CN110652522B

CN110652522B - miR-2052在制备抗肝癌药物中的应用

Info

Publication number: CN110652522B
Application number: CN201910983731.5A
Authority: CN
Inventors: 张学武; 张宏伟; 廖智斌; 刘富荣; 张必翔; 陈孝平
Original assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Current assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2039-10-16
Also published as: CN110652522A

Abstract

本发明提供了一种miR‑2052的新用途‑在制备抗肝癌药物中的应用，所述miR‑2052的序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还提供了一种抗肝癌药物，所述抗肝癌药物包括miR‑2052 mimic、miR‑2052真核表达载体、miR‑2052病毒表达载体、以及所述miR‑2052病毒表达载体包装形成的病毒中的至少一种。本发明通过大量的实验数据证明miR‑2052能够明显抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移，因此miR‑2052可用于制备防治肝癌的药物。

Description

miR-2052在制备抗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及miR-2052在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。其发病机制是极其复杂的，可以有多种原因，包括慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、接触黄曲霉毒素B1、酒精性和非酒精性脂肪性疾病等。尽管最近的研究发现了许多影响肝癌发展的基因和途径，但治疗和患者预后仍不能令人满意。

微小RNA(miRNA)广泛存在于生物体内，具有高度保守性，并参与了机体内的多种病理生理过程。miRNA是由19～25个核苷酸构成的内源性非编码RNA，参与信使RNA稳定性和翻译的控制。它最初是在1993年由Ambros等发现的。MiRNA基因是一种非编码基因，其转录产物是miRNA。miRNAs的异常调节参与多种疾病的发生和发展，包括多种癌症、心血管疾病及退行性疾病等。它在体内胚胎发生、调节细胞分化、增殖和凋亡等正常生理变化中发挥关键作用。因此寻找新的与肝癌发生相关的miRNA，对于肝癌的诊断和治疗将非常有意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供miR-2052的新用途-在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明是这样实现的：

第一，本发明检测了42对肝癌组织和癌旁组织中miR-2052的表达水平，结果如图1所示，miR-2052的表达水平在肝癌组织比癌旁组织中明显降低。

第二，本发明采用CCK8实验检测miR-2052对人肝癌细胞增殖的影响，图2A-B可知，转染了miR-2052模拟物(miR-2052mimic)的人肝癌细胞HLF和97H的增殖速率显著低于转染了NC-mimic的人肝癌细胞；由图2C-D可知，转染了miR-2052抑制物(miR-2052inhibitor)的人肝癌细胞HLF和97H的增殖速率显著低于转染了NC-inhibitor的人肝癌细胞，同样表明miR-2052可以抑制人肝癌细胞的增殖速率。综上所述，CCK8检测结果显示miR-2052抑制了HCC细胞的增殖。

第三、本发明采用trans-well实验检测miR-2052对HCC细胞的侵袭与转移能力的影响，结果trans-well分析显示miR-2052模拟物(miR-2052mimic)降低了人肝癌细胞HLF和97H细胞的侵袭(图3A)与转移(图3B)，而miR-2052抑制剂(inhibitor)增加了HLF和97H细胞的侵袭(图3C)与转移(图3D)。

第四，本发明采用异种移植瘤模型研究miR-2052在裸鼠体内的作用，结果表明，miR-2052可以在裸鼠体内抑制肝癌细胞的增殖。

综上可知，miR-2052可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移。

因此，所述miR-2052可以作为抗肝癌药物进行应用。具体应用时，可以将miR-2052mimic或miR-2052病毒表达载体包装形成的病毒制备成抗肝癌药物制成不同的剂型，也可以构建miR-2052的表达载体(表达区序列如SEQ ID NO.4所示，包括真核表达载体，病毒表达载体)用于基因治疗。

