CN106310275A - 用于降低细胞衰老水平的组合物及其用途 - Google Patents

用于降低细胞衰老水平的组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

提供用于通过抑制以下一种或多种的活性或表达降低细胞衰老水平的组合物和方法：DCUN1D3蛋白或编码其的基因和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，以及治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法。

Description

用于降低细胞衰老水平的组合物及其用途
相关申请
本申请要求在韩国专利局于2015年7月1日提交的韩国专利中请No.10-2015-0094272和2015年1月25日提交的韩国专利申请No.10-2016-0008900的权益，其完整内容通过提述并入本文。
发明背景
1.领域
本公开涉及用于降低细胞衰老水平的组合物，降低哺乳动物中细胞衰老水平的方法，和治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法。
2.相关领域的描述
衰老可以定义为细胞分裂的永久性停止。观察复制性衰老或细胞衰老作为细胞水平上的老化模型。当持续培养细胞时，使细胞分裂多次，但一旦达到衰老时细胞不再分裂。衰老细胞经常对程序性细胞死亡有抗性，且在一些情况中，衰老细胞保持不分裂状态达几年。
在与血清应答元件(SRE)途径活化有关的新的人基因的高通量筛选的过程期间发现DCUN1D3。DCUN1D3基因在脊椎动物中高度保守。人DCUN1D3互补DNA(cDNA)编码304个氨基酸，具有34kDa的表观分子量。DCUN1D3的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列可以分别是在Genbank登录号NP_775746.1和NM_173475.2中描述的那些。DCUN1D3在几种肿瘤组织和培养细胞系中广泛表达。UV辐射显著增加癌细胞系中的DCUN1D3表达水平。
在此背景下，仍然需要用于降低细胞衰老水平的组合物及其方法。
发明内容
一个方面提供用于降低细胞衰老水平的组合物。
另一个方面提供降低哺乳动物中细胞衰老水平的方法。
再一个方面提供治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法。
附图说明
这些和/或其他方面从连同附图一起采用的例示性实施方案的以下描述将变得明显和更容易领会的。
图1是用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的培养的衰老细胞的显微镜图；
图2A是用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒(小图A)或含混杂shRNA的慢病毒(小图B)转染的衰老细胞的X-gal染色图；
图2B是在图2A的X-gal染色图中染成蓝色的细胞的百分比；
图3显示根据用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞中的荧光强度的脂褐素量；
图4显示用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒或含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的相对细胞大小(对照的％)；
图5显示引入有DCUN1D3 siRNA或对照siRNA的衰老细胞在细胞周期的G0/G1、S或G2/M期的比例；
图6显示用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒转染的培养的衰老细胞的相对数目(A)和DNA含量(B)；
图7显示用含混杂shRNA(A)或SEAT1 shRNA(B)或DCUN1D3 shRNA(C)的慢病毒转染的衰老细胞的X-gal染色图，和染成蓝色的细胞的百分比(％)；
图8显示测量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞中的脂褐素的结果；
图9显示测量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的细胞大小(A)和细胞粒度(B)的结果；
图10显示测量用SEAT1 siRNA或DCUN1D3 siRNA或对照siRNA转染的衰老细胞的细胞周期的结果；
图11显示在引入有siSEAT1的人细胞(A)和小鼠细胞(B)中DCUN1D3基因和SEAT1基因的表达水平；
图12显示SEAT1 shRNA和/或DCUN1D3 shRNA对胞内DNA损伤的影响；
图13显示SEAT1或DCUN1D3基因表达抑制对hIL-6表达的影响；和
图14显示miR-20b对DCUN1D3基因表达的影响。
具体实施方式
本文中提供了用于降低细胞衰老水平的组合物，该组合物包含作为活性成分的抑制以下一种或多种的活性的活性抑制剂：DCUN1D3蛋白(DCN1(cullin类泛素修饰(neddylation)缺陷1)含域3蛋白)和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，或抑制以下一种或多种的表达的表达抑制剂：编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因。
在与血清应答元件(SRE)途径活化有关的新的人基因的高通量筛选的过程期间发现了DCUN1D3。DCUN1D3基因在脊椎动物中高度保守。人DCUN1D3互补DNA(cDNA)编码304个氨基酸，具有34kDa的表观分子量。DCUN1D3的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列可以分别是在Genbank登录号NP_775746.1(SEQ ID NO：3)和NM_173475.2(SEQ ID NO：4)中描述的那些。DCUN1D3在几种肿瘤组织和培养细胞系中广泛表达。UV辐射显著增加癌细胞系中的DCUN1D3表达水平。
抑制DCUN1D3活性的活性抑制剂可以是抑制DCUN1D3的类泛素修饰活性的物质。类泛素修饰可以是泛素样蛋白NEDD8缀合到其靶蛋白的过程。
具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸(下文称为“SEAT1(衰老有关的转录本1)RNA”基因)可以是编码长的非编码核糖核酸(lncRNA)的基因。非编码RNA是一种不翻译成蛋白质的功能性RNA分子。ncRNA可以是小核仁RNA(snoRNA)、microRNA、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、胞外RNA(exRNA)、Piwi相互作用性RNA(piRNA)、或长ncRNA(IncRNA)。IncRNA是不翻译成蛋白质或具有低蛋白编码潜力的转录本，且具有约50个核苷酸或更多、约100个核苷酸或更多、约200个核苷酸或更多、或约500个核苷酸或更多的长度。SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸可以是来自位于人16号染色体的p臂的核酸转录的核酸。SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸可以是来自位于人16号染色体的ERI1外切核糖核酸酶家族成员2(ERI2)基因和DCUN1D3基因(DCN1，cullin类泛素修饰缺陷1)含域3基因)之间的基因组区域的核酸。具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸可以具有GenBank登录号AK027199的序列。
抑制SEAT1 RNA活性的活性抑制剂可以是针对SEAT1 RNA的小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、miRNA、或其组合。siRNA可以是短的双链RNA(dsRNA)，具有磷酸化的5′端和羟基化的3′端，有两个突出的核苷酸。siRNA长度可具有20至24个核苷酸。siRNA可以具有与靶基因的mRNA互补的核苷酸序列。针对SEAT1 RNA的siRNA可以包含SEQID NO：6的多核苷酸和SEQ ID NO：7的多核苷酸(SEAT1 siRNA#1)；SEQ ID NO：8的多核苷酸和SEQ ID NO：9的多核苷酸(SEAT1 siRNA#2)；或SEQ ID NO：10的多核苷酸和SEQ ID NO：11的多核苷酸(SEAT1 siRNA#3)。抑制SEAT1RNA活性的活性抑制剂也可以是抑制DCUN1D3表达的表达抑制剂。
编码SEAT1 RNA的基因可以位于人16号染色体的p臂。该基因可以是AK027199基因，即SEQ ID NO：5的多核苷酸。编码SEAT1 RNA的基因可以位于人16号染色体的ERI2基因和DCUN1D3基因之间。
抑制编码DCUN1D3和SEAT1 RNA的一种或多种的基因的表达的表达抑制剂可以是任何表达抑制剂，只要它降低细胞中编码DCUN1D3和SEAT1RNA的一种或多种的基因的表达。表达抑制剂可以是siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸、或其组合。针对DCUN1D3基因的siRNA可包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的核苷酸序列(DCUN1D3 siRNA#1)。针对SEAT1 RNA的siRNA可以包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和SEQ ID NO：7的核苷酸序列(SEAT1 siRNA#1)；SEQ ID NO：8的核苷酸序列和SEQ ID NO：9的核苷酸序列(SEAT1 siRNA#2)；或SEQ ID NO：10的核苷酸序列和SEQ ID NO：11的核苷酸序列(SEAT1 siRNA#3)。抑制编码SEAT1 RNA的基因表达的表达抑制剂也可以是抑制编码DCUN1D3的基因表达的表达抑制剂。
抑制编码DCUN1D3的基因表达的表达抑制剂可以是任何表达抑制剂，只要它降低细胞中编码DCUN1D3基因的表达。表达抑制剂可以是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、或其组合。所述shRNA可包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ IDNO：2的核苷酸序列。表达抑制剂可以是miR-20b。
在所述组合物中，细胞衰老水平的降低可以指细胞衰老的延迟或预防，或将衰老细胞逆转成更幼嫩的细胞状态(例如非衰老细胞)。
在所述组合物中，细胞衰老水平的降低可包括以下一种或多种：细胞增殖的增加、增加自体吞噬活性、减少脂褐素的积累、降低β-半乳糖苷酶的活性、减少线粒体反应性氧种类(reactive oxygen species)的数目、和增加线粒体膜电位。细胞可以是肌细胞，包括成肌细胞、成纤维细胞、早老细胞(early senescent cell)、或神经细胞。早老细胞可以是源自(获自)患有早衰症(progeria)的患者的细胞。早衰症可以是Hutchinson-Gilford(哈-格二氏)早衰或Werner综合征。
所述组合物可以用于治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状。与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状可包括皮肤皱纹、伤口愈合降低、肌肉衰减症(sarcopenia)、肌营养不良、早衰症状(例如哈-格二氏早老综合征)、或其组合。与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状可以包括与脂褐素积累相关的疾病或疾病症状。与脂褐素积累相关的疾病或疾病症状可以是神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroidlipofuscinoses，NCL)、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结(neurofibrillarytangles)、心脏褐色萎缩(Brown atrophy of the heart)、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis(ALS))、肢端肥大症(acromegaly)、去神经萎缩(denervation atrophy)、脂质肌病(lipid myopathy)或慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)。此外，与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状可以是由线粒体损伤所致的疾病，如线粒体ROS的增加、线粒体膜电位的降低、或其组合。另外，与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状可以是由细胞中增加的β-半乳糖苷酶活性导致的疾病。
抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂可以制备为药学可接受的盐。
细胞可以是哺乳动物(包括人)的细胞。哺乳动物可以患有与增加的细胞衰老水平有关的疾病。细胞可以存在于体外(例如细胞系)或体内。细胞可以是成纤维细胞或神经细胞。
组合物还可以包含药学可接受的载体。在组合物中，“药学可接受的载体”一般指惰性材料，即与活性成分组合使用以协助该活性成分的应用的材料。载体可以包括一般使用的药学可接受的赋形剂、添加剂或稀释剂。例如，载体可以包括选自以下的一种或多种：填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、滑润剂、芳香剂(flavoring agent)、稠化剂、着色剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂和等张剂。
载体可以包含用于将核苷酸投递给受试者(例如哺乳动物)的媒介物。所述媒介物可包括纳米颗粒、编码siRNA序列的DNA模板、阳离子脂质体、胆固醇缀合物、抗体缀合物阳离子脂质(如Lipofectamine)、带正电荷的肽或蛋白质、和/或肽介导的投递系统。可以使用将siRNA投递到特定靶细胞的胞质的许多办法，复杂性范围从简单的裸siRNA到复杂的基于纳米颗粒的投递媒介物。例子包括但不限于，可以将编码siRNA序列的DNA模板投递至可转录以表达siRNA的细胞；使用阳离子脂质体、胆固醇缀合物、抗体缀合物、电穿孔、直接注射、水动力转染(hydrodynamic transfection)、电脉冲或任何其他适用于直接投递的方法；阳离子脂质，如Lipofectamine，作为转染试剂可用于体外投递siRNA；siRNA可以使用胆固醇缀合物、脂质体和基于聚合物的纳米颗粒大小的投递媒介物系统性投递；且siRNA可以经由肽介导的投递系统投递。可以使用用于投递的质粒或病毒载体。
根据一些实施方案，带正电荷的肽或蛋白质可以用于产生蛋白质-siRNA复合物，其可用于投递siRNA。siRNA的磷酸酯骨架带负电荷，且允许与阳离子肽和蛋白质形成复合物，不管其序列如何。在一些实施方案中，蛋白质-siRNA复合物可包含非特异性细胞穿透肽(例如Tat)来将siRNA投递至细胞。在其他实施方案中，蛋白质-siRNA复合物可包含靶向性模块，如受体结合肽或抗体用于特异性投递。所述组合物可以以“治疗有效量”包含抑制以下一种或多种的活性的活性抑制剂：DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，或抑制以下一种或多种的表达的表达抑制剂：编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因，其药学可接受的盐，或溶剂合物。在组合物中，“治疗有效量”指在施用给需要治疗的受试者时足以指示治疗效果的量。术语“治疗”指在受试者(例如哺乳动物，包括人)中治疗疾病或医学症状如与细胞衰老相关的疾病的实践，且治疗的例子如下：(a)预防疾病或医学症状的发生，即对患者的预防性治疗；(b)缓解疾病或医学症状，即涉及患者中的疾病或医学症状的除去或恢复；(c)抑制疾病或医学症状，即涉及延迟或停止受试者中疾病或医学症状；或(d)减轻受试者中的疾病或医学症状。“有效量”可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，“有效量”可以在约0.01mg至约10,000mg、约0.1mg至约1,000mg、约1mg至约100mg、约0.01mg至约1,000mg、约0.01mg至约100mg、约0.01mg至约10mg、或约0.01mg至约1mg每日的范围内。
组合物可以口服施用给受试者，或胃肠外经由静脉内、腹膜内、皮下、直肠和局部施用给受试者。因此，组合物可以配制为多种形式，包括片剂、胶囊剂、水性溶液、或悬浮剂。在用于口服使用的片剂配制剂的情况中，一般可以将赋形剂如乳糖或玉米淀粉和滑润剂如硬脂酸镁添加至组合物。在用于口服使用的胶囊剂配制剂的情况中，乳糖和/或干玉米淀粉可以用作稀释剂。当需要用于口服使用的水性悬浮剂时，活性成分可以与乳化剂和/或悬浮剂联合使用。若必要的话，可添加特定的甜味剂和/或芳香剂。在神经、肌内、腹膜内、皮下和静脉内施用的情况中，一般制备活性成分的无菌溶液，由此适当地调整和缓冲溶液的pH。在静脉内施用的情况中，调整溶质的总浓度以赋予配制剂以等张性。组合物可以制备成含有药学可接受的载体的水性溶液，具有pH 7.4，如同盐水。水性溶液可以经由局部推注注射引入患者的肌肉或神经血液流中。
如本文中使用的，术语“细胞衰老(或细胞的衰老)”指相比于参照细胞，下列一种或多种：细胞增殖的降低、自体吞噬活性的降低、脂褐素的累积、β-半乳糖苷酶活性的增加、线粒体ROS数目的增加、和线粒体膜电位的降低、或指导致上述现象的过程。在本文中，所述参照细胞可以是同一类型的已知的非衰老细胞。术语“幼嫩细胞”指与参照细胞相比时，具有以下一种或多种的细胞：细胞增殖的增加、自体吞噬活性的增加、脂褐素累积的降低、β-半乳糖苷酶活性的降低、线粒体ROS数目的降低、和线粒体膜电位的增加。在本文中，所述参照细胞可以是同一类型的已知的衰老细胞。作为参考细胞的非衰老细胞可以是源自年龄为约18至约25、约18至约23或约18至约20岁的正常且健康的人的细胞，例如成纤维细胞或神经细胞。
所述组合物可以与一种或多种另外的治疗剂组合使用来治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病。或者，除了以下之外，组合物可以没有其他活性成分来治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病：抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂，其药学可接受的盐，或其溶剂合物。
另一个方面提供用于降低细胞中脂褐素累积的组合物，该组合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂作为活性成分。该组合物可以用于治疗与细胞中脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状。与脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状可以是NCL、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结、心脏褐色萎缩、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病、或COPD。除非本文中另外提到，在“用于降低细胞中的脂褐素累积的组合物”中使用的术语与“用于降低细胞衰老水平的组合物’中的那些相同。
再一个方面提供用于增加细胞增殖的组合物，该组合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂作为活性成分。该组合物可以用于治疗与降低的细胞增殖有关的疾病或疾病症状。与降低的细胞增殖有关的疾病或疾病症状可以是皮肤皱纹、伤口愈合降低、肌肉衰减症、肌营养不良、早衰症状(例如哈-格二氏早老综合征)、或其组合。除非本文中另外提到，在“用于增加细胞增殖的组合物“中使用的术语与”用于降低细胞衰老水平的组合物“中的那些相同。
又一个方面提供了降低哺乳动物中细胞衰老水平的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂来降低细胞衰老水平。
关于所述方法使用的“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂”，“降低细胞衰老水平”和“哺乳动物”与上文的描述相同。有效量指在施用给受试者时“足以降低细胞衰老水平的量”。施用指施用上文描述的组合物，包含“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂，其药学可接受的盐或其溶剂合物”。
再一个方面提供了治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法，该方法包括对哺乳动物施用治疗有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂以治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状。
关于所述方法使用的“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种表达的表达抑制剂”，“与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状”和“哺乳动物”与上文的描述相同。有效量指在施用给具有与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的受试者时“足以治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的量”。施用指施用上文描述的组合物，包含“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂，其药学可接受的盐或其溶剂合物”。
关于所述方法，本领域技术人员可以根据患者的状况适宜地选择施用路径。施用可以是口服、胃肠外或局部施用。施用可以是局部应用至组成为(consist of)或包含衰老细胞的组织。施用可以局部施用至皮肤组织、肌肉组织或神经组织。
关于所述方法，“治疗有效量”是在哺乳动物中有效得足以治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的量。如上文描述的，施用量可根据多种因素而变化，诸如患者的状况、施用路径或内科医师的决定。可以通过体外或从动物模型测试获得的剂量-反应曲线来估测有效施用量。本发明的组合物中组分的比率或浓度可以根据化学特性、施用路径或治疗量来确定。当以约约1μg/kg至约1g/kg每天或约0.1mg/kg至约500mg/kg重量每天的范围施用时，施用量在受试者中可以是有效的。施用量可以随受试者的年龄、重量、易感性或症状而变化。
再一个方面提供了降低哺乳动物细胞中脂褐素水平的方法，该方法包括对哺乳动物施用治疗有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂以降低细胞中的脂褐素水平。该方法可以用于治疗与哺乳动物细胞中增加的脂褐素水平有关的疾病或疾病症状。与增加的脂褐素水平有关的疾病或疾病症状可以是NCL、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结、心脏褐色萎缩、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病、或COPD。除非本文中另外提到，在“降低哺乳动物细胞中脂褐素水平的方法”中使用的术语与“治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法”中的那些相同。
仍一个方面提供了增加哺乳动物细胞增殖的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂以增加细胞的增殖。该方法可以用于治疗与哺乳动物细胞的降低的增殖有关的疾病或疾病症状。与细胞的降低增殖有关的疾病或疾病症状可以是皮肤皱纹、伤口愈合降低、肌肉衰减症、肌营养不良、早衰症状(例如哈-格二氏早老综合征)、或其组合。除非本文中另外提到，在“增加哺乳动物细胞增殖的方法”中使用的术语与“治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法”中的那些相同。
根据一个方面的组合物可以用于降低细胞衰老水平，该组合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂，其药学可接受的盐，或其溶剂合物。
根据另一个方面的降低哺乳动物中细胞衰老水平的方法可以用于有效降低哺乳动物中的细胞衰老。
根据又一个方面的治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法可以用于有效治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状。
再一个方面提供降低细胞中细胞衰老水平的方法，该方法包括抑制细胞中DCUN1D3和/或具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的多核苷酸的活性或表达。
用于所述方法的细胞可以源自哺乳动物。哺乳动物可以患有与增加的细胞衰老或脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状。所述疾病或症状可以是皮肤皱纹、伤口愈合降低、肌肉衰减症、肌营养不良、早衰症状(例如哈-格二氏早老综合征)、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结、心脏褐色萎缩、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病或慢性阻塞性肺病(COPD)、或其组合。可以通过对细胞施用小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、反义寡核苷酸、或其组合(其与编码DCUN1D3的核苷酸序列或SEQ ID NO：5杂交)在细胞中抑制DCUN1D3和/或具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的活性或表达。
现将详细参考例示性实施方案，其例子在所附附图中例示，其中类似的参考编号通篇指类似的要素。在此方面，本发明的例示性实施方案可具有不同的形式且不应理解为受到本文中列出的描述的限制。因此，例示性实施方案仅在以下通过参照附图描述来解释各方面。如本文中使用的，术语“和/或”包括一种或多种所列关联项的任意和所有组合。
下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于例示性目的且不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：DCUN1D3 shRNA或siRNA对衰老细胞的影响
(1)诱导衰老细胞的增殖
将DCUN1D3 shRNA转导到衰老细胞中来检查其对衰老细胞增殖的影响。要使用的衰老细胞通过将获自4步龄男孩的人皮肤成纤维细胞(HDF)M4细胞(源自该4步龄供体的包皮，Seoul National University)在DMEM(下文称为‘DMEM”)(HyClone，Logan，UT，USA：货号SH30243)中在37℃和5％CO2的条件下传代培养来制备，所述DMEM含有高浓度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸盐，并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/链霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素)。使用的衰老细胞在第33代且细胞倍增时间为约14天或更长。
将DCUN1D3 shRNA引入慢病毒中来制备含DCUN1D3 shRNA的慢病毒，将其转导到所述衰老细胞中。通过以下来制备含DCUN1D3 shRNA的慢病毒pLKO.1puro载体(OriGene，USA)：分别合成SEQ ID NOS：1和2的核苷酸序列来制备双链shRNA构建体(IDT，Korea)，并将该shRNA构建体连接到用限制酶AgeI和EcoRI消化的pLKO.1puro载体中。使用Lipofectamine 2000连同包装载体VSV-G和PAX2(OriGene，USA)将制备好的含DCUN1D3shRNA的慢病毒转导到293FT人胚胎肾细胞(#R700-07：Invitrogen)。本文中，在转导期间，向肾细胞的生长培养基添加6ug/ml聚凝胺(polybrene)以增加转导效率。在转导后的第2天，收集慢病毒上清并使用Lenti-X(Clontech，货号631231)浓缩。
将如此制备的含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染到衰老细胞中并在DMEM(下文称为“DMEM”)(HyClone，货号SH30243，USA)中在37℃和5％CO2的条件下传代培养4周，所述DMEM含有高浓度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸盐，并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/链霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素)。DCUN1D3 shRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO：1(有义)和SEQ ID NO：2(反义)的核苷酸序列。制造商提供的混杂RNA(Bioneer，Korea)被用作对照组。
SEQ ID NO：1(有义)：GUCACUGCAUCGGGAAAUA(dTdT)
SEQ ID NO：2(反义)：UAUUUCCCGAUGCAGUGAC(dTdT)
图1是用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的培养衰老细胞的显微镜图。在图1中，“对照shRNA”指用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞，而“DCUN1D3 shRNA”指用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞。如图1中显示的，用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞显示与用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞(即阴性对照组)相比，细胞数目的增加和与幼嫩细胞类似的形态学，从而指示DCUN1D3 shRNA在引入衰老细胞后诱导衰老细胞的增殖。
(2)衰老有关的beta-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性的降低
衰老细胞由于增加的SAβ-gal活性而被X-gal染成蓝色。如(1)中解释的，将衰老细胞用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染，并测量培养的衰老细胞中的SAβ-gal活性。没有用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被用作阴性对照组。
详细地，使用细胞衰老测定试剂盒(CeU BIOLABS，INC.)依照制造商说明来染色培养的衰老细胞，并在显微镜下对染成蓝色的细胞数计数。图2A是用含DCUN1D3 shRNA(右)或混杂shRNA(左)的慢病毒转染的衰老细胞的X-gal染色图(A)，且图2B是在图2A的X-gal染色图中染成蓝色的细胞的百分比(B)。
如图2B中显示的，约84％的用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被染色，而约52％的用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被染色。因此，确认了SAβ-gal活性通过用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染衰老细胞而降低，表明细胞衰老水平通过用含DCUN1D3shRNA的慢病毒转染衰老细胞而降低。
(3)自体吞噬活性的降低和脂褐素累积的降低
已知衰老细胞显示自体吞噬活性的降低、脂褐素的累积和线粒体损伤。为了检查这点，如(1)描述的，将衰老细胞用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染，并测量培养的衰老细胞中脂褐素的量。没有用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被用作阴性对照组。此外，测量了细胞的大小。
通过自身荧光测量培养的衰老细胞中脂褐素的量。图3显示用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞中脂褐素的量。
如图3中显示的，与用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的自身荧光水平(作为100％)相比，用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的自身荧光水平为约66％。因此，确认了脂褐素累积通过用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染细胞而在衰老细胞中降低，表明细胞衰老水平通过用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染衰老细胞而降低。
图4显示测量用含DCUN1D3 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的大小的结果。如图4显示的，用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的大小比用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞小。
在图3-4中，通过流式细胞术估测细胞的大小、粒度和自身荧光。详细地，将用胰蛋白酶处理的细胞收集到PBS中，并通过FACS Caliber仪(Becton Dickson，USA)分析。通过之前的前向和侧向散射来评估100,000个细胞的大小和粒度。使用用于激发的488-nm激光和用于检测的530/30带通滤波器来测量自身荧光。在图4的A和B的纵轴中的FSC和SSC分别代表前向散射(细胞大小)和侧向散射(细胞粒度)。
(4)对细胞周期调控的影响
当衰老时，在G0/G1期的细胞的比例增加，而在S期和G2/M期的细胞的比率降低。
为了确认这一点，对衰老细胞引入siRNA和对照siRNA，并检查细胞周期。详细地，如(1)解释的，将siRNA和对照siRNA引入衰老细胞中，通过使用lipofectamine而不是将shRNA或混杂RNA包装在慢病毒中将其导入，培养衰老细胞，然后检查细胞周期。引入DCUN1D3 shRNA，因此允许DCUN1D3 siRNA在细胞内产生。
图5显示测量引入有DCUN1D3 siRNA或对照siRNA的衰老细胞的细胞周期的结果。在图5中，一式三份地进行实验，并实施培养3天。如图5显示的，与引入对照siRNA的衰老细胞相比，引入DCUN1D3 siRNA的衰老细胞显示在G0/G1期的降低的细胞百分比和在S期和G2/M期的增加的细胞百分比。图5纵轴的单位是％，其为当将对照siRNA的结果取作100时的百分比。
[表1]
n＝3，3天培养，HDF(M4，倍增时间＝14天)。
实施例2：DCUN1D3 shRNA或siRNA和/或shSEAT1或siSEAT1对衰老细胞的影响
在本实施例中，检查了DCUN1D3和SEAT1的胞内水平的相关性，并检查了其对衰老细胞的影响。
(1)诱导衰老细胞的增殖
将DCUN1D3 shRNA或SEAT1(衰老相关的转录本1)shRNA转导到衰老细胞中来检查其对衰老细胞增殖的影响。要使用的衰老细胞通过将获自4岁龄男孩的人皮肤成纤维细胞(HDF)M4细胞(源自该4岁龄供体的包皮，Seoul National University)在DMEM(下文称为“DMEM”)(HyClone，Logan，UT，USA：货号SH30243)中在37℃和5％CO2的条件下传代培养来制备，所述DMEM含有高浓度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸盐，并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/链霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素)。使用的衰老细胞在传代第33代且细胞倍增时间为约14天或更长。
将DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA引入慢病毒中来制备含DCUN1D3shRNA或SEAT1shRNA的慢病毒，将其转导到所述衰老细胞中。通过以下来制备含DCUN1D3 shRNA或SEAT1shRNA的慢病毒pLKO.1puro载体(OriGene，USA)：分别合成SEQ ID NOS：1和2，和SEQ IDNOS：6-11的核苷酸序列来制备双链shRNA构建体(IDT，Korea)，并将该shRNA构建体连接到用限制酶AgeI和EcoRI消化的pLKO.1puro载体中。使用Lipofectamine 2000连同包装载体VSV-G和PAX2(OriGene，USA)将制备好的含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒转导到293FTA胚胎肾细胞(#R700-07：Invitrogen)。本文中，在转导期间，向肾细胞的生长培养基添加6ug/ml聚凝胺以增加转导效率。在转导后的第2天，收集慢病毒上清并使用Lenti-X(Clontech，货号631231)浓缩。
将如此制备的含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒转染到衰老细胞中并在DMEM(下文称为“DMEM”)(HyClone，货号SH30243，USA)中在37℃和5％CO2的条件下传代培养4周，所述DMEM含有高浓度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸盐，并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/链霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素)。使用的DCUN1D3 shRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO：1(有义)和SEQ ID NO：2(反义)的核苷酸序列。使用的SEAT1 shRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO：6的核苷酸序列和SEQ ID NO：7的多核苷酸(SEAT1 siRNA#1)；SEQ ID NO：8的核苷酸序列和SEQ ID NO：9的多核苷酸(SEAT1 siRNA#2)；或SEQ ID NO：10的核苷酸序列和SEQ ID NO：11的多核苷酸(SEAT1 siRNA#3)。制造商提供了用作对照组的混杂RNA(Bioneer，Korea)。
DCUN1D3 shRNA：
SEQ ID NO：1(有义)：GUCACUGCAUCGGGAAAUA(dTdT)
SEQ ID NO：2(反义)：UAUUUCCCGAUGCAGUGAC(dTdT)
SEAT1 shRNA：
SEAT1 siRNA#1；SEQ ID NO：6(有义)和SEQ ID NO：7(反义)的多核苷酸
SEAT1 siRNA#2；SEQ ID NO：8(有义)和SEQ ID NO：9(反义)的多核苷酸
SEAT1 siRNA#3；SEQ ID NO：10(有义)和SEQ ID NO：11(反义)的多核苷酸
图6显示用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒转染的培养的衰老细胞的相对数目(A)和DNA含量(B)。在图6中，“对照shRNA”表示用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞，而“DCUN1D3shRNA”和“SEAT1shRNA”分别表示用含DCUN1D3 shRNA(SEQ ID NOs：1和2)或SEAT1shRNA(SEQ ID NOs：6和7)的慢病毒转染的衰老细胞。如图6中显示的，用含DCUN1D3shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞显示与用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞(即阴性对照组)相比，细胞数目和DNA含量的增加。此外，其细胞形态与幼嫩细胞的细胞形态相同。因此，可以看出将DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA引入衰老细胞中诱导衰老细胞的增殖。在图6中，如下测量DNA含量。将细胞以20,000个细胞/孔的密度接种到平底6孔微板中。通过测量在预定的时间在fluorstar微板读数器(BMG Labtec，Cary，NC，USA)中的SYBR Gold(Invitrogen)荧光强度来测定细胞数。
(2)衰老有关的beta-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性的降低
衰老细胞由于增加的SAβ-gal活性被X-gal染成蓝色。如(1)中解释的，将衰老细胞用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染，并测量培养的衰老细胞中的SAβ-gal活性。没有用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被用作阴性对照组。
详细地，使用细胞衰老测定试剂盒(Cell BIOLABS，INC.)依照制造商说明来染色培养的衰老细胞，并在显微镜下对染成蓝色的细胞数计数。图7显示用含混杂shRNA(A)或SEAT1 shRNA(B)或DCUN1D3 shRNA(C)的慢病毒转染的衰老细胞的X-gal染色图，和染成蓝色的细胞的百分比(％)。
如图7中显示的，约85.5％的用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被染色，而分别为约52％和约12.6％的用含DCUN1D3 shRNA和SEAT1 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被染色。因此，确认了SAβ-gal活性通过用含DCUN1D3 shRNA和/或SEAT1 shRNA的慢病毒转染衰老细胞而降低，表明细胞衰老水平通过用含DCUN1D3 shRNA和/或SEAT1 shRNA的慢病毒转染衰老细胞而降低。
(3)自体吞噬活性的降低和脂褐素累积的降低
已知衰老细胞显示自体吞噬活性的降低、脂褐素的累积和线粒体损伤。为了检查这点，如(1)描述的，将衰老细胞用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染，并测量培养的衰老细胞中脂褐素的量。没有用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞被用作阴性对照组。此外，测量了细胞的大小。
通过自身荧光测量培养的衰老细胞中脂褐素的量。图8显示测量用含DCUN1D3shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞中脂褐素的量的结果。
如图8中显示的，与用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的自身荧光水平(作为100％)相比，用含SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的自身荧光水平分别为约10％和约66％。因此，确认了脂褐素累积通过用含SEAT1 shRNA或DCUN1D3shRNA的慢病毒转染细胞而在衰老细胞中降低，表明细胞衰老水平通过用含SEAT1 shRNA或DCUN1D3shRNA的慢病毒转染而降低。
图9显示测量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的细胞大小(A)和细胞粒度(B)的结果。如图9显示的，用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的尺寸比用含混杂shRNA的慢病毒转染的衰老细胞的尺寸小。
在图8和9中，通过流式细胞术估测细胞的大小、粒度和自身荧光。详细地，将用胰蛋白酶处理的细胞收集到PBS中，并通过FACS Caliber仪(Becton Dickson，USA)分析。通过之前的前向和侧向散射来评估100,000个细胞的大小和粒度。使用用于激发的488-nm激光和用于检测的530/30带通滤波器来测量自身荧光。在图9的A和B的纵轴中的FSC和SSC分别代表前向散射(细胞大小)和侧向散射(细胞粒度)。
(4)对细胞周期调控的影响
当衰老时，在G0/G1期的细胞增加，而在S期和G2/M期的细胞减少。
为了确认这一点，对衰老细胞引入siRNA和对照siRNA，并检查细胞周期。详细地，如(1)解释的，将siRNA和对照siRNA引入衰老细胞中，通过使用lipofectamine而不是将shRNA或混杂RNA包装在慢病毒中将其导入衰老细胞中进行，培养衰老细胞，然后检查细胞周期。分别引入SEAT1 siRNA和DCUN1D3 shRNA，因此允许SEAT1 siRNA和DCUN1D3 siRNA在细胞内产生。
图10显示测量引入有SEAT1 siRNA或DCUN1D3 siRNA或对照siRNA的衰老细胞的细胞周期的结果。在图10中，一式三份地进行实验，并实施培养3天。如图10显示的，与引入对照siRNA的衰老细胞相比，引入SEAT1 siRNA或DCUN1D3 siRNA的衰老细胞显示在G0/G1期的降低的细胞百分比和在S期和G2/M期的增加的细胞百分比。图10纵轴的单位是％，其为当将对照siRNA的结果取作100时的百分比。
[表2]
n＝3，3天培养，HDF(M4，倍增时间＝14天)。
SEAT1shRNA#2的序列如下。
SEAT1#2shRNA：
SEAT1siRNA#2；SEQ ID NO：8(有义)和SEQ ID NO：9(反义)的多核苷酸
(5)DCUN1D3作为SEAT1的靶蛋白
检查了DCUN1D3基因是否是Lnc RNA，SEAT1的靶物。
首先，检查了DCUN1D3基因的表达是否通过用siSEAT1引入人细胞和小鼠细胞而降低。使用的人细胞是(1)中使用的衰老的HDF M4细胞，且小鼠细胞是MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞。将siRNA引入细胞以与(4)中相同的方式实施。
图11显示在引入siSEAT1的人细胞(A)和小鼠细胞(B)中DCUN1D3基因和SEAT1基因的表达水平。如图11显示的，当引入SEAT1 siRNA时，DCUN1D3基因的表达以及SEAT1基因的表达降低，表明DCUN1D3基因的表达与SEAT1基因的表达强烈相关。亦即，DCUN1D3基因是SEAT1的靶物。
(6)SEAT1和DCUN1D3对DNA损伤的影响
检查了SEAT1和/或DCUN1D3是否降低或增加DNA损伤。
详细地，将SEAT1 shRNA和DCUN1D3 shRNA的每种根据(1)中描述的方法引入(1)中描述的衰老的HDF M4细胞中并培养。然后，使用特异于DNA损伤标志物vH2AX和53BP1的单克隆抗体来检查vH2AX和/或53BP1阳性细胞。详细地，细胞在聚L-赖氨酸包被的盖玻片(#08-774-383；Corning Inc.，Corning NY，USA)上或在35-mm皿(#81156：Corning Inc.)中培养。将细胞在室温用新鲜PBS中2％低聚甲醛固定10至20分钟，然后用PBS中0.5％Triton X-100和2ug/ml Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)透化5分钟。在室温使用PBS中2％BSA实施封闭30分钟。在室温将样品与用2％BSA/PBS-d稀释的一抗温育1至2hr或过夜，并用PBS洗涤。然后，将样品与二抗(Jackson ImmunoResearch)温育30分钟。接着，使用ProLong GoldAntifade试剂(Invitrogen)封固样品，接着保藏在-30℃或立即成像。使用ZeissAxioObserver D1或Zeiss 710共聚焦显微镜(Wetzlar，Germany)可视化荧光信号。结果在图12给出。
图12显示SEAT1 shRNA和/或DCUN1D3 shRNA对胞内DNA损伤的影响。如图12显示的，当将SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA引入衰老细胞时，DNA损伤显著降低，表明SEAT1shRNA或DCUN1D3 shRNA将衰老细胞转化成幼嫩细胞，或保护衰老细胞，且还指示SEAT1shRNA或DCUN1D3 shRNA可以阻止或治疗衰老有关的疾病或病症。在图12中，“增殖”代表HDFM4细胞。图12的纵轴代表vH2AX和53BP1双阳性细胞的百分比。该值越高则DNA损伤越高。
(7)抑制SEAT1或DCUN1D3基因表达对hIL-6表达的影响
检查了抑制SEAT1或DCUN1D3基因表达对hIL-6表达的影响。IL-6(白介素-6)是促炎性细胞因子，且在人中由IL6基因表达。已知衰老细胞比幼嫩细胞显示更高的IL-6水平。胞内IL-6水平的降低可以是保护衰老细胞或将衰老细胞转化成幼嫩细胞的能力的指数。
详细地，将SEAT1 shRNA和DCUN1D3 shRNA的每种根据(1)中描述的方法引入(1)中描述的衰老的HDF M4细胞中并培养。然后，使用特异于hIL-6的单克隆抗体来实施ELISA，并通过Luminex测量培养上清中的hIL-6水平。结果在图13中给出。
图13显示SEAT1或DCUN1D3基因表达抑制对hIL-6表达的影响。在图13中，siSEAT1#3，DCUN1D3#2和#3代表从具有以下序列的shRNA形成的siRNA。此外，siSEAT1#1，2，3和siDCUN1D3#1，2，3分别表示三种siRNA的共引入。
SEAT1#3shRNA：
SEQ ID NO：10(有义)的多核苷酸
SEQ ID NO：11(反义)的多核苷酸
DCUN1D3#2shRNA：
SEQ ID NO：12(有义)的多核苷酸
SEQ ID NO：13(反义)的多核苷酸
DCUN1D3#3shRNA：
SEQ ID NO：14(有义)的多核苷酸
SEQ ID NO：15(反义)的多核苷酸
如图13中显示的，当将SEAT1和/或DCUN1D3的siRNA引入衰老细胞中时，hIL-6水平显著降低，表明SEAT1和/或DCUN1D3的shRNA可以将衰老细胞转化成幼嫩细胞，保护衰老细胞，或预防或治疗受试者的衰老有关的疾病或症状。
(8)通过miR-20b调控DCUN1D3基因表达
涉及DCUN1D3基因表达调控的miR-20b(SEQ ID NO：16)通过将SEAT1和DCUN1D3基因的序列与已知miRNA序列比较而鉴定。
详细地，将miR-20b根据(1)中描述的方法引入(1)中描述的衰老的HDFM4细胞中并培养。然后，使用特异于DCUN1D3的单克隆抗体来实施ELISA，并测量细胞中的DCUN1D3水平。具体地，根据以下方法将miR-20b转染到衰老的HDF M4细胞中，并培养3天。收获细胞并从其提取RNA。将提取的RNA用作模板来实施RT-PCR，并测量DCUN1D3mRNA水平。使用与Lipfectamine RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)混合的50nM siRNA依照制造商说明来实施HDF M4细胞的转染。转染后3天时，收获细胞并从其提取RNA。使用miR-20b模拟物(50nM)及其阴性对照(50nM)在HDF M4细胞上实施miR-20b功能获得(gain-of-function)研究。使用miR-20b抑制剂(75nM)及其阴性对照(75nM)在HDF M4细胞上实施功能丧失(loss-of-function)研究。结果在图14给出。
图14显示miR-20b对DCUN1D3基因表达的影响。在图14中，纵轴代表相对DCUN1D3水平。如图14中显示的，当将miR-20b引入衰老细胞时，DCUN1D3表达显著降低。
应理解本文中描述的例示性实施方案应仅视为描述性意义而不是用于限制目的。对每个例示性实施方案内的特征或方面的描述应通常视为可用于其他例示性实施方案中的其他类似的特征或方面。
尽管已参照附图描述了一个或多个例示性实施方案，但本领域普通技术人员将理解可在其中进行形式和细节的多种变化而不背离本发明的精神和范围，如由所附权利要求限定的。

Claims (21)

1.用于降低细胞衰老水平的组合物，该组合物包含抑制以下一种或多种的活性的活性抑制剂：DCUN1D3蛋白(DCN1，cullin类泛素修饰缺陷1含域3蛋白)和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，或抑制以下一种或多种的表达的表达抑制剂：编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因。
2.权利要求1的组合物，其中所述表达抑制剂是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、反义寡核苷酸、或其组合。
3.权利要求2的组合物，其中所述shRNA包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述活性抑制剂是针对具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、或其组合。
5.权利要求1的组合物，其中细胞衰老水平的降低包括以下一种或多种：细胞增殖的增加、自体吞噬活性的增加、脂褐素积累的降低、β-半乳糖苷酶活性的降低、线粒体反应性氧种类的数目的减少、和线粒体膜电位的增加。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物用于治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状。
7.权利要求6的组合物，其中所述与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状是皮肤皱纹、伤口愈合降低、肌肉衰减症、肌营养不良、早衰症状(哈-格二氏早老综合征)、或其组合。
8.权利要求6的组合物，其中所述与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状是与脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状。
9.权利要求8的组合物，其中与脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状是神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结、心脏褐色萎缩、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病或慢性阻塞性肺病(COPD)。
10.用于降低细胞中脂褐素累积的组合物，该组合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂作为活性成分。
11.权利要求10的组合物，其中所述细胞存在于体内且所述组合物用于治疗与脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状。
12.降低哺乳动物中细胞衰老水平的方法，该方法包括对哺乳动物施用抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂来降低细胞衰老水平。
13.治疗哺乳动物中与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状的方法，该方法包括对哺乳动物施用抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂来治疗与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状。
14.权利要求13的方法，其中所述表达抑制剂是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、反义寡核苷酸、或其组合。
15.权利要求13的方法，其中所述活性抑制剂是针对具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、或其组合。
16.权利要求13的方法，其中所述与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状是皮肤皱纹、伤口愈合降低、肌肉衰减症、肌营养不良、早衰症状(哈-格二氏早老综合征)、或其组合。
17.权利要求13的方法，其中所述与增加的细胞衰老水平有关的疾病或疾病症状是与脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状。
18.权利要求17的组合物，其中与脂褐素的累积有关的疾病或疾病症状是神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结、心脏褐色萎缩、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病或慢性阻塞性肺病(COPD)。
19.降低哺乳动物细胞中脂褐素水平的方法，该方法包括对哺乳动物施用抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一种或多种的活性的活性抑制剂，或抑制编码DCUN1D3的基因和编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一种或多种的表达的表达抑制剂来降低细胞中的脂褐素水平。
20.权利要求19的方法，其中该方法用于治疗哺乳动物细胞中与增加的脂褐素水平有关的疾病或疾病症状。
21.降低细胞中细胞衰老水平的方法，该方法包括抑制细胞中DCUN1D3和/或具有SEQID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的活性或表达。
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