CN116115734A - Gsdme基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及GSDME基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。本发明要解决的技术问题是为结肠癌的治疗提供一种新选择。本发明的技术方案是GSDME基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。本发明还提供了一种治疗结肠癌的药物，其主要活性成分为GSDME基因的编码蛋白。本发明利用溶瘤痘苗病毒介导GSDME基因在结肠癌细胞中特异性表达，从而发挥溶瘤效应和肿瘤细胞焦亡，增强抗肿瘤免疫，为靶向抗结肠癌治疗提供新型治疗策略。

Description

GSDME基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用
技术领域
本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及GSDME基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。
背景技术
结肠癌(Colon cancer)是常见的发生在结肠部位的消化道恶性肿瘤，也是全球最常见的死亡原因之一。早期结肠癌可以手术切除，但晚期癌通常是致命的，伴随的肝脏转移是最常见的死亡原因。目前结肠癌治疗涉及综合治疗过程，除常规传统手术，化放疗外，干细胞移植治疗、分子靶向免疫治疗以及溶瘤病毒治疗等也成为研究重点。溶瘤病毒联合新型抑癌基因靶向治疗结肠癌，有望为结肠癌的临床治疗提供新思路和新技术。
溶瘤病毒最近一直处于癌症生物治疗的前沿。溶瘤病毒是指在不损害正常细胞的情况下对肿瘤细胞进行选择性杀伤的一类病毒，它们自身具有有良好的溶瘤作用和靶向性。由于肿瘤组织的异质性和癌细胞的复杂性，单一类型的溶瘤病毒治疗不足以杀伤所有癌细胞。这些未被杀伤的癌细胞可能对某些溶瘤病毒具有抗性，这表明单一类型的溶瘤病毒治疗可能对一些类型的癌症都无效。因此，溶瘤病毒疗法最具挑战性的部分是识别最适合癌症类型自身的病毒和递送方法，并激活针对肿瘤细胞的免疫系统。目前，包括牛痘病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒和麻疹病毒在内的几种病毒正在被广泛研究并正在进行临床试验，用于治疗各种类型的晚期癌症。溶瘤病毒治疗的有效策略之一就是要改造出具有靶向特异性的重组溶瘤病毒，病毒靶向杀伤到肿瘤细胞来达到治疗目的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为结肠癌的治疗提供一种新选择。
本发明的技术方案是GSDME基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。
具体的，GSDME基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
本发明还提供了一种治疗结肠癌的药物，其主要活性成分为GSDME基因的编码蛋白。
本发明还提供了一种促进结肠癌细胞焦亡的药物，其主要活性成分为GSDME基因的编码蛋白。
进一步的，所述GSDME基因的编码蛋白来自表达GSDME基因的重组溶瘤痘苗病毒。
特别的，所述药物还包括多柔比星。
本发明还提供了GSDME基因的编码蛋白在激活肺癌细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、GzmB和/或GSDME途径中的应用。
具体的，GSDME基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
焦孔素E(Gasdermin E，GSDME)，又称DFNA5，是焦孔素(Gasdermin)家族的成员。
本发明的有益效果：
本发明利用溶瘤痘苗病毒介导GSDME基因在结肠癌细胞中特异性表达，从而发挥溶瘤效应和肿瘤细胞焦亡，增强抗肿瘤免疫，为靶向抗结肠癌治疗提供新型治疗策略。
首先利用RT-qPCR和Western blot检测了GSDME在不同细胞中的表达，结果表明GSDME在结肠癌细胞株中呈现低表达；MTT法检测了转染GSDME基因的结肠癌细胞SW480生长受到显著的抑制，且过表达GSDME的SW480经化疗药物Doxorubicin处理后，在形态学上有细胞焦亡的特征；Westernblot检测到GSDME-FL和GSDME-NT的产生，RT-qPCR检测到GSDME、IL-1β、TNF-α和GzmB的mRNA水平增加。由此可见化疗药物可以诱导GSDME介导的细胞焦亡途径，为接下来探究重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME诱导细胞焦亡的作用机制提供了依据。进一步，利用同源重组方法构建了携带GSDME基因的重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME，MTT法发现oncoVV-GSDME以剂量依赖或时间依赖的方式降低了HCT-116和SW480细胞的存活率，同时增加了乳酸脱氢酶LDH的释放量，表明oncoVV-GSDME能明显抑制结肠癌细胞的生长，并发生了细胞焦亡；形态学观察发现oncoVV-GSDME处理的HCT-116和SW480细胞显示出细胞肿胀且从质膜中出现大气泡的细胞焦亡特征；Western blot检测到经oncoVV-GSDME处理后HCT-116和SW480细胞中Caspase-3激活、GzmB增加和GSDME-NT的形成，这表明结肠癌细胞焦亡的水平与Cleaved caspase-3、GzmB和GSDME-NT的水平有关；流式细胞术检测到HCT-116经oncoVV-GSDME处理后，凋亡晚期的细胞明显增多。最后，利用构建的结肠癌HCT-116荷瘤裸鼠进行了体内异种移植的动物实验，结果显示相比对照空载溶瘤病毒oncoVV-KZ，oncoVV-GSDME对肿瘤生长具有显著的抑制作用，实现了更大程度的肿瘤消退。
综上，本发明成功构建了携带GSDME基因的重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME，体内外实验表明其能特异性靶向杀伤结肠癌细胞，诱导其发生依赖于Caspase-3/GzmB/GSDME途径的癌细胞焦亡，增强其抗肿瘤的能力；此外，重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME以非依赖化疗药物而是通过激活Caspase-3以及增加GzmB表达的GSDME介导的癌细胞焦亡途径，有望为结肠癌治疗提供一种有新型的治疗策略。
附图说明
图1、RT-qPCR检测GSDME在胰腺导管细胞hTERT-HPNE、胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990、结肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116和HT29中mRNA的相对表达。
图2、Western blot检测GSDME在胰腺导管细胞hTERT-HPNE、胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990、结肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116和HT29中的蛋白表达；(a)为hTERT-HPNE、PANC-1、SW1990、SW480、SW620、HCT-116和HT-29中GSDME-FL和GAPDH的蛋白免疫印迹图片。(b)为hTERT-HPNE、PANC-1、SW1990、SW480、SW620、HCT-116和HT-29中GSDME-FL的蛋白定量分析图。
