CN116650650A - 一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的方法，提供了一种用于抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的功能产品，并应用于食管鳞癌治疗，克服现有技术中缺乏针对改善食管鳞癌免疫微环境研究的缺陷。

Description

一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的方法。

背景技术

食管癌是全球癌症发病率排名第七、死亡率排名第六的恶性肿瘤。在我国新发的食管癌病例中，食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占90％以上。近年来，尽管治疗食管癌的手术方法和放化疗方案取得了很大的进步，食管癌患者的预后有所改善，但其总体生存率仍然很差，在非转移情况下，食管癌患者的5年生存率为20％-35％。

巨噬细胞是高度可塑性的细胞，具有多种功能，包括组织发育和体内平衡、清除细胞碎片、消除病原体和调节炎症反应。巨噬细胞激活状态通常被简化为两类：M1经典激活的巨噬细胞和M2替代激活的巨噬细胞。M1巨噬细胞具有抗肿瘤作用，而M2巨噬细胞具有促肿瘤作用。肿瘤将循环单核细胞和组织驻留巨噬细胞募集到肿瘤微环境，并将它们极化为M2巨噬细胞，再通过各种可溶性和机械因素产生肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associatedmacrophages，TAMs)。TAMs通过促进遗传不稳定性、血管生成、纤维化、免疫抑制、淋巴细胞排斥、侵袭和转移来增强肿瘤进展。越来越多的证据表明靶向TAMs可以打破肿瘤免疫治疗耐受和化疗抵抗，而且以TAM为靶点的单一疗法或联合化疗的治疗方法正在临床前和临床中进行试验。因此，发掘调控肿瘤相关巨噬细胞浸润的关键分子对于ESCC的治疗极其重要。

SPP1又称为骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)，分子量约为44kDa。SPP1蛋白在多种组织和体液中表达，其基本生理功能是参与生物矿化，骨重塑和伤口愈合等。以往研究表明SPP1能够促进肿瘤转移，激活细胞增殖途径，维持干细胞样表型，上皮间充质转化以及化疗和放疗的抵抗，而且，SPP1通过调节巨噬细胞中PD-L1的表达来促进肝癌免疫抑制。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抑制SPP1表达的物质的应用。

所述应用包括在制备抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润产品中的应用；在一些实施例中，所述物质为药物。

所述应用包括在制备治疗肿瘤相关巨噬细胞高浸润型肿瘤产品中的应用；在一些实施例中，所述物质为药物。

所述应该包括在制备治疗相关巨噬细胞高浸润型食管鳞癌产品中的应用；在一些实施例中，所述肿瘤相关巨噬细胞高浸润型肿瘤为食管鳞癌；在一些实施例中，所述物质为药物。

所述应用包括抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润。

所述应用包括治疗肿瘤相关巨噬细胞高浸润型肿瘤；在一些实施例中，所述肿瘤相关巨噬细胞高浸润型肿瘤为食管鳞癌。

所述应用包括治疗相关巨噬细胞高浸润型食管鳞癌。

所述应用包括在构建巨噬细胞低浸润型食管鳞癌模型中的应用。

在一些实施例中，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示的shRNA。

在一些实施例中，所述抑制SPP1表达的物质包括含有所述shRNA的重组质粒；所述重组质粒通过将所述shRNA连接到载体上得到。

在一些实施例中，所述抑制SPP1表达的物质包括含有所述shRNA的pLV-shSPP1；所述pLV-shSPP1的制备方法如下；

(1)将所述shRNA合成退火后连接到载体上，得到重组质粒；

(2)将所述重组质粒利用Lentivirus系统进行病毒包装，得到pLV-shSPP1。

第二方面，本发明提供了一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的方法。

在一些实施例中通过抑制SPP1表达的物质来抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润，在一些实施例中通过敲除SPP1来抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润。

第三方面，本发明提供了一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的药物和治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物。

所述抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的药物和治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物均包括有效剂量的抑制SPP1表达的物质。

在一些实施例中，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示的shRNA。

在一些实施例中，所述抑制SPP1表达的物质包括含有所述shRNA的重组质粒；所述重组质粒通过将所述shRNA连接到载体上得到。

在一些实施例中，所述抑制SPP1表达的物质包括含有所述shRNA的pLV-shSPP1；所述pLV-shSPP1的制备方法如下；

(1)将所述shRNA合成退火后连接到载体上，得到重组质粒；

(2)将所述重组质粒利用Lentivirus系统进行病毒包装，得到pLV-shSPP1。

在一些实施例中，所述抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的药物和治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物的剂型包括注射剂。

