CN113502288A - 反义寡核苷酸及其在抑制新冠病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一系列反义寡核苷酸序列，含有其的药物组合物或试剂盒以及抑制病毒复制的用途。所述反义寡核苷酸包括：SEQ ID NO：1～128任一所示的核苷酸序列中的至少13个连续核苷酸构成的核苷酸片段。利用本发明的反义寡核苷酸可以有效地抑制病毒的复制，降低细胞内病毒含量，起到治疗因病毒感染而引发的疾病的效果，尤其适用于新型冠状病毒的治疗。

Description

反义寡核苷酸及其在抑制新冠病毒中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及反义寡核苷酸及其在抑制新冠病毒中的应用。

背景技术

新型冠状病毒COVID-19引起的严重急性呼吸道感染对全球健康构成了巨大威胁，目前，尚无针对新型冠状病毒感染的特效治疗方法，根据国家卫健委最新发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中推荐的药物治疗方案，主要的药物治疗分为抗病毒治疗、抗菌(细菌和真菌)治疗和针对危重症患者的特殊治疗三大类。其中，明确给出的抗病毒药物包括α-干扰素、洛匹那韦/利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹和阿比多尔；强调抗菌药物避免盲目或不恰当使用，尤其是广谱抗菌药物的联合使用，并未给出具体的药物品种；对于危重症患者的治疗，可考虑使用糖皮质激素和血必净。

目前针对新冠肺炎尚无特效抗病毒药物，所有的药物选择都是基于既往SARS和MERS 或其他新型流感病毒的治疗经验，其中所涉及到药物治疗的有效性和安全性仍有待在临床治疗和研究中进一步证实，积极的对症支持治疗仍是救治的关键。

3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3C-like protease，3CLPro)是冠状病毒复制所必须的酶，可作为有效的抗病毒药物靶点。3CLPro是新型冠状病毒产生的主要的蛋白酶，冠状病毒大多数功能蛋白(非结构蛋白)由ORF1ab基因编码，先翻译成一个多蛋白体(7096aa)，再由3CLPro切割成多个有活性的蛋白如病毒复制蛋白RdRp。由于人体内没有与3CLPro类似切割位点的蛋白酶，可筛选出高特异性的抑制剂，具有更好的安全性。目前未有报道针对3CLPro的特异性小分子化药。

RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是除逆转录病毒外的其他RNA病毒复制所必须的酶，复制形成新的病毒RNA。RdRp复制正义链，产生负义链，再以负义链为模板，生成大量的正义链，完成了RNA的复制。新的病毒RNA和通过水解酶产生的蛋白质结合，组装成了大量的新的病毒，释放出原宿主细胞。目前批准的核苷类似物(favipiravir和利巴韦林)和实验性核苷类似物(瑞德西韦和galidesivir)都是以此为靶点。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决了现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了反义寡核苷酸、含有其的药物组合物、试剂盒及其用途和抑制病毒复制的方法，利用该反义寡核苷酸可以有效地抑制病毒的复制，降低细胞内病毒含量，起到治疗因病毒感染而引发的疾病的效果，尤其适用于新型冠状病毒的治疗。

本发明提出了一种反义寡核苷酸(ASO)。根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸包括：SEQ ID NO：1～128任一所示的核苷酸序列中的至少13个连续核苷酸构成的核苷酸片段。

本发明针对3CLPro和RdRP分别设计了多条反义寡核苷酸，并测试了其对新型冠状病毒的抑制潜力，发现上述反义寡核苷酸可以有效地结合于病毒RNA的不稳定区域(如发卡结构、多分支环、膨胀环等)，尤其是新型冠状病毒，抑制复制关键基因3CLPro和RdRP 的表达，从而抑制病毒的复制，降低细胞内病毒含量。并且，上述序列与人基因组序列同源性低，因而不会干扰人正常基因的表达调控。由此，为病毒复制、治疗病毒感染所引发的疾病奠定了理论研究和临床应用基础，有望治疗新型冠状病毒引发的疾病，应用价值高。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸包括至少一个被修饰的核苷酸。由此，有助于核苷酸与病毒RNA结合。

根据本发明的实施例，所述被修饰的核苷酸选自下列至少之一：5'-硫代磷酸酯基(PS) 的核苷酸、5-甲基化胞嘧啶核苷酸(5-mC)、2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-2-甲氧乙基(2'-MOE)修饰的核苷酸、2'-氟代(2'-F)修饰的核苷酸、3'-氮取代(3'-NP)修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸(PMO)、多肽核苷酸(PNA)。由此，以便于核苷酸特异性识别并结合于病毒上。

5'-硫代磷酸酯基(PS)的结构为：

经过锁核酸(LNA)修饰的鸟嘌呤(GL)、腺嘌呤(AL)、胸腺嘧啶(TL)、5-甲基化胞嘧啶核苷酸(5mCL)的结构分别如下所示：

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸的长度至少为16个核苷酸。由此，以便于核苷酸特异性识别并结合于病毒上。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸的长度为16～25个核苷酸。由此，以便于核苷酸特异性识别并结合于病毒上。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸靶向作用于3CLPro蛋白(例如SEQ IDNO： 148所示核苷酸编码的蛋白)或RdRp蛋白(例如SEQ ID NO：149所示核苷酸编码的蛋白)。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸靶向作用于SEQ ID NO：135～137任一所示的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸具有如SEQ ID NO：138～142任一所示的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸靶向作用于SEQ ID NO：143～147任一所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述的反义寡核苷酸；以及药学上可接受的辅料。由此，根据本发明实施例的药物组合物可以用于抑制复制关键基因的表达，从而抑制病毒的复制，降低细胞内病毒含量，用于治疗感染病毒所引发的疾病，尤其是新冠病毒的治疗。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述的反义寡核苷酸。由此，根据本发明实施例的试剂盒可以用于抑制复制关键基因的表达，从而抑制病毒的复制，降低细胞内病毒含量，尤其适用于抑制新冠病毒复制。进一步地，可以采用该试剂盒对是否感染病毒(尤其是新型冠状病毒)进行诊断，具体地，将上述反义寡核苷酸与细胞接触，测定接触前后细胞中的3CLPro或RdRP基因表达量变化，若该基因表达量降低，则表明其表达受到抑制，可以初步判断细胞中含有病毒(尤其是新型冠状病毒)。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制病毒复制的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述反义寡核苷酸与病毒接触。通过将前述反义寡核苷酸与病毒接触，核苷酸序列可以结合到病毒RNA上，抑制复制关键基因的表达，从而抑制病毒的复制，清除细胞内病毒含量。

根据本发明的实施例，所述病毒为冠状病毒。

根据本发明的实施例，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸抑制3CLPro基因表达。由此，可以有效地抑制病毒的复制。

根据本发明的实施例，所述反义寡核苷酸抑制RdRp基因表达。由此，可以有效地抑制病毒的复制。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述反义寡核苷酸在制备药物或试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述药物或试剂盒用于抑制病毒复制。前述反义寡核苷酸可以有效地与病毒RNA结合，抑制病毒复制关键基因的表达，从而抑制病毒的复制，清除细胞内的病毒。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗因感染病毒而引发的疾病。通过对机体施加含有上述反义寡核苷酸的药物，可以抑制病毒复制，从而起到治疗目的。

根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断是否感染病毒。如前所述，上述反义寡核苷酸可以抑制病毒中的3CLPro或RdRP基因表达。进而，可以使反义寡核苷酸与细胞接触，测定接触前后细胞中的3CLPro或RdRP基因表达量变化，若该基因表达量降低，则表明其表达受到抑制，可以初步判断细胞中含有病毒。

