KR20160146099A - Ｒｃｃ1 조절 물질을 포함하는 세포 또는 개체의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

Abstract

일 양상에 따른 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 세포 또는 개체에서 노화 수준을 조절하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 세포 또는 개체의 노화 수준을 효율적으로 조절하고, 노화와 연관된 증상 또는 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

ＲＣＣ1 조절 물질을 포함하는 세포 또는 개체의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition for reducing senescence of a cell or a subject comprising RCC1 regulating material and method using the same}

세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물, 및 이를 이용한 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

노화(senesence 또는 aging)는 나이가 들면서 일어나는 쇠퇴적인 현상을 말한다. 사람의 경우 노화에 따라 생리 활성이 저하되기도 하지만 일부 효소 활성이나 호르몬 분비 기능은 증가되기도 한다. 세포의 노화는 세포 분열(cellular division)의 영구적 정지(permanent halt)로서 정의될 수 있다. 복제 노화(replicative senescence) 또는 세포 노화(cellular senescence)는 세포 수준에서 에이징(aging)을 위한 모델로서 관찰되었다. 세포가 연속으로 배양되는 경우, 많은 회수의 분열을 하지만, 노화에 따라 세포는 더 이상 분열할 수 없다. 노화된 세포는 실제로 프로그램된 세포사(programmed cell death)에 저항성이 있고, 일부 노화된 세포는 수년 동안 비증식 상태(nondividing state)로 유지되었다.

핵과 세포질 사이의 물질 이동인 핵 수송계(nuclear transport system)은 세포의 기능 유지에 필요하다. 핵막을 경계로 세포질의 물질의 이동에는 크게 핵공 복합체, 핵 수송 수용체, RanGTP 구배, 및 수송물질(cargo) 변형이 관여한다. 세포 노화가 진행되면 핵 수송계의 기능이 변화된다. 그러나, 노화에 따른 핵 수송계의 변화가 노화의 원인인지 또는 결과인지 모르고, 노화와 관련된 핵 수송계의 인자가 밝혀지지 않았다.

상기한 선행기술에 의하더라도, 핵 수송계를 변화시키는 물질을 포함하는 세포 또는 개체의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법이 요구된다.

일 양상은 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 세포 또는 개체에서 노화 수준을 조절하는 방법을 제공한다.

일 양상은 RCC1(Regulator of chromosome condensation 1) 유전자의 발현 또는 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질을 포함하는, 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.

용어 "RCC1"은 용어 "RanGEF(Ran Guanine nucleotide Exchange Factor)"와 상호교환적으로 사용할 수 있다. 상기 RCC1은 Ran(Ras-related nuclear protein) 단백질의 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자로서 기능할 수 있다. Ran 단백질은 핵공 복합체를 통한 RNA 및 단백질의 핵 수송에 기능한다. RCC1은 세포의 핵 내에서 구아노신 디포스페이트(guanosine diphosphate: GDP)가 결합한 Ran 단백질(RanGDP)와 결합하고, 핵 내 GTP와 RanGDP의 GDP를 교환하여 구아노신 트리포스페이트(guanosine triphosphate: GTP)가 결합한 Ran 단백질(RanGTP)을 생성할 수 있다. RCC1 유전자 발현 또는 RCC1 단백질의 기능을 조절함으로써 핵 수송계를 조절할 수 있다.

상기 RCC1 유전자는 RCC1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 프로모터와 RCC1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 상기 RCC1 유전자는 인간에서 예를 들면 GenBank Accession No. NM_001048194의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 RCC1 유전자는 마우스에서 예를 들면 GenBank Accession No. NM_001197082의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 예를 들면 RCC1 유전자의 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, U6 프로모터, PGK 포로모터, 및 신장 인자(elongation factor: EF)-1 프로모터일 수 있다.

용어 "유전자의 발현(expression of gene)"은 유전자의 정보로부터 유전자 산물을 합성하는 과정을 말한다. 상기 유전자 산물은 폴리펩티드, 단백질, 또는 RNA일 수 있다. 상기 RCC1 유전자의 발현은 RCC1 유전자로부터 RCC1 단백질을 합성하는 과정일 수 있다. 상기 RCC1 유전자의 발현의 조절은 RCC1 유전자의 발현의 촉진 또는 저해일 수 있다.

상기 RCC1 단백질은 인간에서 예를 들면 GenBank Accession No. NP_001041659의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 RCC1 단백질은 마우스에서 예를 들면 GenBank Accession No. NP_001184011의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 RCC1 단백질의 활성은 세포핵 내 GTP와 RanGDP의 GDP를 교환하여 RanGTP를 생성하는 것일 수 있다. 상기 RCC1 단백질의 활성의 조절은 RCC1 단백질의 활성의 촉진 또는 저해일 수 있다. 상기 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질은 화합물, 핵산, 이온, 항체, 안티펩티드, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 RCC1 유전자의 발현을 조절하는 물질은 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질 또는 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질일 수 있다.

상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 마이크로 RNA(microRNA: miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, RCC1 유전자의 전사인자의 저해제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 shRNA는 RNA 간섭(RNA interference)을 통해 표적 유전자의 발현을 억제(silence)할 수 있는 헤어핀 구조를 갖는 RNA 분자일 수 있다. 상기 siRNA는 RNA 간섭에 관여하는 RNA 분자로서, 특정 단백질의 생산을 억제함으로써 유전자 발현을 방해할 수 있다. 상기 shRNA 또는 siRNA의 길이는 10 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함) 내지 50 nt, 15 nt 내지 40 nt, 20 nt 내지 30 nt, 또는 21 nt 내지 23 nt일 수 있다. 상기 shRNA는 서열번호 3의 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 3의 핵산 서열 중 2 nt 이상 연속된 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 단편의 길이는 예를 들면 2 nt 내지 50 nt, 3 nt 내지 40 nt, 4 nt 내지 30 nt, 5 nt 내지 20 nt, 6 nt 내지 15 nt, 또는 7 nt 내지 10 nt일 수 있다. miRNA는 생물의 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 작은 RNA로서, 길이가 약 17 nt 내지 약 25 nt이다. miRNA는 mRNA와 상보적으로 결합하여 특정 단백질의 생산을 발현을 증가 또는 감소시키는 역할을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특성 서열에 상보적인 단일가닥의 DNA 또는 RNA이고, mRNA와 상보적으로 결합하여 특정 단백질의 생산을 발현을 증가 또는 감소시키는 역할을 한다. 상기 RCC1 유전자의 전사 인자의 저해제는 RCC1 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 세포의 핵에서 RanGDP의 양을 증가시키고 RanGTP의 양을 감소시킬 수 있다. 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 세포의 핵에서 RanGTP의 양을 감소시킴으로써 세포 또는 개체의 노화 수준을 증가시킬 수 있다.

상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 RCC1 유전자를 포함한 발현 벡터, RCC1 유전자의 전사 인자, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, pSV 벡터, pCMV 벡터, 백시니아(vaccinia) 벡터, 렌티바이러스 벡터(예, pLKO.1 또는 pGIPZ), 또는 레트로바이러스 벡터(예, pMSCV))일 수 있다. 상기 RCC1 유전자를 포함한 발현 벡터는 RCC1 유전자가 발현될 수 있도록 RCC1 유전자가 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 RCC1 유전자의 전사 인자는 SP1(specificity protein 1) 폴리펩티드일 수 있다. SP1 폴리펩티드는 전사 인자로 기능하여 RCC1 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 세포의 핵에서 RanGDP의 양을 감소시키고 RanGTP의 양을 증가시킬 수 있다. RanGTP의 양이 증가하면 핵 수송계는 활성화될 수 있다. 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 노화(senescence) 세포의 사멸, 젊은(young) 세포의 세포 분열, 또는 이들의 조합을 유도할 수 있다.

상기 세포는 예를 들면, 신경 세포, 면역 세포, 상피 세포, 생식 세포, 근육세포, 또는 암세포일 수 있다. 상기 세포는 섬유아세포 또는 조기노화 세포일 수 있다. 상기 조기노화 세포는 조로증(progeria) 환자 유래의 세포일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 래트, 마우스, 래빗, 또는 고양이일 수 있다.

상기 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하는 것은 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것일 수 있다. 노화는 시간의 경과에 따라 나타나는 변화 현상을 의미한다. 세포 또는 개체의 노화(senescence)는 표준(reference) 세포 또는 표준 개체에 비하여 세포의 증식능의 감소, 리포푸신(lipofuscin) 축적, β-갈락토시다제 활성 증가, 미토콘드리아 활성 산소 종 증가, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그를 야기하는 과정을 나타낼 수 있다. 세포 또는 개체의 노화는 자식작용(autophagy) 활성 감소 또는 미토콘드리아 막 전위 감소를 포함하거나, 이들을 야기하는 과정을 더 포함할 수 있다. 젊은(young) 세포 또는 개체는 표준 세포 또는 개체에 비하여 세포의 증식능의 증가, 리포푸신 축적 감소, β-갈락토시다제 활성 감소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 노화 세포는 계대수 2의 분열 시간(doubling time)에 비해 분열 시간이 2 배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상 증가한 경우 그 세포는 노화 세포라고 할 수 있다. 사람의 경우 약 30세 이상, 약 40세 이상, 약 50세 이상, 약 60세 이상, 약 70세 이상, 약 80세 이상, 약 90세 이상, 또는 약 100세 이상의 사람으로부터 수득된 세포는 노화 세포라고 할 수 있다.

상기 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포 또는 개체의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화 세포 또는 개체를 그보다 젊은 세포 또는 개체로 전환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, 미토콘드리아 활성 산소 종을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 자식작용 활성을 증가시키는 것, 미토콘드리아 막 전위를 높이는 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 세포의 증식능을 증가시키는 것은 세포 분열 시간의 감소 또는 세포 분열 횟수의 증가일 수 있다. 상기 β-갈락토시다제는 노화 연관 β-갈락토시다제일 수 있다.

상기 조성물은 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 피부 주름, 상처 재생 저하, 퇴행성 뇌질환(예를 들면, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 및 치매), 뇌졸중, 당뇨(예를 들면, 제2형 당뇨), 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 골다공증, 근감소증, 조로증, 리소좀 축적 질환(lysosome storage disease), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 리포푸신 축적과 연관된 질병일 수 있다. 상기 리포푸신은 과립의 황갈색의 자가형광을 띠는 세포 내 색소로서, 노화의 지표로 이용되고, 노화 색소(aging pigment)로도 지칭된다. 망막이나, 노인이나 장기간 소모성 질환을 앓는 환자의 간, 신장, 심장 등에도 리포푸신 침착 현상이 나타날 수 있다.

용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 노화와 연관된 증상 또는 질병을 억제시하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 노화와 연관된 증상 또는 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 통상적인 약학적으로 허용가능한 부형제, 첨가제 또는 희석제를 포함한다. 상기 담체는 예를 들면 충전제(filler), 결합제(binder), 붕해제(disintergrant), 완충제, 보존제, 항산화제, 활택제, 향미제, 점증제(thickener), 발색제(coloring agent), 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 RCC1 유전자의 발현 또는 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질을 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 상기 유효량은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 "유효량"은 상기 조성물 당 0.01 mg 내지 10,000 mg, 0.1 mg 내지 1000 mg, 1 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 1000 mg, 0.01 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 10 mg, 또는 0.01 mg 내지 1 mg일 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 예를 들면, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회, 1일 다회, 수일 1회 투여될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제, 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토스, 또는 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토스 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성 성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 신경내, 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시킬 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절될 수 있다. 상기 조성물은 pH가 약 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사(local bolus injection)로 환자의 근육내 또는 신경내 혈류에 투여될 수 있다.

상기 조성물은 세포 또는 개체의 노화와 연관 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 치료제를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 RCC1 유전자의 발현 또는 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질을 세포 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체에서 노화 수준을 조절하는 방법을 제공한다.

상기 RCC1, RCC1 유전자, RCC1 유전자의 발현, RCC1 단백질, RCC1 단백질의 활성, RCC1 유전자의 발현 또는 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질, 세포, 개체, 및 노화는 전술한 바와 같다.

상기 세포 또는 개체는 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸리거나 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸릴 위험이 있는 세포 또는 개체일 수 있다.

상기 투여는 예를 들면, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내일 수 있고, 1일 내지 1년의 기간 동안 1일 1회, 1일 다회, 또는 수일 1회 투여될 수 있다. 상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 노화 세포를 포함하는 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.

상기 RCC1 유전자의 발현을 조절하는 물질은 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질 또는 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질일 수 있다. 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질 및 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 전술한 바와 같다. 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 세포의 핵에서 RanGTP의 양을 감소시킴으로써 세포 또는 개체의 노화 수준을 증가시킬 수 있다. 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 세포의 핵에서 RanGTP의 양을 증가시킴으로써, 노화 세포의 사멸, 젊은 세포의 세포 분열, 또는 이들의 조합을 유도할 수 있다.

상기 방법은 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절함으로써 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 양상에 따른 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 세포 또는 개체에서 노화 수준을 조절하는 방법에 따르면, 세포 또는 개체의 노화 수준을 효율적으로 조절하고, 노화와 연관된 증상 또는 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1a는 SA β-gal 염색된 세포의 이미지(%)이고, 도 1b 및 도 1 c는 각각 SA β-gal 염색된 세포의 비율(%) 및 염색된 세포의 발광 비율(임의 단위/㎍ 단백질 %)을 나타내는 그래프이고, 도 1d는 약물을 처리한 세포를 면역 블로팅하여 수득한 이미지이다.
도 2a는 노화 세포 모델의 단백질을 면역 침강 및 면역 블로팅하여 수득된 이미지이고, 도 2b는 상대적인 RanGTP의 양(%)을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 노화 세포 모델에서 RCC1 mRNA의 양을 정량적 PCR 방법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 인간 피부 섬유아세포의 노화 세포 모델에서 RCC1 단백질을 면역블로팅하여 수득한 이미지이고, 도 3c는 연속 세포 분열된 HDF, IMR-90, 및 HMEC의 RCC1 단백질을 면역블로팅하고 면역블로팅 결과로부터 수득된 Actin 강도에 대한 RCC1 단백질의 상대적인 강도를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 RCC1 shRNA를 형질감염시킨 젊은 세포를 SA β-gal로 염색하여 수득한 이미지이고, 도 4b는 RCC1 shRNA를 형질감염시킨 젊은 세포의 단백질을 면역블로팅하여 수득한 이미지이다.
도 5a는 RCC1을 과발현시키는 바이러스를 형질감염시킨 노화 세포를 SA β-gal로 염색하여 수득한 이미지이고, 도 5b는 형질감염된 젊은 세포 및 노화 세포의 세포 생존능(%)을 나타내는 그래프이고, 도 5c는 형질감염된 젊은 세포 및 노화 세포를 면역블로팅하여 수득된 이미지이고, 도 5d는 RCC1-V5 바이러스를 형질감염시킨 노화 세포를 SA β-gal로 염색하여 수득한 이미지이다.
도 6a 및 도 6b는 젊은 세포 및 노화 세포의 크로마틴 면역침강 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. RCC1 기능 조절제에 의한 세포에서 노화 수준의 조절

1. 핵외 이동( nuclear export )의 저해에 의한 세포의 노화 유도

세포의 노화 수준이 핵내/외 이동(nuclear import / export)의 저해에 의해 변화하는지 여부를 확인하였다.

우선, 신생아 포피(neonatal foreskin)에서 수득된 HDF(human dermal fibroblast) M11 세포를 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 고농도 글루코스, 글루타민, 및 피루베이트를 함유한 DMEM, 10%(v/v) FBS, 및 1x 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 배양하여 젊은 세포를 수득하였다. 젊은 세포로서 계대수 10 이하이고 분열 기간이 약 1일인 세포를 이용하였다.

준비된 젊은 세포를 6-웰 플레이트에 20,000 개 세포/웰의 농도로 접종하였다. 접종된 세포에 최종 농도 6 ㎍/㎖의 소맥 배아 글루티닌(wheat germ agglutinin: WGA)(Sigma, L0636) 또는 0.1 ㎍/㎖의 렙토마이신 B(Leptomycin B: LMB)(Sigma, L2913)를 첨가하였다. WGA는 핵내 이동(nuclear import) 저해제이고, LMB는 핵외 이동(nuclear export) 저해제이다. 약물은 3일 마다 처리 하였고, 약물 처리후 8일 후에 약물을 포함하지 않는 신선한 배지로 갈아 주었다. 음성 대조군으로 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO)(Sigma-Adrich)를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였고, 양성 대조군으로 약물을 처리하지 않은 세포를 연속 배양하여 세포 노화를 유도한 것을 제외하고 동일하게 하였다.

노화 세포는 노화 지표인 노화-연관 베타-갈락토시다제(Senescence-associated beta-galactosidase: SA β-gal)의 활성이 증가하여, X-gal 염색시 세포가 파란색으로 염색된다. WGA 또는 LMB의 투여에 의해 젊은 세포의 노화 수준이 감소하는지 확인하기 위해, 배양된 세포를 Senescence β-Galactosidase Staining Kit(Cell Signaling Technology, Cat. No. 9860)를 이용하여 염색하였다. 염색된 세포를 현미경으로 관찰하여 수득한 이미지를 도 1a에 나타내었다("+": 약물 투여, "+ → -": 약물 투여 후 제거, "노화": 연속배양에 의한 세포 노화 유도). 또한, 염색된 세포의 비율(%) 및 염색된 세포의 발광 비율(임의 단위/㎍ 단백질 %)을 각각 도 1b 및 도 1c에 나타내었다("- WGA": WGA 투여 후 제거, "- LMB": LMB 투여 후 제거). 발광에 의한 SA β-gal의 정확한 정량은 Galacto-light System을 이용해서 Luminometer(Promega GloMax®)로 얻은 값을 단백질 양으로 보정해서 수득하였다. 도 1b 및 도 1c에 나타난 바와 같이, SA β-gal 양성 세포가 음성 대조군과 WGA처리군 보다 렙토마이신 B 처리군에서 약 60% 증가하였고, 렙토마이신 B을 처리후 제거한 군에서도 여전히 SA β-gal 양성 세포가 노화세포와 비슷한 수준으로 유지됨을 확인하였다.

또한, 세포에서 세포 분열 마커 단백질의 양이 약물의 처리에 의해 변화하는지 확인하기 위해, 항-p53 항체(Santa Cruz, sc-126), 항-p21 항체(BD Pharmingen, #554228), 항-Rb 항체(BD Pharmingen, #554136), 항-pS10H3 항체(Cell Signalling, #9701), 및 항-Actin 항체(Sigma, A1978)를 사용하여 면역 블로팅을 수행하였다. 면역 블로팅의 결과로서 수득된 이미지를 도 1d에 나타내었다("d"; 일, "S": 연속배양에 의한 세포 노화 유도). 도 1d에 나타난 바와 같이, 렙토마이신 B을 처리한 군과, 처리하였다가 제거한 군에서 Histone H3의 인산화된 pS10H3의 강도가 급격히 감소하였고, 세포 분열을 멈추게 하는 주요한 단백질인 p53과 p21이 현저하게 증가하였다.

따라서, 핵과 세포질 이동에서 핵에서 세포질로 나가는 물질 수송에 문제가 생기면, 세포의 노화가 유도됨을 확인하였다.

2. 노화 세포에서 RanGTP 양의 확인

노화 세포에서 RanGTP의 수준을 확인하기 위해, 노화 모델로서 연속적인 세포 분열을 거친 노화 세포(replication-induced senescence cell), 종양성(oncogenic) ras의 발현에 의한 노화 세포(oncogene-induced senescence cell) 및 텔로미어 기능 장애에 의한 노화 세포(telomere dysfunction-induced senescence cell)를 준비하였다.

연속적인 세포 분열을 거친 세포를 준비하기 위해, 1.에 기재된 바와 같이 준비된 젊은 세포(계대수 9)를 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 연속 배양하여 분열 기간이 약 14일인 노화 세포(계대수 52)를 준비하였다. 종양성(oncogenic) ras의 발현에 의한 노화 세포를 준비하기 위해, 종양성 Ras 단백질을 암호화하는 Ras V12 핵산(GenBank Accession No. NM_001130442.1)이 클로닝된 pLenti CMV/TO RasV12 Puro (w119-1) 벡터(Addgene, #22262)를 상기 젊은 세포에 도입하였다. 텔로미어 기능 장애에 의한 노화 세포를 준비하기 위해, 돌연변이 텔로미어 반복 결합 인자(telomere repeat binding factor: TRF)2(ΔBΔM)(GenBank Accession No. NM_005652.4)의 발현 벡터(Pmscv TRF2 ΔBΔM을 강원대 한정아 교수로부터 얻음)를 상기 젊은 세포에 도입하였다.

준비된 세포로부터 수득된 단백질을 항-Active Ran 마우스 항체(Abcam, ab173247)를 사용하여 면역침강시키고, 면역침강에 의해 수득된 단백질을 항-Ran 래빗 폴리클로날 항체(Abcam, ab11693)를 사용하여 면역 블로팅을 수행하였다. 음성 대조군으로서 pLenti-puro(Addgene, #39481) 벡터를 도입한 것을 제외하고 동일하게 하였다. 면역 블로팅의 결과로 수득된으로 이미지를 도 2a에 나타내고("Ran pAb": 항-Ran 래빗 폴리클로날 항체, HC": heavy chain) 이로부터 산출된 상대적인 RanGTP의 양(%)을 도 2b에 나타내었다("HDF": 인간 피부 섬유아세포, "Y": 젊은 세포, "S": 노화 세포, "V": 벡터를 도입한 세포, "R": 종양성 RasV12을 도입한 세포, "T": TRF2(ΔBΔM) 핵산을 도입한 세포, *: P<0.05).

도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 연속적인 배양에 의해 유도된 노화 세포, 종양성 ras발현에 의한 노화세포 및 텔로미어 기능 장애에 의해 유도된 노화 세포의 RanGTP 수준은 젊은 세포의 RanGTP 수준에 비해 약 30 내지 50% 감소하였다. 따라서, 노화 세포에서 RanGTP 수준은 젊은 세포의 RanGTP 수준에 비해 감소함을 확인하였다.

3. 노화 세포 모델에서 RCC1 발현 감소의 확인

세포 내 RanGTP를 만드는 조절 인자인 RCC1(Regulator of chromosome condensation 1)의 양이 변화하는지 확인하기 위해, 2.의 3종의 노화 세포 모델을 분석하였다.

2.의 HDF의 노화 세포 모델로부터 mRNA 및 단백질을 수득하였다. 또한, 인간 폐 유래 섬유아세포인 IMR-90, 및 인간 유선 상피 세포(human mammary epithelial cell: HMEC)을 2.에 기재된 방법으로 노화 세포로 유도하였다. 노화 세포 모델들로부터 수득된 mRNA를 하기 프라이머 세트를 사용하여 정량적 중합효소 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction: qPCR)을 수행하였다.

정방향 프라이머: 5'-AAGAAGGTGAAGGTCTCACAC-3' (서열번호 1)

역방향 프라이머: 5'-GCACAACATCCTCCGGAATG-3' (서열번호 2)

qPCR 결과를 도 3a에 나타내었다(□: HDF 세포, ■: IMR-90 세포, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.005, ****: P<0.001). 또한, 수득된 단백질을 항-RCC1 항체(Epitomics #5134), 항-p53 항체(Santa Cruz, sc-126), 항-pS10H3 항체(Cell Signalling, #9701), 항-Ras 항체(BD Transduction Laboratories, #610001), 항-TRF2 항체(Santa Cruz, sc-52968) 및 항-Actin 항체(Sigma, A1978)를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 면역 블로팅의 결과로서 수득된 이미지를 도 3b에 나타내었다("HDF": 인간 피부 섬유아세포, "Y": 젊은 세포, "O": 노화 세포, "V": 벡터를 도입한 세포, "R": 종양성 ras 핵산을 도입한 세포, "T": TRF2(ΔBΔM) 핵산을 도입한 세포). 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, RCC1 mRNA와 RCC1 단백질이 모두 3종의 노화 세포 모델에서 유의하게 감소함을 확인하였다.

HDF, IMR-90, 및 HMEC를 연속적인 세포 분열로 세포 노화를 유도하고, 세포의 RCC1 단백질을 항-RCC1 항체(Epitomics, #5134)를 사용하여 면역블로팅을 하였다. 계대수에 따른, Actin 강도에 대한 RCC1 단백질의 상대적인 강도를 도 3c에 나타내었다("p": 계대수). 도 3c에 나타난 바와 같이, 연속적인 세포 분열로 노화세포가 유도될 때, 계대수가 증가함에 따라 RCC1 단백질의 양이 감소함을 확인하였다.

따라서, RCC1의 감소가 노화와 아주 밀접한 관계가 있음을 확인하였다.

4. RCC1 감소에 의한 세포 노화의 유도의 확인

세포내 RCC1이 감소되어 세포내 RanGTP의 양이 변화될 경우 세포 노화가 유도되는지 확인하기 위해, 하기 핵산 서열의 RCC1 shRNA를 포함하는 렌티바이러스 pLKO.1(Dharmacon, RHS3979-201872540 서린바이오사이언스)을 준비하였다.

RCC1 shRNA: 5'-TTTCTAGTAGGCAAAGCCAGG-3' (서열번호 3)

1.에서 준비된 젊은 세포(HDF)에 RCC1 shRNA를 갖는 바이러스를 형질감염시켰다. 음성 대조군으로 대조군 shRNA(Dharmacon)을 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다. 형질감염된 세포를 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 약 14일 동안 배양하고, 배양된 세포를 1.에 기재된 바와 같이 SA β-gal로 염색하고 그 이미지를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서 SA β-gal 양성 세포는 약 12.7%인 반면에, RCC1 shRNA 형질감염군에서 SA β-gal 양성 세포는 약 53.4%였다.

또한 배양된 세포로부터 단백질을 수득하고, 수득된 단백질을 항-p53 항체(Santa Cruz, sc-126), 항-p16 항체(Epitomics, #1963-1), 항-pS10H3 항체(Cell Signalling, #9701), 항-rH2A.x 항체(Cell Signalling, #9718) 및 항-RCC1 항체(Epitomics #5134)를 사용하여 면역블로팅하였다. 면역블로팅으로 수득된 이미지를 도 4b에 나타내었다. 도 4b에 나타난 바와 같이, 세포 분열 억제 단백질인 p53과 p16, 및 DNA 손상 지표인 rH2A.x의 양이 음성 대조군에 비해 RCC1 shRNA 형질감염군에서 증가하였다.

따라서, 젊은 세포에서 RCC1의 기능 억제에 의해 노화가 유도될 수 있음을 확인하였다.

5. 노화 세포에서 RCC1 과발현에 의한 효과의 확인

RCC1 과발현에 의한 노화 세포의 변화를 확인하기 위해, RCC1을 암호화하는 핵산(NM_001048194)을 포함하는 V5 바이러스(provided by Dr. Kalab petr, NCI, NIH)을 준비하였다.

젊은 세포로서 1.에서 준비된 젊은 HDF 세포, 및 노화 세포로서 2.에서 준비된 연속적인 세포 분열을 거친 HDF 세포를 준비하였다. 준비된 세포에 상기 V5 바이러스를 이용하여 형질감염시켰다. 음성 대조군으로 대조군 바이러스(Addgene, #39481)를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다.

형질감염된 젊은 세포 및 노화 세포를 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 약 14일 동안 배양하였다. 형질감염시킨 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)에 따른 노화 세포의 이미지를 도 5a에 나타내었다("NT": 바이러스 형질감염시키지 않음. "control": 대조군 바이러스 형질 감염, "RCC1": RCC1 과발현 바이러스 형질 감염). 또한, 형질감염된 젊은 세포 및 노화 세포의 생존능(cell viability, %)을 MTT 방법으로 산출하여, MOI에 따른 세포 생존능(%)을 도 5b에 나타내었다. 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이 RCC1을 과발현시킨 노화 세포는 형질 감염 후 약 5일부터 세포 사멸이 유도되었고, 반면에 RCC1을 과발현시킨 젊은 세포는 세포 분열이 촉진되었다.

형질감염된 젊은 세포 및 노화 세포의 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 항-PARP1 항체(Santa Cruz, sc-8007), 항-caspase-3 항체(Cell Signalling, #9665S), 항-RCC1 항체(Epitomics #5134), 및 항-Actin 항체(Sigma, A1978)를 사용하여 면역블로팅하였다. 면역블로팅 결과 수득된 이미지를 도 5c에 나타내었다. 도 5c에 나타난 바와 같이, RCC1 과발현 바이러스가 형질감염된 노화 세포에서, 세포자살(apoptosis)의 대표적인 마커인 caspase-3의 절단 형태가 증가함을 확인하였다.

또한, 노화세포에 RCC1-V5 바이러스를 MOI=1 로 감염시킨 뒤, 약 4주 후에 SA β-gal로 염색을 하고, 그 결과를 도 5d에 나타내었다("control": 대조군 바이러스 형질 감염, "RCC1": RCC1-V5 바이러스 형질 감염). 도 5d에 나타난 바와 같이 면, 약 25% 정도 SA β-gal 양성 세포가 감소함을 확인하였다.

따라서, RCC1의 과발현에 의해 노화 세포 특이적 세포 사멸이 유도되고, RCC1 발현을 조절함으로써 세포 또는 개체의 노화 수준을 낮추고, 노화와 관련된 질병을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

6. 노화 세포에서 RCC1 의 발현을 조절하는 전사 인자의 확인

노화 세포에서 RCC1의 발현을 조절하는 전사 인자를 확인하기 위해, 젊은 세포로서 1.에서 준비된 HDF 세포(계대수 9), 및 노화 세포로서 2.에서 준비된 연속적인 세포 분열을 거친 HDF 세포(계대수 52)를 준비하였다.

준비된 세포에 대해 항-Sp1 항체(Millipore, #07-645)을 사용하여 크로마틴 면역침강(Chromatin Immunoprecipitation: ChIP) 분석을 수행하였다.

크로마틴 면역침강 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다(% input: 반응에 사용된 크로마틴 양에 대한 %). 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 노화 세포에서 RCC1을 포함한 여러 핵 수송계 관련 유전자들이 전사인자인 Sp1과의 결합이 유의하게 감소하였다. 따라서, 노화 세포에서 Sp1이 RCC1의 전사 인자로 작용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Composition for reducing senescence of a cell or a subject comprising RCC1 regulating material and method using the same <130> PN109861 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of RCC1 <400> 1 aagaaggtga aggtctcaca c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of RCC1 <400> 2 gcacaacatc ctccggaatg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCC1 shRNA <400> 3 tttctagtag gcaaagccag g 21

Claims (20)

1. RCC1(Regulator of chromosome condensation 1) 유전자의 발현 또는 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질을 포함하는, 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하기 위한 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 발현을 조절하는 물질은 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질 또는 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질인 것인 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 마이크로 RNA(microRNA: miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, RCC1 유전자의 전사인자의 저해제, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 RCC1 유전자를 포함한 발현 벡터, RCC1 유전자의 전사 인자, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
5. 청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 전사 인자는 SP1 폴리펩티드인 것인 조성물.
6. 청구항 2에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 세포의 핵에서 GTP-결합된 Ran(RanGTP)의 양을 감소시킴으로써 세포 또는 개체의 노화 수준을 증가시키는 것인 조성물.
7. 청구항 2에 있어서, 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 세포의 핵에서 RanGTP의 양을 증가시킴으로써, 노화(senescent) 세포의 사멸, 젊은(young) 세포의 세포 분열, 또는 이들의 조합을 유도하는 것인 조성물.
8. 청구항 1에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절하는 것은 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것인 조성물.
9. 청구항 8에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포 또는 개체의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화 세포 또는 개체를 그보다 젊은 세포 또는 개체로 전환시키는 것인 조성물.
10. 청구항 8에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, 미토콘드리아 활성 산소 종을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
11. 청구항 1에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절함으로써 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 피부 주름, 상처 재생 저하, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 골다공증, 근감소증, 조로증(progeria), 리소좀 축적 질환(lysosome storage disease), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
13. RCC1 유전자의 발현 또는 RCC1 단백질의 활성을 조절하는 물질을 세포 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체에서 노화 수준을 조절하는 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 세포 또는 개체는 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸리거나 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸릴 위험이 있는 것인 방법.
15. 청구항 13에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 발현을 조절하는 물질은 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질 또는 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질인 것인 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 마이크로 RNA(microRNA: miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, RCC1 유전자의 전사인자의 저해제, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 RCC1 유전자를 포함한 발현 벡터, RCC1 유전자의 전사 인자, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
18. 청구항 15에 있어서, 상기 RCC1 유전자의 발현을 저해하는 물질은 세포의 핵에서 RanGTP의 양을 감소시킴으로써 세포 또는 개체의 노화 수준을 증가시키는 것인 방법.
19. 청구항 15에 있어서, 상기 RCC1 유전자를 과발현시키는 물질은 세포의 핵에서 RanGTP의 양을 증가시킴으로써, 노화 세포의 사멸, 젊은 세포의 세포 분열, 또는 이들의 조합을 유도하는 것인 방법.
20. 청구항 13에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 조절함으로써 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 것인 방법.

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