CN111494388B

CN111494388B - Ym201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用

Info

Publication number: CN111494388B
Application number: CN202010396189.6A
Authority: CN
Inventors: 罗震; 吴建国; 梁艺聪; 邬开朗; 苏芮
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2040-05-12
Also published as: CN111494388A

Abstract

本发明属于生物技术和生物医药技术领域，公开了YM201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用。所述YM20163的分子式为：C₂₅H₂₁N₇O₃；结构式如下。本发明基于肠道病毒在宿主细胞中复制的共性，采取小分子化合物YM201636，特异性地靶向宿主细胞PIKFYVE蛋白，导致细胞器膜成分受阻，即抑制早期内体向晚期内体的环节，阻断内吞体分选转运复合体(ESCRT)膜转运复合体的正常形成，破坏ESCRT复合体介导的肠道病毒复制复合体，从而抑制肠道病毒的复制水平，到达控制多种肠道病毒的目的，实现广谱，高效的抗肠道病毒效果。

Description

YM201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药技术领域，特别涉及YM201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用。

背景技术

肠道病毒感染是广泛分布于世界各地的传染病，该疾病在成人和儿童中均可发病，在儿童尤甚。临床表现为轻症患者四肢出现红疹，水泡，全身乏力等；重症患者则出现全身性重要器官(包括脑，心和肝)损伤，预后较差，可导致后遗症或死亡。肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(Enterocytopathic human orphan virus，ECHO简称埃可病毒)及新型肠道病毒(Enterovirus)共71个血清型。本属病毒感染分布广泛，由此引起的脊髓灰质炎和手足口病临床表现复杂多样，目前临床防控手段仍以预防为主。脊髓灰质炎疫苗预防效果甚佳，但是对其他肠道病毒感染尚缺少特异的控制方法；EV71疫苗在预防病毒感染有一定的效果，然而EV71儿童感染人数有相当数目，尚无特效的治疗药物。

当出现肠道病毒感染患者，现有的技术一是采取传播途径阻断，避免急性发热病人接触婴幼儿；也有采取注射γ-球蛋白或胎盘球蛋白，起到一定的预防和治疗作用。此外，手足口病患者中常常出现柯萨奇病毒和新型肠道病毒的共感染或病毒之间基因组重组，为防控手足口病流行带来新的困扰，采用疫苗预防控制感染数目有限。

目前关于抗肠道病毒的药物，主要还围绕在单一的某类肠道病毒株，如利用氨基噻唑类或喹啉甲酰胺类或芳香酯类化合物实现抗EV71[1-3]，其机理针对EV71病毒复制本身，易产生耐药性，且只能针对单一的肠道病毒。

因此，我们亟需寻求一种新型的广谱，高效的预防和治疗肠道病毒感染的药物，对不同肠道病毒感染引起的疾病实施快速有效地控制，以此为治疗该类提供建设性的治疗策略。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供YM201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

YM201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用。

所述YM201636的分子式为：C₂₅H₂₁N₇O₃；结构式如下：

所述肠道病毒包括但不限于：肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇B3病毒(CVB3)、脊髓灰质炎病毒1型(PV1)、肠道病毒68型(EV68)、甲型肝炎病毒(HAV)、人鼻病毒(RhV)等无包膜单链RNA病毒。

所述抗肠道病毒感染药物的剂型包括但不限于目前药学上可接受任何剂型，包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。

所述以YM201636或其药学上可接受的盐为活性成分的药物可以与药物上可接受的载体或辅料配合，制成药物组合物，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。

优选的，所述药物组合物的给药方式为口服给药、注射给药、局部给药。

其中，对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂；对于注射给药，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂；对于局部给药，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。

所述药物组合物的剂型不限；优选的，对于口服给药制剂，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片；对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。

