CN117257796A - 奥巴克拉甲磺酸盐在制备抗bkv药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了奥巴克拉甲磺酸盐(ObatoclaxMesylate)在制备抗BKV药物中的应用。在Vero E6细胞中，Obatoclax半数细胞毒性浓度为7.26μM，细胞毒性低，对BKV早期基因大T抗原和晚期基因VP1表达均有抑制作用，对细胞中和细胞上清中BKV的复制均产生明显抑制作用，细胞中BKV半数抑制浓度为0.2μM，细胞上清中BKV半数抑制浓度为0.02μΜ，且伴随药物浓度增加，其抑制效果越明显。奥巴克拉甲磺酸盐的有效性和安全性较高，在抗BKV和治疗BKV病毒感染相关疾病的药物中具有广阔的应用前景。

Description

奥巴克拉甲磺酸盐在制备抗BKV药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及奥巴克拉甲磺酸盐(ObatoclaxMesylate)在制备抗BKV(BK多瘤病毒，BK polyomavirus)药物中的应用。
背景技术
BKV是一种小型无包膜的DNA病毒。BKV感染在人群中普遍存在，全世界血清阳性率约为80％。BKV感染通常发生在儿童早期，多是在10岁以内；在免疫功能正常的人群中通常是无症状感染，或出现轻微的类似呼吸道感染的症状。但在免疫抑制的情况下BKV感染可重新激活并导致严重疾病，例如HIV感染和移植后。肾移植受者(KTR)是最常经历BKV再激活的患者群体，19.5％的肾移植受者在移植后发生BK病毒血症，这些受者中的一部分将继续发展为多瘤病毒相关肾病(BKVAN)，这与移植物丢失的风险显著相关。此外出血性膀胱炎(HC)是造血干细胞移植受者(HSCT)中公认的BKV相关并发症。
很少有对照研究可用于指导肾移植受者中BK病毒血症和BKVAN的管理。在鉴定出BK病毒血症或BKVAN后，通常的临床方法是利用PCR连续监测BK病毒血症的情况下，逐渐减少免疫抑制。但即使减少免疫抑制，一些患者仍经历BKV病毒血症并伴有BKVAN；同时免疫抑制的降低有引发急性排斥反应的风险。
目前还没有针对BKV的特异性抗病毒药物。虽然临床上已经使用氟喹诺酮类、西多福韦、来氟米特等药物用于抗BKV感染，但这些药物的疗效都缺乏大规模的前瞻性研究证据的支持。尽管病毒特异性免疫控制是治疗和持久治愈的最终目标，但迫切需要抗病毒治疗来减少或预防BKV疾病，从而缩短建立病毒特异性免疫所需的时间。。
奥巴克拉(Obatoclax Mesylate)是泛BCL-2家族蛋白抑制剂，它是BH3模拟物，具有抗癌和广谱抗寄生虫活性。在针对晚期恶性肿瘤的治疗中，obatoclax直接诱导培养的急性骨髓性白血病(AML)细胞以及原发性患者样本的细胞凋亡，并对实体瘤和骨髓瘤细胞异种移植小鼠表现出抗肿瘤活性。近年有研究，发现obatoclax具有特异的抗病毒功能，其对流感病毒、寨卡病毒、冠状病毒都有一定的抑制作用，但其是否对其他种属病毒具有抑制作用仍未可知。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明提供了一种抗BKV的有效药物及治疗方法，具体为提供奥巴克拉甲磺酸盐(Obatoclax Mesylate)在制备抗BKV药物中的应用，奥巴克拉甲磺酸盐可以抑制BKV早晚期基因的表达，抑制BKV的复制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物、或含有奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的药物组合物在制备抗BKV药物中的应用，所述奥巴克拉甲磺酸盐的结构式如式(I)所示：
进一步地，所述抗BKV药物包括以下药物中的一种：用于治疗和/或预防由BKV复制的所引起疾病的药物、用于治疗和/或预防BKV早晚期基因表达所引起疾病的药物。
进一步地，所述抗BKV药物包括以下药物中的一种：抑制BKV的复制的药物、抑制BKV早晚期基因表达的药物。具体地，BKV早晚期基因包括BKV早期基因大T抗原和晚期基因VP1。
进一步地，所述抗BKV药物选自以下药物中的至少一种：治疗和/或预防由BKV引起的病毒血症的药物、治疗和/或预防由BKV引起的出血性膀胱炎的药物、治疗和/或预防由BKV引起的病毒性肾病的药物。
