4)将d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽转移到磷酸盐缓冲液中,得到d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液,将d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液和4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液混合后在35~40℃条件下反应10~20h,得到d(X2)nd(SF)m-连接臂-亲和肽。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)的混合液中d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺的浓度为30~50μM,所述步骤(3)中的混合液中C-PEG12-亲和肽的浓度为d(X2)nd(X2*)m-马来酰亚胺浓度的10倍以上,所述醋酸三乙胺缓冲液的浓度为0.4~0.6M,pH为7.5~8.5。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中的磷酸盐缓冲液的浓度为0.4~0.6mM,pH为6.5~7.5;所述步骤(4)中d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液中d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽的浓度为30~50μM,所述4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液中4-溴苯磺酰氟的浓度为d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽浓度的100倍以上,所述d(X2)nd(X2*)m-连接臂-亲和肽溶液和4-溴苯磺酰氟的乙腈溶液的体积比为0.8~1.2:1。
9.权利要求1~3任意一项所述的修饰肽材料在制备检测SARS-CoV-2的产品中的应用。
10.权利要求1~3任意一项所述的修饰肽材料在制备抑制SARS-CoV-2病毒药物中的应用。
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