CN103590116A

CN103590116A - 一种低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法

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Publication number: CN103590116A
Application number: CN201310564121.4A
Authority: CN
Inventors: 刁有江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明属于多肽药物技术领域，具体涉及到一种低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法，其特征在于：以细菌为靶细胞，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽，并经阳性克隆、ssDNA测序、合成亲和肽和抗菌活性测定进行高通量筛选抗菌肽先导化合物；以大肠杆菌细胞为靶目标，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽，其中一条10肽亲和肽的氨基酸序列为QKRPRVRLSA 。本发明从噬菌体肽库中，通过亲和筛选的方法，可以从特定长度的随机肽中，高通量筛选得到具有特定生物活性的多肽如抗菌肽等，通过此策略可快速筛选到抗菌肽先导化合物，提高了抗菌肽新药创制的速度。

Description

一种低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法。

背景技术

病原细菌对临床抗菌药物耐药性的迅速增长和传播，已成为危害公共健康最为严重的问题之一。多重耐药大肠杆菌的出现，给临床治疗造成严重困难。开发安全有效又不容易产生耐药性的新型抗菌药物是摆在我们面前的重要课题。

传统药物的开发一般是从自然界的动物、植物和微生物中分离出具有特定药理作用的化学物质或蛋白质(多肽)，作为药物研究的先导化合物，再经过进一步的设计、改造及合成有效的功能药物；而对于蛋白质(多肽)，则一般通过基因工程手段进行改造发展成基因工程药物。目前大部分药物是通过这些方法获得的。

抗菌肽是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。一般由12到100个氨基酸组成。抗菌肽作为机体的有效防御分子广泛存在。目前已经从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖类动物以及哺乳动物中鉴定出上千种抗菌肽。

抗菌肽的发现和快速发展为开发新型抗菌肽类抗菌药物提供了巨大的资源库，也为解决临床耐药株的问题提供了极大可能。随着生物技术的进步，目前人们既可以从生物体内直接分离纯化得到抗菌肽，也可以利用基因工程手段重组得到抗菌肽，又可以直接利用化学合成手段来合成大量的抗菌肽。天然来源的抗菌肽会因为分子量较大存在免疫原性，对宿主细胞有细胞毒作用，或引起溶血等方面的问题，限制了抗菌肽作为抗菌药物的推广应用。因此，寻找分子量更小，抗菌活性更强，尤其不能存在细胞毒以及溶血等不良作用的抗菌肽，是抗菌肽类药物开发的关键。

噬菌体随机肽库(phage random peptide library)，它是以感染性丝状噬菌体为载体，将一段人工合成的随机序列DNA片段，通过基因工程手段插入其编码外壳蛋白的基因中，这个外源DNA片段所编码的多肽可与噬菌体外壳蛋白一起以融合蛋白的形式展示于活的噬菌体表面衣壳上，并保持相对独立的空间构象和生物活性，同时不影响该重组噬菌体感染宿主菌的能力。每个噬菌体病毒粒子的表面只能展示一种外源随机肽，所有展示不同多肽的噬菌体集合就构成了随机肽库。然后通过目标蛋白对噬菌体随机肽库进行亲和筛选，富集那些展示能与目标蛋白发生结合的肽的噬菌体(即相应的噬菌体抗原肽)，而且这种展示有抗原肽的噬菌体可以在大肠杆菌中大量增殖，因此一旦获得了展示有特异性肽的一个重组噬菌体，那么此噬菌体就可以成为特异性肽的无限来源。

噬菌体肽库的主要优点就是成本低，能够在体外扩增，可以简单而迅速地得到大量目标噬菌体肽。从理论上来说，噬菌体随机肽库只要足够大，就可以从中筛选到任何所需要的多肽序列，而且有可能筛选到自然界根本不存在的某些序列。

任何药物都是通过受体发挥作用的，这就需要药物与受体发生特异性结合，而受体一般都是蛋白质或核酸，这种相互结合的位点就为药物筛选与设计提供科学依据，避免药物筛选的盲目性。噬菌体肽库展示技术是寻找抗菌肽的理想工具，其具体过程是：先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，接着洗涤除去非特异性结合噬菌体，将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的淘选；继续重复淘选、洗脱、扩增，最终淘选出特异结合的重组噬菌体克隆。

