CN116650653A - 下调剂组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法 - Google Patents

下调剂组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及下调剂组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞方法。揭示了一种区别于导入外源下调剂诱导正常分化细胞或异常分化的肿瘤细胞直接重编程的方法；优选地采用导入20‑25碱基对的干扰RNA(如siRNA/shRNA)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性的分化细胞。该下调剂组合物为药物组合物，可添加载体或赋形剂开发为药物或药物前体，以及科研用试剂。

Description

下调剂组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分 化细胞的方法
技术领域
本发明属于分子生物学、干细胞生物学(细胞重编程)、医学、药学交叉领域；更具体地，本发明涉及一种利用下调剂、如干扰RNA(interfering RNA，iRNA)，包括小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)或短发夹RNA(short hairpin RNA，hRNA)组成的组合物，诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法；该下调剂组合物可用于开发制备为抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或用于制备科研用试剂。
背景技术
细胞重编程(Cell reprogramming)是细胞从一种类型向另外一种类型的转化过程。是通过导入外源转录因子(基因)，或化学小分子、生长因子、细胞因子，以及其他诱导因子，靶向诱导调控特定细胞信号通路或表观遗传的改变，使一种细胞转化为另一种细胞的过程。诱导细胞重编程包括：(1)诱导分化的细胞逆转恢复到多能或全能性状态的诱导多潜能干细胞重编程；(2)诱导分化的细胞不经过多潜能干细胞阶段，从一种分化细胞类型直接转化为另一种分化细胞类型的诱导细胞直接重编程(又称：转分化、谱系重编程)。
2006年山中伸弥(Shinya Yamanaka)导入四个外源转录因子(基因)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的诱导组合于分化的体细胞内，通过诱导多潜能干细胞重编程获得诱导多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)。这一惊人发现，为获得患者自身来源的特异性iPSCs提供了技术方法和多能干细胞源，具有巨大的临床意义。但由于导入外源转录因子(基因)，存在破坏细胞原基因序列稳定，可导致突变致癌风险，以及外源转录因子分子较大(上千碱基对及以上)，感染细胞率和细胞转化率极低、稳定性差、操作复杂等缺陷。因此导致采用导入外源转录因子诱导细胞重编程方法，及其转化的诱导多能干细胞或谱系分化细胞，至今难以进入临床实际应用。
目前细胞重编程方法包括“诱导多潜能干细胞重编程”和“细胞直接重编程”，已广泛应用于正常细胞类型的转化。iPSCs重编程和细胞直接重编程已可通过使用转录因子、MicroRNA、或减少转录因子同时添加化学小分子、生长因子、细胞因子辅助等方法获得各种细胞。如已能够将动物或人的来源于不同胚层的分化细胞以及从尿液收集的细胞，诱导多潜能干细胞重编程为iPSCs；已能够将成纤维细胞、肝细胞、黑色素细胞等直接重编程为心肌细胞(induced cardiomyocytes,iCMs)，神经细胞，肝样细胞(induced hepatocyte-likecell,iHep)，血液细胞等。甚至体内原位直接重编程神经胶质细胞为神经元，心脏成纤维细胞转化为心肌细胞，胰岛外分泌细胞转化为β细胞等也已实现。
不仅正常分化细胞可被重编程为另一种正常细胞，肿瘤细胞也可通过导入转录因子或者miRNA被重编程为iPSCs。虽然源自肿瘤细胞的iPSCs大多保留了肿瘤细胞的致瘤性，但其迁移侵袭能力及对药物的敏感性则发生程度不等的改变。也有研究报道，异常分化的粘液瘤细胞通过导入转录因子诱导细胞重编程获得的亚多能干细胞，部分可被终末分化为非致瘤的分化细胞。
因此，细胞重编程有一个重要特点：多种类型分化细胞，甚至包括肿瘤细胞，通过多潜能细胞重编程可转化为同一类型细胞(iPSC)；不同类型分化细胞也可通过细胞直接重编程转化为同一种分化细胞类型(如神经细胞)。甚至多种类型分化细胞可通过同一套转录因子，或诱导因子组合，多能重编程或直接重编程转化为同一种类型细胞。
2015年12月，本发明申请人率先发明了“小分子组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞的方法”(中国专利申请号：201510869117.8；PCT专利申请号：PCT/CN2016/107910)，将仅使用化学小分子诱导细胞直接重编程方法(化学诱导细胞直接重编程)应用于异常分化的肿瘤细胞。通过仅使用化学小分子组合物诱导肿瘤细胞为非致瘤性细胞；其中优选实施例为使用小分子组合物将肝癌细胞直接重编程为非致瘤性的成熟分化肝样细胞。
2018年12月Cheng Z等(Cheng Z et al.Conversion of hepatoma cells tohepatocyte-like cells by defined hepatocyte nuclear factors.Cell Res.2019Feb；29(2):124-135.doi:10.1038/s41422-018-0111-x.)公开发表“通过明确的肝细胞核因子将肝癌细胞转化为肝细胞样细胞”，通过导入外源肝细胞谱系的核转录因子“HNF1A、HNF4A、FOXA3”诱导肝细胞癌细胞直接重编程为肝细胞样细胞。其机理是外源肝细胞核转录因子HNF1A、HNF4A、FOXA3导入肝细胞癌细胞中外源性过表达，启动了肝细胞癌细胞中内源性肝细胞谱系核转录因子的内源性过表达，促进了肝细胞癌细胞向肝细胞样细胞直接重编程转化。但该诱导外源核转录因子方法同样存在前述缺陷(破坏细胞原基因序列稳定，有致突变、致癌风险，且外源转录因子分子较大，感染率和细胞转化率低、稳定性差、操作复杂等缺陷)，难以进入临床实际应用。
发明内容
本发明涉及一种利用下调剂(Downregulator)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法；该下调剂组合物可用于开发制备为通过下调特定靶点来抗肿瘤的药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或用于制备科研用试剂。
在本发明的第一方面，提供一种下调剂组合物，所述下调剂组合物包含以下组分或由以下组分组成：靶向GSK3β的下调剂、靶向ALK5的下调剂和靶向G9a的下调剂；用于：诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；或，制备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的药物组合物/药物/药物前体/药物制剂，或科研试剂。
在一个优选例中，所述下调剂包括选自：干扰或敲除GSK3β、ALK5和G9a的试剂，干扰GSK3β、ALK5和G9a与效应分子的相互作用的试剂，特异性与GSK3β、ALK5和G9a结合的结合分子(如抗体)，或针对GSK3β、ALK5和G9a的化学小分子抑制剂或拮抗剂。
