CN114369141A - 一种靶向结合ace2蛋白的ace2靶向肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向结合ACE2蛋白的ACE2靶向肽及其用途。ACE2靶向肽为多肽，氨基酸序列分别为：FPHWHGNHKHNR、GFKSHFHHNHMR、AHYHRHPPHLNR、LSPHFHHHRGAK、METRPVAPHEFR、LHRPHFHAHNNS、GHQGHWYGMFRA、YPWHHRHMPVHP、SHKHHHWPYHAH、FHGHGSHHNKHR；还包括由微生物、多聚体混合物的表面形成有ACE2靶向肽后的生物活性物质。本发明能够高效靶向ACE2蛋白，阻断新型冠状病毒刺突蛋白与ACE2蛋白的结合，进而起到抑制新型冠状病毒感染的作用。

Description

一种靶向结合ACE2蛋白的ACE2靶向肽及其用途
技术领域
本发明属于生物医学领域的一种多肽及其用途，尤其是涉及了一种能够靶向结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的多肽及其用途。
背景技术
血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种存在于多种细胞表面的蛋白质。新型冠状病毒表面的刺突蛋白能够靶向识别ACE2蛋白，通过刺突蛋白与ACE2的相互作用，新型冠状病毒得以进入人体细胞，从而引发肺炎病情。
通常，科研人员主要通过单克隆抗体来阻断ACE2蛋白与新冠病毒刺突蛋白的结合。但是，单克隆抗体的分子量较大，阻断效率较低，结构不稳定，在常温条件下容易失去活性。因此，单克隆抗体的生产、运输及保存均需要低温条件，成本较高。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种与ACE2蛋白具有高度亲和力并能够特异性靶向结合ACE2蛋白的多肽序列以及该多肽在阻断新型冠状病毒感染人体细胞领域中的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一、一种ACE2靶向肽：
所述ACE2靶向肽为多肽，氨基酸序列选自FPHWHGNHKHNR、 GFKSHFHHNHMR、AHYHRHPPHLNR、LSPHFHHHRGAK、METRPVAPHEFR、 LHRPHFHAHNNS、GHQGHWYGMFRA、YPWHHRHMPVHP、 SHKHHHWPYHAH、FHGHGSHHNKHR其中之一，具体可以为SEQ ID No.1～ SEQID No.10。
所述ACE2靶向肽的氨基酸序列分别为：FPHWHGNHKHNR、 GFKSHFHHNHMR、AHYHRHPPHLNR、LSPHFHHHRGAK、METRPVAPHEFR、 LHRPHFHAHNNS、GHQGHWYGMFRA、YPWHHRHMPVHP、 SHKHHHWPYHAH、FHGHGSHHNKHR。具体如下表。
表1氨基酸序列表
Figure BDA0003394881650000011
Figure BDA0003394881650000021
二、一种生物活性物质：
包含权利要求1所述ACE2靶向肽；
包括微生物、多聚体混合物，表面形成有所述ACE2靶向肽。
所述的多聚体混合物包括共价键连接的化合物或纳米颗粒，所述的微生物包括工程化的噬菌体。
若为纳米颗粒，表面修饰有ACE2靶向肽；
若为共价键连接的化合物，通过化合键表面修饰有ACE2靶向肽；
若为工程化的噬菌体，通过基因工程将ACE2靶向肽展示在噬菌体表面。
这样形成的生物活性物质具有与ACE2靶向肽相同的生物医学功能，即靶向结合ACE2蛋白，阻断病毒与ACE2蛋白的结合。
本发明ACE2靶向肽或者生物活性物质在制备药物中应用。
三、一种多聚核苷酸序列，能够编码所述ACE2靶向肽。
四、一种多聚核苷酸序列，，能够编码所述生物活性物质。
五、一种用于治疗疾病的多肽类药物，包含所述ACE2靶向肽。
ACE2靶向肽、生物活性物质或者多肽类药物在靶向结合ACE2蛋白中应用。具体是在阻断病毒与ACE2蛋白结合、调节血压中应用。
本发明获得的ACE2靶向肽，能够特异性结合ACE2蛋白，阻断新型冠状病毒表面刺突蛋白与ACE2的相互作用，进而抑制新型冠状病毒的感染。ACE2靶向肽可作为病毒阻断药物，在疾病治疗及疫情控制领域具有广泛的应用前景。
发明人利用噬菌体12肽库，针对ACE2蛋白进行4轮筛选，通过单克隆测序并探索验证，最终得到了能够特异性结合ACE2蛋白的多肽序列。
相比于常规能特异性结合ACE2蛋白的ACE2蛋白抗体等，本发明的ACE2 靶向肽的优势在于：
(1)序列短小，合成生产成本低；
(2)多肽片段结构稳定，降低了运输保存的成本及难度；
(3)可通过多种方式进行给药。在抗击新型冠状病毒肺炎疫情领域，为病毒感染阻断药物的研发开拓了新的思路。
本发明的有益效果是：
本发明的多肽能够高效靶向ACE2蛋白，阻断新型冠状病毒刺突蛋白与ACE2蛋白的结合，进而起到抑制新型冠状病毒感染的作用。
本发明所述多肽对ACE2蛋白具有特异性靶向结合能力，为临床上新型冠状病毒感染的治疗及相关疫情的控制提供了新的思路。
附图说明
图1为实施例1中利用噬菌体12肽库对ACE2蛋白进行4轮筛选的过程中，每轮的输出/投入比图。
图2为实施例2中利用DNAStar软件对测序结果进行分析后，出现频次较高的10种多肽序列及其相应的频次图。
图3为实施例2中利用MEGA软件对多肽序列保守性分析的结果图。