图3、目的基因GSDME片段PCR扩增图；M：2000bp Marker。泳道1、2、3、4为pCS2-3flag-GSDME的转化产物。
图4、pCB-GSDME质粒的酶切鉴定；M：5000bp Marker，泳道1、2、3、4为pCB-GSDME的转化产物。
图5、重组痘苗病毒目的基因的PCR鉴定；M：2000bp Marker；泳道1：阴性对照；泳道2：GSDME阳性对照；泳道3、4、5oncoVV-GSDME基因组。
图6、重组痘苗病毒野毒的PCR鉴定；M：2000bp Marker；泳道1：阴性对照；泳道2：GSDME阳性对照；泳道3、4、5oncoVV-GSDME基因组。
图7、oncoVV-KZ处理组和oncoVV-GSDME处理组对SW620的抑制效果。
图8、oncoVV-KZ处理组和oncoVV-GSDME处理组对HT-29的抑制效果。
图9、oncoVV-KZ处理组和oncoVV-GSDME处理组对HCT-116的抑制效果。
图10、oncoVV-KZ处理组和oncoVV-GSDME处理组SW480的抑制效果。
图11、不同MOI的oncoVV-KZ和oncoVV-GSDME处理HCT-116细胞或SW480细胞在72h时的LDH释放量。
图12、2MOI oncoVV-KZ或2MOI oncoVV-GSDME处理HCT-116细胞或SW480细胞在不同处理时间的LDH释放量。
图13、2MOI的oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理HCT-116和SW480细胞48h时的细胞形态示意图；Original magnification：×200；Scale bar，200μm；红色箭头所指为焦亡细胞。
图14、2MOI oncoVV-GSDME处理HCT-116和SW480细胞48h时的焦亡细胞形态图；Original magnification：×400；Scale bar，200μm；红色箭头所指为焦亡细胞，黑色箭头所指为焦亡小体。
图15、HCT-116和SW480不同病毒处理组的结晶紫染色示意图
图16、Western blot检测oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理HCT-116后PARP、GSDME-FL、GSDME-NT、GzmB、Caspase-8、Cleaved Caspase-8、Caspase-3Cleaved、Caspase-3、IL-1β和GADPH的蛋白表达。
图17、Western blot检测oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理SW480后PARP、GSDME-FL、GSDME-NT、GzmB、Caspase-8、Cleaved Caspase-8、Caspase-3Cleaved、Caspase-3、IL-1β和GADPH的蛋白表达。
图18、RT-qPCR检测oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理HCT-116后GSDME-FL、GzmB、TNF-α、Caspase-3和IL-1β的mRNA相对表达。
图19、RT-qPCR检测oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理SW480后GSDME-FL、GzmB、TNF-a、Caspase-3和IL-1β的mRNA相对表达。
图20、流式细胞术检测oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理组HCT-116的细胞凋亡情况。
图21、检测GSDME在SW480NC和SW480GSDME+中的表达情况；(a)为原始细胞株SW480NC和瞬时转染GSDME的SW480GSDME+中的GSDME-FL和GAPDH蛋白免疫印迹图片；(b)为GSDME-FL蛋白定量分析图；(c)为RT-qPCR检测原始细胞株SW480NC和瞬时转染GSDME的SW480GSDME+中的GSDME的mRNA表达水平示意图。
图22、MTT检测SW480NC和SW480GSDME+在48h和72h的细胞存活率。
图23、DOX处理SW480后48h和72h的工作曲线。
图24、SW480NC组、SW480NC+DOX组、SW480GSDME+组和SW480GSDME++DOX组在48h时的细胞形态图；Original magnification：×200。Scale bar，200μm。红色箭头所指为焦亡细胞。
图25、Western blot检测SW480NC组、SW480NC+DOX组、SW480GSDME+组和SW480GSDME++DOX组中PARP、GSDME-FL、GSDME-NT和GAPDH的蛋白表达水平；(a)为原始细胞株SW480NC、原始细胞株SW480NC+DOX处理组、瞬时转染GSDME的SW480GSDME++DOX处理组和瞬时转染GSDME的SW480GSDME+中的PARP、GSDME-FL、GSDME-NT和GAPDH蛋白免疫印迹图片。(b)为原始细胞株SW480NC、原始细胞株SW480NC+DOX处理组、瞬时转染GSDME的SW480GSDME++DOX处理组和瞬时转染GSDME的SW480GSDME+组PARP、GSDME-FL和GSDME-NT相比于GAPDH的蛋白定量分析图。
图26、RT-qPCR检测SW480NC组、SW480NC+DOX组、SW480GSDME+组和SW480GSDME++DOX组中GSDME、GzmB、IL-1β和TNF-α的mRNA相对表达水平。
图27、2MOI oncoVV-KZ、2MOI oncoVV-GSDME、DOX、DOX+2MOI oncoVV-KZ和DOX+2MOI oncoVV-GSDME处理SW48048h时的细胞形态学示意图；Original magnification：×200。Scale bar，200μm。红色箭头所指为焦亡细胞。
图28、不同病毒处理组或药物处理组的LDH释放量。
图29、Western blot检测SW480的不同病毒处理组或药物处理组GSDME-FL和GSDME-NT蛋白含量变化；(a)为SW480的各个处理组中GSDME-FL、GSDME-NT和GAPDH的蛋白免疫印迹图片。(b)为SW480的各个处理组中的GSDME-FL和GSDME-NT相比于GAPDH的蛋白定量分析图。
图30、PBS组、oncoVV-KZ组和oncoVV-GSDME组小鼠肿瘤体积变化曲线图。
图31、PBS组、oncoVV-KZ组和oncoVV-GSDME组内每只小鼠肿瘤体积变化
具体实施方式
下述实施例中涉及到的材料、方法等详见以下各表。
表1细胞株及其培养条件
细胞株 类型 来源 培养条件
hTERT-HPNE 人胰腺导管细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
PANC-1 人胰腺癌细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
SW1990 人胰腺癌细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
SW480 人结肠癌细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