根据本发明的实施例，所述病毒为冠状病毒。

根据本发明的实施例，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。

根据本发明的实施例，所述药物用于抑制3CLPro基因表达。由此，可以有效地抑制病毒的复制。

根据本发明的实施例，所述药物用于抑制RdRp基因表达。由此，可以有效地抑制病毒的复制。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了本发明实施例1的实时定量PCR检测结果示意图；

图2显示了本发明实施例5的小鼠血液ALT和AST表达水平分析示意图；

图3显示了本发明实施例5的小鼠血液ALB和T-BIL表达水平分析示意图；

图4显示了本发明实施例5的小鼠血液CRE和BUN表达水平分析示意图；

图5显示了本发明实施例5的小鼠肝HE染色图，其中白色箭头表示炎性细胞浸润，黑色箭头表示肝细胞变性坏死；

图6显示了本发明实施例5的小鼠肾HE染色图；

图7显示了本发明实施例6的小鼠肝体比、肾体比和肺体比分析示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

“药学可接受的载体”在本领域中是公认的，包括适于将本发明的化合物施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。所述载体包括参与携带主体物质或将其从一个器官或机体的一部分转移到另一个器官或机体的另一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。各载体在与制剂中的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素、粉状西黄蓍胶、麦芽、明胶、滑石粉，赋形剂如可可脂和栓剂蜡类；油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中所用的其它无毒的可相容的物质。

在组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

本发明的药物组合物包括适于口服、鼻、局部、口含、舌下、直肠和/或胃肠外施用的那些。制剂可以方便地以单位剂型形式存在并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。可以与载体物质组合来制备单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗作用的化合物的量。一般而言，以百分之一为单位，该量为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10至约30％。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

3CLPro基因具有如SEQ ID NO：148所示的核苷酸序列：

agtggt tttagaaaaa tggcattccc atctggtaaa gttgagggtt gtatggtacaagtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtgatctgcacct ctgaagacat gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatttcttggtaca ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagcttaaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg acagactttttcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc tatgaggccc aatttcactattaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg ttttaacata gattatgact gtgtctctttttgttacatg caccatatgg aattaccaac tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttatggaccttttg ttgacaggca aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttagcttggttgta cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatgactttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat actaggacctctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa agaattactg caaaatggtatgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga tgaatttaca ccttttgatg ttgttagacaatgctcaggt gttactttcc aa

RdRp基因具有如SEQ ID NO：149所示的核苷酸序列：

cgggtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca ccgtgcggca caggcactag tactgatgtcgtatacaggg cttttgacat ctacaatgat aaagtagctg gttttgctaa attcctaaaa actaattgttgtcgcttcca agaaaaggac gaagatgaca atttaattga ttcttacttt gtagttaaga gacacactttctctaactac caacatgaag aaacaattta taatttactt aaggattgtc cagctgttgc taaacatgacttctttaagt ttagaataga cggtgacatg gtaccacata tatcacgtca acgtcttact aaatacacaatggcagacct cgtctatgct ttaaggcatt ttgatgaagg taattgtgac acattaaaag aaatacttgtcacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag gactggtatg attttgtaga aaacccagatatattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa cgtgtacgcc aagctttgtt aaaaacagta caattctgtgatgccatgcg aaatgctggt attgttggtg tactgacatt agataatcaa gatctcaatg gtaactggtatgatttcggt gatttcatac aaaccacgcc aggtagtgga gttcctgttg tagattctta ttattcattgttaatgccta tattaacctt gaccagggct ttaactgcag agtcacatgt tgacactgac ttaacaaagccttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta aaactctttg accgttattttaaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac tgtttggatg acagatgcat tctgcattgtgcaaacttta atgttttatt ctctacagtg ttcccaccta caagttttgg accactagtg agaaaaatatttgttgatgg tgttccattt gtagtttcaa ctggatacca cttcagagag ctaggtgttg tacataatcaggatgtaaac ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatgcacgctgctt ctggtaatct attactagat aaacgcacta cgtgcttttc agtagctgca cttactaacaatgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat gactttgctg tgtctaagggtttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc ttctttgctc aggatggtaa tgctgctatcagcgattatg actactatcg ttataatcta ccaacaatgt gtgatatcag acaactacta tttgtagttgaagttgttga taagtacttt gattgttacg atggtggctg tattaatgct aaccaagtca tcgtcaacaacctagacaaa tcagctggtt ttccatttaa taaatggggt aggctagac tttattatga ttcaatgagttatgaggatc aagatgcact tttcgcatat acaaaacgta atgtcatccc tactataact caaatgaatcttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc tctatctgta gtactatgaccaatagacag tttcatcaaa aattattgaa atcaat

实施例1：体外筛选细胞模型的建立

本实施例用于构建反义寡核苷酸的体外筛选细胞模型。

根据NCBI上公布的新冠病毒基因组数据(NC_045512.2，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/1798174254)，将RdRp和3CLPro的基因组序列构建到慢病毒质粒模板上，然后将目的质粒与慢病毒包装质粒PsPAX2和PMD2.G共同转染至HEK293T细胞中，转染后 48h和72h分别收集上清液，0.45μM滤膜过滤后，感染A549细胞株，同时加入8μg/ml的促转染试剂polybrene；感染24h后，加入2μg/ml的嘌呤霉素进行细胞株的筛选；筛选1 周后，提取细胞的总RNA，通过实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别来检测 RdRp和3CLPro序列的表达情况。其中用于扩增内参基因PPIB、RdRp和3CLPro的PCR 引物如表1所示：

表1：

实时定量PCR检测的结果如图1所示，相对于母本细胞A549，RdRp和3CLPro的过表达细胞株(A549-RdRp和A549-3CLPro)的相对表达水平高达50000倍以上，即细胞过表达模型构建成功。

实施例2：在体外细胞模型测试反义寡核苷酸的活性

本实施例用于检测反义寡核苷酸在体外对RdRp/3CLPro表达水平的抑制率。

将实施例1中的过表达细胞株(A549-RdRp和A549-3CLPro)分别用含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基接种细胞于12孔板，接种密度为1×10⁵细胞/孔，每孔1mL培养基，37℃培养过夜。

转染试剂配制：反义寡核苷酸的母液浓度为100μM，用Opti-MEM稀释1μl反义寡核苷酸(终浓度分别为100nM)，吹吸3-5次混匀；Opti-MEM稀释2μl Lipofectamine^TM2000，吹吸3-5次混匀。混合转染试剂和反义寡核苷酸稀释液，吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。

细胞处理：弃旧培养基，每孔加入含10％FBS RPMI-1640培养基，将转染复合物加至 12孔板中，轻摇细胞板混匀。置于37℃，5％CO₂培养箱培养24h。

24h后，提取细胞的总RNA，通过实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别来检测RdRp和3CLPro序列的表达情况。反义寡核苷酸对RdRp/3CLPRro mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验组RdRp/3CLPRro mRNA的表达量/实验组PPIBmRNA的表达量)/(阴性对照组RdRp/3CLPRro mRNA的表达量/阴性对照组PPIB mRNA的表达量)]×100％。其中，各实验组为分别经反义寡核苷酸处理的细胞；阴性对照组(记为Blank)为未经任何反义寡核苷酸处理的细胞。结果如表2所示。可以看出，下述128条反义寡核苷酸序列有部分序列可以有效地抑制RdRp基因或3CLPro基因的表达，有望抑制病毒的复制。

表2：

实施例3：在体外细胞模型测试修饰反义寡核苷酸的活性

本实施例用于检测修饰反义寡核苷酸mC1、mC8、mC28、mC29-1、mR9在体外对 RdRp/3CLPro表达水平的抑制率。

将实施例1中的过表达细胞株(A549-RdRp和A549-3CLPro)分别用含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基接种细胞于12孔板，接种密度为1×10⁵细胞/孔，每孔1mL培养基，37℃培养过夜。

转染试剂配制：反义寡核苷酸的母液浓度为200μM，用500μl含10％FBS R1640培养基分别稀释2.5μl，12.5μl ASO(终浓度分别为1μM，5μM)，振荡混匀。

细胞处理：弃掉旧培养基，尽快将稀释好的转染复合物加至细胞培养板中，加好后，将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱，培养24h后提取RNA。

24h后，提取细胞的总RNA，通过实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别来检测RdRp和3CLPro序列的表达情况。反义寡核苷酸对RdRp/3CLPRro mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验组RdRp/3CLPRro mRNA的表达量/实验组PPIBmRNA的表达量)/(阴性对照组RdRp/3CLPRro mRNA的表达量/阴性对照组PPIB mRNA的表达量)]×100％。其中，各实验组为分别经反义寡核苷酸处理的细胞；阴性对照组(记为Blank)为未经任何反义寡核苷酸处理的细胞。

结果如表3所示。由此，可以看出修饰的反义寡核苷酸可以作用于3CLPro基因靶区1 (SEQ ID NO：135)、3CLPro基因靶区2(SEQ ID NO：136)和RdRp基因靶区(SEQ ID NO：137)，有效地抑制RdRp/3CLPro的表达。

表3修饰反义寡核苷酸序列与抑制率

注：A＝腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，T＝胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，G＝鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，mC＝5'-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，L＝锁核酸修饰核糖核苷酸，s＝磷酸硫酸酯。

实施例4：体外真病毒模型测试修饰反义寡核苷酸的活性

本实例测试新冠病毒感染的Vero-E6细胞在不同受试药物存在的条件下，通过显微镜观察SARS-COV-2对Vero-E6细胞的细胞病变程度，反应LNA-ASO(mC1、mC8、mC28、 mC29-1、mR9)的作用效果，探究其对病毒的抑制效果。

试剂配制：称取一定量的粉末，用DMSO充分溶解稀释为50mM的母液，然后用培养基进行梯度稀释，其中mC6、mC8、mC9反应终浓度分别为1μM，4μM，8μM；mC1、 mC28、mC29-1反应终浓度分别为0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM，16μM。

细胞处理：将Vero E6细胞1×10⁴cell/100μL接种于96孔细胞培养板中，细胞在37℃和5％CO2培养箱中培养过夜后备用。

Vero E6细胞去上清，每孔加入50μL含2％FBS的DMEM维持培养基及梯度稀释的样品稀释液50μL，同时加入用含2％FBS的DMEM稀释的50μL病毒稀释液，轻摇混匀。实验为每个药物浓度双复孔检测。实验设置只加150μL维持培养基的孔为细胞对照孔，加 100μL维持培养基及50μL病毒稀释液的孔为病毒对照孔。将细胞板放入37℃、5％CO2 培养箱中培养。

在不同受试药物存在的条件下，通过显微镜观察SARS-COV-2对猴肾细胞系VeroE6 的CPE程度，检测核酸药物mC1、mC8、mC28、mC29-1和mR9在细胞水平上对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)复制的抑制效果。通过显微镜观察经药物处理Vero E6细胞的生长状态判断受检测样品的细胞毒性作用；通过观察经药物处理后病毒感染Vero E6细胞导致的病变效应(CPE)判断受检测样品对病毒复制的抑制作用。

样品mC6、mC8和mR9对病毒抑制效果如表4所示，细胞加药加病毒培养48h后，细胞毒性方面，受测试样品mC6、mC8和mR9在1μM和4μM浓度下没有明显的细胞毒性；在8μM浓度下会稍微影响细胞的生长，细胞比对照组细胞稍微稀一点；病毒抑制方面，细胞加药加病毒培养48h后，mC8的抑制效果最佳，在1μM浓度下可以达到50％的抑制效果，在4μM浓度下可以达到75％的抑制效果；其他两个测试样品mC6和mR9表现要差一些，在4μM和8μM浓度下分别可以达到50％和75％的抑制效果。

样品mC1、mC28和mC29-1对病毒抑制效果如表5所示，在加药加病毒培养48h后，细胞毒性方面，样品mC1、mC28和mC29-1在16μM浓度下对细胞的生长有一定影响；病毒抑制方面，样品mC1、mC28和mC29-1对SARS-CoV-2病毒的复制有一定的抑制效果，在16μM浓度下可达到75％的抑制效果。综合分析，病毒抑制结果趋势总体与其沉默效率结果一致。

表4受测试样品对细胞的毒性和对SARS-CoV-2病毒的抑制作用

表5样品对细胞的毒性和对SARS-CoV-2病毒的抑制作用

注：1.在细胞毒性实验中，“-”表示药物对细胞没有毒性，“+”表示药物对细胞有约25％毒性，“++”表示约50％毒性，以此类推。2.在抗病毒活性实验中，“-”表示病毒感染后细胞没有产生CPE，也没有药物毒性，“+”表示病毒感染后约25％的细胞产生CPE或者药物毒性，“++”表示约50％CPE或药物毒性，以此类推。3.a：细胞比对照组细胞密度小一点。

实施例5：体内动物模型测试修饰反义寡核苷酸的毒性(单次给药)

在小鼠体内通过尾静脉注射或雾化给药的方式，研究ASO潜在的肝脏和肾脏毒性大小，并且确认其在肺部的分布与毒性作用，观察受试药物单次给药对小鼠的毒性影响。

试剂：称取一定量的LNA-ASO(mC1、mC8、mC28、mC29-1、mR9)，用PBS充分溶解稀释为5mg/ml的母液，震荡15s，离心数秒，备用。

动物模型：雄性CD1小鼠，6～8周龄。

实验处理：根据小鼠体重，按照10μl/g给药体积，通过静脉注射给与CD1小鼠受试物，每组3只小鼠，连续观察7天。第7天，取血和肝、肾，分别进行血生化指标检测和组织病理检测。

眼球取血，血液静置1小时，室温下，3000转离心15分钟，吸取血清，用生化分析仪检测小鼠肝功能(ALT、AST、Albumin、T.Bil)和肾功能(BUN、Creatine)指标。

取肝、肾组织，用福尔马林固定液固定，进行包埋、切片和HE染色，显微镜下拍照，分析组织病理变化。

小鼠毒性反应：各受试物在50mg/kg剂量均未引起小鼠明显毒性反应和死亡发生。表明各受试物的MTD均在50mg/kg以上。

小鼠肝功能指标检测结果见图2、3：各ASO组的ALT均<200U/L；除mC28的 AST>200U/L外，其余ASO组均<200U/L。mR9和mC29-1的T-BIL与PBS相比有显著性降低。由此可以得出，50mg/kg剂量的各ASO引起的小鼠肝功生化指标变化均在可接受范围内。

小鼠肾功能指标检测结果见图4：mC29-1的CRE与PBS相比有显著性降低。各ASO 组的BUN与PBS相比无显著性差异。由此可得，50mg/kg剂量的各ASO引起的小鼠肾功生化指标变化均在可接受范围内。

肝HE染色结果见图5：mR9、mC1、mC28和mC8的肝组织中出现不同程度的脂肪变性，mC29-1肝小叶内存在炎性细胞浸润。由此得出，50mg/kg的mR9、mC1、mC28和mC8 会对小鼠肝脏造成不同程度的损伤。

肾HE染色结果见图6：各组脏器均无明显病变，得出50mg/kg的各ASO不会对小鼠肾脏造成损伤。

实施例6：体内动物模型测试修饰反义寡核苷酸的毒性(多次给药)

通过多次给药观察受试药物对小鼠的毒性影响及可恢复性。

试剂：称取一定量的LNA-ASO(mC1,mC8,mC28,mC29-1和mR9)，用PBS充分溶解为100mg/ml的母液，震荡15s，离心数秒，备用。给药前，根据小鼠体重稀释成不同浓度溶液使用。

动物模型：36只CD1小鼠，6～8周龄，雄性，初始给药时体重不应超过或低于平均体重的20％。

实验操作：称量小鼠，根据体重配制不同浓度受试物溶液。然后用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠。根据小鼠体重，按照25μl的给药体积，使用微量雾化仪通过气管内给与CD1小鼠受试物，每组6只小鼠(主试验组3只，恢复组3只)，每2天给药1次，连续给药3次。

第7和21天，取血和肝、肾和肺，分别进行血生化指标检测和组织病理检测。

眼球取血，血液静置1小时，室温下，3000转离心15分钟，吸取血清，用生化分析仪检测小鼠肝功能(ALT、AST、Albumin、T.Bil)和肾功能(BUN、Creatine)指标。

取肝、肾和肺组织，称重，再用福尔马林固定液固定，进行包埋、切片和HE染色，显微镜下拍照，分析组织病理变化。

小鼠毒性反应：各受试物在50mg/kg剂量均未引起小鼠明显毒性反应和死亡发生，表明50mg/kg各受试物未对小鼠有明显毒性作用。

小鼠组织学检测结果如图7所示：与PBS相比，各受试物未引起小鼠肝体比和肾体比显著性变化，mC29-1则引起小鼠肺体比有显著性差异。由此得出，各受试物在50mg/kg剂量未引起小鼠肝和肾器官组织学变化，而mC29-1对小鼠肺器官有明显组织学影响，mC29-1对小鼠肺组织学的影响有可恢复性，mR9对小鼠肺组织影响可能具有潜伏性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括：SEQ ID NO：1～128任一所示的核苷酸序列中的至少13个连续核苷酸构成的核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括至少一个被修饰的核苷酸；

任选地，所述被修饰的核苷酸选自下列至少之一：5'-硫代磷酸酯基的核苷酸、5-甲基化胞嘧啶核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-2-甲氧乙基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、3'-氮取代修饰的核苷酸、锁核酸、吗啉代核苷酸、多肽核苷酸；

任选地，所述反义寡核苷酸靶向作用于3CLPro蛋白或RdRp蛋白；

任选地，所述反义寡核苷酸靶向作用于SEQ ID NO：135～137任一所示的核苷酸序列；

任选地，所述反义寡核苷酸具有如SEQ ID NO：138～142任一所示的核苷酸序列；

任选地，所述反义寡核苷酸靶向作用于SEQ ID NO：143～147任一所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸的长度至少为16个核苷酸；

任选地，所述反义寡核苷酸的长度为16～25个核苷酸。

4.一种药物组合物，其特征在于，包括：

权利要求1～3任一项所述的反义寡核苷酸；以及药学上可接受的辅料。

5.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～3任一项所述的反义寡核苷酸。

6.一种抑制病毒复制的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1～3任一项所述反义寡核苷酸与病毒接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒为冠状病毒，优选新型冠状病毒SARS-CoV-2。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸抑制3CLPro基因表达；

任选地，所述反义寡核苷酸抑制RdRp基因表达。

9.权利要求1～3任一项所述反义寡核苷酸在制备药物或试剂盒中的用途，其特征在于，所述药物或试剂盒用于抑制病毒复制。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗因感染病毒而引发的疾病；

任选地，所述试剂盒用于诊断是否感染病毒；

任选地，所述病毒为冠状病毒；

任选地，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2；

任选地，所述药物用于抑制3CLPro基因表达；

任选地，所述药物用于抑制RdRp基因表达。

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