所述YM201636作为抗病毒药物，在细胞水平上，预防模型抑制EV71复制的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.563±0.038μM；治疗模型抑制EV71复制的IC₅₀为0.519±0.032μM。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明基于肠道病毒在宿主细胞中复制的共性，采取小分子化合物YM201636，特异性地靶向宿主细胞PIKFYVE蛋白，导致细胞器膜成分受阻，即抑制早期内体向晚期内体的环节，阻断内吞体分选转运复合体(ESCRT)膜转运复合体的正常形成，破坏ESCRT复合体介导的肠道病毒复制复合体，从而抑制肠道病毒(包括EV71，CVB3和PV1)的复制水平，到达控制多种肠道病毒的目的，实现广谱，高效的抗肠道病毒效果。因此，我们将该小分子化合物YM201636进一步开发作为预防和治疗人肠道病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的YM201636在细胞水平抑制EV71复制的检测结果示意图；其中：

图1A：显示了YM201636对RD细胞的细胞毒性检测结果图；

图1B：显示了YM201636在RD细胞中抑制EV71病毒蛋白表达的检测结果图；

图1C：显示了YM201636在RD细胞中抑制EV71子代病毒产生的检测结果图；

图1D：显示了YM201636在RD细胞中抑制EV71复制的药效检测结果图。

图2为实施例2的YM201636在乳鼠中抑制EV71复制的检测结果示意图；其中：

图2A显示了YM201636对乳鼠体重(i)、临床评分(ii)、生存率(iii)检测结果图；

图2B显示了YM201636在乳鼠不同器官中抑制EV71复制的检测结果图。

图3为实施例3的YM201636抑制在细胞水平中CVB3和PV1的复制的检测结果示意图；其中：

图3A显示了YM201636在RD细胞中抑制CVB3复制中的检测结果图；

图3B：显示了YM201636在RD细胞中抑制PV1复制中的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

所述YM201636的化学名如下：6-氨基-N-[3-[4-(4-吗啉基)吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯基]-3-吡啶甲酰胺

(6-Amino-N-[3-[4-(4-morpholinyl)pyrido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]-3-pyridinecarboxamide)

试剂：DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；DMSO购自Sigma公司；CCK8(Cell Counting Kit-8)活性检测试剂盒购自日本Dojindo公司；结晶紫和低熔点琼脂糖购自上海生物生工公司。EV71 VP1抗体购于中国台湾Abnova公司，EV71 3C抗体购于武汉爱博泰克生物公司，HRP发光底物反应液购于Bio-Rad公司；无菌PBS溶液购于Hyclone公司；dsRNA鼠源一抗购自匈牙利Scicons公司，DAPI购自Roche公司，羊抗鼠Cy3荧光二抗购自武汉三鹰生物公司。

实验仪器：多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermofisher公司产品；生物发光仪购于日本Fujifilm公司；荧光共聚焦显微镜为日本Olympus公司。

实施例1

1.实验材料：

1.1细胞、病毒：

人胚胎横纹肌肉瘤(RD)细胞(资源编号：3142C0001000000321)从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉)获取。肠道病毒71(EV71)菌株(Xiangyang-Hubei-09)源自中国湖北省襄阳市一名死于EV71感染婴儿的脑组织，之前由武汉大学病毒学国家重点实验室中分离并保存(GenBank：JN230523.1)，病毒原种在RD细胞中扩增。小分子化合物YM201636购自美国MCE(MedChemExpress)公司。

2.实验方法与结果：

2.1 YM201636对RD细胞的细胞毒性检测

(1)将RD细胞按照5×10⁵个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，采用含10％FBSDMEM培养基，并添加1％的青霉素和链霉素。在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中培养。

(2)RD细胞贴壁后添加不同浓度梯度药物(YM201636)处理。药物浓度由新鲜2％FBS DMEM培养基稀释为：0，0.2，0.5，1，2，5和10μM，随后添加到贴壁的RD细胞中，每组三个重复孔。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用CCK8细胞活性检测试剂盒检测药物对细胞的毒性影响，此试剂的主要成分是一种基于WST(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)在450nm处读取吸光值(OD)。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，细胞活力(Cellviability％)计算公式＝(OD药物组-OD空白孔)/(OD未加药物组-OD空白孔)×100％。通过GraphPad Prism 7软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制YM201636对RD细胞的细胞毒性检测结果图，并计算出CC₅₀值。