SW620 人结肠腺细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
HCT-116 人结肠癌细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
HT-29 人结肠癌细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
293A 人胚肾细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
BSC40 非洲绿猴肾细胞株 中国科学院上海细胞所 DMEM+10％FBS
表2实验试剂
Figure BDA0003979312100000041
Figure BDA0003979312100000051
表3试剂配方
Figure BDA0003979312100000052
表4PCR引物序列
Figure BDA0003979312100000053
Figure BDA0003979312100000061
表5实验抗体
抗体名称 产商 货号
IL-1β Santa cruz SC-12742
GAPDH Santa cruz SC-47724
GzmB Santa cruz SC-8022
GSDME Abcam ab230482
GSDME-N Abcam ab215191
Caspase-3 CST 14220S
Caspase-8 CST 9746S
Cleaved caspase-3 CST 9664S
Cleaved caspase-8 CST 9748S
TNF-α CST 3707S
BAX CST 2274S
PARP CST 9542S
兔二抗/鼠二抗HPR 华安生物 HA1009
表6实验药配制
Figure BDA0003979312100000062
表7实验仪器
Figure BDA0003979312100000063
Figure BDA0003979312100000071
下述实施例中涉及到的一些实验操作：
一、细胞培养
细胞复苏：打开细胞超净台紫外灭菌30min，确保复苏细胞时无菌操作。打开37℃恒温水浴锅备用。从液氮罐或-80℃冰箱取出冷冻管，迅速放入37℃水浴锅中，不时地摇晃使其快速融化，融化后快速移出水浴锅，防止细胞死亡增加，于离心机800rpm，离心3min。用酒精棉球擦拭冷冻管外部，在超净台中小心开启瓶盖，弃掉管中的冻存液，加1mL新鲜培养基重悬细胞，然后移入含有4mL新鲜培养基的6cm培养皿中，轻轻的十字晃动培养皿，使细胞均匀分布，于细胞恒温培养箱37℃，5％CO2中培养。细胞培养12h后，待细胞贴壁，更换新鲜培养基，继续培养直至形成单层，即可进行细胞传代。
细胞传代培养：从4℃冰箱拿出PBS、新鲜培养基和0.25％胰酶消化液置于室内预热，超净台灭菌30min用来进行细胞传代操作。每天观察所培养的细胞，待细胞密度达到95％左右，将其进行细胞传代或铺板实验，首先用酒精棉球将超净台台面擦拭干净，再用酒精棉球擦拭培养皿表面后放入超净台。弃去培养皿中的培养基，加入3mL的PBS，上下左右轻柔的洗去细胞表面残留的培养基，此操作重复两次。用枪头将皿中的PBS彻底吸去后，贴着培养皿壁缓慢加入1mL的胰酶消化液，上下左右晃动使胰酶完全覆盖细胞。静置，期间准备干净的5mL离心管，并在管盖上标记所传细胞名称。待细胞被消化至从皿底脱落时，加1mL培养基至培养皿中来终止消化。用枪头将轻轻吹打将细胞完全吹落，收集至准备好的5mL离心管中，800rpm室温离心3min。在超净中，小心弃掉上清，加入1mL新鲜的培养基重悬细胞沉淀，按照细胞的传代规律，按一定比例吸至新的培养皿(已加9mL新鲜培养基)中。十字轻轻的摇晃培养皿使细胞均匀分布，将培养皿放置细胞恒温培养箱37℃，5％CO2中培养。
细胞计数与细胞铺板：使用70％乙醇将细胞计数板和盖玻片清洗、晾干，将盖玻片轻轻覆盖在细胞计数板上。准备一个1.5mL离心管，加入900μL PBS备用。将贴壁生长的细胞从培养皿上消化下来，再对重悬的细胞进行细胞计数操作，吸取100μL的细胞重悬液至900μL PBS中，震荡混匀，吸取10μL细胞重悬液滴加到计数池的边缘，此时液滴将会在虹吸作用下进入盖玻片下方的计数池。将计数板静置片刻使细胞扩散、沉降。在20倍显微镜下，移动计数板将视野分别对准四个大方格，用手动细胞计数器记四个大方格中的细胞总数，计数原则为“数上不数下，数左不数右”。根据计数公式计算每1mL细胞悬液的细胞个数：每毫升样品中的细胞总数＝每个大方格内细胞的平均数×细胞稀释倍数×104。根据所得重悬细胞的浓度，计算铺板所需的细胞悬液的体积。细胞接种量如表8所示。
表8细胞接种量
Figure BDA0003979312100000072
Figure BDA0003979312100000081
细胞冻存：在细胞冻存前一天更换新鲜培养基。将程序降温盒置于室温环境，待其及合金内芯恢复至室温备用。将超净台灭菌30min后，在台内预先配置细胞冻存液(10％FBS的培养基：DMSO＝9：1)，放置4℃冰箱预冷。将贴壁生长的细胞从培养皿上消化下来。离心后的细胞液，小心弃掉上清，加入2mL预冷的细胞冻存液，用枪头重悬细胞后，分装至2个冻存管中。在冻存管上标记细胞名称，冻存时间及操作人。放已降温的程序降温盒内，盖上降温盖，将其放入-80℃冰箱，冷冻12h以上达到冻存效果后，迅速将其中的冻存管移至液氮罐中长期保存。
二、细胞或组织中总RNA的提取
对于细胞总RNA的提取，首先将所需细胞样品用PBS洗两次后，加入适量的RnaEXTM(每1×107个细胞加1mL RnaEXTM)，再用枪头吹打细胞至完全脱落，收集至1.5mL RNasefree离心管中。对于动物组织的RNA提取，首先在液氮中将组织研磨成粉末，收集至1.5mLRNase free离心管中，加入适量的RnaEXTM(每50mg动物组织加1mL RnaEXTM)。在涡旋仪上充分震荡30s，室温静置5min，使样品充分裂解。每管样品按照1mL RnaEXTM加200μL氯仿的比例加入氯仿，在涡旋仪上剧烈震荡60s，室温放置5min。再于离心机12000rpm，4℃离心10min。离心结束后，溶液会呈现三层分层，RNA在最上层水相中，用中枪头小心的将上层水相(约500μL)移至干净无菌的1.5mL RNase free离心管中。再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀。离心管中可能出现絮状沉淀，将离心管中的全部溶液移至GenClean柱(已套收集管)，室温静置3min，于离心机8000rpm，4℃离心1min。弃掉收集管中的废液，再向吸附柱中加600μLbuffer RWA(已含乙醇)，于离心机8000rpm，室温离心1min；步骤5重复一次。弃掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放入，于离心机8000rpm，室温离心2min。打开吸附柱的盖子，室温放置5min以除去残留乙醇，将吸附柱移到干净无菌的1.5mL RNase free离心管中，向吸附柱膜中间加入50μL DEPC-H2O，于65℃金属浴中静置3min。于离心机12000rpm，室温离心1min。离心管中的液体即为RNA溶液。在超微量分光光度计Nano-2000上检测RNA浓度，并记录于管身，-80℃冰箱长期保存。
三、RNA的逆转录