在一个优选例中，所述干扰或敲除GSK3β、ALK5和G9a的试剂包括：特异性干扰GSK3β、ALK5和G9a的编码基因表达的干扰分子，针对GSK3β、ALK5和G9a的CRISPR基因编辑试剂，针对GSK3β、ALK5和G9a的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GSK3β、ALK5和G9a进行功能丧失性突变。
在一个优选例中，所述干扰分子包括(但不限于)：干扰RNA，miRNA，反义核酸；或，能形成所述干扰RNA，miRNA，反义核酸的构建体；较佳地，所述干扰RNA包括：siRNA或shRNA。
在一个优选例中，所述的下调剂组合物包括siGSK3β、siALK5、siG9a或shGSK3β、shALK5、shG9a；或所述的组合物由siGSK3β、siALK5、siG9a或shGSK3β、shALK5、shG9a组成。
在一个优选例中，所述的siGSK3β、siALK5、siG9a或shGSK3β、shALK5、shG9a在组合物中的比例为1～100：1～100：1～100；较佳地1～80：1～80：1～80；较佳地1～60：1～60：1～60；较佳地1～40：1～40：1～40；较佳地1～20：1～20：1～20；较佳地1～10：1～10：1～10；较佳地1～8：1～8：1～8；较佳地1～5：1～5：1～5；例如1～3：1～3：1～3、1～2：1～2：1～2、1：1：1。
在一个优选例中，所述的下调剂组合物中：siGSK3β/shGSK3β是特异的靶向抑制于GSK3β基因的siRNA或shRNA；siALK5/shALK5是特异的靶向抑制于ALK5基因的siRNA或shRNA；siG9a/shG9a是特异的靶向抑制于G9a基因的siRNA或shRNA。
在一个优选例中，所述的下调剂组合物(如siGSK3β、siALK5、siG9a；或shGSK3β、shALK5、shG9a)中任一单独成分都不具备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的重编程功能。
在一个优选例中，所述的下调剂组合物的组分中，由siGSK3β和siALK5或shGSK3β和shALK5组成的组合物；由siGSK3β和siG9a或shGSK3β和shG9a组成的组合物；都具有诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞功能，但其诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能效果低于由siGSK3β、siALK5、siG9a；或shGSK3β、shALK5、shG9a，组成的组合物。
在一个优选例中，所述的下调剂组合物较佳地诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。
在一个优选例中，上述任一所述的组合物中，所述siGSK3β/shGSK3β，siALK5/shALK5，siG9a/shG9a都属于20-25碱基对的干扰RNA(iRNA)，需要载体或载体载送系统才能导入细胞。其载体或载体载送系统包括但不限于：病毒载体载送系统、生化修饰载送系统、显微注射载送系统、非病毒纳米载体载送系统。
在一个优选例中，上述任一所述的组合物是RNA干扰(RNAi)药物组合物，可开发或制备为RNA干扰(RNAi)型抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂。
在一个优选例中，上述任一所述的组合物是RNA干扰(RNAi)药物组合物，还包含药学上可接受的药学载体或赋形剂，其药学载体或赋形剂包括但不限于：病毒载体载送系统、化学修饰载送系统、显微注射载送系统、非病毒纳米载体载送系统。
在一个优选例中，上述任一所述的组合物中，所述siRNA或shRNA为20～25碱基对的干扰RNA(iRNA)；较佳地，所述siRNA或shRNA藉由载体或载体载送系统导入细胞。
在一个优选例中，所述载体或载体载送系统包括但不限于：病毒载体载送系统、非病毒纳米载体载送系统、生化修饰载送系统、显微注射载送系统或入膜引导分子(如穿膜肽)载送系统；更佳地，所述病毒载体包括(但不限于)：腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体；或，所述非病毒纳米载体包括(但不限于)：siRNA-金纳米粒子(siRNA-NPs)给药载体，siRNA-脂质体纳米粒子给药载体，siRNA-聚合物纳米粒子给药载体，siRNA-无机物纳米粒子载体，siRNA-pH敏感纳米粒子载体，siRNA-磁性纳米粒子载体，iRNA-外泌体载体或siRNA-其它纳米粒子载体；或，所述生化修饰载送系统：核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰和核酸修饰；或，所述显微注射载送系统包括(但不限于)：裸siRNA注射系统，脂质体、高分子聚合物或外泌体等载体或载体载送系统，脂质纳米粒(LNP)与稳定核酸脂质复合物(SNALP)递送系统；或，所述膜引导分子载送系统(但不限于)：穿膜肽递送系统。
在一个优选例中，所述下调剂组合物是药物组合物，还包含药学上可接受的药学载体(“药学载体”通常为生理盐水等辅剂，不同于前述的“载体”)或赋形剂。
在一个优选例中，所述的下调剂组合物还具有诱导成纤维细胞直接重编程为肝样细胞的新功能。
在本发明的另一方面，提供一种下调剂组合物的用途，所述下调剂组合物包含以下组分或由以下组分组成：靶向GSK3β的下调剂、靶向ALK5的下调剂和靶向G9a的下调剂。
在一个优选例中，所述组合物包含以下组分或由以下组分组成：siGSK3β、siALK5、siG9a(或：shGSK3β、shALK5、shG9a)；或所述的组合物由siGSK3β、siALK5、siG9a(或：shGSK3β、shALK5、shG9a)组成，用于：诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；或制备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或科研试剂。
在一个优选例中，所述的用途中：siGSK3β/shGSK3β是特异的靶向抑制于GSK3β基因的siRNA或shRNA；siALK5/shALK5是特异的靶向抑制于ALK5基因的siRNA或shRNA；siG9a/shG9a是特异的靶向抑制于G9a基因的siRNA或shRNA。
在一个优选例中，所述的用途中，由siGSK3β和siALK5(或：shGSK3β和shALK5)组成的组合；由siGSK3β和siG9a(或：shGSK3β和shG9a)组成的组合，具有诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能，但其诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能效果低于由siGSK3β、siALK5、siG9a；或：shGSK3β、shALK5、shG9a，组成的组合。
在一个优选例中，所述的用途中，所述组合物较佳地诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。
在一个优选例中，所述的用途中，所述组合物还可用于诱导成纤维细胞直接重编程为肝样细胞的新用途。
在一个优选例中，上述任一所述的用途，所述组合物用于开发或制备RNA干扰(RNAi)型抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或用于制备RNAi科研用试剂。