现有抗菌药物的开发技术存在以下缺点：1）传统药物的开发一般是从自然界中分离出具有特定药理作用的化学物质，作为药物研究的先导化合物，再经过进一步的设计、改造及合成有效的功能药物；而对于蛋白质(多肽)，则一般通过基因工程手段进行改造发展成基因工程药物。这种方法往往周期长、风险高、耗资巨大，在随机筛选过程中带有很大的盲目性；2）基于药物靶标的靶向药物设计是新药筛选的一个重要方向。药物靶标是指体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子，如蛋白质、核酸等。基于药物靶标的药物发现过程是：利用基因组学、蛋白质组学以及生物芯片技术等获取病原体相关的生物分子信息，通过进行生物信息学分析，然后对相关的生物分子进行功能研究，以确定候选药物作用靶标，针对候选药物作用靶标，设计小分子化合物，在分子、细胞和整体动物水平上进行药理学研究，验证靶标的有效性。虽然分子生物学实验技术取得了很大进步，但药靶的发现是其中的发展瓶颈。同理，在新药发现中，药物靶标也是基于药靶分子的噬菌体肽库亲和筛选的发展瓶颈。

发明内容

为克服现有技术的缺点，本发明提供了一种工艺简单可行、成本低、效率高的高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法，其特征在于其步骤为：

a）对噬菌体展示随机肽库进行扩增；所述噬菌体展示随机肽库为噬菌体随机10肽库～噬菌体15肽库；

b）以细菌为靶细胞，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽，进行亲和淘选3～4轮，用ELISA法挑选阳性克隆；

c）将目的阳性克隆进行ssDNA测序，根据推导出的亲和肽氨基酸序列，合成亲和肽；

d）对亲和肽的抗菌活性测定。

优选的，步骤b）中，以大肠杆菌细胞为靶目标，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽。

更进一步的，步骤b)和c）中，以大肠杆菌细胞为靶目标，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽，其中一条10肽亲和肽的氨基酸序列为QKRPRVRLSA。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明以细菌作为靶细胞，从噬菌体肽库中，通过亲和筛选的方法，可以从特定长度的随机肽中，高通量筛选得到与细菌表面特异性结合的具有抗菌活性的多肽，作为新型肽类抗菌药物的先导化合物，突破了现代新药筛选中的药靶瓶颈，具有工艺简单可行、成本低、效率高等优点。通过此策略可快速筛选到抗菌肽先导化合物，提高了抗菌肽新药创制的速度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例：

一、实验材料

1、菌株

大肠杆菌(Escherichia coli) TG1，辅助噬菌体M13KO7均为山东农业工程学院实验室保存。

2、主要试剂

噬菌体展示10肽库为山东农业工程学院实验室构建（库容1.36×10⁸），HRP－M13抗体购自华美公司，96孔酶标板为Nunc公司产品，ELISA试剂均为华美公司产品。

主要溶液的配制：

PBS：

1×PBS：133mmol/l NaCl

3mmol/L KCl，

8mmol/L Na₂HPO₄

1.5mmol/L KH₂PO₄

1 0×PBS：80.0gNaCl

2.0gKCl

11.5gNa₂HPO₄·7H₂O

20.0gKH₂PO₄

溶于1升H₂O中，调至pH 7.5，高压灭菌。

PBS-Tween 20 (PBST)：

1升1×PBS中加入1ml 吐温（Tween）－20。

PBSM： 100ml PBS中加入2g脱脂奶粉，离心取上清液。

50mmol/L甘氨酸－HCl (Gly-HCl)，pH 2.0：（1mol/L 贮存液）

111.6g 甘氨酸

溶于1L H₂O中，HCl调成pH2.0，高压灭菌。

200mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)：（1mol/L 贮存液）

44.16g NaH₂PO₄·2H₂O

450.66g Na₂HPO₄·7H₂O

溶于1LH₂O中，高压灭菌。

20%PEG-8000/2.5M NaCl：

200.0g polyethylene glycol 8000

146.1g NaCl

溶于1LH₂O中，0.22um滤膜过滤除菌。

邻苯二胺(OPD)底物缓冲液：

2.84g Na₂HPO₄·7H₂O

2.10g Citric Acid

溶于100mlH₂O中，pH5.0。

M9培养基平板的配制：

瓶1： 0.6g Na₂HPO₄

0.3g KH₂PO₄

0.1g NH₄Cl

将上述试剂溶于50 ml H₂O中，NaOH调至pH7.4。

瓶2：1.5g 琼脂粉溶于50 ml H₂O中。

将瓶1、瓶2高压灭菌后，冷却至50℃～60℃时加入1mol/L MgCl₂0.1 ml、1mol/LCaCl₂0.1 ml、1mol/L葡萄糖0.5 ml、0.5mol/L维生素B₁0.2 ml，立即将瓶1、瓶2混匀倒平板。