进一步地，所述奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的起效浓度为0.05～3μM，优选0.125～2.0μM。
进一步地，对于Vero E6细胞，所述奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的半数细胞毒性浓度为7.26μM。
进一步地，对于Vero E6细胞，细胞内BKV半数抑制浓度为0.2μM。
进一步地，对于Vero E6细胞，细胞上清中BKV半数抑制浓度为0.02μΜ。
进一步地，对于Huh7细胞，所述奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的半数细胞毒性浓度为1.05μM。
进一步地，所述衍生物包括奥巴克拉甲磺酸盐的药学上可接受的盐类或酯类，或式(I)结构减少或增加基团所形成的具有同等功能的化合物。
进一步地，所述药物的剂型包括：片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、注射剂等。
进一步地，所述药物的给药方式包括：口服、静脉注射、肌肉注射、鼻腔、口腔粘膜、肺和呼吸道、皮肤等。
进一步地，所述药物组合物含有药学上可接受的载体或赋形剂。可理解的是，基于药物剂型及给药方式的不同，其所选择的载体或赋形剂的种类和用量也进行适应性调整选择，上述载体或赋形剂均为本领域常规常用的试剂。
进一步地，所述药物组合物还含有其他能够抗BKV的药物。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
奥巴克拉甲磺酸盐(Obatoclax Mesylate)能够有效抑制BKV早晚期基因表达和病毒复制，在Vero E6细胞中，其半数细胞毒性浓度(CC50)为7.26μM，细胞毒性低，对BKV早期基因大T抗原(T-antigen)和晚期基因VP1表达均有抑制作用，对细胞中和细胞上清中BKV的复制均产生明显抑制作用，且伴随药物浓度增加，其抑制效果越明显。奥巴克拉甲磺酸盐(Obatoclax Mesylate)的有效性和安全性较高，在抗BKV和治疗BKV病毒感染相关疾病的药物中具有广阔的应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一实施例中奥巴克拉磺酸盐的筛选实验结果示意图；
图2为本发明一实施例中奥巴克拉甲磺酸盐的细胞毒性的实验结果图。
图3为本发明一实施例中奥巴克拉甲磺酸盐抑制BKV早晚期基因的表达的结果示意图。
图4为本发明一实施例中奥巴克拉甲磺酸盐抑制细胞中BKV复制的结果示意图。
图5为本发明一实施例中奥巴克拉甲磺酸盐抑制细胞上清中BKV复制的结果示意图。
图6为本发明一实施例中奥巴克拉甲磺酸盐在肝癌细胞Huh7对HBV复制的影响的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
下述实施例中使用的奥巴克拉甲磺酸盐(购自Target Mol，CAS 803712-79-0)，其英文名称为Obatoclax Mesylate，分子式为C21H23N3O4S，具体分子结构如式(I)所示：
下述实施例中，除非另有描述，实施例中将采用细胞生物学等常规技术，这些均是本领域技术人员所熟知的，在诸如Bruce Alberts《细胞分子生物学》第5版(2002)等工具书中均有完整的描述，或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1-筛选获得奥巴克拉甲磺酸盐
将prBKV/VP1表达质粒的早期基因区域删除替换成分泌型的Nano荧光素酶基因，构建表达prBKV/T-Nluc，示意图如图1的A部分所示(prBKV/VP1的具体构建方法参见专利CN202310508053.3-一种多瘤病毒BKV重组表达载体及其应用)；将prBKV/T-Nluc与Cre重组酶表达质粒1：1共转染VERO E6细胞(购自中国科学院细胞库/干细胞库)，然后加入药物处理，通过检测上清中的荧光素酶强度进行药物筛选。
荧光素酶的检测：