在一个优选例中，所述的用途，所述组合物(siGSK3β、siALK5、siG9a；或：shGSK3β、shALK5、shG9a)中任一单独成分均不具备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的重编程功能；
在本发明的另一方面，提供一种诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法，所述方法包括：应用前面任一所述的下调剂组合物处理人肿瘤细胞。
在一个优选例中，所述方法包括：(1)a.将设计构建的shGSK3β、shALK5、shG9a质粒，按照1:1:1比例，分别通过慢病毒载体载送入肿瘤细胞；48小时后加入抗生素进行筛选阳性细胞，将未感染细胞清除；b.如果是用siRNA(siGSK3β、siALK5、siG9a)干扰细胞靶基 因，则无需包装病毒，直接将siRNA用非病毒载体载送系统，如：脂质体技术或PEI技术等导入细胞；(2)3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，肿瘤细胞形态特征改变为目标细胞形态特征；较佳地，通过细胞生物学鉴定实验鉴定细胞的改变；更佳地，所述细胞生物学鉴定方法包括(但不限于)：致瘤性消除相关实验和/或非致瘤分化细胞相关实验；
在本发明的另一方面，提供一种干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物用于诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的药盒/试剂盒，所述的药盒/试剂盒中包括：权利要求中任一所述的干扰RNA组合物；或基于该组合物开发制备的RNA干扰(RNAi)抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或RNAi科研用试剂。
如前面任一方面，任一所述的组合物、所述的方法、所述的药盒或试剂盒，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括但不限于：肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤或神经系统肿瘤及其它血液系统肿瘤和实质性肿瘤或其细胞；较佳地为肝癌或肝癌细胞。
在一些实施方式中，本发明所述的方法或用途可以为非治疗性的方法或用途。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，转分化获得细胞失去生长增殖能力，已失去致瘤性。
图2、导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，转分化获得细胞失去克隆形成能力，不再具有致瘤性。
图3、导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，转分化获得细胞失去迁移侵袭能力，已失去致瘤性。
图4、导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌细胞转化为肝样细胞(A)，具有肝细胞的糖原储存和脂肪摄取功能(B)，属于成熟分化肝样细胞。
图5、导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌细胞转化为肝样细胞，表达肝细胞相关基因。
图6、导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，成纤维细胞直接重编程转化为肝样细胞，具肝细胞形态(A)，功能(B)，表达肝细胞相关基因(C)，并下调成纤维细胞基因表达(D)。实验结果表明：导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导成纤维细胞直接重编程转化为成熟分化肝样细胞。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种利用下调剂组合物，例如干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法；该下调剂组合物可用于开发制备为抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或用于制备科研用试剂。
在一些优选方式中，本发明人筛选出干扰RNA组合物：shGSK3β、shALK5、shG9a；或：siGSK3β、siALK5、siG9a；用于诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；较佳地，应用于诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性肝样细胞；经重编程转化获得的肝样细胞不再具有致瘤性，且具有正常成熟分化肝细胞的形态和部分特有功能。
除非另外说明，文中的“/”表示“或”。
如本文所用，所述的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”等，是指具有统计学意义的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。如与对照组相比，显著“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”；更具体例如20％以上、较佳的50％以上、更佳的80％以上的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。
如本文所用，所述的“下调剂”包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。
如本文所用，所述的“下调剂”是指任何可降低靶基因(包括GSK3β、ALK5、G9a)的活性、降低靶蛋白(包括GSK3β、ALK5、G9a所编码的蛋白)或其编码基因的稳定性、下调靶蛋白的表达、减少靶蛋白的有效作用时间、或抑制靶基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调靶基因或靶蛋白有用的物质，从而可用于诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞。例如，所述的下调剂是：特异性干扰靶基因(包括基因转录本)表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；特异性与靶基因编码的蛋白结合的抗体或配体；等等。
基本机理
诱导细胞直接重编程(又称：转分化、谱系重编程)，是通过导入外源转录因子(基因)，或使用化学小分子、生长因子、细胞因子，以及其他诱导因子，部分替代或全部替代转录因子，靶向诱导调控特定细胞信号通路或表观遗传的改变，不经过多潜能干细胞阶段，从一种分化细胞类型直接转化为另一种分化细胞类型的过程。
细胞重编程具有一个重要特点:多种类型分化细胞，甚至包括肿瘤细胞，通过多潜能细胞重编程可转化为同一种类型细胞(iPSCs)；不同类型分化细胞，通过细胞直接重编程转化为同一种类型分化细胞(如神经细胞)。甚至多种类型细胞通过同一套转录因子，或诱导因子组合，可多能重编程或直接重编程转化为同一种细胞类型。该重要特点表明利用重编程方法，不仅有克服肿瘤异质性的潜力，而且可以研发广谱抗肿瘤药物的潜力。
肿瘤细胞通常认为是一种异常分化的细胞。因此，导入外源下调剂组合物、如干扰RNA将其诱导重编程直接转化为非致瘤性的分化细胞，属于诱导细胞直接重编程。
而通过导入外源性下调剂组合物、如干扰RNA(siRNA/shRNA)诱导肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞，则未见任何文献报道。