图4为实施例3中通过酶联免疫吸附实验探究展示有10种不同多肽序列的噬菌体与ACE2蛋白的亲和能力结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明的实施例如下：
实施例1
利用通过噬菌体展示技术所构建的噬菌体12肽库，针对ACE2蛋白特异性结合阳性多肽进行四轮筛选。由于噬菌体12肽库的丰度大，在筛选过程中取10 μL的噬菌体12肽库进行筛选，实验通过以下的操作步骤，成功获得了能够高效靶向ACE2蛋白的多肽序列。
1.1、复苏、培养宿主菌E.coil.ER2738
制备LB固态培养板，置于37℃培养箱中预热1小时。使用挑菌棒，蘸取融化的E.coil.ER2738菌液，“Z”字形涂于LB平板表面，置于37℃培养箱中培养12小时。在摇菌管中加入5mL含有四环素的液态LB培养基中，使用无菌枪头挑取平板中的单克隆菌落，并将枪头置于培养基中。将培养管置于37℃摇床中，220rpm振荡培养，直至细菌处于对数生长中期。
1.2、ACE2蛋白质的包被
将500μL ACE2蛋白溶液加入24孔板中，并将24孔板置于湿盒中。将湿盒置于翘板摇床上，4℃过夜包被。
1.3、ACE2蛋白质的封闭
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入2mL 0.5％BSA封闭液。将孔板置于翘板摇床上，封闭1小时。
1.4、洗涤
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL无菌PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL无菌PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中多余的封闭液。
1.5、噬菌体12肽库与ACE2蛋白质的结合
取无菌EP管，加入1mL PBS溶液以及10μL噬菌体12肽库，通过涡旋进行混合。将混合液加入24孔板中，并将孔板置于翘板摇床上，室温孵育1小时。
1.6、洗涤
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL无菌PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL无菌PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤10次，从而彻底洗净孔板中与ACE2蛋白不结合或结合不牢固的噬菌体。
1.7、洗脱
使用移液枪将24孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL无菌PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL无菌PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤10次，从而彻底洗净孔板中与ACE2蛋白不结合或结合不牢固的噬菌体。
1.8、噬菌体滴度的测定
将LB/IPTG/Xgal平板置于37℃培养箱中预热1小时。将噬菌体溶液进行梯度稀释，取10μL稀释后的噬菌体溶液加入200μL处于对数生长期的E.coil. ER2738菌液中。静置15min。将感染后的噬菌体加到LB/IPTG/Xgal平板表面，使用无菌涂覆棒均匀涂开。将涂好的平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑并计数。
1.9、菌液的制备
将20mL的LB培养基置于250mL的无菌锥形瓶中，再加入1mL处于对数生长中期的宿主菌E.coil.ER2738。将锥形瓶置于37℃摇床中，220rpm振荡培养，直至细菌处于对数生长中期。
1.10、噬菌体的扩增及纯化
将中和后的噬菌体洗脱液加入20mL处于对数生长期的E.coil.ER2738菌液中。室温静置20min后，将菌液置于37℃摇床中，220rpm振荡培养4.5小时。之后将菌液倒入50mL离心管中，12000×g离心20min。将上清液倒入含有4 mL PEG/NaCl溶液的离心管中，置入4℃冰箱中，过夜沉降。第二天，将该离心管12000×g离心20min，弃上清液。在离心管中加入1mLPBS溶液，将沉淀重新溶解，并将重悬液转移至1.5mL EP管中，置于37℃摇床中，振荡1小时。之后将EP管12000×g离心10min，并将上清液转移至含有200mL PEG/NaCl 溶液的EP管中。将EP管置于4℃，静置1小时沉降噬菌体。之后将EP管12000 ×g离心20min，弃上清液，加入100μL PBS重悬沉淀。
1.11、第二到四轮的筛选
按照相同的步骤进行第二、三、四轮的筛选，将每一轮扩增纯化后的噬菌体溶液作为下一轮筛选的次级噬菌体肽库。每一轮筛选的噬菌体投入量保持一致，测定每轮筛选洗脱产物的滴度作为每轮噬菌体输出量，并计算每轮噬菌体的输出/投入比。
输出/投入比结果如图1所示，图1为利用噬菌体12肽库对ACE2蛋白特异性结合多肽的四轮筛选实验结果图。其中第一轮筛选的输出/投入比为5×10-6；第二轮筛选的输出/投入比为9.4×10-5；第三轮输出/投入比为2.64×10-3；第四轮输出/投入比为6.42×10-2。根实验结果显示输出/投入比逐轮递增，展示有ACE2 亲和肽的噬菌体得到有效富集。
1.12、噬菌体阳性单克隆
将第三轮及第四轮洗脱洗脱产物进行滴度测定。选择噬菌斑不超过100个的平板，随机挑取100个噬菌体蓝斑，加入100个含5mL LB培养基的摇菌管中，37℃220rpm振荡培养24小时。每个单克隆取700μL培养物加入含300μL 甘油(50％)溶液的EP管中，混匀后放入-80℃冰箱保存。剩余菌液进行测序处理。