如图1A所示。结果显示：YM201636对RD细胞的CC₅₀为24.82±4.01μM。

2.2 YM201636在细胞水平抑制EV71复制的检测：

EV71感染RD细胞后，病毒复制表达病毒蛋白，同时可导致细胞发生剧烈的细胞病变效应(CPE)，在低熔点琼脂糖培养基中单层细胞之间会产生空斑。因此，可分别通过免疫印迹和空斑实验来检测药物的抗病毒效果。

预防模型：

(1)将RD细胞接种到12孔板中，待细胞生长至90％密度时，更换含2％FBS DMEM培养基。

(2)配置一定浓度的药物(YM201636)，由新鲜2％FBS DMEM培养基稀释为0.5μM，添加到RD细胞中，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养处理1小时，更换为新鲜无血清DMEM培养基。

(3)用EV71(MOI＝0.5)感染细胞中，37℃培养2小时，再更换为2％FBS DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)分别在8，12和24小时后，收取细胞和细胞培养液上清。分别进行下一步的免疫印迹和空斑实验。

治疗模型：

(1)将RD细胞接种到12孔板中，待细胞生长至90％密度时，更换为无血清DMEM培养基。

(2)用EV71(MOI＝0.5)感染细胞中，37℃培养2小时。

(3)配置一定浓度的药物(YM201636)，由新鲜2％FBS DMEM培养基稀释为0.5μM，添加到RD细胞中，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养处理1小时，更换为2％FBS DMEM培养基。

免疫印迹检测：

(i)将收集的细胞加入100μl含有细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.5,300mMNaCl，1％Triton-X，5mM EDTA和10％甘油)和蛋白酶抑制剂cocktail充分重悬，放置冰上裂解15分钟。随后放在4℃、12000rpm离心10min，然后将裂解液上清转移到新的无菌EP管中。

(ii)采用BCA蛋白质定量试剂测定不同蛋白样品的蛋白浓度，各取40μg总蛋白，进行SDS-PAGE蛋白凝胶进行100V电压电泳，待蛋白样品电泳至分离胶停止电泳。

(iii)将分离胶按负极-1层支持物-3层滤纸-分离胶-NC膜-3层滤纸-1层支持物-正极的顺序放入转膜槽和转膜器中，加入转膜缓冲液，将整个转膜槽置于冰上，150mA转膜120分钟。

(iv)使用PBST溶液配置的5％脱脂牛奶，于常温下封闭转好的NC膜1小时，随后用PBST溶液洗去脱脂牛奶，按蛋白分子量大小将NC膜剪开，分别孵育EV71 VP1、EV71 3C和内参β-actin一抗，置于4℃垂直摇床过夜。

(v)用PBST溶液洗去残余的一抗，洗3次，每次5分钟。随后孵育对应一抗的HRP标记的二抗，置于4℃垂直摇床45分钟，PBST溶液洗去残余的一抗，洗5次，每次5分钟。最后向NC膜加入HRP发光底物，显色5分钟，在生物发光仪上曝光，获取目的蛋白的免疫印迹图片。

如图1B所示。结果图1B显示预防模型YM201636抑制EV71病毒蛋白表达和治疗模型YM201636抑制EV71病毒蛋白表达的免疫印迹实验结果代表图。

空斑实验检测：

(i)将细胞培养液上清中病毒滴度稀释成约10⁵/ml数量级。加入到RD细胞中37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时。

(ii)配制37℃，2％FBS，3％低熔点琼脂糖的培养基，更换旧培养基，在室温放置半小时，待培养基凝固后放回37℃、5％CO₂培养箱中继续培养72小时。

(iii)0.5％结晶紫(无水乙醇配制)对各孔进行染色，统计空斑数量。

如图1C所示。结果图1C显示预防模型YM201636抑制EV71子代病毒产生和治疗模型YM201636抑制EV71子代病毒产生的空斑实验代表图。

2.3 YM201636在细胞中抑制EV71复制药效IC₅₀浓度检测：

预防模型：

(2)添加不同浓度梯度药物(YM201636)处理，药物浓度由新鲜培养基稀释为：0，0.1，0.2，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2μM，添加到RD细胞中，将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养处理1小时，更换新鲜无血清DMEM培养基。