第四方面，本发明提供了SPP1基因作为靶点在制备抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的药物和治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中的应用。

在一些实施例中，所述药物通过敲除SPP1、和/或敲低SPP1获得。

在一些实施例中，所述药物的剂型包括注射剂。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物。

所述药物组合物包括(i)上述第三方面所述药物，(ii)与所述药物相配伍的其他药物及其药学上可接受的载体和/或辅料。

在一些实施例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明提供一种用于抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的功能产品，并应用于食管鳞癌治疗，克服现有技术中缺乏针对改善食管鳞癌免疫微环境研究的缺陷。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为TCGA数据库中SPP1的表达与食管鳞癌中免疫细胞的浸润的相关性。

图2为SPP1与食管鳞癌中M2型巨噬细胞的相关性。(A)在TCGA数据库食管鳞癌组织中SPP1与CD163和CD206的表达相关性。(B)相同两张食管鳞癌组织芯片中SPP1和CD206免疫组化染色的代表性图片。(C)SPP1和CD206免疫组化染色结果的相关性分析。

图3为敲低SPP1抑制食管鳞癌细胞在小鼠体内的生长。(A)SPP1敲低组和对照组小鼠皮下瘤模型和肿瘤组织；(B)小鼠皮下肿瘤生长曲线；**为P＜0.01。

图4为敲低SPP1抑制小鼠肿瘤组织中M2/M1型巨噬细胞的比例。(A)小鼠肿瘤组织中SPP1和巨噬细胞标志物的免疫组化染色及其评分。(B)实时荧光定量PCR检测小鼠肿瘤组织中M1和M2型巨噬细胞标志物的表达情况。*为P＜0.05，**为P＜0.01，***为P＜0.001。

图5为敲低SPP1抑制巨噬细胞的募集和M2极化。(A)实时荧光定量PCR检测共培养后M1型巨噬细胞标志物及M2型巨噬细胞标志物的表达水平。(B)Transwell实验检测SPP1敲低的ESCC细胞对巨噬细胞的募集情况。*为P＜0.05，**为P＜0.01，***为P＜0.001。

图6为巨噬细胞清除削弱了SPP1敲低对肿瘤生长的抑制作用。(A)shNC+Control组、shSPP1+Control组、shNC+Clodronate组及shSPP1+Clodronate组小鼠肿瘤的图片。(B)小鼠肿瘤的生长曲线。***为P＜0.001。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1生物信息学分析

通过在线网站临床生信之家(https：//www.aclbi.com/static/index.html#/)分析TCGA数据库中SPP1的表达与食管鳞癌中免疫细胞浸润的相关性；利用R语言分析TCGA数据库中SPP1与食管鳞癌中浸润的M2型巨噬细胞标志物CD163和CD206的相关性。

如图1和图2A所示，分析发现SPP1的表达仅与食管鳞癌中巨噬细胞的浸润呈正相关，同时分析SPP1与食管鳞癌中浸润的M2型巨噬细胞的相关性，发现SPP1的表达与M2型巨噬细胞标志物CD163和CD206呈显著正相关关系。