分析噬菌体单克隆的DNA序列
根据测序结果，找到插入的外源DNA序列，并根据三联密码子的原则翻译出相应的氨基酸序列。使用DNAStar软件分析多肽的氨基酸序列，使用MEGA 软件分析多肽序列的保守性。
结果如图2、图3所示。图2为阳性单克隆噬菌体出现频次大于2的多肽序列及其重复次数。其中展示有FPHWHGNHKHNR多肽序列的噬菌体出现5次， 3种多肽序列的出现3次，另外6种多肽序列出现2次。
图3为多肽序列的保守性Logo图，图中的每个字母的高度与该位置的相应氨基酸残基出现的频率成正比。从图中可见组氨酸出现的频率较高。
测试：通过噬菌体酶联免疫吸附实验检测阳性噬菌体与ACE2蛋白的亲和力
S1、阳性单克隆噬菌体的扩增及纯化
从-80℃冰箱中取出冻存的E.coil.ER2738菌种，使用枪头挑取少量冰渣加入到含有6mL LB培养基(含四环素)的摇菌管中，37℃220rpm振荡培养过夜。在11个250mL锥形瓶中加入20mL LB培养基，高温高压灭菌后加入500μL 过夜培养的菌液。37℃220rpm振荡培养直至细菌处于对数生长中期。
从-80℃冰箱中取出冻存的10个阳性单克隆噬菌体样品及1个野生噬菌体样品，待样品融化后取100μL加入11个锥形瓶中。室温静置20min后，放入37℃摇床中，220rpm振荡培养4.5小时。取培养液加入11个50mL离心管中12000 ×g离心20min。将上清液倒入11个含有4mL PEG/NaCl溶液的离心管中，置入4℃冰箱中，过夜沉降。第二天，将该离心管12000×g离心20min，弃上清液。在离心管中加入1mL PBS溶液，将沉淀重新溶解，并将重悬液转移至1.5mL EP管中，置于37℃摇床中，振荡1小时。之后将EP管12000×g离心10min，并将上清液转移至含有200mL PEG/NaCl溶液的EP管中。将EP管置于4℃，静置1小时沉降噬菌体。之后将EP管12000×g离心20min，弃上清液，加入 100μL PBS重悬沉淀。
S2、ACE2蛋白的包被及封闭
将ACE2蛋白溶液加入96孔板中，并将96孔板置于湿盒中。将湿盒置于翘板摇床上，4℃过夜包被。使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入200μL 0.5％BSA封闭液。将孔板置于翘板摇床上，封闭1小时。
S3、洗涤
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中与ACE2蛋白结合或结合不牢固的噬菌体。
S4、阳性单克隆噬菌体与ACE2蛋白的结合
在96孔板中加入相同浓度的11种噬菌体，室温孵育1小时。
S5、洗涤
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次，从而彻底洗净孔板中与ACE2蛋白不结合或结合不牢固的噬菌体。
S6、一抗结合
在96孔板中加入噬菌体pVIII蛋白抗体，将平板放入37℃培养箱中静置1 小时。
S7、洗涤
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤6次。
S8、二抗结合
在96孔板中加入偶联辣根过氧化物酶的二抗，将平板放入37℃培养箱中静置1小时。
S9、洗涤
使用移液枪将96孔板中的液体洗净，并在无菌滤纸上拍甩孔板以彻底除净液体。加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。5min后再次吸弃并拍甩孔板中的液体，加入1mL PBST溶液，并将孔板置于翘板摇床上。重复该步骤3次。
S10、显色
在96孔板中加入显色底物TMB，将平板放入37℃培养箱中静置15min。
S11、终止
在96孔板中加入2M硫酸溶液终止反应。
S12、结果的测量
通过酶标仪测量450nm处的吸光光度值。保存结果并进行分析。
结果如图4所示，10种工程型噬菌体与ACE2蛋白结合的强度均高于野生型噬菌体，其中展示有FPHWHGNHKHNR、LSPHFHHHRGAK、 LHRPHFHAHNNS序列的噬菌体与ACE2蛋白的结合明显强于其他噬菌体。
本发明涉及的基因和蛋白序列如下：
SEQ ID No.1；
名称：ACE2靶向肽1的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
UUUCCGCAUUGGCAUGGUAAUCAUAAACAUAAUCGU
SEQ ID No.2；
名称：ACE2靶向肽2的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGUUUUAAAAGCCAUUUUCAUCAUAAUCAUAUGCGU
SEQ ID No.3；
名称：ACE2靶向肽3的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GCACAUUAUCAUCGUCAUCCGCCGCAUCUGAAUCGU
SEQ ID No.4；
名称：ACE2靶向肽4的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
CUGAGCCCGCAUUUUCAUCAUCAUCGUGGUGCAAAA
SEQ ID No.5；
名称：ACE2靶向肽5的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
AUGGAAACCCGUCCGGUUGCACCGCAUGAAUUUCGU
SEQ ID No.6；
名称：ACE2靶向肽6的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
CUGCAUCGUCCGCAUUUUCAUGCACAUAAUAAUAGC
SEQ ID No.7；
名称：ACE2靶向肽7的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGUCAUCAGGGUCAUUGGUAUGGUAUGUUUCGUGCA
SEQ ID No.8；
名称：ACE2靶向肽8的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
UAUCCGUGGCAUCAUCGUCAUAUGCCGGUUCAUCCG
SEQ ID No.9；
名称：ACE2靶向肽9的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
AGCCAUAAACAUCAUCAUUGGCCGUAUCAUGCACAU
SEQ ID No.10；
名称：ACE2靶向肽10的氨基酸序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
UUUCAUGGUCAUGGUAGCCAUCAUAAUAAACAUCGU。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种靶向结合ACE2蛋白的ACE2靶向肽及其用途
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcaggcag gaacaaaaca aacg 24
<210> 2
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gguuuuaaaa gccauuuuca ucauaaucau augcgu 36
<210> 3
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcacauuauc aucgucaucc gccgcaucug aaucgu 36
<210> 4
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cugagcccgc auuuucauca ucaucguggu gcaaaa 36
<210> 5
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
auggaaaccc guccgguugc accgcaugaa uuucgu 36
<210> 6
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cugcaucguc cgcauuuuca ugcacauaau aauagc 36
<210> 7
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggucaucagg gucauuggua ugguauguuu cgugca 36
<210> 8
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uauccguggc aucaucguca uaugccgguu cauccg 36
<210> 9
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agccauaaac aucaucauug gccguaucau gcacau 36
<210> 10
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uuucaugguc augguagcca ucauaauaaa caucgu 36

Claims (9)

1.一种ACE2靶向肽，其特征在于：所述ACE2靶向肽为多肽，氨基酸序列选自FPHWHGNHKHNR、GFKSHFHHNHMR、AHYHRHPPHLNR、LSPHFHHHRGAK、METRPVAPHEFR、LHRPHFHAHNNS、GHQGHWYGMFRA、YPWHHRHMPVHP、SHKHHHWPYHAH、FHGHGSHHNKHR其中之一。
2.一种生物活性物质，其特征在于：
包含权利要求1所述ACE2靶向肽；
包括微生物、多聚体混合物，表面形成有所述ACE2靶向肽。
3.根据权利要求2所述的一种生物活性物质，其特征在于：
所述的多聚体混合物包括共价键连接的化合物或纳米颗粒，所述的微生物包括工程化的噬菌体。
4.权利要求1所述ACE2靶向肽或者权利要求2所述生物活性物质的应用，其特征在于：在制备药物中的应用。
5.一种多聚核苷酸序列，其特征在于：能够编码权利要求1所述ACE2靶向肽。
6.一种多聚核苷酸序列，其特征在于：能够编码权利要求2所述生物活性物质。
7.一种多肽类药物，其特征在于，包含权利要求1所述ACE2靶向肽。
8.权利要求1所述ACE2靶向肽、权利要求2所述生物活性物质或者权利要求7所述多肽类药物的应用，其特征在于：在靶向结合ACE2蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
在阻断病毒与ACE2蛋白结合、调节血压中的应用。
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