(3)用EV71(MOI＝0.5)感染细胞中，37℃培养2小时，再更换无血清DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)24小时后，收取细胞培养液上清中EV71子代病毒。进行下一步的空斑实验。

治疗模型：

(2)用EV71(MOI＝0.5)感染细胞中，37℃培养2小时。

(3)更换添加含有不同梯度药物(YM201636)的培养基，药物浓度由新鲜培养基稀释为：0，0.1，0.2，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2μM。稀释后的药物直接添加到RD细胞中，将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养处理1小时，更换无血清DMEM培养基。

(4)24小时后，收取细胞培养液上清。进行下一步的空斑实验。

将以上细胞培养上清，分别进行(2.2)中空斑实验检测：统计空斑数量，计算抑制率％(Inhibition％)＝药物处理组空斑数/药物未处理组空斑数×100％。根据不同浓度药物对EV71复制的抑制率，计算YM201636抑制EV71复制的IC₅₀值。

如图1D。结果图1D显示预防模型YM201636抑制EV71复制的IC₅₀为0.563±0.038μM；治疗模型YM201636抑制EV71复制的IC₅₀为0.519±0.032μM。

实施例2:YM201636在小鼠体内抑制EV71复制活性的检测

YM201636在制备治疗或预防肠道病毒感染药物中的应用，其步骤是：

1.实验材料：

1.1动物、病毒：

C57BL/6WT小鼠购自上海实验动物中心，将小鼠在无特定病原体(SPF)条件下，关在单独通风的笼子中饲养。肠道病毒71(EV71)菌株(Xiangyang-Hubei-09)源自中国湖北省襄阳市一名死于EV71感染婴儿的脑组织，之前由武汉大学病毒学国家重点实验室中分离(GenBank：JN230523.1),病毒原种在RD细胞中扩增。小分子化合物YM201636购自美国MCE(MedChemExpress)公司。

2.实验方法与结果：

2.1 YM201636对EV71感染乳鼠的体重、临床评分和生存率影响的检测。

(1)将3日龄C57BL/6乳鼠分为感染组和非感染组，分别腹腔注射接种EV71(每只1×10⁷PFU，重悬于20μl PBS中)和等体积PBS，2小时后分别注射25μg/只的YM201636和等量溶剂包含的DMSO。一天后重复分别注射25μg/只YM201636和等量溶剂包含的DMSO，每组8只小鼠。测量和计算乳鼠七天内体重、临床评分和生存率。

(2)连续七天测量和计算乳鼠体重、临床评分和生存状况，并计算生存曲线

如图2A，乳鼠体重(i)、临床评分(ii)和生存曲线(iii)。

2.2 YM201636抑制EV71感染乳鼠中不同器官中病毒复制活性的检测

(1)将3日龄C57BL/6乳鼠分为感染组和非感染组，分别腹腔注射接种EV71(每只1×10⁷PFU，重悬于20μl PBS中)和等体积PBS，2小时后分别注射25μg/只的YM201636和等量溶剂包含的DMSO。一天后重复分别注射25μg/只YM201636和等量溶剂包含的DMSO，每组8只小鼠。

(2)在感染第三天每组取4只乳鼠，解剖分离获得：脑、肝、心、肺、脾、肠和肌肉，并称重。

(3)碾磨组织，用100μl PBS重悬，于4℃，12000rpm离心5分钟，收集上清。

(4)将上清中病毒滴度稀释成约10⁵PFU/ml数量级。加入到RD细胞中37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时。