作为本发明的一种优选方式，采用RNA干扰技术。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，指内源性或外源性siRNA/shRNA介导的细胞内目标基因的mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生抑制效果。干扰RNA包括：小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，都属于20-25碱基对的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)。siRNA和shRNA虽然都属于干扰RNA，但siRNA是单链RNA干扰，不需要整合至基因组，通过结合目标mRNA，诱导mRNA切割，导致mRNA的降解，阻止蛋白的表达，从而沉默或抑制编码该mRNA的目标基因。shRNA却是整合至基因组中进行基因干扰，从而沉默或抑制目标基因。因此siRNA和shRNA的最大区别就在于是否整合进入了基因组中以及感染或RNA干扰有效性的长短。两者在感染效率上现在已经没有多少差别，siRNA或shRNA都可通过沉默机制诱导靶标mRNA的降解，从而沉默或抑制目标基因。其高效抑制标靶基因的特点为：抑制标靶基因特异性；抑制快速性；抑制标靶基因精准性；作用靶标基因位点具选择性；抑制作用稳定性。
RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性。所以是基因功能和基因靶点研究的重要工具。大多数药物属于标靶基因(或疾病基因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，这种RNA干扰抑制使基因沉默而失去细胞特定形态功能的方法，比传统的导入转录因子使基因过表达而获得细胞特定形态功能的方法更具优势。因此，在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA可被进一步开发成为RNAi药物。RNA干扰技术与传统基因治疗相比，具有“高效、特异、毒性小”的优势；与传统药物开发相比，RNAi药物具有易于合成和批量生产，前期投入较少以及开发时间和成本较少的特点。应用前景十分诱人，已成为生物医药研发热点。
在疾病治疗方面，siRNA药物研发截止2019年统计，约30种已进入临床I-III期。研发药物治疗疾病如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等、抗病毒、帕金森病等神经系统疾病。
作为本发明的优选方式，本发明的“一种干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性的分化细胞方法”，其基本机理为：
首先筛选出诱导肿瘤细胞(较佳地，为肝癌细胞)直接重编程为非致瘤性分化细胞的3个关键靶基因(GSK3β基因，ALK5基因，G9a基因)。并分别根据靶基因序列，设计构建了抑制该3个靶基因的外源干扰RNA抑制组合物：siGSK3β、siALK5、siG9a(或：shGSK3β、shALK5、shG9a)；例如，在实施例中本发明人选择使用外源shGSK3β、shALK5、shG9a分别通过慢病毒载体载送入肿瘤细胞(例如肝癌细胞)，进入肿瘤细胞的shGSK3β、shALK5、shG9a，分别整合至基因组中，特异性地对各自的靶基因进行干扰抑制，从而沉默或抑制靶基因。
如果选择使用siGSK3β、siALK5、siG9a，则分别各自通过特异结合目标mRNA，诱导mRNA切割，导致mRNA的降解，阻止蛋白的表达，从而沉默或抑制编码该mRNA的目标基因；siRNA与shRNA靶向抑制靶基因的效果基本相同。最大区别就在于是否整合进入了基因组中以及感染或RNA干扰有效性的长短。
shGSK3β、shALK5、shG9a；或siGSK3β、siALK5、siG9a，协同诱导抑制各自靶基因，从而产生协同效应和干扰RNA组合物的整体功能效应：诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；或诱导人肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。
其它的一些下调剂也是可用的，作为本发明的一种可选方式，采用基因编辑技术，例如以CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除GSK3β、ALK5或G9a。常见的敲除靶基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas mRNA或能形成所述Cas mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas mRNA。
作为本发明的一种可选方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于GSK3β、ALK5或G9a，使之发生表达缺陷或缺失表达。例如，可应用Cre和loxp方法使动物或细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。
作为本发明的一种可选方式，所述的下调剂是针对GSK3β、shALK5或shG9a的小分子化合物。
下调剂组合物及其应用
本发明人经过广泛的研究，率先使用下调剂组合物、如干扰RNA组合物(如shGSK3β、shALK5、shG9a；或：siGSK3β、siALK5、siG9a)诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞。较佳地，诱导人肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。
还发现：本发明的下调剂组合物、如干扰RNA组合物(如siGSK3β、siALK5、siG9a；或：shGSK3β、shALK5、shG9a)中任一单独成分都不具备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性的分化细胞的重编程功能。
本发明人发现，经由RNA干扰技术时优选的，且发现：由siGSK3β和siALK5(或：shGSK3β和shALK5)组成的组合物；由siGSK3β和siG9a(或：shGSK3β和shG9a)组成的组合物；同样可用于诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞，但其诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能效果，低于由siGSK3β、siALK5、siG9a(或：shGSK3β、shALK5、shG9a)组成的干扰RNA组合物。
由于上述干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物需要载体或载体系统载送进入诱导起始细胞内，才能发挥诱导抑制靶基因，继而发挥诱导细胞直接重编程转化功能。所以需要各种载体或载体系统，包括但不限于：病毒载体载送系统、生化修饰载送系统、显微注射载送系统、非病毒纳米载体载送系统。
同样，上述干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物可以开发制备为RNA干扰(RNAi)药物组合物，或RNA干扰(RNAi)抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂，或科研用RNAi药物试剂；所以其还包含药学上可接受的药学载体或赋形剂，其载体或赋形剂包括但不限于：病毒载体载送系统、化学修饰载送系统、显微注射载送系统、非病毒纳米载体载送系统。
较佳地，所述干扰RNA：siRNA或shRNA藉由载体或载体载送系统导入细胞。