使用Nano-Glo Luciferase检测系统(N1120，Promega，Madison，USA)测量上清中荧光素酶活性。将Nano-Luciferase Assay Substrate和Nano-/>LuciferaseAssay Buffer(1：50)混合，之后与等量的上清液反应。反应5min后使用发光计(Promega)检测荧光素酶的活性，从测量的相对光单位值中减去背景(仅介质)，发光强度以对数值为单位表示。其检测结果如图1的B部分所示，其表明奥巴克拉甲磺酸盐以浓度依赖的方式降低上清中的荧光素酶强度。
实施例2-奥巴克拉甲磺酸盐的细胞毒性实验
本实施例测试了不同浓度化合物(奥巴克拉甲磺酸盐)对Vero E6细胞和Huh7(均购自中国科学院细胞库/干细胞库)的毒性作用，具体操作包括：
(1)在96孔板中接种Vero E6和Huh7细胞(1×104个/孔)，将培养板放置培养箱培养12h；
(2)向培养孔加入不同浓度的待测化合物(0.31μM，0.63μM，1.25μM，2.5μM，10.0μM,20.0μM，40.0μM)，对照组为溶剂DMSO，作用72h后检测化合物对细胞增殖的影响；
(3)使用同仁CCK8终点法试剂盒(ck04)。弃掉孔内培养基，每孔加入100μL含有10％CCK8溶液的无血清培养基；将培养板置于37℃培养箱内孵育1～4小时；
(4)使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
Vero E6细胞的实验结果如图2所示，奥巴克拉甲磺酸盐对于Vero E6的半数细胞毒性浓度(CC50)为7.26μM，细胞毒性低，安全性较高。奥巴克拉甲磺酸盐对于Huh7的半数细胞毒性浓度(CC50)为1.05μM。
实施例3-奥巴克拉甲磺酸盐抑制BKV早晚期基因的表达
本实施例通过Western Blot实验观察不同浓度化合物(奥巴克拉甲磺酸盐)在细胞中对BKV早晚期基因表达的影响，具体过程包括：
(1)在24孔板中接种Vero E6细胞悬液(2×105个/孔)，将培养板放在培养箱培养12h；
(2)每孔使用Lip 3000转染0.5μg prBKV/VP1和0.5μg pCMV-Cre，37℃培养8h后分别加入不同浓度的化合物(0.125μM，0.25μM，0.5μM，1.0μM，2.0μM)对照组加等量DMSO，作用72h后进行样品收集。prBKV/VP1表达质粒的构建方法为以BKV Dunlop毒株(GenBank：V01108.1)序列为模板，(具体构建方法参见专利CN202310508053.3-一种多瘤病毒BKV重组表达载体及其应用)；
(3)使用SDS裂解液将细胞裂解，收集细胞裂解液，加入蛋白上样缓冲液，100℃变性10min。
(4)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，抗体孵育[anti-β-actin(Sigma-Aldrich),anti-SV40 Large T Antigen(15729S,Cell Signaling Technology,Beverly,USA)and anti-BKV VP1(MAB3204，Abnova)]，进行相应的二抗孵育后用ECL BlottingSubstrate(Millpore)进行显色。
实验结果如图3所示，奥巴克拉甲磺酸盐对早期基因大T抗原(T-antigen)和晚期基因VP1表达均有抑制作用，随着浓度的增加，其抑制现象越明显。
实施例4-奥巴克拉甲磺酸盐抑制BKV复制
本实施例通过Southern blot实验观察不同浓度化合物(奥巴克拉甲磺酸盐)在细胞中对BKV病毒复制的影响，具体过程包括：
(1)在12孔板中接种Vero E6细胞悬液(5×105个/孔)，将培养皿放在培养箱中预培养12h，细胞贴壁生长。
(2)每孔使用Lip 3000转染1μg prBKV/VP1和1μg pCMV-Cre，，37℃培养8h后分别加入不同浓度的化合物(0.125μM，0.25μM，0.5μM，1.0μM，2.0μM)，对照组加等量的DMSO，作用72h后进行样品收集。prBKV/VP1表达质粒的构建方法为以BKV Dunlop毒株(GenBank：V01108.1)序列为模板(具体构建方法参见专利CN202310508053.3-一种多瘤病毒BKV重组表达载体及其应用)；
(3)提取细胞内BKV的DNA
1)细胞裂解：将转染后细胞弃上清，用预冷的PBS洗2遍，加入200μL的Hirtsolution(10mM Tris，10mM EDTA和0.6％ SDS)，室温裂解10min。