将RNA Template、dNTP Mix、DTT、Primer Mix、5×RT buffer、RNase-Free Water和HiFiScript置于冰上溶解备用。打开金属浴调置70℃备用。参照RNA逆转录试剂盒说明书给的反应体系配置所需体积的反应混合液，体系如下：dNTP Mix 4μL，500μM Each PrimerMix 2μL，RNATemplate 50pg～5μg，RNase-Free Water up to 13μL。配置好所需体积的反应液后，放置70℃金属浴中孵育10min，之后立即置于冰上冰浴2min。瞬时离心，保证管壁上的溶液都收集至管底。继续向上述反应液加入如下试剂：5×RT Buffer 4μL；DTT 2μL，终浓度10mM，HiFiScript 1μL，终浓度50pg～5μg。如果所合成的cDNA用于普通PCR来扩增目的条带，则需将反应液在50℃孵育30～50min，再85℃孵育5min。如果所合成的cDNA用于荧光定量PCR检测，则需将反应液在50℃孵育15min，再85℃孵育5min。反应结束后，瞬时离心，迅速置于冰上冷却，所得的逆转录产物便可用于PCR或qPCR检测，或置于-20℃冰箱保存。
四、荧光定量PCR检测
将cDNA样品、需检测基因的qPCR引物、ddH2O置于冰上融化，准备冰板，qPCR上样96孔板备用。根据SYBRGreen的说明书中的反应体系在冰板上配置上样混合液，cDNA样品应作10倍稀释，反应体系如下：2×SYBR Green Mix 10μL，Forward Primer(10μM)0.4μL，Reverse Primer(10μM)0.4μL，余量为cDNA Template，RNase-Free Water配制体系至20μL。将所有样品混匀加到qPCR上样96孔板，每个处理做3个平行复孔，再覆盖96孔板封板膜，密封后置于多孔板离心机500g离心3min。扩增程序如下：95℃5min；95℃10s，60℃34s，95℃15s，40循环；60℃1min，95℃30s，60℃15s。等待仪器反应结束，保存数据，利用相应的软件进行数据分析。
实施例1RT-qPCR检测GSDME基因在不同细胞中的表达
提取不同的肿瘤细胞和正常细胞的总RNA逆转录为cDNA，通过GAPDH和GSDME的qPCR引物(表4中的SEQ ID No.15和16，7和8)进行RT-qPCR在mRNA水平检测GSDME的相对表达。GSDME通常在正常细胞中高表达，在癌细胞中低表达。结果如图1所示，GSDME在胰腺导管细胞hTERT-HPNE中高表达，在胰腺癌细胞PANC-1、结肠癌细胞SW620和结肠癌细胞HCT-116中低表达，在胰腺癌细胞SW1990、结肠癌细胞SW480和结肠癌细胞HT-29中几乎不表达。
实施例2Western blot检测GSDME基因在不同细胞中的表达水平
提取不同肿瘤细胞和正常细胞的总蛋白进行Western blot，具体操作如下：
1)样品制备：根据实验需要对细胞进行处理，若所需样品为细胞蛋白组分，则用PBS将细胞洗涤两次以除去培养基中血清成分，然后根据细胞量加入适量的1×SDSloading buffer直接裂解细胞，收集至1.5mL离心管中，再置于100℃金属浴煮样10min。若所需样品为细胞释放至培养基中的蛋白成分，则离心去除培养基中残留细胞，再加入相应体积的100％三氯乙酸(终浓度10％)，置于4℃沉淀过夜，离心后用丙酮洗涤沉淀三次后，晾干丙酮，加入适量的1×SDS loading buffer溶解沉淀，收集至1.5mL离心管中，再置于100℃金属浴煮样10min。
2)SDS-PAGE电泳：根据蛋白样品大小来配置所需浓度的分离胶(如图)和5％的浓缩胶。使用1.5mm的玻璃板和对应的梳子。待凝胶彻底凝固后上样。上层胶恒压90V，30min，下层胶恒压120V，55min至溴酚蓝条带接近凝胶低端时停止电泳。
3)转膜：准备合适大小的PVDF膜用无水甲醇活化后，将PVDF膜、滤纸与SDS-PAGE凝胶浸泡于电转缓冲液中。以从阴极到阳极依次为滤纸-蛋白凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序叠放在转膜装置中，确保蛋白凝胶和PVDF膜之间没有气泡。将转膜仪置于充足的冰上，调至恒流400mA，恒压120V，冰浴转膜2h。
4)封闭：电转结束后，将PVDF膜用镊子取出，正面朝上置于预先配置好的5％的脱脂奶粉中，置于缓慢的摇床上室温孵育2h。
5)抗体孵育：封闭完成后，用1×TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min。再根据所需蛋白样品进行剪膜，孵育对应的一抗稀释液，4℃孵育过夜。回收一抗，用1×TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min。再加入对应的二抗，室温孵育2h，回收二抗，用1×TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min。
6)上机显影：取显影液reagent A∶reagent B＝1∶1混匀，滴加至PVDF膜上，避光反应后吸去残留显影液，于暗室中曝光，用超灵敏化学发光仪进行检测记录。曝光时间根据蛋白样品信号强弱进行调整。
结果如图2所示，与RT-qPCR结果一致，GSDME蛋白在hTERT-HPNE中呈现高表达，在PANC-1、SW620和HCT-116中呈现低表达，在SW1990、SW480和HT-29中几乎不表达。综上，结果表明GSDME在结肠癌细胞系的表达整体偏低。
实施例3溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME的构建及鉴定
重组质粒pCB-GSDME的构建：利用GSDME引物(表4中SEQ ID No.1和2)从pCS2-3flag-GSDME(WT)(载体出处为：Nature.Chemotherapy drugs induce pyroptosisthrough caspase-3cleavage of a gasdermin.2017May 1.doi：10.1038/nature22393.)中高保真PCR扩增出目的条带GSDME，GSDME条带大小约1500bp，PCR电泳图如图3所示。泳道2、3、和4在1500bp左右处皆有一条带，对目的条带再进行割胶回收获得目的基因GSDME。利用Bgl II和EcoR I对GSDME和pCB质粒(质粒出处：J Clin LabAnal.Luteolin enhancesthe antitumor efficacy of oncolytic vaccinia virus that harbors IL-24gene inliver cancer cells.2021Mar；35(3)：e23677.doi：10.1002/jcla.23677.)进行双酶切，酶切后进行连接和转化大肠杆菌感受态DH5α(上海生工生物公司)。再对转化产物进行酶切鉴定，电泳如图4，可以明显看出，泳道1、2、3和4在1500bp左右处皆有一条带，与GSDME基因大小相符，在4500bp左右处皆有一条带，与pCB载体大小相符，说明pCB-GSDME重组质粒构建成功。鉴定正确后送去公司进行基因测序分析。取测序分析正确的重组质粒pCB-GSDME对应的保存菌液15μL置于含Amp抗性的LB液体培养基中，摇床37℃，220rpm培养12～16h。之后进行无内毒素质粒DNA小量抽提(QIAGEN无内毒素质粒大提试剂盒)，得到无内毒素重组质粒pCB-GSDME，用于后续的重组痘苗病毒的包装。
SEQ ID No.17GSDME序列：
Figure BDA0003979312100000101
重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME的包装：取野生型痘苗病毒(WR株)10μL，用无血清的DMEM培养基稀释到1mL。取稀释后的野生型痘苗病毒(约300μL)薄层感染在6孔板中培养过夜的293A细胞(密度80％左右)2h后，弃掉病毒液，加1mL新鲜培养基。将重组病毒穿梭质粒pCB-GSDME用脂质体转染试剂盒转染到293A细胞中，转染过程按试剂盒(Effectene，QIAGEN)说明书进行操作，2μg pCB-GSDME加150μL EC buffer，混合8μL Enhancer涡旋1s，室温静置5min。再往mixture中加入25μL 的Effectene transfection reagent，用枪头吹打混匀后，室温静置10min。再补加无血清的DMEM培养基至1mL。再将上述转染混合液加入6孔板中，轻轻摇晃均匀，放37℃，5％CO2培养箱培养。待转染8h后将6孔板中的转染混合液弃去，加入2mL新鲜培养基，放37℃，5％CO2培养箱培养。待细胞完全病变之后(约48h)，将病变细胞全部吹下，收集到无菌的离心管中，于-80℃和37℃反复冻融三次。
重组溶瘤痘苗病毒的药物筛选：由于野生型痘苗病毒不含有筛选标记基因gpt，从而不能在霉酚酸、黄嘌呤、次黄嘌呤存在下正常增殖，而成功同源重组的痘苗病毒含有筛选标记基因gpt，从而可以正常生存，所以将三种药物按照一定比例混匀，连续对包装的病毒进行药物筛选三次。药物配制：用0.1MNaOH配制40×黄嘌呤，670×次黄嘌呤，400×霉酚酸，使其浓度均为10mg/mL，置于37℃水浴锅中溶解后，在超净台中用0.22μm的滤膜过滤除菌，再分装至1.5mL离心管中，封口-20℃避光保存。三种药物40×黄嘌呤，670×次黄嘌呤，400×霉酚酸在使用时应稀释成1×的。把转染后的重组痘苗病毒原液4000rpm，5min离心后，加200μL至6孔板中(培养过夜的293A细胞)，薄层感染2h后，弃掉病毒液，加入含药物的培养液2mL(其中含40×黄嘌呤50μL，670×次黄嘌呤3μL，400×霉酚酸5μL)，放37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞完全病变之后，将病变细胞吹下，连同上清一起收集到无菌的离心管中，于-80℃和37℃反复冻融三次，用于下次薄层感染。药物筛选重复三次，后面两次筛选可以根据前一次细胞病变的情况，增加或减少用于薄层的病毒液。
重组溶瘤痘苗病毒的单克隆筛选：5％低熔点较的配置：称取1g的低熔点琼脂糖凝胶于50mL的离心管中，加入20mL PBS，高压灭菌后置于4℃备用。铺低熔点胶前一天，将状态良好的293A细胞铺6孔板培养皿中，待细胞密度达到80％左右，吸去培养基，将经过三次药物筛选的病毒液用新鲜培养基梯度稀释250倍、500倍、1000倍及5000倍分别接种于六孔板中，每孔加1mL病毒稀释液，于37℃，5％CO2培养箱培养4h。将已灭菌的5％的低熔点胶置于8℃C水浴锅中融化，在超净台中取15mL新鲜培养基于50mL离心管中，再置于42℃水浴锅中预热。在超净台中将病毒感染后的6孔板中的病毒液吸去，迅速将融化的5％低熔点较与预热的培养基按照1∶3的比例配置混匀，每个孔贴壁滴加2mL混合液，在室温下待低熔点胶凝固后，将6孔板放于37℃，5％CO2培养箱培养。每天在显微镜下观察细胞病变情况，并在挑取单克隆病毒的前一天，用293A铺好一个24孔板，每个孔约5×104个细胞。在显微镜下用黑色油性笔标记单个的病变空斑后，在超净台中用小枪头挑取标记的单克隆病毒接种到24孔板中培养，挑取多个单克隆于不同的孔中，待细胞病变后，将细胞吹下，将接种单克隆病毒的病毒液分别收集起来，做好相应的标记，于-80℃和37℃反复冻融三次，用于后续感染细胞或提取病毒基因组。
重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME的鉴定：对痘苗病毒进行鉴定，主要从两个方面鉴定：野毒鉴定和目的基因的鉴定。将野生型痘苗病毒(WR株)和获得的重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME用索莱宝的病毒基因组抽提试剂盒提取病毒DNA。分别以挑空斑后oncoVV-GSDME基因组、野生型痘苗病毒基因组和水为模板进行平行PCR(表4中的SEQ ID No.1和2，3和4)实验。来鉴定oncoVV-GSDME是否被野生型痘苗病毒所污染。再进行目的基因的鉴定，用GSDME基因的上下游引物(表4中的SEQ ID No.1和2)进行PCR，鉴定重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME是否含有目的基因。将鉴定无野毒含目的基因的oncoVV-GSDME继续铺低熔点胶挑选单克隆病毒三次，三次挑选的重组病毒单克隆均鉴定为无野毒污染且含目的基因，即成功包装出重组痘苗病毒oncoVV-GSDME。
结果如图5所示，在泳道3、4和5都有一条和GSDME基因的阳性对照大小相同的条带，约1500kb。如图6所示，在泳道3、4和5都没有野毒条带。证明所包装的重组溶瘤痘苗病毒包含目的基因GSDME，且没有野毒的污染，即成功包装出重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME。
实施例4溶瘤痘苗病毒的大量扩增与纯化
将包装成功的重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME或oncoVV-KZ(空载)，接种到铺有293A细胞的6孔板中(每孔10μL病毒原液)进行小量扩增，待细胞完全病变收集细胞和病毒液，于-80℃和37℃反复冻融三次，并3000rpm，离心5min来去除细胞碎片。选取4盘(10em培养皿)状态良好的293A细胞，待细胞密度为80％左右，将上述小扩病毒液以不同体积加入培养皿中(10μL，20μL，50μL，100μL)，放入病毒恒温培养箱37℃，5％CO2中培养。每天观察每盘细胞的病变情况，确定最终能使一盘细胞病变完全且细胞量最多的病毒体积用作后续病毒大量扩增的接种量。多次大量培养状态良好的293A细胞，每次接种病毒时不宜超过40盘，待细胞密度至80％左右，加20μL小扩病毒液至每一盘细胞中，48h后待细胞完全病变，将细胞全部吹下，连同培养液一起收集到干净无菌的瓶子中。大量扩增并收集约100盘病毒液后进行病毒纯化。
溶瘤痘苗病毒的纯化：提前将50mL离心管高温灭菌烘干备用，用STE溶液配置60％、50％、40％和30％的蔗糖溶液，将天平，若干离心管放入超净台中灭菌2h。将溶瘤痘苗病毒大量扩增的病毒液在-80℃与37℃之间反复冻融3次，置于冰上备用。将冻融3次后的病毒液分装至50mL离心管中，2500rpm，4℃离心30min，以去除细胞碎片。取病毒上清于新的50mL离心管中，于离心机12000rpm，4℃，离心30min，把病毒沉淀下来，再弃上清。用5mLPBS重悬病毒沉淀(所有)，收集至一个离心管中，于离心机12000rpm，4℃，离心30min，弃上清(重复两次)。弃上清后，用4mL 30％的蔗糖溶液将病毒沉淀重悬，蔗糖梯度离心，离心管从下至上分别是60％浓度蔗糖，50％浓度蔗糖，40％浓度蔗糖，30％浓度蔗糖与30％蔗糖溶液与病毒的混合液，于离心机39000g，4℃，离心30min。离心后可观察到三层液体，由上往下数，用移液枪把第二层，第三层的病毒液的主条带小心吸取后，加入两倍体积的STE溶液，于离心机39000g，4℃，离心30min。离心后弃上清，加入等体积的STE溶液重悬沉淀，于离心机39000g，4℃，离心30min。重复洗涤一次。离心后弃去上清，加入一定体积无菌PBS溶液重悬病毒沉淀，于离心机39000g，4℃，离心30min。弃上清用无菌PBS溶液重悬沉淀后分装于干净的离心管中，-80℃保存。