较佳地，所述载体或载体载送系统包括但不限于：病毒载体载送系统、非病毒纳米载体载送系统、生化修饰载送系统、显微注射载送系统或入膜引导分子(如穿膜肽)载送系统；更佳地，所述病毒载体包括(但不限于)：腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体；或，所述非病毒纳米载体包括(但不限于)：siRNA-金纳米粒子(siRNA-NPs)给药载体，siRNA-脂质体纳米粒子给药载体，siRNA-聚合物纳米粒子给药载体，siRNA-无机物纳米粒子载体，siRNA-pH敏感纳米粒子载体，siRNA-磁性纳米粒子载体，iRNA-外泌体载体或siRNA-其它纳米粒子载体；或，所述生化修饰载送系统：核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰和核酸修饰；或，所述显微注射载送系统包括(但不限于)：裸siRNA注射系统，脂质体、高分子聚合物或外泌体等载体或载体载送系统，脂质纳米粒(LNP)与稳定核酸脂质复合物(SNALP)递送系统；或，所述膜引导分子载送系统(但不限于)：穿膜肽递送系统；
较佳地，所述干扰RNA组合物是药物组合物，还包含药学上可接受的药学载体(“药学载体”通常为生理盐水等辅剂，不同于前述的“载体”)或赋形剂。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的药物添加剂、载体、赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质；如本领域常用的药物载体或赋形剂。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的药学载体或赋形剂”，其中载体指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系；药物载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于：病毒载体载送系统、生化修饰载送系统、显微注射载送系统、非病毒纳米载体载送系统。
此外，常规药物的其他载体或赋形剂也可能使用，如：水、盐水、磷酸缓冲液以及其它水性溶剂；微球、脂质体、微乳液、高分子表面活性剂；胶体型载药系统、新型高分子载药系统、新型药物载体以及其他药学上的载体；其中赋形剂指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
对赋形剂的一般要求是性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的药学载体或赋形剂的充分讨论。其载体或赋形剂包括但不限于：水、盐水、磷酸缓冲液等水溶液；微球、脂质体、微乳液、高分子表面活性剂；胶体型载药系统、新型高分子载药系统、新型药物载体以及其他药学上的载体；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、pH缓冲物质，片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂以及其它药物赋形剂等。
如本文所用，术语“组合物可制备的药物剂型”中的药物剂型指：为适应治疗或预防的需要而制备的药物应用形式，称为药物剂型；本发明任一组合物可制备的药物剂型包括但不限于：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂及其它固体剂型；注射剂、输液剂、混悬剂及其它液体剂型，以及气体剂型、半固体剂型等其它剂型。
应理解，随着RNA干扰药物及其载体或载体载送系统，或赋型剂的研究发展，该RNA干扰药物使用的载体或载体载送系统，或赋型剂也是可以变换的。
对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于导入或递送到人或哺乳动物细胞，或适用于人或哺乳动物服用的剂型；可制备的剂型包括：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂及其它固体剂型；注射剂、输液剂、混悬剂及其它液体剂型；以及气体剂型、半固体剂型等其它剂型。优选的，所述的剂型可以是但不限于：粉末剂、颗粒剂、胶囊、缓释剂、片剂等固体剂型或注射剂、输液剂、溶液剂、混悬液等液体剂型。
本发明的组合物的制备方法根据所需使用的载体载送系统和制备的剂型以及给药途径来决定，本领域技术人员在参考了本发明所提供的靶基因和干扰RNA组合后，采用RNA干扰药物组合物的制备方法即可制备出本发明的组合物。
应理解，尽管在具体实施方式中，本发明人列举了使用shGSK3β、shALK5、shG9a，诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；但本领域人员也可由此推导使用siGSK3β、siALK5、siG9a组合诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；或诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞，也是同样具有突出效果的。都包含在本发明中。应理解，干扰RNA高效抑制标靶基因的特点具有“作用靶标基因位点具选择性”，因此凡是针对GSK3β靶基因序列、ALK5靶基因序列、G9a靶基因序列，设计构建的siGSK3β、siALK5、siG9a；或：shGSK3β、shALK5、shG9a；都属于本发明的保护范围。
应理解，尽管在具体实施方式中，本发明人列举了使用慢病毒载体包装载送组合物形式，但本领域人员也可由此推导：本发明的其它任何一种载体载送组合形式也是同样具有突出效果的。都属于本发明的保护范围。
本发明人首次证实了本发明的RNA干扰组合物可用于开发制备预防、改善或治疗肿瘤的药物或药物配方。当用于预防、改善或治疗肿瘤时，所用的组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗肿瘤类型以及疾病的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或药剂师可以判断的范围内。
本发明中，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括但不限于：肝癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、食管癌、宫颈癌、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤或神经系统肿瘤，以及其它血液系统肿瘤和实质性肿瘤或其细胞。较佳地为肝细胞癌或肝细胞癌细胞。
此外，在另一个优选例中，上述干扰RNA组合物：shGSK3β、shALK5、shG9a(或：siGSK3β、siALK5、siG9a)，还具有诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞的新功能或新用途。同样属于本发明的保护范围。
下调剂组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞方法
本发明还公开了一种下调剂组合物，如干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞方法。作为一种优选的方案，所述方法包括：(1)a.将设计构建的shGSK3β、shALK5、shG9a质粒，按照1:1:1比例，分别通过慢病毒载体载送入肿瘤细胞；48小时后加入抗生素进行筛选阳性细胞，将未感染细胞清除；b.如果是用siRNA(siGSK3β、siALK5、siG9a)干扰肿瘤细胞靶基因，则无需包装病毒，直接将siRNA用脂质体技术或PEI技术或者其他递送技术等导入细胞；(2)3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，肿瘤细胞形态特征改变为目标细胞形态特征；较佳地，通过细胞生物学鉴定实验鉴定细胞的改变；更佳地，所述细胞生物学鉴定方法包括(但不限于)：致瘤性消除相关实验和/或非致瘤分化细胞相关实验。