所述抗肝癌药物的剂型为颗粒剂、缓释剂、显微注射剂、转染剂或表面活性剂；所述抗肝癌药物还包括制备不同剂型所需的常规辅料。

本发明具有的有益效果是：

本发明通过大量的实验数据证明，miR-2052能够明显抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移，因此miR-2052可用于制备防治肝癌的药物。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的肝癌组织和癌旁组织中的miR-2052的表达分析检测结果，图中横坐标中N代表癌旁组织，C代表肝癌组织；

图2为本发明实施例3提供的CCK8实验检测miR-2052对人肝癌细胞增殖的影响的结果；其中图A为mimic和NC-mimic转染HLF细胞的结果；图B为mimic和NC-mimic转染97H细胞的结果；图C为inhibitor和NC-inhibitor转染HLF细胞的结果；图D为inhibitor和NC-inhibitor转染97H细胞的结果；图中mimic代表miR-2052mimic，NC-mimic代表mimic阴性对照，inhibitor代表miR-2052inhibitor，NC-inhibitor代表inhibitor阴性对照；

图3为本发明实施例4提供的采用trans-well实验检测miR-2052对HCC细胞的侵袭与迁移能力的影响结果；其中图3A为mimic和NC-mimic转染HLF细胞和97H细胞的侵袭实验结果；图3B为mimic和NC-mimic转染HLF细胞和97H细胞的迁移实验结果；图3C为inhibitor和NC-inhibitor转染HLF细胞和97H细胞的侵袭实验结果；图3D为inhibitor和NC-inhibitor转染HLF细胞和97H细胞的迁移实验结果；

图4为本发明实施例5提供的异种移植小鼠模型中肿瘤组织的变化结果；其中A图为肿瘤组织的图片；B图为肿瘤组织的体积；C图为肿瘤组织的重量；

图5为本发明实施例5提供的剥离的肿瘤组织免疫组化检测miR-2052的表达结果；

图6为本发明实施例5提供的剥离的肿瘤组织免疫组化检测Ki67的表达结果；

图7为本发明实施例2中慢病毒载体构建所用的的GV369慢病毒载体的图谱；

图8为Pri-miRNA-2052重组病毒载体的病毒上清感染效果结果；其中(A)图为绿色荧光视野；(B)图为明场视野。

具体实施方式

实施例1肝癌组织和癌旁组织中的miR-2052的表达分析检测

1、肝癌临床样品的采集

42对肝癌组织和癌旁组织由华中科技大学同济医学院附属同济医院提供。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，迅速切成小块于冻存管中置于液氮中速冻后于-80℃保存备用。

2、miRNA提取

每100mg组织加入1mL Trizol，置于冰上充分匀浆破碎组织块，室温下静置5分钟后，加入200μL氯仿溶液，涡旋混匀15秒后室温静置10分钟。4℃，13400g室温离心15分钟；将上清液转移至新的1.5mL离心管，加入等倍上清体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀数次后，室温静置10分钟，4℃，13400g离心10分钟后，吸除上清，加入1000μL的75％乙醇溶液(无RNA酶水新鲜配制)，轻吹悬浮清洗RNA，4℃，13400g离心5分钟沉淀RNA。吸除上清后，置于室温通风处晾干，干燥5分钟左右。加入适量无核酸酶水待充分溶解后测定OD₂₆₀和OD₂₈₀吸收值。也可按照北京天根生物技术公司的miRcute minRNA提取分离试剂盒提取miRNA。

3、荧光定量PCR检测miR-2052水平

采用3’端加多聚poly(A)尾的反转录后荧光定量PCR的方法。

(1)采用3’端加多聚poly(A)尾后反转录成cDNA：采用北京天根生物技术公司的加多聚poly(A)尾和针对miRNA的cDNA第一链合成试剂盒，取上述提取的2μg miRNA作为模板，对miRNA进行加Poly(A)尾并反转录成cDNA。简要操作为：

miRNA3’端加多聚poly(A)尾：反应体积为20μL，含E.coli Poly(A)聚合酶2U，5×rATP反应液及miRNA提取液5μL，反应条件为37℃60min；