溶瘤痘苗病毒的滴度测定：用293A铺96孔板，每孔约3000个细胞，每孔100μL培养基。每种病毒做两组平行结果，于病毒恒温培养箱37℃，5％CO2中培养12h。在生物安全柜中取重组溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME大扩原液10μL进行梯度稀释。首先用无血清无双抗的DMEM将10μL的病毒原液稀释100倍(即10μL病毒原液+990μL无血清DMEM)，用涡旋仪震荡混匀，再从该梯度稀释液中取100μL加入到另一个1.5mL离心管中，震荡混匀，即为将病毒原液作10-3稀释。以此类推，继续稀释到10-12，每个稀释度做8个平行复孔，每孔加100μL的病毒稀释液。同时设置不加病毒每孔只加100μL无血清无双抗DMEM的对照孔。放入病毒恒温培养箱37℃，5％CO2中培养。每天观察细胞是否出现团缩、裂解、肿大等病毒致病变效应(CPE)。6～8天后统计出现CPE的孔数。按照Karber氏法的计算公式：Lg CCID50＝L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释倍数的对数；d为组距即稀释系数；S为细胞病变孔比值总和。再代入CCID50与PFUs的换算公式：PFUs＝0.69×CCID50。经测定，oncoVV-GSDME大扩后的病毒滴度为9.2×109pfu/mL。
实施例5溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME的体外杀伤效果
MTT法检测细胞存活比率：为了检测oncoVV-GSDME对结肠癌细胞的杀伤效果，取SW620、HT-29、HCT-116和SW480细胞铺96孔板，分别以不同MOI(4MOI、2MOI、1MOI、0.5MOI和0.1MOI)的oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理细胞，并放置于病毒培养箱中培养，分别在24h、48h、72h和96h的时候各取一块96孔板。在每个孔中加20μL 5mg/mL的MTT溶液，继续放病毒培养箱培养4h。弃尽96孔中的溶液，每孔加150μL的DMSO，于700rpm微量振荡器震荡10min。在酶标仪上读板，测490nm和570nm处每孔的吸光值，细胞存活率＝(病毒感染组OD-调零组OD)/(对照组OD-调零组OD)×100％。结果如图7～10所示，用oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME处理结肠癌SW620、HT-29、HCT-116和SW480都会降低细胞存活率，随着时间的增加或者MOI的增加，两种病毒对结肠癌细胞的杀伤都会随之增加，但oncoVV-GSDME对这四种结肠癌的杀伤效果要强于对照病毒oncoVV-KZ；在SW620细胞中，24h时2MOI、1MOI、0.5MOI和0.1MOI病毒浓度的oncoVV-KZ的杀伤比oncoVV-GSDME略高一点，在72h时两个病毒对SW620的杀伤差异性逐渐显著；在HT-29细胞中，oncoVV-GSDME处理组细胞存活率具有时间依赖和浓度梯度依赖，且在96h时，0.1MOI oncoVV-GSDME处理组的细胞存活率远低于50％；在HCT-116和SW480细胞中，oncoVV-GSDME处理组的细胞杀伤总是大于oncoVV-KZ处理组，在96h时，HCT-116的oncoVV-GSDME处理组的细胞存活率低于SW480组的。结果表明oncoVV-GSDME对这四种结肠癌的杀伤效果都很好，再结合Western blot和RT-qPCR检测结果分析，因为oncoVV-GSDME本身携带GSDME，因此选择不表达GSDME的SW480和低表达GSDME的HCT-116进行后续实验。
实施例6LDH释放检测：取状态良好且细胞密度约95％的HCT-116和SW480细胞铺96孔板，每孔3×103个细胞，过12h后，加2MOI的oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME病毒处理，在24h、48h和72h各取一块96孔板，检测LDH的释放量。加不同MOI(2MOI、1MOI、0.5MOI和0.1MOI)的oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME病毒处理，在48h取出96孔板检测LDH的释放量。LDH是检测细胞坏死的指标之一，也是检测细胞焦亡的指标之一。LDH检测工作液根据所需检测的孔数(含对照)，现配现用。例如每孔检测需要20μL乳酸溶液+20μLINT(1×)溶液+20μL酶溶液。每孔加60μLLDH检测工作液，用枪头混匀，用铝箔包裹96孔板置于摇床缓慢摇动，避光孵育30min。在酶标仪上读板，测490nm和630nm处每孔的吸光值。测得的各个孔的吸光值先减去背景空白对照孔a的吸光值。再根据公式计算：LDH释放比率＝(病毒样品处理孔吸光值d-样品对照孔吸光值b)/(细胞最大酶活性孔c-样品对照孔吸光值b)×100％。
结果如图11所示，溶瘤痘苗病毒处理细胞后会检测到LDH的释放，随着MOI浓度梯度的增加，两种病毒处理HCT-116和SW480细胞的LDH释放量也增加，且oncoVV-GSDME处理的LDH释放量相比于oncoVV-KZ组的LDH释放量更多，差异性极为显著，在2MOI oncoVV-GSDME处理时，LDH释放量达到90％以上，这表明LDH的释放量呈病毒剂量依赖性；如图12所示，随着病毒处理时间增加，处理细胞的LDH释放量也随之增加，这表明LDH的释放量呈病毒处理时间依赖性。
实施例7细胞焦亡的形态学观察
取状态良好且细胞密度约95％的HCT-116和SW480细胞铺6孔板，每孔3×105个细胞，待细胞贴壁后，分别加入2MOI的oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME，继续放置于病毒培养箱中培养48h。
在光学显微镜下观察细胞形态，如图13所示，HCT-116和SW480的空白对照组和oncoVV-KZ病毒处理组都没有发现焦亡细胞，在oncoVV-GSDME处理组有明显的细胞膨大，质膜上出现大气泡的焦亡形态，表明oncoVV-GSDME可以诱导HCT-116和SW480结肠癌细胞焦亡。结果如图14所示，40倍物镜下可以清晰看到HCT-116和SW480细胞焦亡后，细胞的焦亡形态，还有焦亡小体产生，细胞内容物释放。
实施例8结晶紫染色观察细胞病变效应
为了直观地对比oncoVV-KZ与oncoVV-GSDME感染后结肠癌细胞的存活，取状态良好且细胞密度约95％的HCT-116和SW480细胞铺24孔板，每孔3×104个细胞，待细胞贴壁后，分别加不同MOI(4MOI、2MOI、1MOI、0.5MOI和0.1MOI)的oncoVV-KZ或oncoVV-GSDME，将孔板放病毒培养箱继续培养。待48h后取出24孔板。结晶紫染色，在20×光学显微镜下观察细胞形态，比如细胞肿大，并且有很多气泡状突出物，即为焦亡的细胞形态特征，观察有没有焦亡小体的出现，并且拍照保存。按照操作步骤进行。结果如图15所示，oncoVV-GSDME对这两种结肠癌细胞的杀伤更为显著。
实施例9Western blot检测相关蛋白含量变化
取状态良好且细胞密度约95％的HCT-116和SW480细胞铺6孔板，每孔3×105个细胞，待细胞贴壁后，分别加入2MOI的oncoVV-KZ或2MOI的oncoVV-GSDME，继续放置于病毒培养箱中培养。48h后各自提取6孔板中的蛋白，并进行Westernblot实验(实验操作如实施例2)。
如图16和17所示，对比oncoVV-KZ处理组，HCT-116和SW480细胞经过oncoVV-GSDME处理后，GSDME、GSDME-NT、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-3、GzmB和IL-1β这些蛋白的含量都明显增加，Caspase-8和Caspase-3的含量减少，PARP含量基本无变化，这说明oncoVV-GSDME病毒处理后，HCT-116和SW480细胞的GSDME蛋白表达增多，病毒刺激可以活化Caspase-8和Caspase-3，活化的Caspase-8也可以激活Caspase-3，使活化的Caspase-3和GzmB对GSDME进行剪切，产生GSDME-NT片段，从而引起焦亡，释放炎性蛋白IL-1β，活化的Caspase-3没有对PARP进行剪切引起细胞凋亡。综上证明oncoVV-GSDME病毒刺激会诱导活化的活化Caspase-3和GzmB的产生，活Caspase-3和GzmB可以诱导高表达GSDME的结肠癌细胞焦亡，而不是凋亡，且细胞焦亡是在细胞凋亡之前发生的；HCT-116和SW480细胞经过oncoVV-KZ处理后，没有Cleaved caspase-3的表达且GzmB表达降低，导致没有GSDME-NT的表达，且IL-1β释放减少。
实施例10RT-qPCR检测焦亡相关基因含量变化
取状态良好且细胞密度约95％的HCT-116和SW480细胞铺6孔板，每孔3×105个细胞，待细胞贴壁后，分别加入2MOI的oncoVV-KZ或2MOI的oncoVV-GSDME，继续放置于病毒培养箱中培养。48h后各自提取6孔板中的RNA，逆转录得到cDNA，通过GSDEM、Caspase-3、GzmB、IL-1β、TNF-α和GAPDH的qPCR引物(表4中SEQ ID No.7和8，9和10，11和12，13和14，15和16)检测其mRNA的相对表达。
结果如图18和19所示，HCT-116或SW480细胞经过oncoVV-GSDME处理后，GSDME、GzmB、IL-1β和TNF-α这些焦亡相关基因的mRNA相对含量显著增加，Caspase-3的mRNA相对含量减少。这表明oncoVV-GSDME处理HCT-116和SW480细胞后，会过表达GSDME，且细胞焦亡后释放的炎症因子IL-1β的表达增加，同时TNF-α的含量也明显增加，TNF-α会激活Caspase-3，激活的Caspase-3会切割GSDME，释放GSDME-NT端，引起癌细胞焦亡，同时GzmB的mRNA的相对表达也明显增加，GzmB会直接切割GSDME，释放GSDME-NT端，引起癌细胞焦亡，从而证明oncoVV-GSDME刺激结肠癌细胞后，会激活Caspase-3/GzmB/GSDME焦亡途径。
实施例11流式细胞术检测细胞凋亡
取状态良好且细胞密度约95％的HCT-116细胞铺6孔板，每孔3×105个细胞，待细胞贴壁后，分别加入2MOI的oncoVV-KZ或2MOI的oncoVV-GSDME，继续放置于病毒培养箱中培养。48h后取出6孔板处理细胞，按照诺维赞凋亡检测试剂盒进行操作。
结果如图20所示，通过Annexin V-FITC和PI两种染料对不同病毒处理组细胞进行染色后流式分析发现，PBS组有36.6％的细胞处在凋亡状态，其中23％的细胞处于早期凋亡，13.6％的细胞处于凋亡晚期；oncoVV-KZ处理组有51.1％的细胞处在凋亡状态，其中早期凋亡状态的细胞占总细胞的32.7％，处于晚期凋亡的细胞占总细胞的18.4％；oncoVV-GSDME处理组有76.6％的细胞处在凋亡状态，是oncoVV-KZ处理组凋亡细胞的1.5倍，其中早期凋亡状态的细胞占总细胞的38.9％，处于晚期凋亡的细胞占总细胞的37.7％，凋亡晚期的细胞比率是是oncoVV-KZ处理组凋亡晚期的2.05倍。综上说明，两种病毒处理组都有诱导HCT-116细胞凋亡的能力，但oncoVV-GSDME的细胞坏死的数量更多。
实施例12GSDME瞬转结肠癌细胞株的构建与鉴定
通过MTT检测结果分析得到重组溶瘤病毒对SW480和HCT-116具有很好的杀伤作用；结合Western blot(实施例2)和RT-qPCR检测结果(实施例1)分析，选取低表达GSDME的HCT-116和几乎不表达GSDME的SW480这两种结肠癌细胞进行后续细胞实验，用以构建过表达GSDME的SW480细胞株。
将pCS2-3flag-GSDME(WT)质粒瞬时转染至SW480中(每孔加PEI 4μg和pCS2-GSDME质粒2μg转染到铺有SW480细胞的6孔板中，48小时后进行后续实验)。提取SW480GSDME+的蛋白和总RNA，进行Western blot和RT-qPCR(表4中SEQ ID No.7和8)检测GSDME的表达水平。结果如图21所示，瞬时转染GSDME的SW480的GSDME的蛋白水平和mRNA水平与原始细胞株SW480NC相比具有显著性差异，故瞬转GSDME到SW480细胞鉴定成功。
实施例13GSDME瞬转结肠癌细胞后抑制癌细胞的生长
为了检测GSDME基因对SW480的影响，取瞬转GSDME的SW480细胞株铺96孔板，在48h和72h检测细胞存活率(检测方法与实施例5同)。结果如图22所示，对比正常未处理的SW480NC，瞬转GSDME的SW480在48h和96h细胞存活率均低于SW480NC，细胞生长有明显的抑制。表明GSDME本身对结肠癌细胞SW480的生长有一定的抑制作用，将GSDME基因导入SW480中，会抑制SW480细胞增殖。
实施例14DOX的安全剂量检测
为了确定合适的DOX使用浓度，取SW480细胞铺96孔板，分别用不同浓度的DOX处理细胞，在培养48h和72h后用MTT法检测细胞存活率，并用GraphPad Prism 9计算SW480的DOXEC50，结果如图24所示，SW480在48h的DOX的EC50为2.697μg/mL，在72h的DOX的EC50为1.179μg/mL。
实施例15DOX诱导GSDME介导的焦亡发生
用DOX对SW480 GSDME+细胞和SW480NC进行治疗，DOX浓度为2.9μg/mL，设置SW480NC组、SW480 GSDME+组、SW480NC+DOX组和SW480 GSDME++DOX组，在培养48h时，在光学显微镜下观察细胞是否有焦亡形态，并提取DOX治疗后的细胞的总蛋白和总RNA，分别进行Western blot和qRT-PCR检测(表4中SEQ ID No.7和8)焦亡基因的表达。如图25所示，可以观察到SW480NC组、SW480GSDME+组和SW480NC+DOX组没有观察到细胞焦亡形态，但SW480GSDME++DOX组可以观察到在质膜上有气泡形成的焦亡特征，说明不表达GSDME的SW480NC在化疗药物DOX处理后细胞不会发生焦亡，瞬时转染GSDME的SW480在没有焦亡刺激因子的影响下也不会发生焦亡，但是瞬时转染GSDME的SW480在化疗药物DOX处理后细胞会发生焦亡，表明GSDME是化疗药物DOX诱发焦亡的关键蛋白。如图26所示，Western blot结果显示，SW480NC组、SW480GSDME+组和SW480NC+DOX组没有GSDME-NT的产生，且SW480NC+DOX组PARP有剪切体，说明在DOX处理后活化的Caspase-3切割凋亡下游蛋白PARP，从而启动细胞凋亡发生。SW480GSDME++DOX组有GSDME-NT产生，且没有PARP剪切体。综上，这表明在不同条件下GSDME介导的细胞焦亡会发生在凋亡之前，并表明GSDME的表达水平的高低会影响细胞程序性死亡模式，在高表达GSDME时会引起焦亡相反在低表达GSDME时会引起凋亡。如图27所示，RT-qPCR结果显示，SW480GSDME+组和SW480GSDME++DOX组在mRNA水平上有GSDME的表达，说明瞬转表达GSDME的SW480细胞株是构建成功的，同时DOX处理SW480GSDME+后GSDME的mRNA相对表达增加，具体机制未知，后续可进一步研究DOX对GSDME表达的影响。SW480NC+DOX组和SW480GSDME++DOX组GzmB、IL-1β和TNF-α的mRNA相对水平表达增加，且SW480GSDME++DOX组增加的更为显著，这表明DOX处理细胞后，GSDME介导的细胞焦亡会增加，同时焦亡释放的炎症因子IL-1β的表达增加，检测到TNF-α的含量也明显增加，TNF-α会激活Caspase-3，表明SW480GSDME++DOX组会激活GSDME介导的焦亡途径。