3、主要仪器

DG5031型酶联免疫检测仪，华东电子集团公司医疗电子仪器厂；

JJT-7B洁净工作台，北京半导体设备一厂；

THZ-C恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；

DF-C型恒压恒流电泳仪，北京东方仪器厂；

DYY-Ⅲ23A型电泳槽，北京市六一仪器厂；

DYY-Ⅲ31B型电泳槽，北京市六一仪器厂；

台式冷冻离心机 Sigma 1K15，Sigma公司；

二、实验过程

1. 淘选过程

1.1 噬菌体展示随机10肽库的扩增

1.1.1 从M9平板培养基上挑取TG1单菌落于3ml LB培养基，37℃振荡培养过夜。1:100转接至50ml LB培养基中，摇至对数期。取原库10ul (10¹²CFU/mL)，于37℃摇床低速(70-90rpm)感染30min。再加入M13KO7，使感染系数达到10:1(M13K07:宿主菌＝10:1)。37℃摇床低速感染30min. 取出菌液，5000 rpm 离心10分钟。去上清，将菌体重悬至200ml 2YTAK (2×YT，含100ug/ml 氨苄青霉素，50ug/ml卡那霉素)。37℃210rpm 振荡培养12~16小时。

1.1.2 取菌液5000rpm离心10分钟，取上清。加1/4 体积的PEG/NaCl，振荡混匀，冰上放置1小时。4℃12000rpm离心20分钟，去上清。适量PBS重悬沉淀，使沉淀尽量溶解。10000rpm 离心10分钟。取上清，加1/4 体积PEG/NaCl，振荡混匀，冰上放置1小时。4℃12000rpm离心20分钟，去上清。适量PBS重悬溶解，10000rpm离心10分钟。取上清，即得扩增后的噬菌体库。

1.1.3 用灭菌的PBS溶液梯度稀释噬菌体液，取9次，10次，11次的稀释液各50ul，加入已经转接培养到对数期的新鲜TG1菌液50ul，混匀，37℃温育20分钟。全部涂含Amp100ug/ml的LB固体平板。37℃温箱培养过夜。次日计单菌落数，计算滴度。

1.2 细菌亲和肽的亲和淘选

1.2.1包被 1×PBS稀释大肠杆菌菌悬液（2.5 x10⁸CFU/ml），100ul包被酶标板。以100ul PBS包被空白对照孔。37℃，孵育1小时4℃静置过夜。

1.2.2．封闭吸出包被液。2%PBSM加满各孔，37℃静置2小时，或4℃包被过夜。

1.2.3．结合吸出封闭液，如前所述以PBST和PBS各洗涤2-3次，拍尽洗涤液。各孔加入100ul以封闭液稀释的随机肽库液体（噬菌体滴度大于库容量的1000倍），37℃缓慢摇动或静置2个小时。

1.2.4．洗脱吸出噬菌体液，PBST洗10次，PBS洗10次，拍尽洗涤液，以除去未结合的噬菌体粒子。各孔加入100ul甘氨酸－HCl (pH2.0)，37℃缓慢摇动或静置15分钟。吸出洗脱液，加等体积pH 7.5 磷酸钠缓冲液中和。

1.2.5. 测滴度各孔取10ul中和液进行梯度稀释，取2，3，4次稀释度，按照1.1.3 测滴度，计算洗脱噬菌体总数。

1.2.6扩增剩余的洗脱噬菌体液加入到3ml新鲜TG1溶液中，吸附30-60min。加M13K07，使感染系数达到10:1，吸附30～60min。5000rpm10min离心菌体，重悬至3ml 2×YTAK中。37℃210rpm振荡培养12~16小时。按照1.1的步骤提取噬菌体，并测得扩增后的滴度。(对照孔所得噬菌体液无需扩增)

