CN116510017A - Trpv4抑制剂在慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝癌的治疗中的应用 - Google Patents
Trpv4抑制剂在慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝癌的治疗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及TRPV4抑制剂在慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝癌的治疗中的应用。具体涉及:TRPV4抑制剂在慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝癌的治疗中的应用以及一种筛选用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及:TRPV4抑制剂在慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝癌的治疗中的应用以及一种筛选用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物的方法。
背景技术
慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染严重威害着人类的健康。据世界卫生组织报道,全球约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒,其中3.5亿人为慢性HBV感染者。每年约有100万死于HBV感染所致的肝衰竭、硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。我国是HBV感染的高发地区,尽管随着乙肝疫苗的普及化及母婴阻断技术的发展,HBV的新感染率大大降低,但2016年的一项200余万例的大样本流行病学研究表明,我国21-49岁的农村地区男性HBsAg的阳性率仍高达6%,可见在相当长的时间内HBV感染仍然是我国公共卫生系统面临的严峻挑战。
HBV是一种嗜肝细胞的部分双链的环状DNA(rcDNA)病毒。其基因组全长约3.2kb,由四个部分重叠的开放读码框(ORFs)组成,包括S基因区、C基因区、P基因区和X基因区。HBV的复制是将病毒的遗传信息从亲代DNA传递给子代一系列复杂过程,包括以共价闭合环状DNA(Covalently Closed Circular DNA,cccDNA)为初始模板转录mRNA、翻译、以mRNA为模板,反转录合成病毒负链DNA和病毒正链DNA等复杂过程。而HBV ccc DNA稳定存在于被感染的肝细胞核中,并充当病毒转录模板以产生病毒基因产物,是HBV的原始复制模板,HBVcccDNA的存在是病毒复制及感染得以维持的根源,抑制或清除HBV cccDNA是治愈慢性乙型肝炎的关键。
抗HBV的治疗方法一直是感染科学研究的热点及难点之一。慢性乙型肝炎患者大多数需要长期或终生治疗,目前没有一种治疗方案可以将宿主体内的乙肝病毒彻底根除。目前临床上批准的抗病毒治疗药物主要包括核苷(酸)类似物和干扰素两大类。核苷(酸)类似物药物的作用靶点是抑制HBV DNA多聚酶和逆转录酶的活性,进而抑制HBV的复制;干扰素通过作用于HBV复制周期的多个环节来发挥抗病毒作用。主要包括激活宿主免疫应答、抑制HBVcccDNA的转录、抑制病毒核衣壳的形成或增加其降解。这些药物虽然能够有效地抑制HBV复制,但是存在无法消除或沉默肝细胞核内cccDNA,且存在药物副作用较大(尤其是干扰素)、耐药性较高等问题。
在临床上用这两类药物来治疗慢性乙型肝炎患者很难实现HBV表面抗原(HBsAg)的血清学转换,无法达到功能性治愈水平。因此,针对于现有抗病毒药物的不足,现今发现了不同类型的新型在研抗病毒药物,主要包括病毒进入抑制剂、衣壳抑制剂、核酸干扰药物、HBsAg抑制剂及免疫调节剂五大类。虽然诸多在研抗病毒药物都有一定的治疗效果,但是还需要大型临床试验进一步验证其抗病毒效果。因此,寻找新的抗病毒药物仍然是必要的。
发明内容
钙离子(Ca2+)作为细胞内重要的第二信使可以与多种细胞蛋白相互作用,调节多种生理过程并参与多种疾病进展,包括HBV感染。近年来,多项研究表明,依赖于质膜、内质网和线粒体上不同的Ca2+通道,HBV可以提高胞质中Ca2+水平。进一步,在HBV感染的细胞中,Ca2+信号的激活可以通过多种分子机制促进病毒复制。因此,现有证据表明靶向Ca2+信号将是治疗HBV感染的有效方法。
瞬时性受体电位(transient receptor potential,TRP)通道超家族与细胞内Ca2+稳态调控密切相关,TRP通道最早发现于果蝇的视觉系统,迄今为止,在哺乳动物发现的28个亚型被划分到7个亚家族:TRPA,TRPC,TRPM,TRPML,TRPN,TRPP和TRPV。瞬时受体电位香草酸亚型4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是TRPV亚家族的成员,广泛分布于心脏、大脑、肾脏、肺脏、肝脏、骨组织及皮肤等,对Ca2+具有选择通透性,其激活会引起Ca2+内流,从而增加细胞内游离Ca2+的浓度,参与许多生理、病理过程,是多种疾病的潜在治疗靶点。
GSK2798745是首创的,高效的,选择性的且具有口服活性的TRPV4离子通道阻断剂,主要用于充血性心力衰竭相关的肺水肿的研究;GSK2193874是具有口服活性的有效的选择性TRPV4拮抗剂,作用于rTRPV4和hTRPV4;RN-1734是一种选择性TRPV4通道拮抗剂,完全拮抗4αPDD介导的TRPV4活化,作用于hTRPV4,mTRPV4,和rTRPV4。文献中未见单独使用GSK2798745、GSK2193874和RN-1734治疗慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝癌。