实施例2敲低SPP1的稳定细胞系构建

1.PLV-RNAi重组质粒的构建

(1)shRNA的设计

通过Invitrogen在线设计Human-SPP1 CDS序列的shRNA，如下表所示。

表1.shRNA序列

(2)shRNA的克隆

根据Biosettia公司PLV-RNAi载体的使用说明书，按照以下体系和条件进行单链shRNA的退火。退火后形成互补的shRNA，并带有黏性末端。

表2.shRNA退火反应体系

然后稀释退火产物，稀释500倍，取1μL退火产物到499μLdd H₂O中。随后用4％琼脂糖凝胶对稀释后的退火产物进行鉴定，取20-50μL稀释产物即可。

(3)连接

将退火成功的shRNA产物与pLV-H1-EF1α-puro载体进行连接，按照表3连接体系进行。

表3.shRNA连接反应体系

反应条件：4℃，过夜连接。

(4)PLV-RNAi重组质粒的转化

①取出Trans-T1感受态细胞，冰上解冻10min。

②把连接产物加入50μL感受态细胞中，放冰上半个小时。

③42℃热激30-40s，立即移至冰上放置2min。

④移至超净台中操作，用1mL枪吸取500μL LB。

⑤37℃，200rpm/min，震荡培养1h，拿出存放于4℃的LB板(含100mg/mL的氨苄西林(Ampicillin,Amp)，放置37℃预热。

⑥4,000rpm离心1min，倾倒上清但是不倒完，残留用来重悬细菌，然后滴加在LB板上，加灭菌的珠子将菌液均匀涂布，标记清楚质粒的名字。

⑦过夜倒置在37℃培养箱中培养。

(5)挑取单克隆菌落

①提前把需要使用的工具和液体LB等放于超净台中紫外杀菌。

②准备50mL离心管，在管壁上标记质粒名字，每管加入15mL LB培养基(含千分之一的Amp)，挑取单一克隆菌落，然后在LB中来回吹打几次，枪头直接打入其中。

③使离心管盖处于松弛的状态，倾斜放置于震荡器中，37℃，200rpm震荡培养16-20h。

(6)质粒提取

①柱平衡：向放在收集管中的吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，只弃掉废液。

②将菌液离心，4,000rpm，15min，倒掉上清，尽量倒干。准备2mL管，标记质粒的名字；

③用500μL P1溶解菌液，来回吹打溶解完全后转移至准备好的2mLtube中；

④加入裂解液P2500μL，立即上下翻转8次左右，注意不能太剧烈。

⑤加入700μL中和液P3，温和混匀，然后离心，12,000rpm，10min；

⑥分次将上清转移到过滤柱CS中，最多800μL，12,000rpm离心2min，再将所得液体加入吸附柱CP4中，12,000rpm离心1min，弃掉废液；

⑦加入去蛋白液PD500μL，12,000rpm离心1min，弃掉废液；

⑧加入漂洗液PW600μL，放置2min左右后，12,000rpm离心1min，弃掉废液；

⑨重复上一步骤；

⑩12,000rpm离心2min；

室温晾干乙醇；

准备1.5mL离心管，标记质粒名称，把吸附柱对应放入其中，加入洗脱缓冲液TB100μL，放置2min左右，12,000rpm离心2min，收集质粒溶液，存放于-20℃环境中。

(7)双酶切鉴定

按照表4的酶切鉴定体系对质粒进行鉴定。

表4.shRNA酶切鉴定体系

反应条件：37℃，酶切2h。

2.Lentivims包装

当6孔板中的HEK293T细胞密度约为90％时，进行转染：

(1)首先，根据每孔需要7.5μL Lipo 2000和250μL Opti-MEM的量进行计算后，取至一个离心管中，将它们温和混匀，室温静置5min；

(2)期间，将1.5μg构建的质粒及1.5μg包装质粒(Gag-Pol、Rev、VSV-G各0.5μg)与250μL Opti-MEM在另一个离心管中震荡混匀；

(3)把250μL Lipo 2000混合组分加到质粒组分中，震荡混匀后放置20min；

(4)弃掉HEK293T细胞的旧培养基，每孔加入1mL新鲜培养基；

(5)将500μL的混合物沿孔壁慢慢加入孔内，然后放入37℃孵箱，继续培养。

(6)转染12-16h后，弃掉旧培养基，慢慢加入3mL新鲜培养基，继续培养；

(7)换液24h之后，收取病毒，每管分装1mL，测病毒滴度后，放置-80℃冰箱保存。

3.病毒感染KYSE150细胞

(1)把待感染的细胞接种在六孔板中，密度为1-2×10⁵个细胞/孔，37℃孵箱培养。

(2)将病毒放室温化冻。弃掉细胞的旧培养基，每孔先加入2mL新鲜培养基及3μLpolybrene(8μg/μL)，然后加入病毒1mL。37℃，1600rpm离心1h。