本发明的一种干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞方法，可广泛用于防治肿瘤方法及机理研究、临床前期研究、药理及毒理安全性检测；所获得的非致瘤性分化细胞可继续进行功能检测、致瘤性体内外实验、临床前期研究等。该方法为防治肿瘤研究开辟了一个崭新领域，具有广泛的应用前景，具有重大的科学意义和极大的应用价值。
本发明的创新性和优势：
1.率先使用下调剂组合物，优选干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞；较佳地，应用于诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。将病因和发病机理复杂，异质性强的肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化的肝样细胞。转分化获得肝样细胞具有正常人肝细胞特有功能，且不再具致瘤性，为研发干扰RNA诱导转分化抗肿瘤新药开辟新领域。
2.本发明方法优选干扰RNA组合物，所导入的是20-25碱基对的干扰RNA(siRNA/shRNA)，尤其是siRNA并不插入细胞结构基因组内，不改变细胞的基因结构，避免外源基因导入引起新的致癌风险。与导入各种转录因子(基因)诱导细胞重编程方法比较，操作简单，重编程效果更佳，没有致癌风险，更为安全可靠，且易于应用于临床；并且，本发明的实施例中，提供了靶向GSK3β、shALK5或shG9a的优选的靶向区域，其靶向效率高、组合应用效果优异，例如表1中所列举。
3.本发明不是杀死肿瘤细胞，而是将肿瘤细胞转化为无致瘤性分化细胞。因此理论上毒副作用更少，具有治愈或根治肿瘤疾病的潜力。
4.RNA干扰(RNA interference，RNAi)高效抑制标靶基因的特点为：抑制标靶基因特异性；抑制快速性；抑制标靶基因精准性；作用靶标基因位点具选择性；抑制作用稳定性。与化学小分子组合物诱导肿瘤细胞直接重编程(或称转分化)非致瘤性细胞方法相比较，其转分化效果更稳定和精准，效果更佳；优化和合成更简单，研发成本更低；研发时间更短，更易于转化和进入临床。
5.本发明的干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物不仅可诱导肝癌细胞转分化为非致瘤性成熟分化肝样细胞，对其他肿瘤细胞也有类似效果，有研发为广谱抗肿瘤RNA干扰新药的潜力。该发明市场潜力巨大，对于国家防治重大疾病，满足国家人口健康需求，具有十分重要的社会意义。
6.本发明创新使用干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物诱导肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞；拓展和丰富了细胞重编程理论，具有重要的科学意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导肿瘤(肝癌)细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞，使其失去生长增殖能力的实验
1、设计构建质粒
根据GSK3β靶基因序列、ALK5靶基因序列、G9a靶基因序列，分别选择靶基因序列中20-25bp序列，设计构建功能性shGSK3β、shALK5、shG9a质粒。
实施例使用的干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物中，各组成成份分别选择的干扰靶基因目标碱基序列参考表1。
表1
siRNA/shRNA 碱基序列
siG9a/shG9a CCTCTTCGACTTAGACAACAA(SEQ ID NO:1)
siALK5/shALK5 GAAGTTGCTGTTAAGATATTC(SEQ ID NO:2)
siGSK3/shGSK3β CGGAAACAGTATACAGAGTTGC(SEQ ID NO:3)
基于表中的靶基因目标碱基序列，可转化为siRNA；也可基于表中的靶基因目标碱基序列、将之插入慢病毒载体基因组，获得shRNA。后述实施例中应用了shRNA，即shG9a、shALK5、shGSK3β。
2、将功能shGSK3β、shALK5、shG9a质粒，分别包装为慢病毒，然后按照1:1:1比例，将慢病毒分别感染肝癌细胞Hep3B，48小时后加入抗生素进行筛选，将未感染成功细胞清除；通过筛选获得阳性细胞(含干扰RNA组合物的细胞)。
3、3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，肝癌细胞形态转化为肝样细胞，表示直接重编程(转分化)完成，然后检测转分化获得细胞的致瘤性消除情况。
4、用CCK8实验检测细胞增殖能力，确定转分化获得细胞的致瘤性消除：将相同数量的肝癌细胞对照组和转分化获得细胞(1x10^4/孔)接种到96孔板中，分别用CCK8试剂盒检测第0天，1天，3天的细胞数量，通过分析，明确细胞的生长增殖能力。
实验结果表明，导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌细胞转分化获得的细胞已失去生长增殖能力，已失去致瘤性(见图1)。
实施例2：干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导肿瘤(肝癌)细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞，使其失去体外致瘤性实验
1、将功能shGSK3β、shALK5、shG9a质粒分别包装为慢病毒，然后按照1:1:1比例，分别将慢病毒感染肝癌细胞Hep3B，48小时后加入抗生素进行筛选，将未感染细胞清除；通过筛选获得阳性细胞(含干扰RNA组合物的细胞)。
2、3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，肝癌细胞形态转化为肝细胞样细胞，表示转分化完成，检测转分化获得细胞致瘤性消除情况。用单细胞克隆形成实验反映细胞致瘤性。
3、单细胞克隆形成实验：将1x10^3/孔(6孔板)的肝癌细胞对照组和转分化获得细胞分别接种到6孔板中，在10％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2的培养箱中培养10-14天后，待细胞形成克隆后固定细胞，然后用结晶紫染色，取照片，分析结果。通过分析，明确细胞的克隆形成能力。
实验结果表明，导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌转分化获得细胞已失去克隆形成能力，不再具有致瘤性(见图2)。
实施例3：干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导人肝癌细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞，使其失去迁移侵袭能力
1、将功能shGSK3β、shALK5、shG9a质粒分别包装为慢病毒，然后按照1:1:1比例，分别将病毒感染肝癌细胞Hep3B，48小时后加入抗生素进行筛选，将未感染细胞清除；通过筛选获得阳性细胞(含干扰RNA组合物的细胞)。
2、3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，转分化完成，检测转分化获得细胞的迁移侵袭能力消除情况。用细胞跨膜实验反映细胞迁移侵袭能力。
3、细胞跨膜实验：将0.5x10^5的肝癌细胞对照组和转分化获得细胞接种到24孔板的小室中，在小室中用1％FBS的DMEM培养基，在小室外用20％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2的培养箱中培养20-30小时后固定细胞，然后用结晶紫染色，取照片，分析结果，通过分析，明确转分化获得细胞的迁移侵袭能力。
实验结果表明，导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌转分化获得细胞失去迁移侵袭能力，已失去致瘤性(见图3)。
实施例4：干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导人肝癌细胞直接重编程为非致瘤性成熟分化细胞实验
1、将功能shGSK3β、shALK5、shG9a质粒分别包装为慢病毒，然后按照1:1:1比例，分别将病毒感染肝癌细胞Hep3B，48小时后加入抗生素进行筛选，将未感染细胞清除；通过筛选获得阳性细胞(含干扰RNA组合物的细胞)。
2、3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，转分化完成，检测转分化获得细胞的形态、肝细胞相关功能和肝细胞相关基因表达情况，证明其被转化为成熟分化的肝样细胞。
转分化细胞形态和功能相关实验：将0.5x10^6的肝癌细胞对照组和转分化获得细胞接种到6孔板中，用10％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2的培养箱中培养48小时后取照片明确细胞形态改变，随后固定细胞，然后分别进行PAS和Oil-red染色，检测细胞的糖原储存功能和脂肪摄取功能。取照片，分析结果。通过分析，明确肝癌细胞转分化获得的肝细胞样细胞，获得肝细胞相关功能，属于成熟分化肝样细胞。
实验结果表明，导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌细胞转分化为肝细胞样细胞(图4A)，并具有肝细胞的糖原储存和脂肪摄取功能(图4B)，属于成熟分化肝样细胞。
实施例5：干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导人肝癌细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞的肝细胞相关基因表达实验
1、将功能shGSK3β、shALK5、shG9a质粒分别包装为慢病毒，然后按照1:1:1比例，分别将病毒感染肝癌细胞Hep3B，48小时后加入抗生素进行筛选，将未感染细胞清除；通过筛选获得阳性细胞(含干扰RNA组合物的细胞)。
2、3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，转分化完成，检测转分化获得细胞的肝细胞相关基因表达情况，证明其被转化为肝细胞样细胞。
3、检测肝细胞相关基因表达的qRT-PCR实验：将0.5x10^6的肝癌对照组和转分化获得细胞接种到6孔板中，用10％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2的培养箱中培养48小时后提取细胞mRNA并进行qRT-PCR实验，检测肝细胞相关基因表达情况。通过对结果分析，明确肝癌细胞转分化获得的肝细胞样细胞，表达肝细胞相关基因。
实验结果表明，导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物后，肝癌细胞转分化获得细胞，为肝样细胞，表达肝细胞相关基因(见图5)。
实施例6：导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导成纤维细胞直接重编程转化为肝样细胞
1、将功能shGSK3β、shALK5、shG9a质粒分别包装为慢病毒，然后按照1:1:1比例，分别将病毒感染小鼠成纤维细胞，48小时后加入抗生素进行筛选，将未感染细胞清除；通过筛选获得阳性细胞(含干扰RNA组合物的细胞)。
2、3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，转分化完成，成纤维细胞转分化获得细胞具有肝细胞形态(图6A)。将转分化获得细胞固定，然后分别进行PAS和Oil-red染色，检测细胞的糖原储存功能和脂肪摄取功能。结果显示，成纤维细胞转分化获得的肝样细胞具有肝细胞糖原储存和摄取脂肪功能(图6B)。收取转分化获得细胞mRNA并进行qRT-PCR实验，检测肝细胞相关基因和成纤维细胞基因的表达。结果显示，转分化获得细胞表达肝细胞相关基因，同时成纤维细胞相关基因表达被抑制(图6C-D)。
实验结果表明：导入干扰RNA(shGSK3β、shALK5、shG9a)组合物诱导成纤维细胞直接重编程转化为成熟分化肝样细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 海门雨霖细胞科技有限责任公司
<120> 下调剂组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的方法
<130> 220707
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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Claims (18)

1.一种下调剂组合物的用途，其特征在于，所述下调剂组合物包含以下组分或由以下组分组成：靶向GSK3β的下调剂、靶向ALK5的下调剂和靶向G9a的下调剂；用于：
诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞；或
制备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的药物组合物/药物/药物前体/药物制剂，或科研试剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述下调剂包括选自：干扰或敲除GSK3β、ALK5和G9a的试剂，干扰GSK3β、ALK5和G9a与效应分子的相互作用的试剂，特异性与GSK3β、ALK5和G9a结合的结合分子，或针对GSK3β、ALK5和G9a的化学小分子抑制剂或拮抗剂；
较佳地，所述干扰或敲除GSK3β、ALK5和G9a的试剂包括：特异性干扰GSK3β、ALK5和G9a的编码基因表达的干扰分子，针对GSK3β、ALK5和G9a的CRISPR基因编辑试剂，针对GSK3β、ALK5和G9a的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GSK3β、ALK5和G9a进行功能丧失性突变。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述干扰分子包括：干扰RNA，miRNA，反义核酸；或，能形成所述干扰RNA，miRNA，反义核酸的构建体；较佳地，所述干扰RNA包括：siRNA或shRNA。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述干扰RNA包含以下组分或由以下组分组成：siGSK3β、siALK5和siG9a，或shGSK3β、shALK5和shG9a；
较佳地，所述组合物中：siGSK3β/shGSK3β是特异的靶向抑制于GSK3β基因的siRNA或shRNA；siALK5/shALK5是特异的靶向抑制于ALK5基因的siRNA或shRNA；siG9a/shG9a是特异的靶向抑制于G9a基因的siRNA或shRNA。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的组分中，由“siGSK3β和siALK5”或“shGSK3β和shALK5”组成的组合；由“siGSK3β和siG9a”或“shGSK3β和shG9a”组成的组合，具有诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能，但其诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能效果低于由siGSK3β、siALK5和siG9a，或shGSK3β、shALK5和shG9a，组成的组合。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物较佳地诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还用于诱导成纤维细胞直接重编程为肝样细胞的新用途。
8.如权利要求1～7任一所述的用途，其特征在于，所述组合物用于开发或制备RNA干扰抗肿瘤药物组合物/药物/药物前体/药物制剂；或用于制备RNAi科研用试剂。
9.如权利要求1～7所述的用途，其特征在于，所述组合物中任一单独成分均不具备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的重编程功能。
10.一种用于诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的下调剂组合物，其特征在于，所述下调剂组合物包含以下组分或由以下组分组成：靶向GSK3β的下调剂、靶向ALK5的下调剂和靶向G9a的下调剂；
较佳地，干扰或敲除GSK3β、ALK5和G9a的试剂，干扰GSK3β、ALK5和G9a与效应分子的相互作用的试剂，特异性与GSK3β、ALK5和G9a结合的结合分子，或针对GSK3β、ALK5和G9a的化学小分子抑制剂或拮抗剂；
较佳地，所述干扰或敲除GSK3β、ALK5和G9a的试剂包括：特异性干扰GSK3β、ALK5和G9a的编码基因表达的干扰分子，针对GSK3β、ALK5和G9a的CRISPR基因编辑试剂，针对GSK3β、ALK5和G9a的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GSK3β、ALK5和G9a进行功能丧失性突变；
较佳地，所述干扰分子包括：干扰RNA，miRNA，反义核酸；或，能形成所述干扰RNA，miRNA，反义核酸的构建体；更佳地，所述干扰RNA包括：siRNA或shRNA。
11.如权利要求10所述的下调剂组合物，其特征在于，所述下调剂组合物为干扰RNA(siRNA/shRNA)组合物，包含以下组分或由以下组分组成：siGSK3β、siALK5和siG9a或shGSK3β、shALK5和shG9a；
较佳地，所述组合物中：siGSK3β/shGSK3β是特异的靶向抑制于GSK3β基因的siRNA或shRNA；siALK5/shALK5是特异的靶向抑制于ALK5基因的siRNA或shRNA；siG9a/shG9a是特异的靶向抑制于G9a基因的siRNA或shRNA；
较佳地，所述组合物的组分中，由“siGSK3β和siALK5”或“shGSK3β和shALK5”组成的组合；由“siGSK3β和siG9a”或“shGSK3β和shG9a”组成的组合，具有诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能，但其诱导肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的功能效果低于由siGSK3β、siALK5和siG9a，或shGSK3β、shALK5和shG9a，组成的组合。
12.如权利要求10或11所述的下调剂组合物，其特征在于，所述组合物较佳地诱导肝癌细胞直接重编程转化为非致瘤性成熟分化肝样细胞。
13.如权利要求10或11所述的下调剂组合物，其特征在于，所述组合物还具有诱导成纤维细胞直接重编程转化为肝样细胞的新功能。
14.如权利要求10或11所述的下调剂组合物，其特征在于，所述siRNA或shRNA为20～25碱基对的干扰RNA；较佳地，所述siRNA或shRNA藉由载体或载体载送系统导入细胞；
较佳地，所述载体或载体载送系统包括：病毒载体载送系统、非病毒纳米载体载送系统、生化修饰载送系统、显微注射载送系统或入膜引导分子载送系统；更佳地，所述病毒载体包括：腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体；或，所述非病毒纳米载体包括：siRNA-金纳米粒子给药载体，siRNA-脂质体纳米粒子给药载体，siRNA-聚合物纳米粒子给药载体，siRNA-无机物纳米粒子载体，siRNA-pH敏感纳米粒子载体，siRNA-磁性纳米粒子载体，iRNA-外泌体载体或siRNA-其它纳米粒子载体；或，所述生化修饰载送系统：核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰和核酸修饰；或，所述显微注射载送系统包括：裸siRNA注射系统，脂质体、高分子聚合物或外泌体等载体或载体载送系统，脂质纳米粒与稳定核酸脂质复合物递送系统；或，所述膜引导分子载送系统：穿膜肽递送系统；
较佳地，所述干扰RNA组合物是药物组合物，还包含药学上可接受的药学载体或赋形剂。
15.如权利要求10所述的下调剂组合物，其特征在于，所述组合物中任一单独成分均不具备诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的重编程功能。
16.一种诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性分化细胞方法，其特征在于，所述方法包括：应用权利要求10～15任一所述的下调剂组合物处理人肿瘤细胞；
较佳地，所述方法包括：
(1)a.将设计构建的shGSK3β、shALK5、shG9a质粒按照1～100：1～100：1～100比例，分别通过慢病毒载体载送入肿瘤细胞；48小时后加入抗生素进行筛选阳性细胞，将未感染细胞清除；b.如果是用siRNA干扰肿瘤细胞靶基因，则无需包装病毒，直接将siRNA用非病毒载体系统，如脂质体技术或PEI技术或其他递送技术等导入细胞；
(2)3-7天后shRNAs在细胞稳定表达，肿瘤细胞形态特征改变为目标细胞形态特征；较佳地，通过细胞生物学鉴定实验鉴定细胞的改变；更佳地，所述细胞生物学鉴定方法包括：致瘤性消除相关实验和/或非致瘤性分化细胞相关实验。
17.一种用于诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性分化细胞的药盒或试剂盒，其特征在于，所述的药盒或试剂盒中包括：权利要求10～15任一所述的干扰RNA组合物，或基于该组合物开发制备的下调剂药物组合物、药物、药物前体或药物制剂，或RNAi科研用试剂。
18.如权利要求1～9任一所述的用途、权利要求10～15任一所述的下调剂组合物、权利要求16所述的方法、权利要求17所述的药盒或试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括：肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤或神经系统肿瘤及其它血液系统肿瘤和实质性肿瘤或其细胞；较佳地为肝癌或肝癌细胞。
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