本发明首先发现过表达TRPV4可以促进HBV的复制和转录,沉默TRPV4可以抑制HBV的复制和转录,进而发现TRPV4离子通道阻断剂GSK2798745、GSK2193874和RN-1734具有明显抑制HBV RNA、cccDNA和HBV核心蛋白(HBcAg)表达的作用。并以TRPV4为靶点,筛选到同样具有抑制HBV复制和转录的Trichostatin A(TSA)。
为此,在本发明的第一方面,本发明提供了TRPV4抑制剂在制备用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物中的用途。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A
在本发明的第二方面,本发明提供了药物组合在制备用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物中的用途,其中,所述药物组合包含或由以下组成:TRPV4抑制剂以及其他药物。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A
在一些实施方案中,所述其他药物用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述其他药物包括但不限于核苷酸类药物(如恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯或拉米夫定)、干扰素(如干扰素α2a、干扰素α1b或干扰素α2b)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、入胞抑制剂、RNA干扰药物、cccDNA靶向药物,或其任意组合。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种筛选用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物的方法,所述方法包括以下步骤:
1)测试候选药物抑制TRPV4的活性;
2)进一步对于步骤1)中结果显示具有抑制TRPV4的活性的候选药物进行对于HBV的体外药效评价。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,对于HBV的体外药效评价包括测试对于HBV RNA、HBV DNA、cccDNA及HBV核心蛋白(HBcAg)的作用。
在本发明的第四方面,本发明提供了TRPV4抑制剂,其用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
在本发明的第五方面,本发明提供了药物组合物,用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态,其中,所述药物组合物包含或由以下组成:TRPV4抑制剂以及其他药物。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
在一些实施方案中,所述其他药物用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述其他药物包括但不限于核苷酸类药物(如恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯或拉米夫定)、干扰素(如干扰素α2a、干扰素α1b或干扰素α2b)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、入胞抑制剂、RNA干扰药物、cccDNA靶向药物,或其任意组合。
在本发明的第六方面,本发明提供了一种治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的方法,其包括:
给予有需要的受试者有效量的TRPV4抑制剂或者药物组合物,其中,所述药物组合物包含或由以下组成:TRPV4抑制剂以及其他药物。
在一些实施方案中,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述其他药物用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态。
在一些实施方案中,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病。
在一些实施方案中,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
在一些实施方案中,所述其他药物包括但不限于核苷酸类药物(如恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯或拉米夫定)、干扰素(如干扰素α2a、干扰素α1b或干扰素α2b)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、入胞抑制剂、RNA干扰药物、cccDNA靶向药物,或其任意组合。
附图说明
图1-1中的A,B表示在HepG2.2.15细胞中,沉默TRPV4表达或过表达TRPV4后,pgRNA及totalRNA的变化情况;
图1-1中的C,D表示在HepAD38细胞中,沉默TRPV4表达或过表达TRPV4后,pg RNA及total RNA、precore的变化情况;
图1-1中的E,F表示在HepG2细胞中,瞬时转染1.3-HBV vector,同时干扰TRPV4或过表达TRPV4后,pg RNA及total RNA、pre-Core的变化情况。
图1-2表示在HepG2.2.15和HepAD38细胞中沉默TRPV4或过表达TRPV4后,HBcAg表达的变化情况。
图1-3表示在HepG2.2.15和HepAD38细胞中沉默TRPV4或过表达TRPV4后,HBV DNA表达的变化情况。
图1-4表示在HepAD38细胞中沉默TRPV4或过表达TRPV4后,cccDNA的变化情况。