(3)弃掉病毒液，换2mL新鲜培养基，37℃孵箱继续培养。

(4)感染48h后，可以根据抗性进行加药筛选。

实施例3免疫组化染色

1.烤片：提前将两张相同的食管鳞癌病人组织芯片放在65℃烘箱中进行烘烤。在染色之前拿出冷却至室温。

2.脱蜡：根据以下步骤脱蜡

表5.组织脱蜡步骤

用自来水慢慢冲洗2次，5min/次。

3.抗原修复：

将10mM柠檬酸钠缓冲液(PH 6.0)在微波炉中高火加热5min，然后放入片子，解冻20min。然后冷却到室温。

4.去除内源性过氧化物酶

用3％H₂O₂去除内源性过氧化物酶，摇床孵育10min，然后用0.1％PBST洗3次，5min/次。

5.封闭：用含5％山羊血清的PBST封闭，室温1小时。

6.孵育一抗

(1)封闭后，用0.1％PBST洗3次片子，5min/次。

(2)配制一抗，根据所需浓度用封闭液稀释一抗，每张片子用50-200μL一抗稀释液，然后用小纸片覆盖，置于湿盒中，4℃过夜。

7.孵育二抗

(1)0.1％PBST洗3次，每次5min。

(2)用封闭液稀释生物素标记的二抗，并滴加二抗，室温孵育2小时。

8.孵育三抗

(1)用0.1％PBST洗3次，5min/次。

(2)滴加三抗(HRP-生物素偶联)，室温孵育1小时。

9.DAB显色

(1)用0.1％PBST洗片子3次，5min/次。

(2)擦干残留液体，进行DAB显色，显色时间需要摸条件，用自来水终止显色。

10.苏木复染：擦干残留液体，滴加苏木，室温静置1-2min，立即放入自来水中终止染色，显微镜下察看染色情况，可用盐酸酒精分化，使核质更加分明，如果核颜色太深可放入氨水或者自来水进行返蓝。

11.脱水：按照下步骤脱水

表6.组织脱水步骤

12.封片：用中性树胶进行封片，室温晾干。

13.结果分析：采集组织图像，然后根据阳性面积和染色强度得分计算乘积，染色强度分为四级(1-4)，级数对应分数(1-4分)：阴性定义为1级，弱阳性定义为2级，阳性定义为3级，强阳性定义为4级；阳性面积分为四级(1-4)：1-25％为1分，25-50％为2分，50-75％为3分，75-100％为4分，最后统计得分情况并分析统计学意义。

如图2B和图2C所示，在相同的食管鳞癌病人组织芯片中对SPP1和M2型巨噬细胞标志物CD206进行免疫组化染色，统计结果显示二者呈显著正相关。

实施例4实时荧光定量PCR检测巨噬细胞M1和M2标志物

1.总RNA的提取

(1)细胞或组织收集：收集THP1细胞沉淀于1.5mL的EP管，加入1mL Trizol吹打混匀，或者取部分小鼠肿瘤组织于2mL的EP管，加入1mL Trizol和磁珠，在组织破碎仪中进行破碎。此步骤可暂停，将样品存放至-80℃。

(2)提前打开4℃高速低温离心机，温度设置为4℃，转速为12000rpm/min，时间15min。将步骤(1)获得的细胞或组织样品从-80℃冰箱取出后置于冰带上融化，细胞完全融化后加入200μL氯仿，然后上下剧烈振荡30下放在冰带上静置10min。静置完成后，放入4℃离心机离心15min。

(3)离心结束后，细胞裂解为三层，最上层液体含RNA，中层含蛋白，下层为Trizol和氯仿，将最上层含RNA液体吸到新的无酶EP管中。并加入与上清液定量的异丙醇(4℃预冷)约为400μL，上下混匀30下后在在冰袋上静置10min。然后放入4℃离心机中，12000rpm/min，离心10min。

(4)离心结束后，弃去管内上清液，保留底部白色沉淀，加入1mL 75％乙醇，将沉淀轻轻弹到乙醇中清洗。然后于4℃离心机中，7500rpm/min，离心5min。

(5)离心结束后，弃去管内上清液，一定要把上清液吸干净，保留RNA沉淀。

(6)将RNA沉淀溶解于适量的RNase Free water中，并振荡混匀。

2.mRNA反转录为cDNA

(1)使用Nanodrop 2000测定提取的细胞RNA的浓度及纯度，提取的细胞RNA浓度约1000ng/μL。

(2)按照RNA反转录试剂盒NovoScriptPlus All-in-one 2st Strand cDNASynthesis Supermix中说明书操作，步骤一为去基因组DNA反应，配制10μL体系。当RNA定量为1000ng时依据提取的细胞RNA浓度加入所需的RNA模板体积，加入gDNA Purge1μL，用RNase Free water补足体系至10μL。反应条件为42℃，5min。