逆转录反应：反应体积为20μL，含Poly(A)反应液2μL，10×逆转录引物2μL，dNTP 1μL，RNasin 40U，Quant RTase 0.5μL，反应条件为37℃60min；

(2)荧光定量PCR

采用北京天根生物技术公司的miRNA荧光定量检测试剂盒进行操作，反应体积为20μL，含2×SYBR 10μL，10μM的上下游引物各0.4μL，cDNA2μL；荧光定量PCR仪上进行扩增，反应条件为：94℃20Sec；60℃34Sec；重复40个循环；miR-2052荧光定量的上游引物序列为5’-CGGGCGCGCGTGTTTTGATAACAGTAATGT-3’如SEQ ID NO.9所示。

测得样本miR-2052扩增的CT值，以内参基因U6的CT值进行标准化校正；所得CT值使用2^-ΔΔCT法进行计算，比较不同样本间miR-2052含量的差异。

结果如图1所示，与正常肝脏组织相比，miR-2052在肝癌组织中的表达明显降低。表明miR-2052的异常降低与肝癌的发生密切相关。

实施例2miR-2052mimic与miR-2052的表达载体

一、本发明为获得高效表达，分别合成了miR-2052mimic和miR-2052inhibitor。其中，miR-2052mimic，inhibitor以及阴性对照序列如下：

1.miR-2052mimic：正义链UGUUUUGAUAACAGUAAUGU，如SEQ ID NO.2所示；反义链ACAUUACUGUUAUCAAAACA，如SEQ ID NO.3所示；

2.mimic negative control：正义链UUUGUACUACACAAAAGUACUG，如SEQ ID NO.5所示；反义链CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA，如SEQ ID NO.6所示；

3.miR-2052inhibitor：ACAUUACUGUUAUCAAAACA，如SEQ ID NO.7所示；

4.NC-inhibitor：CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA，如SEQ ID NO.8所示。

二、miR-2052的表达载体

miR-2052的表达载体的表达区序列如SEQ ID NO.4所示，miR-2052的表达载体包括miR-2052真核表达载体、miR-2052病毒表达载体，其中所述miR-2052病毒表达载体包括miR-2052慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体。这里以miR-2052慢病毒载体为例，采用同源重组法构建载体，构建方法如下：

1、Pri-miRNA-2052序列的获得

通过miRBase库找到miRNA-2052基因的Pri-miRNA序列(如SEQ ID NO.4所示)，交由上海生工生物公司合成含有Pri-miRNA-2052序列的载体。

2、Pri-miRNA-2052重组质粒的获得

(1)上下游引物：如表1所示，规划引物时引进AgeI/NheI特异性酶切位点，具体地：上游引物5’端前面加的是酶切位点(AgeI)及该酶切位点在GV369慢病毒载体中对应互补片段，下游引物加的是NheI酶切位点及该酶切位点在GV369慢病毒载体中对应后边的互补片段。

表1

(2)所述测序公司合成含有Pri-miRNA-2052序列的载体为模板，用所述上下游引物进行PCR扩增获得的Pri-miRNA-2052基因序列的产物；反应体系为：

表2

温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30S，→58℃，30S，→68℃，30S)×40→68℃，10min→16℃。利用琼脂糖凝胶电泳回收扩增带。

(3)将GV369载体采用AgeI/NheI双酶切进行线性化，利用琼脂糖凝胶电泳回收，冰上融化并且充分混匀，并配制如下反应体系后置于37℃孵育1h；转化大肠杆菌stbl3，挑取阳性克隆送上海生物工程有限公司进行序列测定，测序结果与预期相符，说明Pri-miRNA-2052重组GV369载体构建成功。

表3

3、重组慢病毒表达载体进行病毒包装

培养293T细胞，取Pri-miRNA-2052重组GV369载体与慢病毒包装载体(phelper2.0，phelper 1.0)一起共转染293T细胞，按照病毒包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，48h后收集Pri-miR-2052病毒上清，1500g离心10min后取上清经0.45μM滤膜过滤。