图2表示加入TRPV4抑制剂GSK2798745、GSK2193874、RN-1734后,HepAD38细胞中HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)和cccDNA均明显降低。
图3表示TRPV4抑制剂GSK2798745,GSK2193874,RN-1734可以抑制HepG2.2.15、HepAD38和HepG2+HBV 1.3细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的表达。
图4-1表示给予TRPV4激活剂GSK1016790A后,HepAD38细胞中HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)和cccDNA均明显升高;
图4-2表示给予TRPV4激活剂GSK1016790A后,HepG2.2.15、HepAD38和HepG2+HBV1.3细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的表达均明显升高。
图5-1表示给予TSA后,HepG2.2.15和HepAD38细胞中TRPV4蛋白的表达均明显降低;
图5-2表示给予TSA后,HepAD38细胞中HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)、HBV DNA和cccDNA均明显降低;
图5-3表示给予TSA后,HepG2.2.15、HepAD38和HepG2+HBV 1.3细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的表达均明显下降。
具体实施方式
应该理解,此处采用的术语目的在于描述具体的实施方案,并非意在限制。此外,尽管类似或者等价于此处描述的任何方法、装置和材料均可用于实施或者测试本发明,但是现在描述的是优选的方法、装置和材料。
本发明中,“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状,可以是预防性的;和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用,可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗,包括:(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状;(b)抑制疾病的症状,即阻止其发展;或(c)缓解疾病的症状,即,导致疾病或症状退化。
本发明中,“受试者”指脊椎动物。在某些实施方案中,脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括,但不限于,牲畜(诸如牛)、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中,哺乳动物指人。
本发明中,“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然,由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的,因此预防有效量会低于治疗有效量。在癌症的情况中,药物的治疗有效量可减少癌细胞数;缩小肿瘤体积;抑制(即一定程度的减缓,优选停止)癌细胞浸润到周围器官中;抑制(即一定程度的减缓,优选停止)肿瘤转移;一定程度的抑制肿瘤生长;和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。
本发明涉及的药物组合物可以包含药学上可接受的辅料,辅料包括但不限于:
离子交换剂,氧化铝,硬脂酸铝,卵磷脂,血清蛋白如人血白蛋白,缓冲物质如磷酸盐,甘油,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物,水,盐或电解质,如硫酸鱼精蛋白,磷酸氢二钠,磷酸氢钾,氯化钠,锌盐,胶态氧化硅,三硅酸镁,聚乙烯吡咯烷酮,纤维素物质,聚乙二醇,羧甲基纤维素钠,聚丙烯酸酯,蜂蜡,羊毛脂等等。
本发明所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。例如,所述的药物组合物可以以下面的任意方式施用:口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、阴道用药、局部用药、非肠道用药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入、或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内用药方式。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。如无特别说明,所有试剂或原料均可以市购获得。
实施例1过表达TRPV4促进HBV的复制和转录,沉默TRPV4制HBV的复制和转录
一、实验方法
1.细胞的培养及处理方法:
1.1细胞复苏
1)准备工作:提前将超净工作台紫外照射30min;打开水浴锅并将其温度调至37℃;配制70%酒精备用;
2)将冻存于液氮罐里的细胞取出后,迅速放到37℃水浴锅中,然后缓慢摇动冻存管使其融化;
3)当冻存管中的细胞完全融化后,用70%酒精消毒冻存管外壁,然后在超净工作台内将融化的细胞转移到含有2ml新鲜培养基的15ml离心管内;
4)800rpm,室温离心3min;
5)取出离心管后可见明显的细胞沉淀,弃掉上清液,加入2ml PBS完全重悬细胞后,800rpm,室温离心3min;
6)完全弃掉上清液后,用2ml新鲜培养基重悬细胞后,将细胞悬液转移到25cm2的细胞培养瓶中,然后再补充3ml新鲜培养基;
7)将培养瓶十字晃动使细胞均匀分布在培养瓶底部,然后放入37℃细胞培养箱中长期培养。
1.2细胞换液