(3)在步骤一反应混合液中加入10μL2×NovoScript Plus 1st strand cDNASynthesis Supermix将RNA反转为cDNA。反应条件为50℃，15min，75℃，5min终止反应。以上所有加样操作均需在冰上进行。反应产物可直接用于实时荧光定量PCR反应，若不立即使用，-20℃短期保存。长期保存应置于-70℃。

表7.去除基因组DNA反应

表8.逆转录反应

3.引物设计

根据NCBI中GeneBank数据库所提供的基因CDS序列设计并合成实时荧光定量PCR引物，引物序列如下表所示。

表9.实时荧光定量PCR人源基因引物序列

表10.实时荧光定量PCR鼠源基因引物序列

4.实时荧光定量PCR

(1)按照实时荧光定量PCR反应试剂盒说明书配制10μL反应体系，每个目的基因及内参基因均设置三个重复，以GAPDH为内参，操作过程均需在冰上进行，加样完成后在掌上离心机瞬离，此反应体系的配制如下表所示。

表11.实时荧光定量反应体系

(2)使用实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应，根据试剂盒说明以及仪器操作手册，设定qRT-PCR反应程序，反应程序如下表所示。

表12.实时荧光定量反应程序

(3)实验完成后，保存实验数据。通过2^-ΔΔCt方法分析实验数据并进行统计分析。

实施例5裸鼠皮下异种移植瘤模型的构建

1.将4周龄的裸鼠随机分为三组，每组6只，分别皮下注射KYSE150-NC、KYSE150-shSPP1#1、KYSE150-shSPP1#2细胞，每只注射细胞数为5×10⁶，体积100μL。

2.肿瘤生长曲线测定：从第10天开始，每隔2天对小鼠肿瘤进行测量(用电子游标卡尺测量长和宽)并记录数据。最后对数据进行统计分析，并根据公式V＝1/2ab²(其中a为长，b为宽)进行计算，并制作肿瘤生长曲线。

如图3所示，SPP1敲低组的肿瘤组织显著小于对照组。

3.肿瘤分离：24天后，将小鼠处死，分离小鼠肿瘤，其中福尔马林浸泡肿瘤组织用于免疫组化染色，-80℃保存的肿瘤组织用于实时荧光定量PCR检测。

对小鼠肿瘤组织中的M2型巨噬细胞标志物F4/80和CD206进行免疫组化染色，分析SPP1与食管鳞癌组织中浸润的M2型巨噬细胞的相关性，如图4A所示，结果发现SPP1敲低组中M2型巨噬细胞标志物CD206和F4/80的表达显著低于SPP1对照组。

同时，通过qRT-PCR检测小鼠食管鳞癌组织中M1和M2型巨噬细胞标志物的表达情况，如图4B所示，结果显示与对照组相比，SPP1敲低组中小鼠食管鳞癌组织的M2型巨噬细胞标志物的表达降低，M1型巨噬细胞标志物的表达升高。

实施例6

1.共培养实验检测SPP1敲低对巨噬细胞极化的作用

(1)用孔径为0.4μm的六孔板transwell小室建立非接触式共培养系统将食管鳞癌细胞与M0型巨噬细胞进行共培养。

(2)将THP-1细胞铺入6孔板中，1×10⁶个/孔，然后加入100ng/mL的PMA刺激THP-1细胞，在细胞培养箱中培养48小时后取出六孔板放在倒置显微镜下观察，悬浮的THP-1细胞被诱导成贴壁的巨噬细胞，检测巨噬细胞标志物CD68的表达以确定诱导成功。

(3)PMA诱导THP-1细胞的第二天，在六孔板transwell小室中铺入ESCC细胞(此时不应将上室置于下室上方，避免其在未贴壁时共培养)，ESCC细胞与巨噬细胞的比例约为2：1。

(4)待ESCC细胞与巨噬细胞各自贴壁后，将上下两室均换上新鲜培养基，并将上室置于下室上方，共培养48小时。

将THP-1细胞诱导为M0型巨噬细胞，然后与SPP1敲低的KYSE150细胞共培养，通过qRT-PCR检测共培养后M1和M2型巨噬细胞标志物的变化，如图5A所示，发现SPP1敲低抑制M2型巨噬细胞标志物Arginase-1、IL-10和CCL22的表达，促进M1型巨噬细胞标志物iNOS、TNF-α和IL-1β的表达。