4、Pri-miRNA-2052重组病毒载体的病毒上清感染效果的检测

将Pri-miR-2052慢病毒上清感染HL-7702肝细胞，36h后在荧光显微镜下观察到病毒感染效果如图8所示，从图8可知Pri-miR-2052慢病毒带GFP发绿色荧光，证明病毒包装感染成功。计算出病毒的滴度为8×10⁸IFU。

同时实施例5中从剥离的组织中提取总RNA和蛋白，通过qPCR检测miR-2052的表达。图5结果也说明Pri-miR-2052慢病毒在肝癌细胞中成功表达同时能说明病毒感染表达成功。

实施例3CCK8实验检测miR-2052对小鼠肝癌细胞增殖的影响

采用CCK8试剂盒进行检测，具体方法如下：

收集成功转染miR-2052的mimic、NC-mimic、inhibitor以及NC-inhibitor 24h的97H，HLF细胞，用血球计数板计数大约2×10⁴个细胞/mL，并将记数后的细胞铺在96孔板的每孔中，总体积为100μl，每组设3个复孔。将96孔板放置于37℃，CO₂培养箱中分别培养0d、1d、2d、3d、4d。每孔细胞悬液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO₂培养箱中孵育30min。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的方差分析方法来分析各组数据，结果如图2所示。

由图2A-B可知，转染了miR-2052模拟物(miR-2052mimic)的人肝癌细胞HLF、97H的增殖速率显著低于转染了NC-mimic的人肝癌细胞；由图2C-D可知，转染了miR-2052抑制物(miR-2052inhibitor)的人肝癌细胞HLF、97H的增殖速率显著高于转染了NC-inhibitor的人肝癌细胞，同样表明miR-2052可以抑制小鼠肝癌细胞的增殖速率。综上所述，CCK8检测结果显示miR-2052抑制了HCC细胞的增殖。

实施例4trans-well实验检测miR-2052对HCC细胞的侵袭与转移能力的影响

1、Melting EC Matrix gel(BD，USA)胶置于4℃过夜融化，待胶融化后，将胶分别与无血清的DMEM培养基按1：4的比例混匀，加入混合液50μl于各个小室中。将小室置于在37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h。吸出胶融化后小室中残余的空培养基。

2、细胞悬液的制备

(1)细胞转染：200nM终浓度转染24h的两组细胞

第一组：mimic与NC-mimic分别转染HLF细胞；

第二组：mimic与NC-mimic分别转染97H细胞；

第三组：inhibitor与NC-inhibitor分别转染HLF细胞；

第四组：inhibitor与NC-inhibitor分别转染97H细胞；

(2)悬浮液的制备

0.25％胰酶消化并用含10％FBS的DMEM悬浮制备单细胞悬液，细胞计数后调整细胞浓度至5×10⁵个/ml；

3、加入细胞悬液

侵袭实验：吸取约100μl不含血清的培养基将各组细胞悬液按每孔100μl的量加入含上述Matrix gel胶处理的Transwell小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入600μl全培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养细胞24h。PBS冲洗各小室3次，用棉签擦拭上室的上层细胞(未穿过小室的细胞)。

迁移实验：同时吸取约100μl不含血清的培养基将各组细胞悬液按每孔100μl的量加入不含Matrix gel胶的Transwell小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入600μl全培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养细胞24h。

4、检测

24h后取出Transwell小室，用PBS冲洗三次，冲洗小室下部未固定的细胞，用棉签头擦去Transwell小室上层细胞，4％多聚甲醛固定20min后0.1％结晶紫染色20min；正置显微镜观察Transwell小室下底面发生转移的细胞，并对转移的细胞进行计数，各组细胞间的差异采用单因素方差分析，SPSS13.0统计学软件进行分析，结果如图3所示。

5、由图3可知，转染mimic后，穿过小室的肝癌细胞减少，细胞侵袭力下降。trans-well分析显示miR-2052mimic降低了人肝癌细胞HLF和97H细胞的侵袭(图3A)与转移(图3B)，而miR-2052抑制剂(inhibitor)增加了HLF和97H细胞的侵袭(图3C)与转移(图3D)。

实施例5异种移植瘤模型研究miR-2052在体内的作用

一、异种移植小鼠模型的构建

1、将10只雄性BALB/c裸小鼠(5周龄)分为2组(NC慢病毒、Pri-miR-2052慢病毒)。然后，将2×10⁶个稳定表达有NC慢病毒(不含miR-2052的空载慢病毒)、miR-2052的慢病毒(构建包装方法如实施例2所述)的处于对数生长期的HLF细胞皮下注射到裸鼠体内。5周后处死裸鼠，剥去肿瘤组织称重。肿瘤体积计算公式：V(mm³)＝0.5×L(mm)×W²(mm²)。

2、肿瘤组织的图片如图4-A所示，可明显看到miR-2052组的肿瘤组织小于NC组的肿瘤组织；肿瘤组织的体积与重量分别如图4-B、图4-C所示，表明：与对照组相比，miR-2052组肿瘤的体积与重量明显下降。

3、从剥离的组织中提取总RNA和蛋白，通过qPCR检测miR-2052的表达。具体方法见实施例1，图5为miR-2052的相对表达量结果，与NC组相比，miR-2052的异种移植瘤的miR-2052表达高。

4、将剥离的组织置于10％中性福尔马林中固定、石蜡包埋后用于免疫组化检测Ki67(细胞增殖的标记物)的表达。图6为Ki67的相对表达量结果，与NC组相比，miR-2052的异种移植瘤的Ki67表达较低。

综上表明，miR-2052可以在裸鼠体内抑制肝癌细胞的增殖。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限制本发明，凡在本发明之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120> miR-2052在制备抗肝癌药物中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uguuuugaua acaguaaugu 20

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uguuuugaua acaguaaugu 20

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acauuacugu uaucaaaaca 20

<210> 4

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaaagggaa aagccttcag taaaacatag agatggtgct tgtagtcaag ggatacgacc 60

ttaggcagaa agaaggggga aaaaaagacc atgtcagttt ctacttccaa gaaaagctgg 120

ttgctgtttt gataacagta atgtcccttt agttcaaagt taccagctat caaaacaagt 180

tgcagtccat agcagactaa ctcctttccc ttacagagaa gcagattcta gtgtaactga 240

ctccaaataa aaatatattt acgataaaac taggcccatg g 281

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uuuguacuac acaaaaguac ug 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caguacuuuu guguaguaca aa 22

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acauuacugu uaucaaaaca 20

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caguacuuuu guguaguaca aa 22

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgggcgcgcg tgttttgata acagtaatgt 30

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaggatcccc gggtaccggt gaaagggaaa agccttcag 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacacattcc acaggctagc catgggccta gttttatcg 39

Claims

1.miR-2052在制备用于抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞的侵袭与转移的药物中的应用，所述miR-2052的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抗肝癌药物，其特征在于，所述抗肝癌药物包括miR-2052 mimic、miR-2052真核表达载体、miR-2052病毒表达载体、以及所述miR-2052病毒表达载体包装形成的病毒中的至少一种。

3.如权利要求2所述的抗肝癌药物，其特征在于，所述miR-2052 mimic

的正义链序列如SEQ ID NO.2所示；反义链序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求2所述的抗肝癌药物，其特征在于，所述miR-2052的真核表达载体的表达区序列如SEQ ID NO.4所示。

5.如权利要求2所述的抗肝癌药物，其特征在于，所述miR-2052病毒表达载体包括miR-2052慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体。

6.如权利要求5所述的抗肝癌药物，其特征在于，所述miR-2052慢病毒载体的表达区序列如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求2所述的抗肝癌药物，其特征在于，所述抗肝癌药物的剂型为颗粒剂、缓释剂或显微注射剂；所述抗肝癌药物还包括制备所述剂型所需的常规辅料。