实施例16溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME联合DOX的体外杀伤效果
细胞焦亡的形态学观察：取对数生长期的SW480细胞铺6孔板，每孔3×105个细胞，待细胞贴壁后，加入病毒和药物DOX(2.9μg/mL)，设置实验孔包含：空白对照组、2MOIoncoVV-KZ组、2MOI oncoVV-GSDME组、DOX组、DOX+2MOI oncoVV-KZ组和DOX+2MOI oncoVV-GSDME组，继续放置于病毒培养箱中培养。48h后在光学显微镜下观察细胞形态，如图3.27所示，空白对照组，oncoVV-KZ组、DOX组没有观察到细胞焦亡形态，在DOX+oncoVV-KZ组、oncoVV-GSDME组和DOX+oncoVV-GSDME组观察到明显的细胞焦亡形态，且病毒联合DOX组的焦亡细胞数量更多。DOX处理SW480 GSDME+后GSDME的mRNA相对表达相比于SW480 GSDME+的GSDME的mRNA的相对表达更多，且本实验中DOX+oncoVV-GSDME组的细胞焦亡数量比oncoVV-GSDME组的更多，说明DOX+oncoVV-GSDME处理后细胞GSDME的含量增加更为显著，所以引发的癌细胞焦亡是增多的，所以DOX在联合溶瘤痘苗病毒后会增加GSDME的表达。
LDH释放检测：取对数生长期的SW480细胞铺96孔板，每孔3×103个细胞，待细胞贴壁后，加入病毒和药物DOX(2.9μg/mL)，设置实验孔包含：空白对照组、最大酶活性组、2MOIoncoVV-KZ组、2MOI oncoVV-GSDME组、DOX、DOX+2MOI oncoVV-KZ组和DOX+2MOI oncoVV-GSDME组，在48h取出96孔板检测LDH的释放量。结果如图28所示，在DOX组DOX+oncoVV-KZ组也有LDH释放，在oncoVV-GSDME组、DOX+oncoVV-KZ组和DOX+oncoVV-GSDME组有更明显的LDH释放，三组的LDH释放量都达到80％以上，但三者之间的差异性不显著，oncoVV-KZ组和oncoVV-GSDME组的LDH释放量差异性显著。综上，加入药物DOX后，细胞坏死明显增加，相比与单病毒oncoVV-KZ组治理组，DOX+oncoVV-KZ组的LDH释放量更大，细胞坏死数量更多，相比与单病毒oncoVV-GSDME治理组，DOX+oncoVV-GSDME组的LDH释放量更大，细胞坏死数量更多。这说明，DOX和溶瘤痘苗病毒在诱导癌细胞焦亡的过程中可能起到协同作用，由于SW480本身不表达GSDME，oncoVV-KZ处理SW480后只能引起细胞凋亡，并且不会有LDH的释放，进一步说明，oncoVV-GSDME可以引起细胞坏死，释放LDH。同时DOX的加入不影响oncoVV-GSDME发挥作用。
Western blot检测相关蛋白含量变化：取对数生长期的SW480细胞铺96孔板，每孔3×103个细胞，待细胞贴壁后，加入病毒和药物DOX(2.9μg/mL)，设置实验孔包含：空白对照组、最大酶活性组、2MOI oncoVV-KZ组、2MOI oncoVV-GSDME组、DOX组和DOX+2MOI oncoVV-GSDME组，在48h后提取各组蛋白，进行Western blot检测。如图29所示，在oncoVV-GSDME组和DOX+oncoVV-GSDME组有GSDME-FL和GSDME-NT的产生。且联合处理组DOX+oncoVV-GSDME组有更多的GSDME-FL和GSDME-NT的表达，说明化疗药物联合oncoVV-GSDME治疗对SW480细胞焦亡的产生有增强作用。
实施例17溶瘤痘苗病毒oncoVV-GSDME体内抑制结肠癌细胞生长
动物模型的建立：取5周龄的雌性裸鼠，每只小鼠皮下注射5×106个HCT-116细胞，建立裸鼠皮下-移植瘤模型。每天观察小鼠成瘤情况，待肿瘤出现后，每天用游标卡尺测量肿瘤大小，根据公式计算肿瘤体积(mm3)＝长×宽×宽/2。
溶瘤痘苗病毒抑制肿瘤生长实验：待肿瘤体积达到80～150mm3时，将小鼠随机分为3组，每组8只，分别瘤内注射50μL PBS、瘤内注射50μL oncoVV-KZ或瘤内注射50μLoncoVV-GSDME。每种病毒每次注射3×107pfu，隔一天注射一次，总共注射2次，一共注射6×107pfu。注射日开始后，每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，并且称量小鼠的重量，记录数据。待PBS组肿瘤体积超过2000mm3时，每组取三只小鼠眼球采血分离血清，再脱颈处死小鼠，解剖小鼠，取脾脏、肝脏、肾脏和肿瘤。肿瘤进行拍摄体积大小图片，脾脏和肿瘤组织取一部分做流式检测，再将脾脏、肝脏、肾脏和肿瘤部分组织切成小块，用4％多聚甲醛固定。
根据接种病毒起每3天测量的肿瘤大小用相应公式计算肿瘤体积，绘制每组小鼠体积变化曲线(如图30所示)和组内每只小鼠的肿瘤体积变化曲线(如图31所示)。从结果可以看出，PBS组小鼠的肿瘤增长趋势很显著，且后期小鼠肿瘤体积达到2000mm3；病毒治疗组在治疗3天后，肿瘤开始缓慢增长；oncoVV-GSDME组在治疗6天后有肿瘤体积明显的下降趋势，此时oncoVV-KZ组肿瘤体积趋势呈缓慢增长；oncoVV-GSDME组在治疗18天时，出现肿瘤完全消退的情况，且18天后陆续有肿瘤消退的小鼠出现。在病毒治疗6天后oncoVV-GSDME组小鼠肿瘤体积始终比oncoVV-KZ组小鼠肿瘤体积低，oncoVV-GSDME组的小鼠在治疗第9天后肿瘤体积都呈下降趋势，oncoVV-GSDME组小鼠肿瘤体积在整个治疗期间都没有超过300mm3。综上说明溶瘤痘苗病毒oncoVV-KZ和oncoVV-GSDME在体内对结肠癌细胞都有显著杀伤，同时oncoVV-GSDME治疗对结肠癌细胞生长有更显著抑制作用，能更有效地抑制肿瘤生长，治疗至肿瘤完全消退。

Claims (8)

1.GSDME基因的编码蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，GSDME基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
3.一种治疗结肠癌的药物，其主要活性成分为GSDME基因的编码蛋白。
4.一种促进结肠癌细胞焦亡的药物，其特征在于，其主要活性成分为GSDME基因的编码蛋白。
5.如权利要求3或4所述药物，其特征在于，所述GSDME基因的编码蛋白来自表达GSDME基因的重组溶瘤痘苗病毒。
6.如权利要求3或4所述药物，其特征在于，所述药物还包括多柔比星。
7.GSDME基因的编码蛋白在激活肺癌细胞Caspase-3、GzmB和/或GSDME途径中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，GSDME基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
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