2.共培养实验检测SPP1敲低对巨噬细胞迁移的影响

(1)将对照和SPP1敲低的KYSE150细胞接种于24孔板中，1×10⁵/孔。

(2)待KYSE150细胞贴壁后，在孔径为8μm的24孔板transwell小室中铺入M0型巨噬细胞(1×10⁵/孔)，置于培养KYSE150细胞的24孔板中，然后放入培养箱中继续培养48小时。

(3)培养完成后，弃去上室的培养基，在PBS中清洗3次，然后将小室放入0.5％结晶紫染液中固定30分钟。染色完成后，在PBS中清洗3次，每次5分钟。用棉签轻轻擦拭小室内残留的细胞，然后室温晾干。

(4)小室晾干后，在倒置显微镜下随机选取5个视野拍照保存并计数。

如图5B所示，SPP1敲低抑制了巨噬细胞的迁移能力。

以上说明敲低SPP1能够抑制巨噬细胞的募集和M2型极化。

实施例7小鼠巨噬细胞清除及皮下荷瘤模型构建

(1)小鼠皮下荷瘤：将24只4周龄的裸鼠，随机分为四组，每组6只，其中两组皮下注射KYSE150-NC细胞，另外两组皮下注射KYSE150-shSPP1#2细胞，每只注射4×10⁶个细胞，体积100μL。

(2)巨噬细胞清除并测量肿瘤大小：从第5天开始，接种KYSE150-NC/KYSE150-shSPP1#2细胞的两组小鼠分别通过腹腔注射Clodronate或control 1iposomes(LIPOSOMA，CP-005-005)，注射体积为100μL/10g，每隔4天一次，连续4次。同时，每隔2天对小鼠肿瘤进行测量，并制作肿瘤生长曲线。

(3)肿瘤分离：荷瘤25天后，将小鼠处死，分离小鼠肿瘤，其中福尔马林浸泡肿瘤组织用于免疫组化染色，-80℃保存的肿瘤组织用于提取蛋白。

如图6所示，使用巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes将裸鼠体内巨噬细胞清除后，显著削弱了SPP1敲低对肿瘤的抑制作用，说明SPP1通过调控巨噬细胞来促进ESCC的进展，SPP1是靶向巨噬细胞来治疗ESCC的靶点。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抑制SPP1表达的物质在制备抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润产品中的应用，其特征在于，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示的shRNA。

2.一种抑制SPP1表达的物质在制备治疗肿瘤相关巨噬细胞高浸润型肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述肿瘤相关巨噬细胞高浸润型肿瘤为食管鳞癌，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的shRNA。

3.一种抑制SPP1表达的物质在构建巨噬细胞低浸润型食管鳞癌模型中的应用，其特征在于，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的shRNA。

4.一种抑制食管鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的药物，其特征在于，包括有效剂量的抑制SPP1表达的物质，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示的shRNA。

5.一种治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物，其特征在于，包括有效剂量的抑制SPP1表达的物质；所述巨噬细胞高浸润型肿瘤为食管鳞癌，所述抑制SPP1表达的物质包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的shRNA。

6.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述产品包括药物。

7.根据权利要求1-3中任意一项所述应用或权利要求4或5所述药物，其特征在于，所述抑制SPP1表达的物质包括含有所述shRNA的重组质粒；所述重组质粒通过将所述shRNA连接到载体上得到。

8.根据权利要求1-3中任意一项所述应用或权利要求4或5所述药物，其特征在于，所述抑制SPP1表达的物质包括含有所述shRNA的pLV-shSPP1；所述pLV-shSPP1的制备方法如下；

(1)将所述shRNA合成退火后连接到载体上，得到重组质粒；

(2)将所述重组质粒利用Lentivirus系统进行病毒包装，得到pLV-shSPP1。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括(i)权利要求4或5所述药物，(ii)与所述药物相配伍的其他药物及其药学上可接受的载体和/或辅料。

10.根据权利要求4或5所述的药物或权利要求9所述药物组合物，其特征在于，所述药物或所述药物组合物的剂型包括注射剂。