HepG2.2.15和HepAD38两株细胞系生长较为缓慢,当培养基的颜色由红色变为淡黄色时,说明此时培养基里的营养成分耗尽,需要及时更换新鲜培养基。
细胞换液的步骤是:弃掉旧的培养基,然后向细胞培养瓶或培养皿中加入2~4mlPBS,轻轻晃动培养瓶或培养皿后,弃掉PBS后,加入足量的新鲜培养基放入细胞培养箱中继续培养。
1.3细胞传代
1)准备工作:提前将超净工作台紫外照射30min;将待用的新鲜培养基、胰酶和PBS提前从4℃冰箱取出后放在室温;
2)从细胞培养箱中取出需要传代的细胞,弃掉旧的培养基,然后加入2~4ml的PBS缓慢摇动后弃掉,此步骤需重复一次;
3)在培养皿中加入1ml的胰酶,然后晃动培养皿使胰酶铺满整个皿底,弃掉多余的胰酶后,将培养皿放到细胞培养箱中孵育1min来消化细胞;
4)取出培养皿,显微镜下观察细胞的消化程度,消化良好的细胞会观察到细胞间隙变大。随后在培养皿中加入2ml的新鲜培养基来终止胰酶消化;
5)用1ml的移液器轻轻吹打细胞,使其变成单细胞悬液,然后将细胞悬液移至15ml离心管中;
6)800rpm,室温离心3min;
7)取出离心管后可见明显的细胞沉淀,弃掉上清液,加入2ml PBS完全重悬细胞后,800rpm,室温离心3min;可选择性的重复此步骤一次;
8)完全弃掉上清液后,用2ml新鲜培养基重悬细胞后,将细胞悬液分到2~3个培养皿中继续培养。
1.4细胞冻存
1)准备工作:将冻存细胞的程序降温盒内加入适量的异丙醇备用;配制冻存液(90%FBS+10%DMSO),遵循现配现用的原则;
2)从细胞培养箱中取出准备冻存的细胞,弃掉旧的培养基,然后加入2~4ml的PBS缓慢摇动后弃掉,此步骤需重复一次;
3)在培养皿中加入1ml的胰酶,然后晃动培养皿使胰酶铺满整个皿底,弃掉多于的胰酶后,将培养皿放到细胞培养箱中孵育1min来消化细胞;
4)消化好的细胞离心后,弃上清,然后用PBS洗两次,800rpm,室温离心3min;
5)尽可能的弃掉上清液后,用配好的冻存液重悬细胞,充分混匀后将细胞悬液移至冻存管中,需在管壁上标记清楚细胞名称及日期;
6)将冻存管放到程序降温盒内,立即放到-80℃冰箱内,24h后将冻存的细胞放到液氮罐里长期储存备用。
1.5细胞转染
本实验应用的细胞转染试剂为转染试剂盒。接下来,我们将以六孔板为例详细描述细胞转染的步骤。
1)在六孔板里接种细胞:将生长状态良好的细胞平均种到六孔板的每一个孔里,接种细胞量为每孔1.5~2.5x10^5个细胞,并加入2ml新鲜培养基放到细胞培养箱培养;
2)细胞生长24h后,显微镜下观察细胞生长呈倍数增长期,并且细胞密度为60%到80%之间转染效率最优。此时我们可以进行转染;
3)本研究中涉及到的细胞转染类型主要是转染外源性过表达质粒或siRNA。配制方法如下(以六孔板每孔转染量为例):
2μg目的质粒或10μl siRNA+200μl jetPRIME Buffer+5μl jetPRIMEReagent;
4)按照以上的配制方法配制转染体系。在配制过程中需注意,首先将一定量的目的质粒或siRNA加入jetPRIME Buffer中,充分震荡混匀后,低速离心后再将适量的jetPRIME Reagent加入体系内,再进行震荡混匀离心后,室温孵育15min即可将转染体系滴加到六孔板的每个孔内。
5)在转染体系孵育时,可先将六孔板里的培养基换成新鲜培养基,每孔2ml;转染体系孵育结束后,将转染混合液缓慢滴加到六孔板里,每孔200μl;
6)加入转染混合液后,轻轻晃动六孔板,然后将六孔板放到细胞培养箱内继续培养;在特定的时间(检测RNA水平的指标,一般处理24h即可;
检测蛋白水平的指标,一般处理48h即可)收集细胞后进行后续的实验。
2.Q-PCR检测HBV RNA的表达
2.1细胞总RNA提取
本实验严格按照Total RNA Kit试剂盒说明书进行,步骤如下(注意:
本实验全程冰上进行,全程使用无RNA 酶的专用枪头):
1)从孵箱中取出12孔细胞培养板,弃去细胞培养液,1×PBS 1mL清洗细胞2次,负压吸引装置吸干净PBS;
2)根据需要配制350μL TRK Lysis Buffer混合液/孔(混合液配制方法:1mLTRKLysis Buffer+20μLβ-巯基乙醇),涡旋混匀。12孔细胞培养板每孔分别加入350μL,室温静置5min,使细胞充分裂解;
3)根据需要配制70%乙醇/孔,涡旋混匀。12孔细胞培养板每孔分别加入350μL,摇晃混匀,转移至离心柱(离心柱+收集管组装好)内;
4)4℃离心机,12000g,60sec,离心后弃废液,保留离心柱;
5)加入500μL RNA Wash BufferⅠ,4℃离心机,12000g,60sec,离心后弃废液,保留收集柱;
6)加入500μL RNA Wash BufferⅡ(确认已加乙醇),4℃离心机,12000g,60sec,离心后弃废液,保留收集柱;
7)重复步骤6)一遍,4℃离心机,12000g,90sec,离心后弃废液,保留收集柱;
8)4℃离心机,12000g,120sec,以保证离心柱充分干燥;
9)干燥后的离心柱插入新的1.5mL EP管中,在离心柱中心的膜上加入30μL DEPC水。注意该步骤不要触碰到EP管盖子。室温静置5min,以确保RNA被DEPC水充分溶解。4℃离心机,12000g,60sec,保留EP管;
10)NanoDrop超微量分光光度计检测RNA浓度;
2.2 RNA逆转录为cDNA:按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)说明书,具体实验步骤如下:
2.2.1配制逆转录反应体系(冰上操作):
表2-1逆转录反应体系
2.2.2逆转录上机反应条件如下:
表2-2逆转录反应条件
2.2.3所得产物即为cDNA,可直接用于后续Q-PCR实验或者-20℃保存。
2.3Q-PCR检测HBV RNA的表达:按照PowerGreen PCR Master Mix说明书,具体操作如下:
2.3.1根据说明书配制Q-PCR反应体系如下:
表2-3Q-PCR反应体系
2.3.2使用ABI7500system采用下列两步法标准扩增程序:
表2-4Q-PCR反应条件
反应结束后,确认Q-PCR的扩增曲线和溶解曲线,采用相对定量法(2-
ΔΔC T法)对实验结果进行数据分析。
2.3.3所用引物序列如下:
表2-5Q-PCR实验所用引物序列
3.HBV DNA的提取与检测
3.1细胞内基因组DNA的提取
1)从细胞培养箱中取出待提取DNA的六孔板,弃掉培养基,然后每孔加入适量的PBS晃动培养板来清洗细胞;此过程需重复一次。
2)收集细胞:每孔加入适量的胰酶,晃动培养板使胰酶铺满整个皿底,室温静置1~2min后,每孔加入1ml的培养基终止消化,然后将细胞悬液收集到1.5ml的EP管里。2000rpm离心5min,弃上清,用PBS洗两遍后尽可能的弃干净上清液;
3)在每个EP管内加入100μl的LB2溶液,缓慢吹打,充分混匀;
4)在每个样品中加入20μl RNase A,室温孵育2min,目的是去除样本中的RNA;
5)孵育结束后,每个样品中加入20μl Proteinase K,室温孵育2min,目的是去除样本中的蛋白质;
6)孵育结束后,每个样品中加入500μl BB2溶液,需要立即涡旋5s,然后室温孵育10min;
7)孵育结束后,将EP管中的全部液体转移到离心柱中,12000rpm离心30s,弃掉收集管中的液体;
8)在每个样品中加入500μl CB2溶液,12000rpm离心30s,弃掉收集管中的液体;
9)重复步骤8)一次;
10)在每个样品中加入500μl WB2溶液(使用前需加入一定量的无水乙醇),12000rpm离心30s,弃掉收集管中的液体;
11)重复步骤10)一次;
12)将离心柱插到收集管中,12000rpm离心2min,彻底去除残留的WB2溶液;
13)将离心柱转移到一个新的1.5ml的EP管中,在离心柱的中央加入50μl预热的EB(65℃),室温静置2min,12000rpm离心2min,洗脱DNA。
洗脱出的DNA于-20℃储存备用。
3.2HBV Hirt DNA的提取
1)从细胞培养箱中取出待提取DNA的六孔板,弃掉培养基,然后每孔加入适量的PBS晃动培养板来清洗细胞;此过程需重复一次。
2)在每个孔中加入750μl的TE缓冲液(10mM Tris,10mM EDTA,pH 7.5),然后每孔再加入50μl的10%SDS溶液,随后,在室温条件下将培养板放到水平摇床上缓慢摇动30min,促使细胞裂解完全;
3)将每孔的所有液体转移到2ml的EP管中,然后每个样本中加入200μl的5M NaCl,缓慢上下颠倒几次后,将样本放到4℃翻转摇床上,此过程需要过夜处理;
4)从4℃翻转摇床上取下样本,进行4℃、12000rpm离心30min;
5)离心结束后,将上清液转移到一个新的2ml的EP管内;
6)苯酚(phenol)萃取:向每个样本中加入与样本等体积的苯酚,缓慢上下颠倒两次,4℃、12000rpm离心10min;
7)离心后取上清(遵循宁少勿多的原则),再加入等体积的苯酚进行二次萃取,4℃、12000rpm离心10min后取上清;
8)苯酚/氯仿/异丙醇(Phenol/chloroform/isoprophanol)萃取:向每个样本中加入等体积的苯酚/氯仿/异丙醇,缓慢上下颠倒两次,4℃、12000rpm离心10min;
9)将上清转移到新的2ml的EP管内,加入样本两倍体积的无水乙醇,此过程需要室温静置过夜处理;
10)样本4℃、12000rpm离心30min;
11)弃上清,每个样本中加入800μl的70%乙醇,4℃、12000rpm离心10min;
12)弃上清,重复步骤11)一次;
13)用负压吸引器尽可能的吸干上清,将EP管开盖放到通风橱内静置干燥10min;
14)每个样本中加入20μl的无核酸酶水溶解Hirt DNA,-20℃储存备用。
此过程提取的总的HBV Hirt DNA,是DP-rcDNA和cccDNA的混合物。
3.3HBV cccDNA的分离纯化
从HBV稳定细胞系中提取Hirt DNA,方法如上所述。接下来我们将分离纯化cccDNA:
1)取19μl Hirt DNA到200μl的小EP管中,然后加入23μl无核酸酶水稀释,总体积为42μl;
2)将金属浴调至85℃,样本放至金属浴中加热5min。目的是将DP-rcDNA变性为单链线性DNA,而cccDNA(共价闭合环状双链DNA)不受影响;
3)样本中加入PSAD(Plasmid-safe ATP-dependent DNase)酶消化单链线性DNA,具体的反应体系如下表3-1:反应条件是37℃,16h。
表3-1PSAD酶消化单链线性DNA反应体系
4)PSAD酶失活:反应条件是70℃,30min。
5)最终得到的样本需要用DNA clean&concentrator kit试剂盒进行cccDNA的纯化,以下为cccDNA纯化的实验步骤:
a)在上述步骤中获得的50μl样本中加入7倍体积的DNA Binding Buffer
350μl,涡旋震荡混匀;
b)将混匀后的所有液体转移到Zymo-SpinTM柱子中,16000g离心1min;
c)弃废液,在柱子里加入200μl DNA Washing Buffer,16000g离心1min;
d)弃废液,重复步骤c)一次;
e)将Zymo-SpinTM柱子转移到一个新的1.5ml的EP管中,并在柱子中央加入20μlDNA Elution Buffer,室温静置2min,16000g离心1min,洗脱纯化的cccDNA。洗脱出的cccDNA于-20℃储存备用。
3.4HBV DNA及cccDNA的检测
本研究中HBV稳定细胞系中的HBV DNA和cccDNA的相对定量,都是运用实时荧光定量PCR技术进行检测。
1)HBV total DNA qPCR:按照FastStart Essential DNA Probes Master说明书,具体操作如下:
a)配制HBV total DNA qPCR的反应体系如下表3-2:
total DNA上游引物:5’-CCGTCTGTGCCTTGTCATCTG-3’
total DNA下游引物:5’-AGTCCAAGAGTYCTCTTATGYAAGACCTT-3’