1.2.7 重复淘选后面2-3轮筛库，步骤同第一轮淘选。

2. 阳性克隆的挑选

2.1随机挑选噬菌体克隆

2.1.1.从最后一轮保存的平板上，随机挑选20个分离良好的单菌落，于3ml

LB(Amp100ug/ml)中37℃振荡培养过夜。1:100转接于3ml LB(Amp)中振荡培养至对数期。各加入M13K07使感染系数达到10。缓慢振荡30min。5000rpm10min，离心菌体。弃上清，将菌体重悬至3ml LBAK或2×YTAK中，37振荡12至16小时。

2.1.2.如1.1.2所述，提取噬菌体。

2.2 用ELISA方法初步挑选阳性克隆

2.2.1. 包被取PBS稀释的目的菌悬液100ul（2.5 x10⁸CFU/ml），包被酶标板，4℃静置过夜。

2.2.2．封闭吸出包被液，加200ul 2%PBSM，37℃静置2小时或4℃过夜。

2.2.3．结合吸出封闭液，如前所述地洗涤，每孔加入100ulPBSM稀释的单克隆噬菌体液，37℃静置2小时。

2.2.4．抗体结合甩出噬菌体液，洗涤。每孔加入以封闭液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的M13噬菌体抗体100ul，37℃静置2小时。

2.2.5．显色甩出抗体溶液，洗涤。各加100ul OPD(TMB)显色底物溶液，37℃于黑暗处显色30min。

2.2.6. 终止加入2mol/L的H₂SO₄溶液50ul，终止反应。

2.2.7. 读取各孔450nm处的吸光度值。记录数据。从中挑出ELISA 阳性克隆进行测序。

3. 合成亲和肽

将目的阳性克隆提取其ssDNA，利用- 96位测序引物，使用ABI PR ISM310 型DNA全自动测序仪测序，序列采用DNARUNR软件进行分析。采用多肽合成仪合成亲和肽。

4. 对亲和肽的抗菌活性测定。

微量肉汤稀释法测定亲和肽的抗菌活性的药敏试验：

参考2009年美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)出版的抗菌药物敏感试验执行标准第十九版信息增刊M100-S19的药敏试验方法，采用微量液基稀释法对大肠杆菌临床分离株进行亲和肽药物敏感性试验，质控菌株为ATCC25922。亲和肽最大工作浓度为1024μg/mL，溶媒为10 mM PBS。具体方法如下：

在普通营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于3mlMH肉汤培养基，37oC培养3.5～4h，使其OD600值达到0.25～0.3，取50μl用MH肉汤作1：600倍稀释，备用，稀释液在15分钟内加入反应体系。在96孔酶标板的每孔加营养成分含量为2倍浓度的MH肉汤50μl，然后在酶标板第一排孔加亲和肽稀释液50μl，用八道移液器混匀，吸取50μl加入第二排孔，混匀后，吸取50μl加入第三排孔，以此类推至第十一排孔，第十一排孔混匀后吸取50μl弃去。将已校正浓度的待测菌液100μl依次加入酶标板的第1～11排孔中，盖盖儿，震荡0.5～1分钟，装入封口塑料袋，37oC培养16～18h后观察结果。每次试验用质控标准菌株作对照。实验结果：

得到56个ELISA 阳性克隆，随机挑取1个阳性克隆，使用ABI PR ISM310 型DNA全自动测序仪测序，序列采用DNARUNR软件进行分析。通过测序结果，我们推导出相应的10肽亲和肽序列为谷氨酰胺-赖氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸（QKRPRVRLSA）。

经药敏试验结果，发现该亲和肽对大肠杆菌具有较好的抗菌活性（MIC=16～32μg/mL）。

Claims

1.一种低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法，其特征在于其步骤为：

d）对亲和肽的抗菌活性测定。

2.根据权利要求1所述的低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法，其特征在于：步骤b）中，以大肠杆菌细胞为靶目标，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽。

3.根据权利要求2所述的低成本、高通量筛选抗菌肽先导化合物的方法，其特征在于：步骤b）和c）中，以大肠杆菌细胞为靶目标，从噬菌体展示随机肽库中淘选与细菌细胞表面特异结合的多肽，其中一条10肽亲和肽的氨基酸序列为QKRPRVRLSA。