2)沉淀细胞蛋白和DNA：加入100μL 5M NaCl，轻轻摇晃2min，将细胞刮下转移到EP管，4℃过夜。
3)蛋白酶K消化，去除病毒衣壳：4℃14,000rpm离心40min，弃去沉淀，上清中加蛋白酶K 37℃8h。
4)苯酚/氯仿抽提，沉淀病毒DNA：用等体积的苯酚/氯仿抽提两次，再加入2μL20mg/ml糖原和等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀过夜。15000g离心15min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗两遍并弃尽乙醇，静置待残留乙醇挥发后，用20μL灭菌蒸馏水溶解。
(4)Southern blot检测BKV复制
1)酶切：将提取的细胞内BKV DNA进行BamHI和DpnI酶切，37℃2小时。
2)琼脂糖电泳：将酶切后的BKV DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳(80V，1.5h)。
3)变性：将电泳后的凝胶置于新鲜配置的变性液(0.5M NaOH和1.5M NaCl)中，室温震荡变性1h。
4)中和：弃变性液，倒入中和液(1.5M NaCl和1M Tris-HCl，pH 7.4)中和，室温震荡中和两次，每次30min。
5)转膜：使用向下毛细管转移法，转移系统由下至上分别是：吸水纸、Parafilm膜、2层3mm滤纸、尼龙膜、含DNA的琼脂糖凝胶、2层3mm滤纸、两端浸在20×SSC缓冲液(3M NaCl和0.3M柠檬酸钠)里的盐桥。常温转膜8h以上。
6)DNA交联：转膜后，取出尼龙膜，尼龙膜用2×SSC浸泡5miin，沥干多余液体，将尼龙膜置于两张滤纸之间，紫外交联90s。
7)预杂交：将膜放入杂交管中，加入杂交液5ml，42℃预杂交30min。
8)探针变性和杂交：取适量探针，于100℃金属浴变性5min，然后迅速将变性的探针放置于冰上5min。回收预杂交液，换入新鲜的杂交液5ml，加入变性好的探针，42℃杂交6～8h。
9)洗去除未结合的探针：先用2×SSC室温洗2遍，每遍5min。再用0.5×SSC，68℃洗2遍，每遍15min；
10)封闭：用Maleic acid buffer稀释10×Blocking solution至1×封闭工作液，加入适量封闭液，37℃封闭30min。
11)孵育抗体：用上述1×封闭液稀释anti-DIG AP抗体(抗体按1:10000稀释)，弃封闭液并换入适量抗体孵育液，37℃孵育30min。
12)洗去未结合抗体：用washing buffer在37℃洗膜2次，每次15min。
13)显色：先用detection buffer平衡膜5min，同时用detection buffer稀释、配制1×CSPD显色液。将平衡好的尼龙膜置于Parafilm膜上，正面朝上，均匀滴加显色液，再盖一层Parafilm膜，去除尼龙膜正面的气泡和多余的显色液，避光室温放置5min，用化学发光检测仪器检测累积信号，保存结果。
实验结果如图4所示，奥巴克拉甲磺酸盐对BKV的复制产生明显抑制作用，同时随药物浓度增加抑制效果越明显，半数抑制浓度(IC50)如图标注所示为0.2μΜ。实验结果证明奥巴克拉甲磺酸盐对于BKV复制有较强的抑制作用，能够作为抗BKV的潜在治疗药物。
实施例5-奥巴克拉甲磺酸盐抑制上清中病毒量
本实施例对药物处理后的细胞上清进行实时定量PCR(qPCR)方法检测，以验证上清中病毒DNA水平，其包括步骤：
(1)去除未包裹的病毒DNA：200μL实施例4中药物处理后的细胞上清培养液在37℃用0.1mg/mL DNase I、10mM MgCl2处理2h。
(2)抽提DNA：按照试剂盒说明提取病毒DNA(Sangon Biotech，B518267)。
(3)实时定量PCR采用天根SYBR Green I嵌合荧光法进行(Tiangen，FP205)。扩增引物采用针对晚期蛋白VP1的特异性引物：VP1上游引物：5’-GCAGCTCCCAAAAAGCCAAA-3’；下游引物：5’-CTGGGTTTAGGAAGCATTCTA-3’。用10倍梯度稀释的质粒BKV Dunlop-PUC19建立标准曲线，并根据标准曲线计算待测组分中BKV DNA的量。
实验结果如图5所示，奥巴克拉甲磺酸盐对上清中BKV病毒DNA产生明显抑制作用，同时随药物浓度增加抑制效果越明显，半数抑制浓度(IC50)所示为0.02μΜ。
实施例6-奥巴克拉甲磺酸盐对乙型肝炎病毒(HBV)在肝癌细胞Huh7中的影响本实施例通过ELISA实验观察不同浓度化合物在细胞中对HBV的影响，具体过程为：
(1)在6孔板中Huh7细胞悬液，放在培养箱中预培养12h，细胞贴壁生长。每孔Huh7细胞先使用Turbofect transfection reagent转染试剂6μL与3μg p1.3×HBV质粒进行转染实验，12h后再分别加入不同浓度的式(I)化合物，作用72h后收集细胞上清。
(2)ELISA检测上清中HBsAg与HBeAg的水平
采用上海科华生物技术有限公司的ELISA试剂盒检测细胞上清中HBsAg HBeAg水平。检测光波450nm处的相对吸光值(OD450)可以反应出抗原的相对水平。具体方法简述如下：将步骤(1)中收集到的细胞上清用PBS稀释20倍后加入ELISA的酶联板中，每孔50uL，随后添加酶反应液，37℃放置30min，随后倒掉反应液，用洗涤液洗5遍后，加入反应液A和B，随后37℃放置10min，加入终止液，采用分光仪读取450nm处的吸光值。其检测结果如图6所示，奥巴克拉甲磺酸盐对HBV的抗原表达无明显影响，这表明奥巴克拉甲磺酸盐对HBV并不具有抑制效果。
本发明主要通过体外实验评价了化学式(I)所示的奥巴克拉甲磺酸盐抗BKV的活性；体外实验主要包括上述化合物抑制BKV早晚期基因的表达、抑制胞内病毒DNA的复制、抑制上清中病毒DNA含量以及药物对细胞毒性的测定等，其解决了目前亟需有效的抗BKV药物的问题，提供了奥巴克拉甲磺酸盐在抗BKV药物中的新用途。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物、或含有奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的药物组合物在制备抗BKV药物中的应用，其特征在于，所述奥巴克拉甲磺酸盐的结构式如式(I)所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗BKV药物包括以下药物中的一种：用于治疗和/或预防由BKV复制所引起的疾病的药物、用于治疗和/或预防BKV早晚期基因表达所引起疾病的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗BKV药物包括以下药物中的一种：抑制BKV的复制的药物、抑制BKV早晚期基因表达的药物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗BKV药物选自以下药物中的至少一种：治疗和/或预防由BKV引起的病毒血症的药物、治疗和/或预防由BKV引起的出血性膀胱炎的药物、治疗和/或预防由BKV引起的病毒性肾病的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的起效浓度为0.125μM～2.0μM。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，对于Vero E6细胞，所述奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的半数细胞毒性浓度为7.26μM；或，对于Vero E6细胞，，细胞内BKV半数抑制浓度为0.2μM；或，对于Vero E6细胞，细胞上清中BKV半数抑制浓度为0.02μΜ；或，对于Huh7细胞，所述奥巴克拉甲磺酸盐或其衍生物的半数细胞毒性浓度为1.05μM。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述衍生物包括奥巴克拉甲磺酸盐的药学上可接受的盐类或酯类，或式(I)结构减少或增加基团所形成的具有同等功能的化合物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物含有药学上可接受的载体或赋形剂。
CN202311487988.4A 2023-11-08 2023-11-08 奥巴克拉甲磺酸盐在制备抗bkv药物中的应用 Pending CN117257796A (zh)

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