Probes:5’-FAM-CCGTGTGCACATGGCTTCACCTCTGC-TAMRA-3’
表3-2HBV total DNA qPCR的反应体系
b)使用罗氏LightCycler480 II实时荧光定量PCR仪器检测,反应条件如下表3-3:
表3-3HBV total DNA qPCR的反应条件
c)反应结束后,使用相对定量的方法(2-ΔΔCT法)分析处理数据。
2)HBV cccDNA qPCR:按照FastStart Essential DNA Probes Master说明书,具体操作如下:FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)
a)配制HBV cccDNA DNA qPCR的反应体系如下表3-4:
cccDNA上游引物:5’-TCATCTGCCGGACCGTGTAC-3’
cccDNA下游引物:5’-TCCGGATACAGAGCTGAGGCG-3’
Probes:5’-FAM-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGCCTGGC-
TAMRA-3’
表3-4HBV cccDNA qPCR的反应体系
b)使用罗氏LightCycler480 II实时荧光定量PCR仪器检测,反应条件如下表3-5;
表3-5HBV cccDNA qPCR的反应条件
4.蛋白免疫印迹检测蛋白水平表达
4.1细胞总蛋白提取:取出细胞,弃去原培养基,加入1~2mL 1×PBS,清洗两次,胰酶消化,弃去上清,轻轻弹起管底细胞,再次加入1mL PBS洗涤细胞两次,1200rpm,离心5min,完全弃去上清,弹匀管底细胞,根据细胞量,加入50~100μL含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液,充分吹打混匀细胞,置于冰上裂解30min后,4℃,12,000rcf,离心15min,吸取上清放入新的EP管中,所得即为细胞总蛋白。可直接进行后续蛋白浓度的测定或-80℃保存。
4.2BCA法测蛋白浓度:将BCA试剂A液与B液按照50:1的比例混匀,制备工作液;取5μL待测样本,加入95μL去离子水混匀,稀释20倍,取20μL稀释后的待测样本加入到96孔板中;加入200μL工作液后,将96孔板置于37℃孵箱,孵育30min,上机检测。
4.3蛋白变性:分别取100μg样品,用蛋白裂解液将各样本体积补齐,加入1/3总体积的4×loading buffer,充分混匀,99℃变性10min,离心后-80℃保存。
4.4蛋白电泳:将预制胶安装入电泳槽中,加入1×MOPS电泳液,拔掉预制胶顶层梳子,轻轻吹打上样孔,去除孔内残余凝胶;将预染蛋白Maker及等质量的蛋白样品小心加入凝胶孔中;将电压调至60V~80V,30min后,调整电压为110V~120V,当溴酚蓝跑至凝胶底部凹槽处,断开电源,停止电泳,整个电泳过程约2h~2.5h。
4.5电转印:将PVDF膜浸入无水甲醇中激活1min;将转膜夹黑色面朝下,由下向上依次放置海面-滤纸-PAGE胶-PVDF膜-滤纸-海绵,小心赶出胶/膜和滤纸之间的气泡,扣紧转膜夹,放入转膜槽中,PAGE胶朝向负极,PVDF膜朝向正极;
放入冰盒,倒入预冷的1×电转液;将电源调至100V,转膜1~1.5h。
4.6封闭:转膜结束后,取出PVDF膜,放入1×TBST清洗数次,去除膜上残留的电转液后,浸入5%脱脂牛奶中封闭,室温2h,或4℃过夜。
4.7孵育一抗:按照1/1000稀释一抗GAPDH,HCBP6;按照蛋白分子量的大小,将相应位置的PVDF膜与上述抗体封闭于杂交袋中,4℃孵育过夜。
4.8洗膜:剪开杂交袋,回收一抗,取出PVDF膜,放入1×TBST中,置于摇床上洗膜三次,每次10min。
4.9孵育二抗:按照1/5,000~1/10,000的比例稀释二抗,将上述PVDF膜浸入相应二抗中,置于摇床上,室温孵育45-60min。
4.10洗膜:回收二抗,取出PVDF膜,放入1×TBST中,置于摇床上洗膜三次,每次10min;检测磷酸化蛋白时,需适当减少洗膜次数和洗膜时间。
4.11曝光显色:将膜置于置于Fusion Solo成像仪暗箱中,滴加ECL曝光液,进行显影。
二、实验步骤和实验结果
实验结果
(a)体外药效评价-TRPV4对HBV RNA、HBV DNA、cccDNA及HBV核心蛋白(HBcAg)的作用
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染TRPV4外源性过表达质粒或siRNA,HepG2细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染1.3-HBVvector,TRPV4外源性过表达质粒或siRNA,48小时后收集细胞,提取总RNA,应用Q-PCR方法检测细胞内的HBV RNA(totalRNA、pgRNA、precore RNA);
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染TRPV4外源性过表达质粒或siRNA,48小时后收集细胞,提取细胞内总蛋白,应用Western blotting检测细胞内的TRPV4蛋白和HBV核心蛋白(HBcAg)的表达量;
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染TRPV4外源性过表达质粒或siRNA,48小时后收集细胞,Hirt法提取DNA,应用Q-PCR方法检测细胞内的HBV DNA;
HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染TRPV4外源性过表达质粒或siRNA,48小时后收集细胞,Hirt法提取DNA,分离纯化cccDNA,应用Q-PCR方法检测细胞内的cccDNA。
结果显示:
HepG2.2.15细胞中沉默TRPV4,pgRNA及totalRNA均下调;过表达TRPV4,pgRNA及totalRNA均上调(图1-1A,B);在HepAD38细胞中沉默TRPV4,pg RNA及total RNA、precore下调;过表达TRPV4,pg RNA及total RNA、precore上调(图1-1C,D);在HepG2细胞中过表达1.3-HBV vector:干扰TRPV4后,pg RNA及total RNA、pre-Core下调,过表达TRPV4后,pgRNA及total RNA、pre-Core上调(图1-1E,F);
HepG2.2.15和HepAD38细胞中,沉默TRPV4表达后,HBcAg表达下降,而过表达TRPV4后,HBcAg表达明显升高(图1-2);
HepG2.2.15和HepAD38细胞中,沉默TRPV4表达后,HBV DNA表达下降,而过表达TRPV4后,HBV DNA表达升高(图1-3);
在HepAD38细胞中沉默TRPV4,诱导12天后cccDNA下调;过表达TRPV4,cccDNA上调(图1-4);
以上结果表明TRPV4可以促进HBV的复制和转录,而沉默TRPV4以后,可以抑制HBV的复制和转录。
实施例2:对于TRPV4抑制剂GSK2798745、GSK2193874、RN-1734的体外药效评价
1.体外药效评价-HBV RNA及cccDNA
HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,分别加入不同浓度TRPV4抑制剂GSK2798745、GSK2193874、RN-1734,48小时后收集细胞,分别提取总RNA,Hirt法提取DNA,分离纯化cccDNA,应用Q-PCR方法检测细胞内的HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)和cccDNA。
结果显示,给予TRPV4抑制剂GSK2798745、GSK2193874、RN-1734后,HepAD38细胞中HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)和cccDNA均明显降低(图2),说明TRPV4抑制剂GSK2798745、GSK2193874、RN-1734在HBV转录和复制水平都发挥了较强的抑制作用。
2.体外药效评价-HBV核心蛋白(HBcAg)的表达
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,加入不同浓度的TRPV4抑制剂GSK2798745,GSK2193874,RN-1734,HepG2细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染1.3-HBV vector,同时加入不同浓度的TRPV4抑制剂GSK2798745,GSK2193874,48小时后收集细胞,提取蛋白,应用Western blotting方法检测细胞内的HBV核心蛋白(HBcAg)的表达量。
结果显示,TRPV4抑制剂GSK2798745,GSK2193874,RN-1734可以抑制HepG2.2.15、HepAD38和HepG2+HBV 1.3细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的表达(图3)。
实施例3:对于TRPV4激活剂GSK1016790A的体外药效评价
体外药效评价-HBV RNA、cccDNA及HBV核心蛋白(HBcAg)的表达
GSK1016790A是有效的,选择性瞬时受体电位香草酸4(TRPV4)通道激活剂。
HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,加入不同浓度的TRPV4激活剂GSK1016790A,48小时后收集细胞,分别提取总RNA,Hirt法提取DNA,分离纯化cccDNA,应用Q-PCR方法检测细胞内的HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)和cccDNA;
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,加入不同浓度的TRPV4激活剂GSK1016790A,HepG2细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染1.3-HBVvector,同时加入不同浓度的TRPV4激活剂GSK1016790A,48小时后收集细胞,提取细胞内总蛋白,Western blotting检测细胞内的HBV核心蛋白(HBcAg)的表达量。
结果显示:
给予TRPV4激活剂GSK1016790A后,HepAD38细胞中HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)和cccDNA均明显升高(图4-1);
给予TRPV4激活剂GSK1016790A后,HepG2.2.15、HepAD38和HepG2+HBV 1.3细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的表达均明显升高(图4-2);
以上结果表明TRPV4激活剂GSK1016790A可以促进HBV的复制和转录。
实施例4:对于“治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态”的药物的筛选
1.筛选对于TRPV4的作用
Trichostatin A
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,加入不同浓度的TSA,48小时后收集细胞,提取细胞内总蛋白,应用Western blotting检测细胞内TRPV4蛋白的表达量;
结果显示:
给予TSA后,HepG2.2.15和HepAD38细胞中TRPV4蛋白的表达均明显降低(图5-1);
2.体外药效评价:对HBV RNA、HBV DNA、cccDNA、HBV核心蛋白(HBcAg)的作用
Trichostatin A
HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,加入不同浓度的TSA,48小时后收集细胞,分别提取总RNA,Hirt法提取DNA,分离纯化cccDNA,应用Q-PCR方法检测细胞内的HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)、HBV DNA和cccDNA;
HepG2.2.15和HepAD38细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,加入不同浓度的TSA,HepG2细胞正常传代分板,贴壁生长12小时后,瞬时转染1.3-HBV vector,同时加入不同浓度的TSA,48小时后收集细胞,提取细胞内总蛋白,应用Western blotting检测细胞内HBV核心蛋白(HBcAg)的表达量。
结果显示:
给予TSA后,HepAD38细胞中HBV RNA(total RNA、pgRNA、precore RNA)、HBV DNA和cccDNA均明显降低(图5-2);
给予TSA后,HepG2.2.15、HepAD38和HepG2+HBV 1.3细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的表达均明显下降(图5-3);
以上结果表明TSA可以抑制TRPV4蛋白的表达,进而抑制HBV的复制和转录。
Claims (6)
1.TRPV4抑制剂在制备用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物中的用途;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
2.药物组合在制备用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物中的用途,所述药物组合包含或由以下组成:TRPV4抑制剂以及其他药物;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
优选地,所述其他药物用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述其他药物包括但不限于核苷酸类药物(如恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯或拉米夫定)、干扰素(如干扰素α2a、干扰素α1b或干扰素α2b)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、入胞抑制剂、RNA干扰药物、cccDNA靶向药物,或其任意组合。
3.一种筛选用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的药物的方法,所述方法包括以下步骤:
1)测试候选药物抑制TRPV4的活性;
2)进一步对于步骤1)中结果显示具有抑制TRPV4的活性的候选药物进行对于HBV的体外药效评价(优选测试对于HBV RNA、HBV DNA、cccDNA及HBV核心蛋白(HBcAg)的作用);
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合。
4.TRPV4抑制剂,用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
5.药物组合物,用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态,其中,所述药物组合物包含或由以下组成:TRPV4抑制剂以及其他药物;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
优选地,所述其他药物用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述其他药物包括但不限于核苷酸类药物(如恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯或拉米夫定)、干扰素(如干扰素α2a、干扰素α1b或干扰素α2b)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、入胞抑制剂、RNA干扰药物、cccDNA靶向药物,或其任意组合。
6.一种治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态的方法,其包括:
给予有需要的受试者有效量的TRPV4抑制剂或者药物组合物,其中,所述药物组合物包含或由以下组成:TRPV4抑制剂以及其他药物;
优选地,所述TRPV4抑制剂选自GSK2798745、GSK2193874、RN-1734、Trichostatin A,
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述其他药物用于治疗和/或预防由HBV引发的疾病或感染或者用于维持肝脏稳态;
优选地,所述由HBV引发的疾病或感染为肝脏疾病;
优选地,所述肝脏疾病选自乙型肝炎(如慢性乙型肝炎)、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化、肝癌(如原发性肝细胞癌),或其任意组合;
优选地,所述其他药物包括但不限于核苷酸类药物(如恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯或拉米夫定)、干扰素(如干扰素α2a、干扰素α1b或干扰素α2b)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、入胞抑制剂、RNA干扰药物、cccDNA靶向药物,或其任意组合。
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