(5)配制37℃，2％FBS，3％低熔点琼脂糖的培养基，更换旧培养基，在室温放置半小时，待培养基凝固后放回37℃、5％CO₂培养箱中继续培养72小时。

(6)0.5％结晶紫(无水乙醇配制)对各孔进行染色，统计空斑数量，根据不同组织重量中产生的空斑计算出每g组织中EV71的空斑形成单位(PFU)，即PFU/g。

结果如图2B。

实施例3:YM201636抗CVB3、PV1的活性检测

1.实验材料：

1.1细胞、病毒：

人胚胎横纹肌肉瘤(RD)细胞从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉)获取。CVB3(Nancy株)(保藏编号：GDV015)和PV1(疫苗株)(保藏编号：GDV057)来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉)，病毒原种在RD细胞中扩增。小分子化合物YM201636购自美国MCE(MedChemExpress)公司。

2.实验方法与结果：

CVB3、PV1感染RD细胞，病毒在细胞内复制过程中产生dsRNA。因此使用免疫荧光技术进行评价病毒在细胞内复制水平。

2.1 YM201636在细胞水平抑制CVB3复制的检测

预防模型：

(2)添加不同浓度梯度药物(YM201636)处理，药物浓度由新鲜2％FBS DMEM培养基稀释为：0，0.1，0.2，0.5，1，2μM，添加到RD细胞中，将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养处理1小时，更换新鲜无血清DMEM培养基。

(3)用CVB3(MOI＝0.5)感染细胞中，37℃培养2小时，再更换为2％FBS DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)24小时后，终止细胞培养。进行下一步实验检测。

治疗模型：

(2)用CVB3(MOI＝0.5)感染细胞中，37℃培养2小时。

(3)更换添加含有不同梯度药物(YM201636)的培养基，药物浓度由新鲜2％FBSDMEM培养基稀释为：0，0.1，0.2，0.5，1，2μM。稀释后的药物直接添加到RD细胞中，将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养处理1小时，更换为2％FBS DMEM DMEM培养基。

(4)24小时后，终止细胞培养。进行下一步实验检测。

将以上样品，进行免疫荧光染色处理，具体步骤如下：

(i)PBS清洗浸洗培养皿2次，每次3分钟；随后用4％的多聚甲醛固定1小时，PBS浸洗培养皿2次，每次3分钟。

(ii)用0.1％saponin(PBST配制)于室温条件通透细胞20分钟。

(iii)PBS浸洗培养皿2次，每次3分钟。加入1％BSA(PBST配制)于室温条件封闭细胞1小时。

(iv)封闭后，用PBST洗三遍，按比例加入dsRNA一抗，4℃孵育细胞过夜。

(v)用预温PBS浸洗细胞2次，每次3分钟。加入用1％BSA稀释的荧光二抗，室温避光孵育1小时。

(vi)孵育结束后，避光条件PBST浸洗细胞3次，每次3分钟。加入10μg/ml DAPI溶液避光孵育5分钟，PBS浸洗细胞4次，每次5分钟。

(vii)在荧光共聚焦显微镜下观察采集图像。

如图3A。

2.2 YM201636在细胞水平抑制PV1复制的检测

按2.1中所述方法，检测PV1在RD细胞中dsRNA的表达情况，进行评价病毒在细胞内复制水平。结果显示，不同浓度YM201636抑制PV1在细胞中的复制。

结果如图3B。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.YM201636及其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒感染药物中的应用；所述肠道病毒为肠道病毒71型、柯萨奇B3病毒、脊髓灰质炎病毒1型；

所述YM201636的分子式为：C₂₅H₂₁N₇O₃；结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述YM201636作为抗病毒药物，在细胞水平上，预防模型抑制EV71复制的IC₅₀为0.563±0.038μM；治疗模型抑制EV71复制的IC₅₀为0.519±0.032μM。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗肠道病毒感染药物的剂型包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：所述以YM201636或其药学上可接受的盐为活性成分的药物与药物上可接受的载体或辅料配合，制成药物组合物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物组合物的剂型为口服给药剂型、局部给药的制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：对于口服给药，该药物上可接受的载体包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂；对于局部给药，药物上可接受的载体包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：对于口服给药制剂，药物组合物被制备成片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆。