CN102459594B - Zdhhc2活性抑制剂在调节脂肪生成中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Zdhhc2，一种参与脂肪生成调节的新靶标。使用siRNA方法，本发明人证明在脂肪组织中Zdhhc2活性降低导致脂肪生成降低。因此，本发明涉及Zdhhc2活性调节剂以及鉴定该靶标活性调节剂的筛选试验，并涉及它们在调节脂肪生成并因而治疗肥胖症和相关障碍中的用途，尤其是在药物组合物中的用途。

Description

Zdhhc2活性抑制剂在调节脂肪生成中的用途
本发明涉及Zdhhc2，一种参与脂肪生成调节的新靶标，并且涉及鉴定该靶标活性调节剂的筛选试验。另外，本发明涉及Zdhhc2活性调节剂以及它们在调节脂肪生成并因而治疗肥胖症和相关障碍中的用途，尤其是在药物组合物中的用途。 
肥胖症是包括高血压、冠状动脉病、血脂异常、胰岛素抵抗和2型糖尿病在内的多种疾病的主要危险因子。因为肥胖症流行的重要性，所以大量研究都集中在脂肪细胞生物学方面，包括产生新脂肪细胞的发育途径。脂肪生成是未分化的间充质前体细胞变为成熟脂肪细胞的过程。最近十年内在阐明脂肪细胞分化的分子机制方面已取得很大进展，该机制包括来自诸如CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPα、α和γ)和核激素受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)(Rosen，E.D.等，2002)的若干家族的转录因子的连续激活。PPARγ被描述为脂肪生成的“主要调节剂”，因为已经证明它是体外和体内脂肪生成的充要条件。近来，已经描述了参与脂肪生成的新转录因子，例如KLF家族(KLF2、5和KLF15)(Banerjee，S.S.等，2003；Gray，S.M.等，2002)、Ebf家族(Jimenez，M.A.等，2007)和Krox 20(Chen，Z.等，2005)，表明发生在脂肪生成期间的转录级联远比先前所想的要复杂的多。此外，也已描述了信号转导分子和/或受体，例如分泌蛋白的Wnt家族(Kang S.等，2007)、音猬蛋白(sonic hedgehog protein)和Notch受体，参与导致脂肪细胞形成的分子事件。 
近年来，一个新概念涉及在发育中的脂肪垫(fat pad)中导致脂肪细胞发育成为胞外基质(ECM)重塑的分子事件。的确，发育中的间叶细胞经历了细胞形态学的巨大改变，从柱状(stelate-shaped)变为球形。细胞形态学上的这些变化与细胞骨架的水平和类型、胞外基质 和相关组分例如肌动蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白(Gregoire F.M.等，1998；Hausman，GJ.等，1996)的巨大变化是平行的。有趣的是，脂肪组织含有丰富ECM，其组成在各种生命中不同，脂肪量各异(Chun，T.等，2006；Gagnon，A.M.，J.等1998；Mehlhom，A.T.，P等，2006；Nakajima，I.S.等，2002)。 
ECM不仅影响支撑细胞的结构系统的完整性，而且在分化过程中还通过细胞-表面受体之间、细胞-细胞之间和细胞-基质之间的相互关系而影响发生在细胞内的分子和信号转导事件。因此，胞外和胞内事件共同调节脂肪生成。 
在脂肪组织中脂肪的储存是有限的，超出该限量就会导致脂质在其它组织(尤其是肌肉、肝脏和内分泌胰脏)中蓄积，并由脂肪细胞分泌各种脂肪因子(adipokine)。脂肪组织由位于不同解剖部位的若干沉积物组成，其可来自不同前体并具有不同的生理功能和病理生理作用。与皮下脂肪沉积相反，内脏脂肪沉积或许更能促进代谢综合征相关缺陷。 
已经知道在所有器官中大麻素1受体在葡萄糖代谢和2型糖尿病中起到关键作用，所述器官即脂肪组织、胃肠道、肝脏、骨骼肌和胰脏。已经证明，利莫那班，第一种用于临床的选择性大麻素受体1(CB1R)拮抗剂，能降低食物摄取和体重，因而能改善葡萄糖代谢调节。 
然而，仍然需要新的治疗靶标用于治疗肥胖症。 
锌指，DHHC型含有2蛋白(DHHC-type containing 2 proteins，Zdhhc2)具有棕榈酰转移酶活性，并将棕榈酸部分添加到膜受体、整联蛋白、caveolin和Wnt蛋白上(Oyama，T.等，2000；Fukumura，D.等，2003)。如上所述，Wnt蛋白质参与脂肪生成。 
本发明人目前已经发现Zdhhc2在脂肪细胞分化中起到关键性作用。 
他们提出该酶通过修饰信号转导分子或胞外基质蛋白例如整联 蛋白而参与脂肪细胞发育。近来已经提出，胞外基质的可塑性不仅在组织完整性方面，而且在脂肪细胞发育方面都起到重要作用。因此，Zdhhc2可能对胞外基质组分有更大影响并且可能在脂肪组织三维发育中起作用。此外，该蛋白质位于所有细胞膜上并可作为新型药物开发的潜在靶标。 
因此认为Zdhhc2是用于调节脂肪生成和治疗肥胖症及相关障碍的新的相关靶标。Zdhhc2的抑制也可用于降低脂肪生成，用于减少皮下和内脏脂肪蓄积。 
发明详述 
本发明涉及在脂肪细胞中调节脂肪生成和代谢功能的方法。 
本发明在于Zdhhc2活性抑制剂在调节脂肪生成中的用途，尤其是在治疗肥胖症及相关障碍中的用途。本发明也涉及含有所述脂肪生成及相关障碍的调节剂的药物组合物和所述调节剂的筛选试验。 
通过转录组学(transcriptomic)方法，本发明人在饲喂高脂膳食的C57BI/6小鼠群组中鉴定了其表达与体重增加相关的基因。然后，他们进行了第二次分析，以评价高脂膳食饲喂的小鼠经利莫那班治疗所诱导的基因表达的改变。保留了以前在脂肪细胞生物学中从未描述的、并且可能参与重要的生物学过程(例如信号传导、胞外基质蛋白修饰和基因转录)的基因。这些基因对脂肪生成是重要的，尤其是因为它们可能涉及利莫那班降低小鼠脂肪量的机制。在这种情况下，认为Zdhhc2参与脂肪细胞代谢，尤其是作为与脂肪组织的三维发育相关的胞外基质组分调节的主要参与者。更通常地，该基因看来在脂肪生成和肥胖症的脂肪组织发育控制中起作用。 
本发明在于Zdhhc2活性调节剂的鉴定。这类调节剂可以是能调节Zdhhc2活性的任何化合物或分子，尤其是小分子、脂质和siRNA。 
Zdhhc2活性调节剂可通过检测药剂调节Zdhhc2活性的能力而得以鉴定。Zdhhc2抑制剂是能够部分地或完全地降低或抑制Zdhhc2 活性的任何化合物。Zdhhc2抑制剂包括但不限于在胞内隔室中能干扰Zdhhc2与其天然配偶体间相互作用的药剂以及能在转录和翻译水平上降低Zdhhc2表达的药剂。 
CD9和CD151是与Zdhhc2专一而直接相互作用的两种膜蛋白。这些蛋白当被Zdhhc2棕榈酰化后能与整联蛋白结合并允许细胞-细胞连接，参见Resh，MD等(2006)和Sharma C，等(2008)。因此，可在因Zdhhc2活性的基于带标记的棕榈酸残基的CD9或CD151存在的筛选中检测Zdhhc2活性调节剂。 
举例而言，在一个具体的实施方案中，筛选试验可进行如下：制备来自表达CD9或CD151的重组细胞的膜部分。将该部分与含Zdhhc2活性的样品(来自患者、来自动物或来自重组细胞的任何来源都适合作为脂肪组织的提取物)以及带标记的棕榈酸盐(作为3H棕榈酸盐)和候选化合物一起温育。然后通过定量测定靶蛋白上存在的带标记的棕榈酸盐，测定Zdhhc2的棕榈酰化活性。对于该步骤，用特异性抗体将靶蛋白(CD9、CD151或Zdhhc2的任何特异性靶标)免疫沉淀。定量测定在保留部分中检测的3H发射。结果，所测信号量与样品中存在的Zdhhc2活性成比例。因此，当检测到Zdhhc2活性比不含候选化合物的对照样品降低时，就可鉴定抑制剂化合物。 
在另一个实施方案中，通过RNA干扰，使用小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)调节Zdhhc2表达。因此，一方面，本发明涉及能介导针对Zdhhc2基因表达的RNA干扰(RNAi)的双链核酸分子，包括小核酸分子，例如小干扰核酸(siNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子，包括这类小核酸分子的混合物和这类小核酸分子的合适制剂。 
RNAi介导的基因沉默现象最初是在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)系统中描述的，其中报道了长双链RNA分子的显微注射。RNA介导的基因失活机制看来在迄今为止所研究的各种生物中有稍许差异。然而，在所有系统中，RNA介导的基因沉默 是基于由内切核酸酶Argonaute2诱导的靶mRNA的转录后降解，所述酶是所谓的RISC复合物的一部分。降解的序列特异性是由装载在RISC复合物上的特定反义RNA链的核苷酸序列决定的。 
将siRNA化合物引入细胞导致细胞靶mRNA水平降低，并因此导致相应多肽水平以及相应酶活性水平同时降低。 
如本文所述，对Zdhhc2具有特异性的siRNA可用作Zdhhc2活性调节剂，以降低Zdhhc2mRNA的翻译。更具体地讲，对Zdhhc2具有特异性的siRNA可用于减少脂肪生成并因此而治疗肥胖症及相关疾病。 
在一个实施方案中，本发明的特征在于双链核酸分子，例如siRNA分子，其双链中的一条包含与靶Zdhhc2核酸分子中的预定Zdhhc2核苷酸序列或其部分具有互补性的核苷酸序列。 
可使用经修饰或未经修饰的RNA分子。修饰的实例是掺入三环-DNA，以允许改善寡核苷酸的血清稳定性。 
在一个实施方案中，预定的Zdhhc2核苷酸序列是本文所述的Zdhhc2核苷酸靶序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3)。 
因为跨越不同生物或不同受试者的基因组具有序列变异性的可能性，所以对于广泛治疗应用的siRNA分子的选择可能包括基因的保守区。因此在一个实施方案中，本发明涉及靶向基因组保守区或跨越不同靶的保守区的siRNA分子。经设计用于靶向不同靶的保守区的siRNA分子使得对在不同患者群体中有效抑制Zdhhc2基因表达成为可能。 
在一个实施方案中，本发明特征在于下调靶Zdhhc2基因表达或引导靶RNA切割的双链短干扰核酸分子，其中所述siRNA分子包含约15至约28碱基对，优选19碱基对。本发明的siRNA或RNAi抑制剂可以是经化学合成的、由载体表达的或经酶促合成的。 
在一个具体的实施方案中，对Zdhhc2具有特异性的siRNA是具有序列SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的shRNA。在一个优选的 实施方案中，对Zdhhc2具有特异性的siRNA是具有序列SEQ ID NO.5的shRNA。本发明siRNA的使用导致相应野生型细胞的mRNA水平减少5％-20％，优选地减少5％-15％，更优选减少5％-10％。野生型细胞是在将编码siRNA化合物的核酸引入之前的细胞，其中靶向的mRNA未被siRNA化合物降解。 
可通过任何合适途径给予Zdhhc2活性抑制剂，或局部或系统给予，取决于分子特性和预期效果。就双链分子而言，可将siRNA局部直接给予靶组织，或者就shRNA而言，可将siRNA通过载体给予，按照本领域所用的方案。 
在一个实施方案中，使用shRNA分子来获取RNAi。ShRNA构建体编码茎-环RNA。在引入细胞之后，该茎-环RNA被加工为双链RNA化合物，其序列对应于原始RNA分子的茎。可以按照本领域已知的任何方法(包括体外和体内方法)制备这样的双链RNA，所述方法例如但不限于以下文献所述的方法：Sahber等(1987)，Bhattacharyya等，(1990)或US 5,795,715。 
对于体内给予，可将shRNA引入质粒中。质粒来源的shRNA具有提供与报道基因或选择标记组合，并通过病毒或非病毒载体递送的选择的优势。将shRNA引入载体、再引入细胞，确保shRNA连续表达。载体通常传给子细胞，允许将基因沉默遗传下去。 
本发明也提供包含用于表达本发明shRNA的多核苷酸的载体。这些载体是可以通过不同合适途径给予的例如AAV载体、逆转录病毒载体(尤其是慢病毒载体)、腺病毒载体，所述途径包括静脉内途径、肌内途径、皮下组织直接注射或按照常规实践选择的其它靶向组织直接注射。 
siRNA的给予途径各不相同，包括局部递送、直接递送乃至全身静脉内给予。局部递送的优势是功效所需siRNA剂量非常低，因为将分子注射到靶组织内或附近。局部给予也允许集中递送siRNA。对于这样的直接递送，可使用裸siRNA。“裸siRNA”是指递送 siRNA(未经修饰或经修饰)的盐水或其它简单赋形剂例如5％右旋糖。这类分子的配制和给予的方便性使其成为具有吸引力的治疗方法。也可将裸DNA制备到脂质尤其是脂质体中。 
siRNA的系统应用通常具有较低侵入性，而且更重要的是，不限于足以从外部进入的组织。对于系统递送，可将siRNA与胆固醇缀合物、脂质体或基于聚合物的纳米粒一起配制。脂质体是传统使用的，以提供增强的药物动力学性能和/或降低的毒性概况。它们允许大量而重复的成功体内递送。当前，基于脂质的siRNA系统递送(尤其是递送到干细胞的)制剂的应用，看来代表了用于开发RNAi治疗药的一个最有希望的近期机会。含聚合物例如动态聚合缀合物(例如与N-乙酰基葡糖胺偶联(用于肝细胞靶向)的聚合缀合物)和基于环糊精的纳米粒的制剂允许靶向递送和核内体逃逸机制两者。其它聚合物例如atelocollagen和脱乙酰壳多糖允许对皮下肿瘤异种移植物以及骨转移具有疗效。 
也可将SiRNA与经设计有助于靶向递送的分子实体直接缀合。假定siRNA双链体的特性，无活性或有义链的存在是缀合的理想位点。缀合物的实例是亲脂性缀合物，例如胆固醇，或基于适体的缀合物。 
阳离子型肽和蛋白质也用于与siRNA双链体的带负电荷的磷酸主链构成复合物。 
这些不同的递送方式可用于将Zdhhc2 siRNA靶向到相关组织(尤其是脂肪组织)。对于这样的靶向，可将siRNA和与前脂肪细胞和脂肪细胞相互作用的不同分子缀合在一起，所述分子例如与脂质转送蛋白、受体、胰岛素受体或本领域已知的任何分子相互作用的配体。 
本发明的另一目的是药物组合物，其包含作为有效成分的本发明Zdhhc2调节剂。这些药物组合物包含有效量的至少一种本发明的调节剂，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。根据药物形式和所 需给药途径，在本领域技术人员已知的常用赋形剂中选择所述赋形剂。 
本发明也在于用于调节脂肪生成的方法。这样的方法可用于治疗肥胖症或相关疾病。也可使用这种方法，从而为了美容目的而降低脂肪蓄积。 
Zdhhc2活性调节剂可用于调节脂肪生成的治疗药，尤其是治疗和预防肥胖症相关障碍，特别是2型糖尿病、血脂异常、高血压、胰岛素抵抗、心血管障碍和更常见的代谢综合征。 
按照其另一方面，本发明涉及用于治疗上述病理学的方法，所述方法包括在体内给予患者有效量的本发明Zdhhc2调节剂。 
合适的单位剂型包括口服形式，例如片剂、软质或硬质明胶胶囊剂、粉剂、颗粒剂和口服溶液剂或混悬剂，舌下、口腔、气管内、眼内、鼻内形式，通过吸入、局部、透皮、皮下、肌内或静脉内形式，直肠形式和植入物。对于局部应用，本发明的化合物可作为乳胶剂、凝胶剂、软膏剂或洗剂来使用。 
按照常规实践，适合各患者的剂量是由医师按照给药途径、患者体重和反应来决定。 
Zdhhc2抑制剂也可用于美容应用，以降低难看的脂肪蓄积。 
对于美容应用，可将Zdhhc2抑制剂掺入到合适制剂中，用于局部用途。Zdhhc2抑制剂可以是小分子或siRNA，如前所述。 
参考以下实施例来描述本发明，所述实施例仅仅是说明性的，并不旨在限制本发明。 
附图简述 
图1：关键性脂肪组织调节基因的选择。维恩图解显示基于以下标准的基因选择。A)通过高脂饲喂，在皮下(SCAT或Sq)和内脏(VAT)中类似调节。选择151个基因(对于SCAT有48个，对于VAT有88个)。B)在这151个基因中，选择受到利莫那班治疗而调节的 基因(对于SCAT有14个，对于VAT有54个)。这导致通过高脂饲喂和利莫那班，选出同时在两类组织中都得以调节的34个基因。在这些基因中，16个的表达水平与L、M和H组的体重相关(肥胖症相关的)，而在各亚组中18个被HFD调节至相同水平(非肥胖症相关的)。 
图2：在不同组织和细胞类型中Zdhhc2的表达。A)通过RT-PCR分析Zdhhc2表达，显示以下各小鼠组织中的mRNA表达：脾、肌肉(腓肠肌)、心、肺、肾、肝、褐色脂肪组织(BAT)、皮下脂肪组织(SCAT)和内脏(VAT)脂肪组织；结果经参考肝脏基础表达而标准化。B至E：经RT-PCR测定的Zdhhc2的mRNA水平。B)在野生型和Ob/Ob小鼠(n＝5)*的SCAT和VAT中，p＜0.05，数据表示为平均值±sd并表示为相对于设置在1的对照SCAT的增加倍数。C)在小鼠的SVF和分离脂肪细胞中(每次提取n＝5只小鼠合并，实验重复3次，显示代表性实验)。数据表示为相对于SCAT SVF表达的增加倍数。D)在人体全组织SCAT和VAT、分离的脂肪细胞、分离的前脂肪细胞和体外分化的脂肪细胞中。数据表示为相对于任意设置在1的全组织SCAT表达的水平。E)在3T3-L1细胞中，在DMI治疗前2天和在DMI治疗后7天。N＝3组细胞。数据表示为相对于第0天表达的水平。 
图3：由shRNA导致的Zdhhc2表达和活性的敲减。A)3T3-L1细胞用含有针对萤光素酶的shRNA(shLuc)或Zdhhc2(shZdhhc2)的逆转录病毒转导。在分化前通过RT-PCR测定mRNA水平。B)在第9天分化的3T3-L1的油红O图像。C)在第9天在与B)同样的细胞中经RT-PCR测定aP2(分化标记)mRNA表达。结果表示为平均值±sd*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3。 
材料与方法 
动物治疗 
给易患肥胖症的C57BL/6J小鼠(5)饲喂高脂膳食(HFD)达6个月。HFD 6个月之后，小鼠表现出分散的体重并具有不同程度的葡萄糖不耐受(经葡萄糖耐量试验测定)。将HFD小鼠分为3组，其都表现出相同的葡萄糖不耐受水平，但具有低(L)、中(M)或高(H)体重，然后用溶媒或利莫那班(10mg/kg/天)治疗它们，同时用正常饲料(normal choW，NC)饲喂小鼠达1个月，并将其体重标准化。治疗也标准化葡萄糖耐量，如前所述(25)。 
RNA制备、标记和在cDNA微阵列上杂交。 
使用peqGOLD TrifastTM(peqlab)和氯仿-异戊醇(24∶1)提取，从内脏和皮下脂肪组织中提取来自每组5只不同小鼠的RNA。RNA用异丙醇沉淀并通过RNeasy柱(Qiagen)纯化。在用Bioanalyzer 2100(Agilent)扩增前后检查RNA质量。RNA经逆转录，然后用MessageAmpTM试剂盒(Ambion)扩增RNA。类似地扩增Mouse Universal Reference(Clontech)，并按照已公开的方案(de Fourmestraux等，J.Biol.Chem.2004279：50743-53)，通过间接技术将脂肪组织和参考RNA用Cy5和Cy3标记。将标记的RNA杂交到含有17664cDNA的微阵列(由洛桑大学DNA阵列部门(DNA Array Facility of the University of Lausanne)制备)上。按照先前已公开的方法(deFourmestraux等，J.Biol.Chem.2004279：50743-53)进行扫描、成像和质量控制分析。数据表示为log2强度比(Cy5/Cy3)，用印刷头(print tip)局部加权线性回归(Lowess)方法标准化并根据点质量(spot quality)和不完全注释(incomplete annotation)过滤。所有分析都用Comprehensive R Archive Network(cran.us.r-project.org/)提供的用于统计学计算的R软件进行。 
细胞培养 
3T3-L1细胞在含有10％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)上，在 5％CO2中培养。经逆转录病毒感染(见下文)之后，让细胞在含有10％FBS的DMEM中，在100-mm或者60-mm碟中生长到汇合。一旦达到汇合，将细胞暴露给含有以下成分的分化培养基：地塞米松(1μM)、胰岛素(5μg/ml)和异丁基甲基黄嘌呤(0.5μM)(DMI)。2天后，将细胞维持在含胰岛素(5μg/ml)的培养基中，直到第7天准备收获。 
油红O染色 
分化7-10天后，细胞在PBS中洗涤一次并用甲醛(Formalde-fresh；Fisher)固定15分钟。将0.5g油红O溶于100ml异丙醇中，制备染色液；将60ml该溶液与40ml蒸馏水混合。在室温下经过1小时后，过滤染色液并将其加入到碟中持续4小时。再除去染色液，细胞用蒸馏水洗涤2次。 
shRNA构建体 
用RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen(Clontech)构建shRNA。通过查询Whitehead siRNA算法(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)以及Clontech的siRNA设计师软件(http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/)，设计Zdhhc2的靶序列；使用EcoRI和BamH1限制位点，将这两种算法代表的至少2个序列亚克隆到pSIREN载体(Clontech)。选择下列Zdhhc2靶序列，SEQ ID NO.5和6作为阴性对照，我们使用针对萤光素酶的下列siRNA序列：SEQ ID NO.7。 
shRNA构建体的转染 
在使用(14)所述的磷酸钙方法用含有Zdhhc2 cDNA的表达载体和RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体(表达针对荧光素酶的shRNA(对照shLUC)或针对Zdhhc2的shRNA(shZdhhc2))共转染的293THEK细胞中测定shRNA的特异性。转染后24小时，对细胞RNA提取物进行RT-PCR分析。 
逆转录病毒构建体的产生和逆转录病毒感染 
在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen(pSIREN Clontech)中构建逆转录病毒。使用Jordan，M.等(2004)所述的磷酸钙方法，将病毒构建体连同编码gag-pol和VSV-G蛋白的构建体一起转染到293HEK包装细胞中。在3μm Trichostatin A(Sigma)存在下，在48小时后收获上清液，然后立即使用或者快速冷冻并贮存于-80℃备用。在polybrene(4μg/ml)存在下将病毒上清液加入到细胞中持续6小时并用新鲜培养基稀释2倍再持续15小时。 
从脂肪组织中分离脂肪细胞和基底血管部分(SVF) 
通过CO2吸入，对8周龄雄性C57BL/6J小鼠(n＝6-8)实施安乐死并收集附睾(内脏)脂肪组织和皮下脂肪组织，然后放入含10mg/mL低脂肪酸的BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，Ml)的DMEM培养基中。将组织切成碎片，再在37℃，在0.12单位/mL胶原酶I型(Sigma)中，在摇动的水浴(80Hz)中消化1小时。然后样品通过无菌250μm尼龙网(Scrynel NY250HC，Milian)过滤，以除去未消化片段。所得悬浮液在1100RPM离心10分钟，从脂肪细胞中分离出SVF。取出脂肪细胞并用DMEM缓冲液洗涤。再将它们悬浮在peqGOLD TriFast试剂(Axonlab)中并按照制造商使用说明分离RNA。将SVF部分在红细胞裂解缓冲液(0.154mM NH4Cl、10mM KHCO3、0,1mM EDTA)中温育2分钟。再将细胞在1100RPM离心10分钟并重悬于500μl peqGOLD TriFast试剂(Axonlab)中，进行RNA分离。 
RNA提取和实时PCR 
按照制造商使用说明(Axonlab)，使用peqGOLD TriFast试剂，从培养细胞中分离总RNA。使用随机引物和Superscript II(Invitrogen)，自0.5μg总RNA合成第一条链cDNA。使用Power SYBR Green Mix(Applied Biosystem)进行实时PCR。下列引物用于小鼠基 因：mZdhhc2-F(SEQ ID NO.8)和mZdhhc2-R(SEQ ID NO.9)，用于Zdhhc2；Ap2-F(SEQ ID NO.16)；Ap2-R(SEQ ID NO.17)，用于m亲环蛋白A-F(SEQ ID NO.12)；m亲环蛋白A-R(SEQ ID NO.13)、m亲环蛋白A-F(SEQ ID NO.12)；m亲环蛋白A-R(SEQ ID NO.13)。下列引物用于人基因：hZdhhc2-F SEQ ID NO.10；hZdhhc2-R SEQ ID NO.11h亲环蛋白A-F SEQ ID NO.14；h亲环蛋白A-R SEQ ID NO.15。 
RNA印迹 
按照制造商使用说明(Axonlab)，使用peqGOLD TriFast试剂从不同小鼠组织中分离总RNA。将总RNA(8μg)在1.2％琼脂糖/甲醛凝胶上分离并向尼龙膜上转移过夜。为了控制RNA载量，膜先用亚甲蓝染色，随后再杂交。为了检测Zdhh2信号，使用来自全长cDNA小鼠质粒(Open Biosystem)的探针。探针通过用[α-32P]dCTP(Amersham)随机引发(random priming)标记。按照制造商使用说明(Stratagene)，使用Quickhib方法进行杂交和洗涤。在-80℃将印迹暴露给Hyperfilm ECL(Amersham)达1天或几天，取决于信号强度。 
结果 
实施例1：微阵列结果 
对微阵列据进行生物信息学分析，以鉴定满足以下三个标准的基因：(i)受到高脂喂养的调节，(ii)通过高脂饲喂，同时在内脏脂肪(VAT)和皮下脂肪(SCAT)中的表达类似被调节，和(iii)通过利莫那班治疗对其表达的类似标准化(图1)。所用的cDNA微阵列上存在的大约17000基因靶标中，有34个基因满足这些标准，列于下表1。引人注目的是，这些基因中有10个(Cav1、Fgf1、Fndc3b、Kif5b、Mest、Npr3、Pik3ca、Sparc、VIdIr和Wwtri)先前已知是脂肪组织发育和功能的重要调节剂。这些基因中的某些的表达水平与体重增加 相关(见表1中的灰色部分)，表明在肥胖症期间在脂肪组织增生和/或肥大中起到潜在作用。这些结果证实用于鉴定肥胖症治疗性治疗的可能新靶标的方法。 
最重要的是，表1所提及的基因中的许多，在脂肪组织发育或生物学方面从未研究过。这些基因属于以下功能分类：胞外基质/细胞相互作用、细胞骨架、胞内信号转导、酶和转录因子/辅因子。它们可能参与组织重塑，以及尤其是脂肪细胞发育。这些基因之一，Zdhhc2基因，及其在脂肪细胞生物学中的作用，在本文中给出并构成本发明的一方面。 
Zdhhc2具有棕榈酰转移酶活性，并将棕榈酸部分添加到膜受体、整联蛋白、caveolin和Wnt蛋白上(23，6)。Wnt蛋白质参与脂肪生成。因此，该酶可能通过修饰信号转导分子或胞外基质蛋白例如整联蛋白而参与脂肪细胞发育。近来已经提出，胞外基质的可塑性不仅在组织完整性方面，而且在脂肪组织发育方面都起到重要作用(20，7，19)。因此根据这一新观念，对Zdhhc2的研究有极大兴趣。 
表1：在SCAT和VAT中受到HFD和利莫那班调节的34个候选基因的列表。全称和基因符号见第一栏。已知基因和参考的生物学作用见第二栏。所有这些基因都被HFD上调并被利莫那班治疗标准化，除了Plac8和Rp9h之外，后两者被HFD下调。与体重增加相关的基因用灰色表示。 
实施例2.所选基因的组织表达和细胞表达。 
为了更好地理解Zdhhc2在脂肪细胞发育中的作用，首先表征其表达模式。通过RNA印迹和RT-PCR，在小鼠肥胖症模型(Ob/Ob小鼠)的不同小鼠组织中、在分离的前脂肪细胞和脂肪细胞中、在内脏脂肪组织(VAT)和皮下脂肪组织(SCAT)以及在人体脂肪组织中测定mRNA水平。 
通过RT-PCR，表明Zdhhc2在心、BAT、SCAT、VAT、脾和 肌肉中强烈表达，而Zdhhc2的表达在肺和肾中比较微弱，而在肝中则是非常微弱(图2A)。也证明了，与野生型小鼠的水平相比，Zdhhc2水平在Ob/Ob小鼠白色脂肪组织中增加(图2B)。数值表示为相对于任意设置在1的SCAT的对照值的增加倍数。 
脂肪组织是复杂组织，其不仅包含成熟脂肪细胞，而且包含前体细胞例如前脂肪细胞、以及血管、巨噬细胞和成纤维细胞。根据胶原酶I消化技术，从分离的脂肪细胞部分中分离出基底血管部分(SVF)(包括前脂肪细胞、内皮细胞和巨噬细胞)。已经发现同时在SVF和分离的脂肪细胞这两部分中都表达Zdhhc2(图2C)。这些结果表明Zdhhc2不仅参与分化和/或增殖过程，还参与未成熟脂肪细胞生物学。 
下一步要确定Zdhhc2基因在物种中是否是保守的。为了解决这一问题，在人体脂肪组织样品上进行RT-PCR。从SCAT或VAT中分离前脂肪细胞和脂肪细胞。诱导分离的前脂肪细胞在体外分化7天。结果表明Zdhhc2的确在人体脂肪中表达(图2D)。它们表明这些基因存在于人体脂肪组织中。总之，这些结果表明Zdhhc2在肥胖症中是脂肪细胞发育、尤其是脂肪生成或脂肪组织增大的相关候选基因。 
实施例3：在3T3-L1分化期间所选基因的表达 
然后，在脂肪生成期间评价Zdhhc2基因表达。为了该目的，在3T3-L1(一种脂肪生成细胞系)的具体分化时间进程期间，通过RT-PCR测定mRNA水平(图2E)。实验表明，在DMI治疗后的非常早的时期(介于15分钟至1小时之间)就已诱导出Zdhhc2表达并且在分化期间维持低水平。 
实施例4：在3T3-L1细胞中shRNA敲减Zdhhc2减少脂肪生成 
对于功能缺失(loss-of-function)研究，使用亚克隆到来自 Clontech的逆转录病毒载体中的对Zdhhc2具有特异性的shRNA(RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen或pSIREN)。该质粒含有GFP标记，其允许控制在3T3-L1细胞中的感染效率。将Zdhhc2的两种不同shRNA克隆到pSIREN质粒中，然后先在293T HEK细胞中测试。该实验证明了对Zdhhc2具有特异性的shRNA抑制Zdhhc2表达的能力。有趣的是，用已经转导到3T3-L1细胞中的shZdhhc2-1和shZdhhc2-2分别获得60％和50％的敲减。 
然后将3T3-L1细胞用表达针对Zdhhc2的shRNA(shZdhhc2)或针对萤光素酶的shRNA(shLuc)的逆转录病毒载体感染6小时。使用GFP标记，我们在3T3-L1细胞中观察到90-95％感染(数据未显示)。然后，让细胞达到汇合并用DMI治疗而使其分化。分化9天后，用油红O染色使细胞染色，以确定脂质含量。该实验证明，如第9天油红O染色和aP2表达所示，Zdhhc2的敲减在体外抑制脂肪生成(图2B)，其在ShZdhhc2-1和shZdhhc2-2感染的3T3-L1细胞中分别降低75和60％(图2C)。作为对照，用shLuc未见抑制。 
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Claims (9)

1.Zdhhc2活性抑制剂在制备抑制脂肪生成的药物中的用途，其中所述抑制剂为能够介导针对Zdhhc2基因表达的RNA干扰的双链核酸分子。
2. 权利要求1的用途，其中所述药物用于降低脂肪生成。
3. 权利要求1或2的用途，其中所述药物用于治疗肥胖症及相关障碍。
4. 权利要求3的用途，其中所述肥胖症相关障碍为血脂异常或代谢综合征。
5. 前述权利要求1或2的用途，其中所述药物用于降低内脏和/或皮下脂肪蓄积。
6. 权利要求1或2的用途，其中所述抑制剂是短发夹RNA (shRNA)。
7. 权利要求6的用途，其中所述shRNA由对应于SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的序列转录的shRNA组成。
8. 由序列SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6组成的核酸。
9. 包含Zdhhc2活性抑制剂和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物或美容组合物，其中所述抑制剂由对应于SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的序列转录的shRNA组成。
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